CN110627888B - 一种调控玉米茎秆强度的Stiff1基因及其编码蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调控玉米茎秆强度的Stiff1基因及其编码蛋白的应用。本发明提供了一种蛋白质，为序列表中序列2所示的蛋白质或序列表中序列4所示的蛋白质。本发明的实验证明，蛋白Stiff1可以调控植物的茎秆弯曲强度、茎秆纤维素含量和/或茎秆木质素含量，从而影响植物的抗倒伏性。用CRISPR系统突变玉米中该基因，可以提高植物茎秆弯曲强度、茎秆纤维素含量和/或茎秆木质素含量，从而提高植物的抗倒伏性。

Description

一种调控玉米茎秆强度的Stiff1基因及其编码蛋白的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控玉米茎秆强度的Stiff1基因及其编码蛋白的应用。
背景技术
19世纪70年代，伴随着化肥在农业上的大量使用，半矮秆基因在世界各地得到广泛的应用，作物的抗倒伏性得到极大的提高，使得当时的水稻和小麦产量翻了一番，有效地避免了一场潜在的粮食危机。在之后的研究中发现，当时应用广泛的半矮秆基因都和赤霉素(gibberellin，GA)有关，即水稻中的Semi Dwarf-1(SD-1)和小麦中的Reduced height-1(Rht-1)，赤霉素信号的消失或减弱能够引起作物株高的降低，同时不会引起其它不利形态和生理性状，因此，通过赤霉素相关基因降低株高以提高作物抗倒伏的模式得到了广泛的应用，据统计，在水稻育种过程中，72％的半矮秆水稻种含有sd-1基因。随着作物产量的不断提高，“矮秆—抗倒—高产”模式的不足逐渐体现出来——矮秆虽然可以降低作物的“茎弯”型倒伏，但是GA信号的消失或减弱在降低株高的同时却导致了茎粗和茎秆中木质素含量的降低，降低了茎秆的强度和作物的生物量。而茎秆强度高的植株不仅可以提高作物的倒伏性，而且还可以提高作物对生物和非生物胁迫的抗性，比如玉米螟(Diatraeagrandiosella D.)、玉米赤霉菌(Gibberella zeae)、玉蜀黍壳色单隔孢菌(Diplodiazeae)和养分胁迫等。并且从理论上来讲，如果在不倒伏的情况下，高秆作物会有更高的生物量和产量，而矮秆作物较低的生物量最终会成为高产的瓶颈。因此，提高茎秆强度是今后提高作物抗倒伏性的一个重要策略。
玉米作为典型的高产C4作物，可为人类提供30％以上的食物热量，在全球粮食安全中发挥着重要的作用。世界范围内每年因倒伏造成的玉米产量损失大约在5-20％，随着玉米育种朝着密植化方向的发展，对玉米的倒伏抗性需求越来越高。
发明内容
为了提高植物的抗倒伏性，本发明提供了如下技术方案：
本发明的一个目的是提供如下应用：
本发明提供了蛋白质或编码所述蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、、重组载体或重组微生物在如下(c1)-(c4)至少一种中的应用也是本发明保护的范围：
(c1)调控植物的抗倒伏性；
(c2)调控植物的茎秆弯曲强度；
(c3)调控植物的茎秆纤维素含量；
(c4)调控植物的茎秆木质素含量。
所述蛋白质，为如下(a1)-(a5)中任一种：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)序列表中序列4所示的蛋白质；
(a3)在(a1)或(a2)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a4)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物倒伏性相关的蛋白质；
(a5)与(a1)或(a2)具有98％以上同一性且与植物倒伏性相关的蛋白质。
本发明另一个目的是提供如下1)或2)所示的物质的用途。
本发明提供了如下1)或2)所示的物质在如下(d1)-(d4)至少一种中的应用：
(d1)提高植物的抗倒伏性；
(d2)增加植物的茎秆弯曲强度；
(d3)增加植物的茎秆纤维素含量；
(d4)增加植物的茎秆木质素含量。
1)所示的物质为降低上述蛋白质含量或活性的物质；
2)所示的物质为抑制或降低上述核酸分子表达的物质；
所述蛋白质，为如下(a1)-(a5)中任一种：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)序列表中序列4所示的蛋白质；
(a3)在(a1)或(a2)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a4)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物倒伏性相关的蛋白质；
(a5)与(a1)或(a2)具有98％以上同一性且与植物倒伏性相关的蛋白质。
上述应用中，所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区为序列表中序列1或序列5所示的DNA分子；
(b2)编码区为序列表中序列3或序列6所示的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。
上述应用中，所述降低蛋白质含量或活性是通过蛋白质编码基因进行基因编辑实现的；
所述1)或2)所示的物质均为抑制或降低所述核酸分子表达的CRISPR系统，所述系统包括表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体；
所述sgRNA1的靶序列为序列1第816-834位或序列3第793-811位；
所述sgRNA2的靶序列为序列1第876-894位或序列3第853-871位。
本发明第3个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明提供的方法，为如下1)或2)或3)：
1)所示的方法为降低目的植物中蛋白质含量或活性，得到转基因植物；
2)所示的方法为抑制或降低目的植物中编码所述蛋白质的核酸分子表达，得到转基因植物；
3)所示的方法为将上述表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体导入目的植物，得到转基因植物；
所述转基因植物具有如下e1)-e4)至少一种表现：
e1)所述转基因植物的抗倒伏性高于所述目的植物；
e2)所述转基因植物的茎秆弯曲强度高于所述目的植物；
e3)所述转基因植物的茎秆纤维素含量高于所述目的植物；
e4)所述转基因植物的茎秆木质素含量高于所述目的植物；
所述蛋白质，为如下(a1)-(a5)中任一种：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)序列表中序列4所示的蛋白质；
(a3)在(a1)或(a2)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a4)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物倒伏性相关的蛋白质；
(a5)与(a1)或(a2)具有98％以上同一性且与植物倒伏性相关的蛋白质。
上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质含量或活性，或，所述抑制或降低目的植物中所述核酸分子表达，为将抑制或降低所述核酸分子表达的CRISPR系统导入目的植物；
所述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区为序列表中序列1或序列5所示的DNA分子；
(b2)编码区为序列表中序列3或序列6所示的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述方法中，所述系统包括表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体；
所述sgRNA1的靶序列为序列1第816-834位或序列3第793-811位；
所述sgRNA2的靶序列为序列1第876-894位或序列3第853-871位。
在本发明的实施例中，表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体按照如下方法构建：
根据靶点特异性及脱靶率等条件综合分析的结果,选择B73-stiff1基因序列中第一个外显子上的CTCGAGGCCCAGAAACCGG和CCAGAGGCGAAAGCCATGC作为该基因的两个靶点，设计包含两个靶点信息的引物
stiff1-MT1-BsF:ATATATGGTCTCTGGCGCTCGAGGCCCAGAAACCGGGTT
stiff1-MT1-F0:TGCTCGAGGCCCAGAAACCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
stiff1-MT2-R0:AACGCATGGCTTTCGCCTCTGGCGCTTCTTGGTGCC
stiff1-MT2-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACGCATGGCTTTCGCCTCTGGC；
同时以pCBC-MT1T2为模板进行PCR扩增并回收,得到的片段再与pBUE411通过酶切-连接的PCR体系,最终得到含有两个靶点信息的CRISPR/Cas9载体。
本发明第3个目的是提供一种CRISPR系统，包括表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体；
所述sgRNA1的靶序列为序列1第816-834位或序列3第793-811位；
所述sgRNA2的靶序列为序列1第876-894位或序列3第853-871位。
上述植物为双子叶植物或单子叶植物；
或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为玉米。
上述抗倒伏为苗期抗倒伏。
本发明另一个目的是提供了一种蛋白质，为如下(a1)-(a5)中任一种：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)序列表中序列4所示的蛋白质；
(a3)在(a1)或(a2)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a4)将(a1)或(a2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物倒伏性相关的蛋白质；
(a5)与(a1)或(a2)具有98％以上同一性且与植物倒伏性相关的蛋白质。
编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。
上述核酸分子为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)编码区为序列表中序列1或序列5所示的DNA分子；
(b2)编码区为序列表中序列3或序列6所示的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交且编码上述蛋白质的DNA分子。
含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，蛋白Stiff1可以调控植物的茎秆弯曲强度、茎秆纤维素含量和/或茎秆木质素含量，从而影响植物的抗倒伏性。用CRISPR系统突变玉米中该基因，可以提高植物茎秆弯曲强度、茎秆纤维素含量和/或茎秆木质素含量，从而提高植物的抗倒伏性。
附图说明
图1为转基因植物中目标基因Stiff1的表达量检测。
图2为转基因植物和对照CK的表型比较结果。
图3为转基因植物和对照CK的表型统计结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、玉米茎秆强度基因Stiff1的克隆
分别提取玉米B73自交系和玉米Ki11自交系叶片的基因组DNA为模板，用StForward和St Reverse进行PCR扩增，得到1.8kb的PCR扩增产物。
St Forward CCTGCTGCATATCATTTGCTACCTT
St Reverse GGCCACACAGAAAAGAAACCACAC
经过测序，B73的PCR扩增产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该核苷酸具有的基因命名为B73-Stiff1；Ki11的PCR扩增产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，该核苷酸具有的基因命名为Ki11-Stiff1。
B73-Stiff1基因的开放阅读框为序列1第166-1646位，该基因的编码区(CDS区)的核苷酸序列为序列5，该编码区编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，命名为B73-Stiff1蛋白；
Ki11-Stiff1基因的开放阅读框为序列3第152-1622位，该基因的编码区(CDS区)的核苷酸序列为序列6，该编码区编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列4，命名为Ki11-Stiff1蛋白。
实施例2、玉米茎秆强度基因Stiff1的功能验证
一、过表达Stiff1实验方法
1、重组载体的制备
重组载体Pubstiff1为将序列5所示的B73-Stiff1基因的CDS区替换载体pCAMBIA1300(Zhang et al.The genetic architecture of nodal root number inmaize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018)的XmaI和SmaI酶切位点间的DNA片段得到的载体，该载体由强启动子ubiquitin启动Stiff1的表达。
2、重组菌的制备
将上述重组载体Pubstiff1导入农杆菌Eh105中，得到重组菌(鉴定，含有重组载体Pubstiff1的菌为目标重组菌)。
3、转Stiff1玉米的制备
将重组菌通过农杆菌介导转入硬秆自交系B73(Zhang et al.The geneticarchitecture of nodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018.)中。B73的幼胚进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代转Stiff1玉米。
将T0代转Stiff1玉米分别进行Bar基因及目标基因筛选以及表达量检测，具体如下：
1)Bar基因筛选
在苗期进行草丁膦喷施以及后期叶片进行Bar基因试纸条(美国一龙，Envirologix Inc.AP-013)测验，结果为阳性的为Bar基因阳性T0代转Stiff1玉米。
2)目标基因Stiff1筛选
提取Bar基因阳性T0代转Stiff1玉米叶片的RNA，反转录得到cDNA作为模板，使用St Forward和St Reverse引物进行扩增，扩增出与B73-Stiff1基因CDS大小相同的条带(1311bp)，为阳性T0代转Stiff1玉米。
3)目标基因Stiff1的表达量检测
提取阳性T0代转Stiff1玉米(Ovsiff1-1、Ovsiff1-2、Ovsiff1-3、Ovsiff1-4、Ovsiff1-5)茎秆的RNA，使用引物Rt进行qPCR验证,使用的ABI7500，荧光染料为TAKARA的sybr green，内参为看家基因GADPH(GADPH-F:ATCAACGGCTTCGGAAGGAT，GADPH-R:CCGTGGACGGTGTCGTACTT)。以野生型玉米B73(CK)为对照。
结果如图1所示，可以看出，与对照CK相比，5株阳性T0代转Stiff1玉米的表达量，在不同程度上都有提高，其中Ovstiff1-1,2,3的表达量明显高于Ovstiff1-4,5的表达量，且均高于对照。
4、转Stiff1玉米的表型鉴定
将3个阳性T0代转Stiff1玉米株系Ovstiff1-1、Ovstiff1-2、Ovstiff1-3和野生型玉米B73对照(CK)进行株高(PH)(使用尺子量取从玉米根部地面到玉米熊穗的最高处)、茎粗(SD)(使用游标卡尺量取玉米地上2-3节节间中部的茎粗)、表皮穿刺强度(RPR)(使用穿刺仪ELECALL,YLK-500对玉米地上2-3节节间中部进行穿刺，每次穿刺取最大值，多次测量后取平均值)、弯曲强度(BS)(使用拉力计ELECALL,YLK-500，在固定高度50cm将玉米拉弯20度需要的力)以及茎秆中的纤维素和木质素含量检测(Sluiter,A.,Hames,B.,Ruiz,R.,Scarlata,C.,Sluiter,J.,Templeton,D.,and Crocker,D.(2011).Determination ofstructural carbohydrates and lignin in biomass.NREL Laboratory AnalyticalProcedure.)。
阳性T0代转Stiff1玉米株系Ovstiff1和对照CK的表型比较结果如图2和图3所示，
其中，阳性T0代转Stiff1玉米株系Ovstiff1-1、Ovstiff1-2和Ovstiff1-3与对照CK的茎秆粗度差异结果如图3a所示，可以看出，Ovstiff1不同株系比对照CK茎秆粗度小。
阳性T0代转Stiff1玉米株系Ovstiff1-1、Ovstiff1-2和Ovstiff1-3与对照CK的的茎秆穿刺抗力差异结果如图3b所示，可以看出，Ovstiff1比对照CK茎秆穿刺抗力小。
阳性T0代转Stiff1玉米株系Ovstiff1-1与对照CK的的茎秆纤维素含量结果如图3d所示，可以看出，Ovstiff1比对照CK茎秆纤维素含量小。
阳性T0代转Stiff1玉米株系Ovstiff1与对照CK的的茎秆木质素结果如图3e所示，可以看出，Ovstiff1比对照CK茎秆木质素小。
从上述结果可以看出，和对照野生型玉米植株相比，过表达Stiff1植株表现出明显的矮化和畸变，茎粗显著变细，RPR和BS显著降低，纤维素和木质素含量也显著降低；在生育后期，出现倒伏现象；雄穗发生畸变导致无法散粉结实，且种子萌发率低。
二、CRISPR/Cas9敲除Stiff1实验方法
1、构建CRISPR载体
根据靶点特异性及脱靶率等条件综合分析的结果,选择B73-stiff1基因序列中第一个外显子上的CTCGAGGCCCAGAAACCGG和CCAGAGGCGAAAGCCATGC作为该基因的两个靶点，设计包含两个靶点信息的引物:
stiff1-MT1-BsF:ATATATGGTCTCTGGCGCTCGAGGCCCAGAAACCGGGTT
stiff1-MT1-F0:TGCTCGAGGCCCAGAAACCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
stiff1-MT2-R0:AACGCATGGCTTTCGCCTCTGGCGCTTCTTGGTGCC
stiff1-MT2-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACGCATGGCTTTCGCCTCTGGC；
分别用上述stiff1-MT1-BsF和stiff1-MT1-F0、stiff1-MT2-R0和stiff1-MT2-BsR以pCBC-MT1T2为模板(Xing et al.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genomeediting in plants.BMC plant biology,2014,14(1):327)进行PCR扩增并回收,得到sgRNA1的编码基因、sgRNA2的编码基因及其一段与sgRNA2相连的启动子。
再将sgRNA1的编码基因、sgRNA2的编码基因及其一段与sgRNA2相连的启动子插入pBUE411载体(Xing et al.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing inplants.BMC plant biology,2014,14(1):327；该载体表达cas9)的BsaI酶切位点中，得到的重组CRISPR载体Cstiff1，该载体表达sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1的靶序列为序列1第816-834位，sgRNA2的靶序列为序列1第876-894位。
2、重组菌的制备
将上述重组载体Cstiff1导入农杆菌Eh105中，得到重组菌。
3、转Stiff1敲除玉米的制备
将上述2得到的重组菌采用农杆菌介导法转入硬秆自交系B73，B73的幼胚进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代Stiff1敲除玉米。构建方法参考：Zhang et al.The genetic architecture of nodal root number in maize.PlantJournal,93(6):1032-1044,2018。
将T0代Stiff1敲除玉米分别进行Bar基因及目标基因筛选以及表达量检测，具体如下：
1)Bar基因筛选
在苗期进行草丁膦喷施以及后期叶片进行Bar基因试纸条(美国EnvirologixInc.AP-013)测验，结果为阳性的为Bar基因阳性T0代Stiff1敲除玉米。
2)目标基因Stiff1筛选
提取Bar基因阳性T0代转Stiff1敲除玉米叶片的RNA，反转录得到cDNA作为模板，使用St Forward和St Reverse引物进行扩增，未扩增出与B73-Stiff1基因CDS大小相同的条带(1311bp)，为阳性T0代Stiff1敲除玉米(Csiff1)。
3)目标基因Stiff1筛选
提取阳性T0代Stiff1敲除玉米(Csiff1)茎秆的RNA，使用引物Rt进行qPCR验证,使用的ABI7500，荧光染料为TAKARA的sybr green，内参为看家基因GADPH(GADPH-F:ATCAACGGCTTCGGAAGGAT，GADPH-R:CCGTGGACGGTGTCGTACTT)。以野生型玉米B73(CK)为对照。
结果如图1所示，可以看出，与对照CK(Stiff1基因表达量为0.51)相比，阳性T0代Stiff1敲除玉米Csiff1中的Stiff1基因表达量(Stiff1基因表达量为0.54)相同，表明，敲除玉米Csiff1只改变基因的蛋白序列，不改变其表达量。
阳性T0代Stiff1敲除玉米(Csiff1)经过测序，发现Stiff1基因第1外显子敲除后有4bp编码序列缺失，导致翻译过程出现蛋白移码。
4、转Stiff1敲除玉米的表型鉴定
将阳性T0代Stiff1敲除玉米Csiff1和野生型玉米进行株高(PH)、茎粗(SD)、表皮穿刺强度(RPR)、弯曲强度(BS)以及茎秆中的纤维素和木质素含量检测(方法同前面)，结果如图2和图3所示。
阳性T0代Stiff1敲除玉米株系Cstif1和对照CK的茎秆弯曲强度比较结果如图3c所示，可以看出，Cstif1比对照CK相比，茎秆弯曲强度大。
阳性T0代Stiff1敲除玉米株系Cstif1和对照CK的茎秆纤维素含量比较结果如图3d所示，可以看出，Cstif1比对照CK相比，茎秆纤维素含量大。
阳性T0代Stiff1敲除玉米株系Cstif1和对照CK的茎秆纤维素含量比较结果如图3e所示，可以看出，Cstif1比对照CK相比，茎秆木质素含量大。
从上述结果可以看出，与对照CK相比，阳性T0代Stiff1敲除玉米株系Cstif1茎秆中木质素和纤维素的含量显著提高。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种调控玉米茎秆强度的Stiff1基因及其编码蛋白的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2009
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cctgctgcat atcatttgct accttcatgg cttcagtcca cacttcacac ctgcaggctt 60
gtagctagct ggattctcac acactcccca gctcccacac gtcctccgat ccgatccgat 120
cccgatcctc cagaagaggg gcgagctgca agcgtagggc ggcagcatga tgcactcgca 180
ccaccctcac taccatccgc gtttccaccc gccgtcgtcc tcctcgtctg aggcggtgga 240
catggacccc cgcgtgtgga gccggctgcc gcagccgctg gtggaccgcg tgctggcgtg 300
cctaccgacg ccatccttcc tccgtctccg ggccgcctgc cgccgcttcg gcaacctcat 360
ctactcgtcg ccgttcctcc actcccacct cctcctctcg ccgcacctcc ccttcttcgc 420
cttcgccgtc ccttccgcgg ggtacccgta cctcctcctg ctcgacccca ccacgcaggc 480
gcccgcgccc tcctggtccc gcctcccgct gccgctgccg gccgcgcccg gcgccgtgca 540
ggcggcgttc tccccggcgg ccgcgtcggc gggcctgctc gcgttcctgt cggacgcgtc 600
cggccacaag acgctgctcc tcgccaaccc catcacgcgc ctcctcgcgc cgctgccgct 660
ctgccccacc gcgcgcctct cccccaccgt cggcctcgcc gcgggaccca cctccttcat 720
cgccgtcgtt gccggcgacg acctcgtgtc ccccttcgcg gtcaagaaca tctccgcgga 780
cacgttcgtc gccgacgccg cctccgtccc gccctccggt ttctgggcct cgagttccat 840
cctgccccgc ctctcctccc tcgacccccg cgccggcatg gctttcgcct ctggaaggta 900
gttaaaggct gatgaagcgc acgcacgtgt gtgcgggatt attatttgtc catgcataca 960
ttatacataa catacacacg agcatacggc agtggcatga gattgagatg aatcaaacta 1020
agctgactac agcatgcaag ttccactact gcttcacttg ttgcaggttc tactgcatga 1080
gctcgtcgcc gttcgcggtg cttgtgttcg acgtggcaac caacgtgtgg agcaaggtgc 1140
agccgccgat gaggaggttc ctgcggtcgc cggcgctcgt ggagctcggc ggcgggaggg 1200
agcgcgaggc ggtggtggcg ctggtctccg ccgtcgaaaa gagccgcctc agcgtgccgc 1260
ggagcgtgcg cgtgtggacg ctgcgaggcg agcacggagc tgctgccggc ggaagcaacg 1320
gcggcggagc gtggactgag gtggcgcgga tgccacccga cgtgcacgcg cagttcgcgg 1380
cggccgaggg cgggcgcggg ttcgagtgcg cggcgcacgg cgacttcgtg gtgctggcgc 1440
cacgcgggcc cgcgagcccc gtgctcgtgt tcgactcgcg ccacgacgag tggcggtggg 1500
cgccgccgtg cccgtacccg tacccgtacg ccgcgggagg cgcggggttc agggtgttcg 1560
cctacgagcc ccgccttgcg acgccggcca tcggtctcct ggacgccacg gcgccggcgg 1620
cctttttgca tgggatgcag ggctagctag gtgctaggct caggcgctca gctcattgac 1680
gtgtacgcat catctacgta acggaaatcg ttccggtctc tgcgttgtga ggtgcaccat 1740
gaaatctggt gtttttcttg agcgtctgtt agcgaaggct gctggtaaga actctactac 1800
tggtctgagg cgtgtcttta atatattagt actattaagt atctcatgat aatttatgtg 1860
tacggggccg gattattagt tatatgaaca tttaaacttg ctttctgcat aagtatttgc 1920
aatctaaaat ggaccatgca tgcaagagtg aagtcttgtc tgcagagaga tctggttttt 1980
ggtgtgtgtg gtttcttttc tgtgtggcc 2009
<210> 2
<211> 436
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Met His Ser His His Pro His Tyr His Pro Arg Phe His Pro Pro
1 5 10 15
Ser Ser Ser Ser Ser Glu Ala Val Asp Met Asp Pro Arg Val Trp Ser
20 25 30
Arg Leu Pro Gln Pro Leu Val Asp Arg Val Leu Ala Cys Leu Pro Thr
35 40 45
Pro Ser Phe Leu Arg Leu Arg Ala Ala Cys Arg Arg Phe Gly Asn Leu
50 55 60
Ile Tyr Ser Ser Pro Phe Leu His Ser His Leu Leu Leu Ser Pro His
65 70 75 80
Leu Pro Phe Phe Ala Phe Ala Val Pro Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Leu
85 90 95
Leu Leu Leu Asp Pro Thr Thr Gln Ala Pro Ala Pro Ser Trp Ser Arg
100 105 110
Leu Pro Leu Pro Leu Pro Ala Ala Pro Gly Ala Val Gln Ala Ala Phe
115 120 125
Ser Pro Ala Ala Ala Ser Ala Gly Leu Leu Ala Phe Leu Ser Asp Ala
130 135 140
Ser Gly His Lys Thr Leu Leu Leu Ala Asn Pro Ile Thr Arg Leu Leu
145 150 155 160
Ala Pro Leu Pro Leu Cys Pro Thr Ala Arg Leu Ser Pro Thr Val Gly
165 170 175
Leu Ala Ala Gly Pro Thr Ser Phe Ile Ala Val Val Ala Gly Asp Asp
180 185 190
Leu Val Ser Pro Phe Ala Val Lys Asn Ile Ser Ala Asp Thr Phe Val
195 200 205
Ala Asp Ala Ala Ser Val Pro Pro Ser Gly Phe Trp Ala Ser Ser Ser
210 215 220
Ile Leu Pro Arg Leu Ser Ser Leu Asp Pro Arg Ala Gly Met Ala Phe
225 230 235 240
Ala Ser Gly Arg Phe Tyr Cys Met Ser Ser Ser Pro Phe Ala Val Leu
245 250 255
Val Phe Asp Val Ala Thr Asn Val Trp Ser Lys Val Gln Pro Pro Met
260 265 270
Arg Arg Phe Leu Arg Ser Pro Ala Leu Val Glu Leu Gly Gly Gly Arg
275 280 285
Glu Arg Glu Ala Val Val Ala Leu Val Ser Ala Val Glu Lys Ser Arg
290 295 300
Leu Ser Val Pro Arg Ser Val Arg Val Trp Thr Leu Arg Gly Glu His
305 310 315 320
Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ser Asn Gly Gly Gly Ala Trp Thr Glu Val
325 330 335
Ala Arg Met Pro Pro Asp Val His Ala Gln Phe Ala Ala Ala Glu Gly
340 345 350
Gly Arg Gly Phe Glu Cys Ala Ala His Gly Asp Phe Val Val Leu Ala
355 360 365
Pro Arg Gly Pro Ala Ser Pro Val Leu Val Phe Asp Ser Arg His Asp
370 375 380
Glu Trp Arg Trp Ala Pro Pro Cys Pro Tyr Pro Tyr Pro Tyr Ala Ala
385 390 395 400
Gly Gly Ala Gly Phe Arg Val Phe Ala Tyr Glu Pro Arg Leu Ala Thr
405 410 415
Pro Ala Ile Gly Leu Leu Asp Ala Thr Ala Pro Ala Ala Phe Leu His
420 425 430
Gly Met Gln Gly
435
<210> 3
<211> 1747
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cctgctgcat atcatttgct accttcatgg cttcagtcca cacttcacac ctgcaggctt 60
gtagctagct ggattctcac acactcccca gctcccacac gtcctccgat ccgatcctcc 120
agaagaggag cgagctgcaa gcgtagggca gcatgatgca ctcgcaccac cctcactacc 180
atccgcgttt ccacccgccg tcgtctgagg aagtggacat ggacccccgc gtgtggagcc 240
ggctgccgca gccgctggtg gaccgcgtgc tggcgtgcct accgacgcca tccttcctcc 300
gcctgcgggc cgccagccgc cgcttcggca acctcatcta ctcgtccccg ttcctccact 360
cccacctcct gctctccccg cacctcccct tcttcgcctt cgccgtccct tccgcggggt 420
acccgtacct cctcctgctc gacccaacca cgcaggcgcc cgcgccctcc tggtcccgcc 480
tcccgctgcc gctgccggcc gcgcccggcg ccgtgcaggc ggcgttctcc ccggctgccg 540
cgtcggcggg cctgctcgcg ttcctgtcgg acgcgtccgg ccacaagacg ctgctcctcg 600
ccaaccccat cacgcgcctc ctcgcgccgc tgccgctctg ccccaccgcg cgcctctccc 660
ccaccgtcgg cctcgccgcg ggacccacct ccttcatcgc cgtcgttgcc ggcgacgacc 720
tcgtgtcccc cttcgcggtg aagaacatct ccgcggacac gttcgtcgcc gacgccgcct 780
ccgtcccgcc gtccggtttc tgggcctcga gttccatcct gccccgcctc tcctccctcg 840
acccccgcgc cggcatggct ttcgcctctg gaaggtagtt aaaggctgat gaagcgcacg 900
cacgtgtgtg cgggattatt atttgtccat gcatacataa cataaacaca cacacgagca 960
tacggcagtg gcatgagatt gagatgaatc aaactaagct gactacagca tgcaagttcc 1020
actactgctt cacttgttgc aggttctact gcatgagctc gtcgccgttc gcggtgcttg 1080
tgttcgacgt ggcaaccaac gtgtggagca aggtgcagcc gccgatgagg aggttcctgc 1140
ggtcgccggc gctcgtggag ctcggcggcg ggagggagcg cgaggcggtg gtggcgctgg 1200
tctccgccgt cgaaaagagc cgcctcagcg tgccgcggag cgtgcgcgtg tggacgctgc 1260
gaggcgagca cggggctgct gccggcggaa gcaacggcgg cggagcgtgg actgaggtgg 1320
cgcggatgcc acccgacgtg cacgcgcagt tcgcggcggc cgagggcggg cgcgggttcg 1380
agtgcgcggc gcacggcgac ttcgtggtgc tggcgccacg cgggcccgcg agccccgtgc 1440
tcgtgttcga ctcgcgccac gacgagtggc ggtgggcgcc gccgtgcccg tacccgtacc 1500
cgtacgccgc gggaggcgcg gggttcaggg tgttcgccta cgagccccgc cttgcgacgc 1560
cggccatcgg tctcctggac gccacggcgc cggcggcctt tttgcatggg atgcagggct 1620
agctaggtgc taggctcagc tcattgacgt gtacgcatca tctacgtaac ggaaatcgtt 1680
ccggtctctg cgttgtgagg tgcaccatga aatctggtgt ttttcttgag cgtctgttag 1740
cgaaggc 1747
<210> 4
<211> 436
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Met His Ser His His Pro His Tyr His Pro Arg Phe His Pro Pro
1 5 10 15
Ser Ser Ser Ser Ser Glu Ala Val Asp Met Asp Pro Arg Val Trp Ser
20 25 30
Arg Leu Pro Gln Pro Leu Val Asp Arg Val Leu Ala Cys Leu Pro Thr
35 40 45
Pro Ser Phe Leu Arg Leu Arg Ala Ala Cys Arg Arg Phe Gly Asn Leu
50 55 60
Ile Tyr Ser Ser Pro Phe Leu His Ser His Leu Leu Leu Ser Pro His
65 70 75 80
Leu Pro Phe Phe Ala Phe Ala Val Pro Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Leu
85 90 95
Leu Leu Leu Asp Pro Thr Thr Gln Ala Pro Ala Pro Ser Trp Ser Arg
100 105 110
Leu Pro Leu Pro Leu Pro Ala Ala Pro Gly Ala Val Gln Ala Ala Phe
115 120 125
Ser Pro Ala Ala Ala Ser Ala Gly Leu Leu Ala Phe Leu Ser Asp Ala
130 135 140
Ser Gly His Lys Thr Leu Leu Leu Ala Asn Pro Ile Thr Arg Leu Leu
145 150 155 160
Ala Pro Leu Pro Leu Cys Pro Thr Ala Arg Leu Ser Pro Thr Val Gly
165 170 175
Leu Ala Ala Gly Pro Thr Ser Phe Ile Ala Val Val Ala Gly Asp Asp
180 185 190
Leu Val Ser Pro Phe Ala Val Lys Asn Ile Ser Ala Asp Thr Phe Val
195 200 205
Ala Asp Ala Ala Ser Val Pro Pro Ser Gly Phe Trp Ala Ser Ser Ser
210 215 220
Ile Leu Pro Arg Leu Ser Ser Leu Asp Pro Arg Ala Gly Met Ala Phe
225 230 235 240
Ala Ser Gly Arg Phe Tyr Cys Met Ser Ser Ser Pro Phe Ala Val Leu
245 250 255
Val Phe Asp Val Ala Thr Asn Val Trp Ser Lys Val Gln Pro Pro Met
260 265 270
Arg Arg Phe Leu Arg Ser Pro Ala Leu Val Glu Leu Gly Gly Gly Arg
275 280 285
Glu Arg Glu Ala Val Val Ala Leu Val Ser Ala Val Glu Lys Ser Arg
290 295 300
Leu Ser Val Pro Arg Ser Val Arg Val Trp Thr Leu Arg Gly Glu His
305 310 315 320
Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ser Asn Gly Gly Gly Ala Trp Thr Glu Val
325 330 335
Ala Arg Met Pro Pro Asp Val His Ala Gln Phe Ala Ala Ala Glu Gly
340 345 350
Gly Arg Gly Phe Glu Cys Ala Ala His Gly Asp Phe Val Val Leu Ala
355 360 365
Pro Arg Gly Pro Ala Ser Pro Val Leu Val Phe Asp Ser Arg His Asp
370 375 380
Glu Trp Arg Trp Ala Pro Pro Cys Pro Tyr Pro Tyr Pro Tyr Ala Ala
385 390 395 400
Gly Gly Ala Gly Phe Arg Val Phe Ala Tyr Glu Pro Arg Leu Ala Thr
405 410 415
Pro Ala Ile Gly Leu Leu Asp Ala Thr Ala Pro Ala Ala Phe Leu His
420 425 430
Gly Met Gln Gly
435
<210> 5
<211> 1311
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atgatgcact cgcaccaccc tcactaccat ccgcgtttcc acccgccgtc gtcctcctcg 60
tctgaggcgg tggacatgga cccccgcgtg tggagccggc tgccgcagcc gctggtggac 120
cgcgtgctgg cgtgcctacc gacgccatcc ttcctccgtc tccgggccgc ctgccgccgc 180
ttcggcaacc tcatctactc gtcgccgttc ctccactccc acctcctcct ctcgccgcac 240
ctccccttct tcgccttcgc cgtcccttcc gcggggtacc cgtacctcct cctgctcgac 300
cccaccacgc aggcgcccgc gccctcctgg tcccgcctcc cgctgccgct gccggccgcg 360
cccggcgccg tgcaggcggc gttctccccg gcggccgcgt cggcgggcct gctcgcgttc 420
ctgtcggacg cgtccggcca caagacgctg ctcctcgcca accccatcac gcgcctcctc 480
gcgccgctgc cgctctgccc caccgcgcgc ctctccccca ccgtcggcct cgccgcggga 540
cccacctcct tcatcgccgt cgttgccggc gacgacctcg tgtccccctt cgcggtcaag 600
aacatctccg cggacacgtt cgtcgccgac gccgcctccg tcccgccctc cggtttctgg 660
gcctcgagtt ccatcctgcc ccgcctctcc tccctcgacc cccgcgccgg catggctttc 720
gcctctggaa ggttctactg catgagctcg tcgccgttcg cggtgcttgt gttcgacgtg 780
gcaaccaacg tgtggagcaa ggtgcagccg ccgatgagga ggttcctgcg gtcgccggcg 840
ctcgtggagc tcggcggcgg gagggagcgc gaggcggtgg tggcgctggt ctccgccgtc 900
gaaaagagcc gcctcagcgt gccgcggagc gtgcgcgtgt ggacgctgcg aggcgagcac 960
ggagctgctg ccggcggaag caacggcggc ggagcgtgga ctgaggtggc gcggatgcca 1020
cccgacgtgc acgcgcagtt cgcggcggcc gagggcgggc gcgggttcga gtgcgcggcg 1080
cacggcgact tcgtggtgct ggcgccacgc gggcccgcga gccccgtgct cgtgttcgac 1140
tcgcgccacg acgagtggcg gtgggcgccg ccgtgcccgt acccgtaccc gtacgccgcg 1200
ggaggcgcgg ggttcagggt gttcgcctac gagccccgcc ttgcgacgcc ggccatcggt 1260
ctcctggacg ccacggcgcc ggcggccttt ttgcatggga tgcagggcta g 1311
<210> 6
<211> 1302
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
atgatgcact cgcaccaccc tcactaccat ccgcgtttcc acccgccgtc gtctgaggaa 60
gtggacatgg acccccgcgt gtggagccgg ctgccgcagc cgctggtgga ccgcgtgctg 120
gcgtgcctac cgacgccatc cttcctccgc ctgcgggccg ccagccgccg cttcggcaac 180
ctcatctact cgtccccgtt cctccactcc cacctcctgc tctccccgca cctccccttc 240
ttcgccttcg ccgtcccttc cgcggggtac ccgtacctcc tcctgctcga cccaaccacg 300
caggcgcccg cgccctcctg gtcccgcctc ccgctgccgc tgccggccgc gcccggcgcc 360
gtgcaggcgg cgttctcccc ggctgccgcg tcggcgggcc tgctcgcgtt cctgtcggac 420
gcgtccggcc acaagacgct gctcctcgcc aaccccatca cgcgcctcct cgcgccgctg 480
ccgctctgcc ccaccgcgcg cctctccccc accgtcggcc tcgccgcggg acccacctcc 540
ttcatcgccg tcgttgccgg cgacgacctc gtgtccccct tcgcggtgaa gaacatctcc 600
gcggacacgt tcgtcgccga cgccgcctcc gtcccgccgt ccggtttctg ggcctcgagt 660
tccatcctgc cccgcctctc ctccctcgac ccccgcgccg gcatggcttt cgcctctgga 720
aggttctact gcatgagctc gtcgccgttc gcggtgcttg tgttcgacgt ggcaaccaac 780
gtgtggagca aggtgcagcc gccgatgagg aggttcctgc ggtcgccggc gctcgtggag 840
ctcggcggcg ggagggagcg cgaggcggtg gtggcgctgg tctccgccgt cgaaaagagc 900
cgcctcagcg tgccgcggag cgtgcgcgtg tggacgctgc gaggcgagca cggggctgct 960
gccggcggaa gcaacggcgg cggagcgtgg actgaggtgg cgcggatgcc acccgacgtg 1020
cacgcgcagt tcgcggcggc cgagggcggg cgcgggttcg agtgcgcggc gcacggcgac 1080
ttcgtggtgc tggcgccacg cgggcccgcg agccccgtgc tcgtgttcga ctcgcgccac 1140
gacgagtggc ggtgggcgcc gccgtgcccg tacccgtacc cgtacgccgc gggaggcgcg 1200
gggttcaggg tgttcgccta cgagccccgc cttgcgacgc cggccatcgg tctcctggac 1260
gccacggcgc cggcggcctt tttgcatggg atgcagggct ag 1302

Claims (8)

1.蛋白质或编码所述蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在如下（c1）-（c4）至少一种中的应用：
（c1）调控玉米的抗倒伏性；
（c2）调控玉米的茎秆弯曲强度；
（c3）调控玉米的茎秆纤维素含量；
（c4）调控玉米的茎秆木质素含量；
所述蛋白质，为如下（a1）-（a2）中任一种：
（a1）序列表中序列2所示的蛋白质；
（a2）在（a1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。
2.如下1）或2）所示的物质在如下（d1）-（d4）至少一种中的应用：
（d1）提高玉米的抗倒伏性；
（d2）增加玉米的茎秆弯曲强度；
（d3）增加玉米的茎秆纤维素含量；
（d4）增加玉米的茎秆木质素含量；
1）所示的物质为降低蛋白质含量或活性的物质；
2）所示的物质为抑制或降低编码所述蛋白质的核酸分子表达的物质；
所述蛋白质，为如下（a1）-（a2）中任一种：
（a1）序列表中序列2所示的蛋白质；
（a2）在（a1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为编码区为序列表中序列1或序列5所示的DNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：
所述降低蛋白质含量或活性是通过蛋白质编码基因进行基因编辑实现的；
所述1）或2）所示的物质均为抑制或降低所述核酸分子表达的CRISPR系统，所述系统包括表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体；
所述sgRNA1的靶序列为序列1第816-834位或序列3第793-811位；
所述sgRNA2的靶序列为序列1第876-894位或序列3第853-871位。
5.一种培育转基因玉米的方法，为如下1）或2）或3）：
1）所示的方法为降低目的玉米中蛋白质含量或活性，得到转基因玉米；
2）所示的方法为抑制或降低目的玉米中编码所述蛋白质的核酸分子表达，得到转基因玉米；
3）所示的方法为将权利要求4中所述表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体导入目的玉米，得到转基因玉米；
所述转基因玉米具有如下e1）-e4）至少一种表现：
e1）所述转基因玉米的抗倒伏性高于所述目的玉米；
e2）所述转基因玉米的茎秆弯曲强度高于所述目的玉米；
e3）所述转基因玉米的茎秆纤维素含量高于所述目的玉米；
e4）所述转基因玉米的茎秆木质素含量高于所述目的玉米；
所述蛋白质，为如下（a1）-（a2）中任一种：
（a1）序列表中序列2所示的蛋白质；
（a2）在（a1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述降低目的玉米中所述蛋白质含量或活性，或，所述抑制或降低目的玉米中所述核酸分子表达，为将抑制或降低所述核酸分子表达的CRISPR系统导入目的玉米；
所述核酸分子为编码区为序列表中序列1或序列5所示的DNA分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述系统包括表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体；
所述sgRNA1的靶序列为序列1第816-834位或序列3第793-811位；
所述sgRNA2的靶序列为序列1第876-894位或序列3第853-871位。
8.一种CRISPR系统，包括表达cas9蛋白和sgRNA的载体；
所述系统包括表达cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2的载体；
所述sgRNA1的靶序列为序列1第816-834位或序列3第793-811位；
所述sgRNA2的靶序列为序列1第876-894位或序列3第853-871位。
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