CN114657204B - 抑制pad1及其编码基因表达在调控植物耐逆性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抑制PAD1及其编码基因表达在调控植物耐逆性中的应用。本发明提供一种培育对盐碱敏感转基因植物的方法，为如下1)或2)或3)：1)为包括如下步骤：降低目的植物中蛋白质活性或含量，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；2)为包括如下步骤：抑制目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子的表达，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；3)为包括如下步骤：对目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；本发明采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术获得了盐碱敏感的植株。

Description

抑制PAD1及其编码基因表达在调控植物耐逆性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及抑制PAD1及其编码基因表达在调控植物耐逆性中的应用。
背景技术
盐碱胁迫对植物造成的危害在于盐碱化土壤中高浓度的Na+和过高的pH。随着植物细胞内盐离子的积累，将对细胞产生离子毒害效应，从而在多方面影响细胞发挥正常功能。在碱土环境中,除碱金属元素外的大部分金属元素都会形成不溶性盐,Na+作为自然界中含量最高的碱金属元素,则会富集在碱土中造成土壤的盐化。
土壤盐碱化趋势在世界范围内不断扩展，严重限制了农作物的生长，已经成为制约农业生产的重要因素。
随着分子生物学、基因组学、遗传学、生物化学以及基因编辑技术的快速发展，对植物抵抗盐碱胁迫的分子机制研究得以不断深入，许多新的基因或蛋白参与调控盐碱胁迫响应过程中。
发明内容
本发明一个目的是提供一种培育对盐碱敏感转基因植物的方法。
本发明提供的方法，为如下1)或2)或3)：
1)为包括如下步骤：降低目的植物中上述蛋白质活性或含量，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；
2)为包括如下步骤：抑制目的植物中上述DNA分子的表达，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；
3)为包括如下步骤：对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物。
所述蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)将序列表中序列2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐碱性相关的由其衍生的蛋白质；
(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物耐盐碱性相关的蛋白质。
上述方法中，所述降低目的植物中上述蛋白质活性或含量、所述抑制目的植物中上述DNA分子表达或所述对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中；
所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1的靶点为第299-317位,sgRNA2的靶点为序列3第721-739位；
2)表达所述sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9载体。
降低上述蛋白质活性或含量的物质在降低植物耐盐碱性或培育对盐碱敏感植物中的应用也是本发明保护的范围；
或，抑制上述DNA分子表达的物质在降低植物耐盐碱性或培育对盐碱敏感植物中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述物质为CRISPR/Cas9系统；
所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1的靶点为第299-317位,sgRNA2的靶点为序列3第721-739位；
2)表达所述sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9载体。
本发明另一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，命名为蛋白PAD1，来源于玉米，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；
(a2)将序列表中序列2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐碱性相关的由其衍生的蛋白质；
(a3)在(a1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(a4)来源于玉米且与(a1)具有98％以上同一性且与植物耐盐碱性相关的蛋白质。
标签具体如表1所示。
表1为标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA
编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子是如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的DNA分子：
(b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
(b2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b4)来源于玉米且与(b1)或(b2)限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌也是本发明保护的范围。
上述的蛋白质或上述DNA分子在调控植物耐盐碱性中的应用也是本发明保护的范围。
本发明还有一个目的是提供一种CRISPR/Cas9系统。
本发明提供的CRISPR/Cas9系统，其包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1的靶点为第299-317位,sgRNA2的靶点为序列3第721-739位；
2)表达所述sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9载体。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为禾本科植物；所述禾本科植物具体为玉米。
本发明的实验证明，PAD1 CRISPR株系与野生型B73-329相比较，CRISPR株系表现出显著的盐碱胁迫敏感性，降低PAD1蛋白含量获得盐碱胁迫敏感株系，利用该基因的负调控作用挖掘其耐盐碱性能。
附图说明
图1为玉米野生型B73-329和PAD1CRISPR株系在含NaHCO3处理的土壤中的表型。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
下述实施例中，除特殊说明外，定量试验均设5个以上的重复实验。
玉米生态型为B73-329(以下称为野生型玉米)，记载在如下文献中：王芳,崔鹏娟,黄芸,王志文,王海峰,陈益芳.玉米磷吸收和再分配的分子机制[A],2018全国植物生物学大会论文集[C],2018年。
农杆菌菌株是EHA105。
CRISPR/Cas9载体pBUE411，记载在如下文献中：Xing HL,Dong L,Wang ZP,ZhangHY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327；A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants。
主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Takara公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。
实施例1、PAD1基因的获得及CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建和检测
一、PAD1基因的获得
利用CRISPR/Cas9技术从玉米(Zea mays L.)B73-329基因组中定向突变了PAD1基因。
玉米PAD1基因的CDS如序列表中序列1所示，基因组序列为3，其编码蛋白的氨基酸序列为序列2。
二、用于基因编辑PAD1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
用于基因编辑PAD1基因的CRISPR载体pBCXUN-PAD1 CRISPR-Cas9，该载体表达2个sgRNA：sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1识别区的编码序列为序列3第299-317位，sgRNA2识别区的编码序列为序列3第721-739位。
选取PAD1基因中2段作为该基因的靶点，设计包含靶点信息的引物:
靶点1：GACGACGGTGTCGACACCG
靶点2：TGTACCAGACTGACCCCTC
根据靶点设计出的序列分别合成单链寡核苷酸，合成方法如下：
CAUC-BsF:ATATATGGTCTCTGGCGTGTACCAGACTGACCCCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
CAUC-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACCGCTGTACCAGACTGACCCCGCTTCTTGGTGCC
该载体按照如下方法制备：
(1)PCR扩增：pCBC-MT1T2(记载在如下文献中：Xing,HL.,Dong,L.,Wang,ZP.etal.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.BMC PlantBiol 14,327(2014).)为模板，CAUC-BsF和CAUC-BsR为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物。
(2)酶切：
将上述PCR产物和pBUE411载体(该载体含有3×FLAG-NLS-zCas9-NLS表达系统和用于插入靶序列的gRNA支架)均用BsaI(NEB)酶切后，连接，得到连接产物，即为重组CRISPR载体pBCXUN-PAD1 CRISPR-Cas9，该载体表达2个sgRNA：sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1识别区的编码序列为序列3第299-317位，sgRNA2识别区的编码序列为序列3第721-739位。
(3)鉴定
取5μl步骤(2)得到的连接产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆，提取质粒送去测序。
测序结果显示，阳性克隆的质粒为重组CRISPR载体pBCXUN-PAD1 CRISPR-Cas9，该载体表达2个sgRNA：sgRNA1和sgRNA2,sgRNA1识别区的编码序列为序列3第299-317位，sgRNA2识别区的编码序列为序列3第721-739位。
实施例2、PAD1基因CRISPR-Cas9植物及表型鉴定
一、PAD1基因CRISPR-Cas9植物的构建
将实施例1中构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体pBCXUN-PAD1 CRISPR-Cas9突变质粒通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆，命名为EHA105/pBCXUN-PAD1 CRISPR-Cas9。
将鉴定正确的农杆菌EHA105/pBCXUN-PAD1 CRISPR-Cas9单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD600在0.8-1.0之间。
将重组菌EHA105/pBCXUN-PAD1 CRISPR-Cas9采用农杆菌介导法转入硬秆自交系B73-329以下也称为野生型玉米)，B73-329的幼胚进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代转化苗。构建方法参考：Zhang et al.The genetic architectureof nodal root number in maize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018。
提取T0代转化苗的DNA作为模板进行PCR扩增并测序，以B73-329玉米为对照。
测序结果表明，与野生型玉米B73-329相比，T0代转化苗的PAD1基因移码，导致蛋白序列改变，停止翻译，蛋白功能被破坏。
将含有该突变形式的转化苗命名为阳性T0代CRISPR-Cas9突变玉米。
阳性T0代CRISPR-Cas9突变玉米培育获得T2代CRISPR-Cas9突变玉米。
二、PAD1基因CRISPR-Cas9突变玉米盐碱处理表型检测
在不含营养土的纯蛭石中播种T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-1种子、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-2种子、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-3种子和野生型玉米B73-329种子，用1/2的Hoagland's营养液浇灌，玉米生长约7天后达到三叶期；
再浇灌含100mM NaHCO3(盐碱胁迫)的1/2的Hoagland's营养液，每7天浇灌一次，每次每盆浇灌两升，培养30天，然后观察拍照并统计株高、存活率。每个株系30株。
结果如图1所示，从左往右依次为野生型玉米B73-329、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-1、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-2和T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-3；在100mM NaHCO3处理的条件下，PAD1 CRISPR株系表现出比野生型B73-329更敏感的盐碱性，叶片较黄，株高更矮。
对盐碱胁迫后培养30天的植株株高进行检测并统计，发现，与野生型玉米相比，T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-1株高降低了20％、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-2株高降低了25％、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-3株高降低了35％。
浇灌含100mM NaHCO3(盐碱胁迫)的1/2的Hoagland's营养液的玉米各株系生长约50天统计各株系的存活率(存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)，可以看出，T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-1的存活率为32％、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-2的存活率为30％、T2代CRISPR-Cas9突变玉米CRISPR-3的存活率为25％；野生型玉米盐碱处理后的存活率为83％。
因此，抑制PAD1蛋白表达或者敲除PAD1基因能够降低玉米耐盐性，PAD1正调控植物抗盐碱性。
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业大学
<120>抑制PAD1及其编码基因表达在调控植物耐逆性中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> Zea mays L.
<400> 1
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Leu Phe Gln Val Glu Tyr Ala Leu Glu Ala Val Arg Lys Gly Asn Ala
20 25 30
Ala Val Gly Val Arg Gly Val Asp Thr Val Val Leu Gly Val Glu Lys
35 40 45
Lys Ser Thr Pro Lys Leu Gln Asp Ser Arg Ser Val Arg Lys Ile Ala
50 55 60
Ser Leu Asp Thr His Ile Ala Leu Ala Cys Ala Gly Leu Lys Ala Asp
65 70 75 80
Ala Arg Val Leu Ile Asn Arg Ala Arg Val Glu Cys Gln Ser His Arg
85 90 95
Leu Thr Val Glu Asp Pro Val Thr Val Glu Tyr Ile Thr Arg Tyr Ile
100 105 110
Ala Gly Leu Gln Gln Lys Tyr Thr Gln Ser Gly Gly Val Arg Pro Phe
115 120 125
Gly Leu Ser Thr Leu Ile Val Gly Phe Asp Pro Tyr Thr Gln Lys Pro
130 135 140
Ala Leu Tyr Gln Thr Asp Pro Ser Gly Thr Phe Ser Ala Trp Lys Ala
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Asn Ala Thr Gly Arg Asn Ser Asn Ser Met Arg Glu Phe Leu Glu Lys
165 170 175
Asn Tyr Lys Glu Thr Ser Gly Lys Glu Thr Ile Lys Leu Ala Ile Arg
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Ala Lys Lys Gly Ala Pro Lys Gly Asn
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<212> DNA
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ctatggcata ttttatttta gaggctctga caatctgctt ttaatatggt tttcaccaat 1740
ataccttata attcataagt tgttaaaaaa gaattttatg taagctcatt tttgttcttg 1800
gtttctgttt tctatattgg aaattgttca attgacccaa agctttcacc tctaggtcat 1860
gaagaatttg cccctctacg ttatcctctt ctagcttact ttcttttttt aatgaactat 1920
ttttggctca attgttctga ttgaaccttc aactgtattt ggtggcaatg attgaccatc 1980
tataatctct aggttgttga gagtggtggc aagaacatag agattgcagt gatgacacac 2040
gaggacggcc ttcatgaact cgaagaggct gagattgatg agtatgttgc cgaaattgaa 2100
gcagagaaag ccgctgccga ggctgcaaag aagggtgcac caaaggggaa ctgattccgc 2160
acaagcttag attgcgcctc ttgttccaga gcatgtctta tgattcacct cttagatgat 2220
tgcccggatg tttggataca ggaatattta taaaaaaaat taagatgaag ccgcttggat 2280
gaaaacatgc tatgtgatgc atagtattgc aataccatgg tggtttgttg tgtgacttgt 2340
cgcagtggtc tcttgatctg tcagtattat tttctggaac ctgtcagtat tattttctgg 2400
aacctggatg ctactcgatt aagagccttg tgttgttggt attgt 2445

Claims (5)

1.一种培育对盐碱敏感转基因植物的方法，为如下1)或2)或3)：
1)为包括如下步骤：降低目的植物中蛋白质活性或含量，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；
2)为包括如下步骤：抑制目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子的表达，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；
3)为包括如下步骤：对目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到耐盐碱性低于所述目的植物的转基因植物；
所述蛋白质是序列表中序列2所示的蛋白质；
所述植物为玉米。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述降低目的植物中所述蛋白质活性或含量、所述抑制目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子表达或所述对目的植物中编码所述蛋白质的DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中；
所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1的靶点为序列3第299-317位,所述sgRNA2的靶点为序列3第721-739位；
2)表达sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9载体；
所述sgRNA1的靶点为序列3第299-317位,所述sgRNA2的靶点为序列3第721-739位。
3.降低蛋白质活性或含量的物质在降低植物耐盐碱性或培育对盐碱敏感植物中的应用；
或，抑制编码所述蛋白质的DNA分子表达的物质在降低植物耐盐碱性或培育对盐碱敏感植物中的应用；
所述蛋白质是序列表中序列2所示的蛋白质；
所述物质为CRISPR/Cas9系统；
所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1的靶点为序列3第299-317位,所述sgRNA2的靶点为序列3第721-739位；
2)表达sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9载体；
所述sgRNA1的靶点为序列3第299-317位,所述sgRNA2的靶点为序列3第721-739位；
所述植物为玉米。
4.序列表中序列2所示的蛋白质或编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA分子在调控植物耐盐碱性中的应用；
所述调控为负调控，即降低序列表中序列2所示蛋白质活性或含量以降低植物耐盐碱性，或，抑制编码序列表中序列2所示蛋白质的DNA分子的表达以降低植物耐盐碱性；
所述植物为玉米。
5.一种用于编辑序列2所示蛋白的编码基因的CRISPR/Cas9系统，其包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1的靶点为序列3第299-317位,所述sgRNA2的靶点为序列3第721-739位；
2)表达sgRNA1和sgRNA2的CRISPR/Cas9载体；
所述sgRNA1的靶点为序列3第299-317位,所述sgRNA2的靶点为序列3第721-739位。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Overexpression of PAD1 and FDC1 results in significant cinnamic acid decarboxylase activity in Saccharomyces cerevisiae;Peter Richard 等人;《AMB Express》;20151231;第1-5页 *
Proteasome subunit alpha type [Zea mays];AQK58961.1;《GenBank》;20170206;序列及相关信息 *

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