WO2011047607A1 - 植物耐逆性相关蛋白GmSIK1及其编码基因与应用 - Google Patents

植物耐逆性相关蛋白GmSIK1及其编码基因与应用 Download PDF

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WO2011047607A1
WO2011047607A1 PCT/CN2010/077770 CN2010077770W WO2011047607A1 WO 2011047607 A1 WO2011047607 A1 WO 2011047607A1 CN 2010077770 W CN2010077770 W CN 2010077770W WO 2011047607 A1 WO2011047607 A1 WO 2011047607A1
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gene
plant
primer
protein
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陈受宜
张劲松
刘鹏
张万科
何锶洁
林晴
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中国科学院遗传与发育生物学研究所
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Definitions

  • the invention relates to a plant stress tolerance related protein GmSIK1 and a coding gene thereof and application thereof, in particular to a soybean stress tolerance related protein GmSIK1 and a coding gene thereof and application thereof.
  • the growth and development of plants are closely related to the external environment.
  • the growth and development stages of plants are subject to various stresses, including biotic and abiotic stresses.
  • Abiotic stresses such as drought, salting, and low temperature are important factors that restrict plant growth and reduce crop yield and quality.
  • the loss of crop yields caused by abiotic stress reduces the average yield of the world's major crops.
  • plants After a long evolutionary process, plants have mechanisms to adapt to different adversities. One of the important mechanisms is to induce the expression of related genes.
  • Genes involved in abiotic stress responses can be divided into two broad categories, one is a functional gene that encodes effector proteins that directly protect plant cells from stress, such as enzymes involved in biosynthetic permeation protectants, late embryos. Enriched proteins (LEA), antifreeze proteins, chaperones, detoxification proteins, aquaporins, etc.; the other are regulatory genes whose products regulate plant gene expression and signaling in abiotic stress responses, including transcription Factors, protein kinases and related enzymes involved in phosphoinositide metabolism.
  • Receptor-like kinases are the largest family of genes in the family of plant protein kinases. Plant receptor-like kinases and cytoplasmic kinases belong to the receptor-like kinase gene family. The receptor-like kinase family is classified according to the phylogenetic relationship of its member kinase domains. Currently, the full-length receptor-like kinase gene has been cloned in more than 20 flowering plants. Plant receptor-like kinases can be divided into two broad categories according to their functions. One is to participate in the regulation of the growth and development of plant bodies under normal growth conditions. The other type is involved in stress response and plant-microbe interactions.
  • GmSIKl Stress Inducible Kinase 1
  • Sequence 2 in the sequence listing consists of 714 amino acid residues, including a signal peptide (amino acid residues 1 to 33 from the amino terminus) and three transmembrane regions (from the amino terminus 5 to 27, 294 to 313, respectively). 333 to 355 amino acid residues) and the intracellular kinase domain (amino acid residues 392 to 662 from the amino terminus).
  • a typical feature of a receptor-like kinase structure The receptor-like kinase family can be divided into different subfamilies according to the evolutionary relationship of the kinase domain. According to this classification method, GmSIK1 belongs to the LRK-10L subfamily, and there is no known domain outside the cell.
  • Substitution and/or deletion and/or addition of the one or more amino acid residues means substitution and/or deletion and/or addition at any position of the sequence of (a) or (b), preferably 1- Substitutions and/or deletions and/or additions of 20 amino acid residues, more preferably substitutions and/or deletions and/or additions of 1 to 15 amino acid residues, more preferably substitutions of 1 to 10 amino acid residues / or deletions and / or additions, most preferably substitutions and / or deletions and / or additions of 1-5 amino acid residues.
  • a label as shown in Table 1 may be attached to the N-terminus or C-terminus of the protein.
  • Poly-His 2-10 (usually 6 HHHHHH
  • the protein in (a), (b), (c) or (d) above may be artificially synthesized, or may be synthesized by first synthesizing the coding gene.
  • the gene encoding the protein in (c) or (d) above may be deleted by one or several amino acid residues of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and/or one or several base pairs may be performed.
  • Substitution, substitution and/or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of the above proteins are caused by naturally occurring mutations, and some are caused by artificial mutagenesis treatment.
  • the coding gene provided by the present invention may specifically be the gene shown in the following 1) or 2) or 3):
  • the defined DNA sequence has at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least A DNA molecule having 98% or at least 99% homology and encoding the plant stress tolerance related protein.
  • the specific hybridization conditions can be as follows: 50 ° C, hybridization in a mixed solution of 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5 M NaPO 4 and 1 mM EDTA, at 50 ° C, 2 X SSC, 0.1% SDS Intermediate rinse; also: 50 ° C, hybridization in a mixed solution of 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5 M NaPO 4 and 1 mM EDTA, at 50 ° C, 1 X SSC, 0.1% SDS Rinsing; also can be: 50 ° C, in a mixture of 7% sodium dodecyl sulphate (SDS), 0.5 M NaP0 4 and 1 mM EDTA, at 50 ° C, 0.5 X SSC, 0.1% SDS Rinsing; also: 50 ° C, hybridization in a mixed solution of 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.5 M NaP0 4 and 1 mM ED
  • the above specific hybridization conditions may also be carried out in a solution of 6 X SSC, 0.5% SDS at 65 ° C, and then washed once with 2 SSC, 0.1% SDS and 1 X SSC, 0.1% SDS.
  • Sequence 1 in the sequence listing consists of 2145 deoxyribonucleotides.
  • a recombinant vector, recombinant strain, transgenic cell line or expression cassette containing any of the above-described coding genes is also within the scope of the present invention.
  • the recombinant expression vector can be obtained by inserting a deoxynucleotide at position 1-2145 from the 5' end of sequence 1 in the sequence 1 between the BamHI and Kpnl sites of pBin438.
  • a recombinant expression vector containing the GmSIK1 gene can be constructed using an existing plant expression vector.
  • the plant expression vector includes a dual Agrobacterium vector and a vector which can be used for plant microprojectile bombardment and the like.
  • the plant expression vector may further comprise a 3, untranslated region of the foreign gene, i.e., comprising a polyadenylation signal and any other DNA fragment involved in mRNA processing or gene expression.
  • the polyadenylation signal can direct polyadenylation to the 3' end of the mRNA precursor, such as Agrobacterium tumefaciens-induced (Ti) plasmid genes (such as the rouge synthase Nos gene), plant genes (such as soybean storage)
  • Ti Agrobacterium tumefaciens-induced
  • the plant expression vector used can be processed, such as a gene encoding a color-changing enzyme or a luminescent compound (GUS gene, luciferase) which can be expressed in plants.
  • GUS gene luminescent compound
  • Genes, etc. resistant antibiotic markers (gentamicin markers, kanamycin markers, etc.) or anti-chemical marker genes (such as anti-tuberculosis genes). From the safety of transgenic plants, the transformed plants can be directly screened by adversity without any selectable marker genes.
  • a primer pair that amplifies the full length of any of the above-described coding genes or any fragment thereof is also within the scope of the present invention.
  • the primer pair may specifically be as follows 1), 2) or 3) or 4):
  • sequence of one primer is shown in sequence 3 in the sequence listing, and the sequence of the other primer is as shown in sequence 4 in the sequence listing;
  • this primer is a primer for amplifying a partial fragment of the gene;
  • the sequence of one primer is shown in sequence 5 in the sequence listing, and the sequence of the other primer is shown in sequence 6 in the sequence listing.
  • This primer is a primer that amplifies a partial fragment of the gene.
  • a final object of the present invention is to provide a method of cultivating a stress-tolerant plant.
  • the method for cultivating a stress-tolerant plant according to the present invention is to introduce a coding gene of any of the above into a plant, and to cultivate and obtain a stress-tolerant plant.
  • the use of any of the above proteins or the coding gene of any of the above for the cultivation of a stress-tolerant plant is also within the scope of the present invention.
  • the stress tolerance is salt tolerant and/or drought tolerant;
  • the plant is a dicotyledonous plant, preferably soybean, alfalfa, hunger root or Arabidopsis thaliana.
  • a transformed cell, tissue or plant is understood to include not only the final product of the transformation process, but also its transgenic progeny.
  • coding sequences comprising single or double stranded DNA and RNA molecules, which may comprise one or more prokaryotic sequences, cDNA sequences, genomic DNA sequences comprising exons and introns , chemically synthesized DNA and RNA sequences, as well as sense and corresponding antisense strands.
  • the gene of the present invention can be introduced into a host by: inserting the gene of the present invention into an expression cassette, and introducing the expression cassette into the host through a plant expression vector, a non-pathogenic self-replicating virus or a bacterium.
  • An expression vector carrying the gene of the present invention can be transformed into a plant packet or tissue by conventional biological methods such as Ti plasmid, Ri plasmid, plant viral vector, direct DNA transformation, microinjection, conductance, Agrobacterium-mediated, and the like.
  • the stress tolerance may specifically be resistance to abiotic stress, such as salt tolerance and/or drought tolerance.
  • the plant may be a monocot or a dicot, including but not limited to corn, wheat, barley, rye, sweet potato, beans, peas, chicory, lettuce, kale, broccoli, Jasmine, turnip, radish, spinach, asparagus, onion, garlic, pepper, celery, winter squash, pumpkin, marijuana, zucchini, apple, pear, warm, melon, plum, cherry, peach, nectarine, apricot, Strawberry, Grape, Raspberry, Blackberry, Pineapple, avocado, Papaya, Mango, Banana, Soy, Tomato, Sorghum, Sugar cane, Beet, Sunflower, Rapeseed, Clover, Tobacco, Carrot, Cotton, Pestle, Rice, Potato , eggplant, cucumber, Arabidopsis and woody plants such as conifers and deciduous trees.
  • Particularly preferred are rice, wheat, barley, corn,
  • a plant that has been transferred to a gene of the present invention can be propagated in the species, and the gene can be transferred to other varieties of the same species, particularly in commercial varieties, by conventional breeding techniques.
  • the gene of the present invention can be modified on the basis of the sequence 1 and then introduced into the host to achieve a better expression effect: 1) In order to express the nucleotide sequence of the present invention in a transgenic plant, the nucleotide sequence of the present invention can be modified and optimized according to actual needs.
  • the codons encoded by the nucleotide sequences of the present invention can be altered to conform to plant preferences, while retaining the amino acids encoded by the nucleotide sequences of the present invention, depending on the codons preferred by the recipient plant.
  • the GC content may be 35%, preferably more than 45%. More preferably, it is more than 50%, and most preferably more than about 60%.
  • the gene sequence adjacent to the starting methionine can be modified. For example, modifications are made using efficient sequences known in plants.
  • the gene of the present invention is linked to a promoter expressed by various plants to facilitate its expression in plants.
  • promoters can include constitutive, inducible, temporal regulation, developmental regulation, chemical regulation, tissue-preferred, and tissue-specific promoters.
  • the choice of promoter will vary with the time and space requirements of expression, and also depends on the target species. For example, a tissue or organ specifically expresses a promoter depending on when the receptor is resistant to development. Although it has been demonstrated that many promoters derived from dicotyledons are functional in monocots, and vice versa, ideally dicotyledon promoters are selected for expression in dicots, monocots The promoter is used for expression in monocots.
  • Preferred constitutive promoters include the CaMV 35S and 19S promoters.
  • the promoter may also be a promoter derived from several actin genes expressed in most cell types.
  • Another preferred constitutive promoter is the ubiquitin promoter.
  • the above promoter may also be a promoter that directs expression in roots, pith, leaves or pollen, i.e., a tissue-specific promoter.
  • a tissue-specific promoter Cotton ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase promoter (U.S. Patent No. 6,040,504), rice sucrose synthase promoter (U.S. Patent No. 5,604,121), Night fragrant yellow leaf curl virus promoter (WO 01/73087) .
  • the chemically inducible promoter can be the Rab29A promoter (U.S. Patent No. 5,614,395). 4) Linking the gene of the present invention to a suitable transcription terminator can also increase the expression efficiency of the gene of the present invention.
  • a suitable transcription terminator For example, tml derived from CaMV, derived from E9 of rbcS. Any available terminator known to function in plants can be ligated to the genes of the invention.
  • Enhancer sequences can be introduced into the genes of the invention, such as intron sequences (e.g., derived from Adhl and bronzel) and viral leader sequences (e.g., derived from TMV, MCMV, and AMV).
  • intron sequences e.g., derived from Adhl and bronzel
  • viral leader sequences e.g., derived from TMV, MCMV, and AMV.
  • genes of the invention can also be targeted for cell targeting. This can be achieved using techniques available in the art. For example, a target gene sequence derived from a targeting organelle and the gene sequence of the present invention The columns are fused and then introduced into the plant cells to locate them.
  • the starting vector in the above recombinant vector can be selected depending on the transformation technique used and the characteristics of the target plant species.
  • the above selection can be embodied in the selection of resistance markers in the vector.
  • different antibiotic or herbicide selective markers may be preferred.
  • Selectable markers commonly used in transformation include genes that confer resistance to kanamycin and related antibiotics, tor genes that confer resistance to the herbicide phosphinothricin, and genes that confer resistance to the antibiotic hygromycin.
  • the nucleotide sequence of the invention is directly transformed into a plastid genome.
  • the main advantage of plastid transformation is that the plastid usually does not require substantial modification to express the bacterial gene, and the plastid expresses multiple open reading frames under the control of a single promoter.
  • the plastid expression in all thousands of circular plastid genome copies present in each plant cell by homologous recombination takes advantage of the fact that the copy number is much higher than that of the nuclear expression gene, so that the expression level can easily exceed the total 10% of the soluble plant protein.
  • the gene of the invention is inserted into a plastid targeting vector and transformed into the desired plant host plastid genome. A plant homologous to a plastid genome containing a nucleotide sequence of the present invention having a high level of expression of a nucleotide sequence is obtained.
  • the protein of the present invention and the gene encoding the same can significantly improve the salt tolerance and drought tolerance of the plant, and the plants transformed into the gene of the present invention have higher stress resistance than the plants not transferred into the gene of the present invention, such as transgenic plants.
  • the stress-tolerant related protein and the coding gene thereof of the present invention are important for cultivating a stress-tolerant plant variety, particularly for breeding a physiological stress such as drought-tolerant and/or salt-tolerant plant varieties, thereby increasing crop yield. Therefore, the protein of the present invention and its coding gene will have broad application prospects in the fields of breeding stress-resistant plants, crop breeding and the like.
  • Figure 1 shows the electrophoresis results of the fragments obtained by 5'-RACE (left) and 3'-RACE (right).
  • Figure 2 is a schematic view showing the structure of the GmSIK1 protein.
  • FIG. 3 shows the expression characteristics of the G S/f7 gene in different tissues and organs.
  • Figure 4 shows the expression characteristics of G S/f 7 gene under different stresses.
  • Figure 5 is a schematic representation of the plant overexpression vector pBin438-G S/f 7 .
  • Figure 6 shows the detection of GmSIK1 highly expressed transgenic Lotus root RT-PCR.
  • the map shows the growth of the GmSIK1 gene under normal conditions.
  • Figure 8 shows the growth status and survival rate of GmSIK1 gene under salt stress.
  • Figure 9 shows the growth status and survival rate of GmSIK1 gene under drought stress. detailed description
  • pBIN438 vector Li Taitian, Ying Chuan, Qin Xiaofeng, et al. Research on highly efficient insect-resistant transgenic tobacco, Chinese Science (Series B), 1994, 24(3): 276-282.) (Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences) );
  • RT-PCR primers were designed by selecting 338 gene fragments with complete sequence to analyze their stress in salt, drought, cold and ABA treatment. The next response is J1 ⁇ 2. A gene fragment was screened and its expression was significantly induced by salt stress. Second, the acquisition of GmSIKl
  • the gene fragment obtained by EST splicing is 1315 bp
  • the gene-incorporated primers designed for 5'-RACE and 3'-RACE according to the 1315 bp sequence are as follows:
  • Primer 1 GmSD l-GSP: 5'- TAGACGTGTAGCTCAAAGAGCGCACCAA-3' (sequence 3);
  • Primer 2 GmSD l-NGSP: 5'- TGT GGG AAAGGC GTAGCC AGG GAT GTTT -3' (sequence 4).
  • Primer 3 GmSDCl-GSP: 5,-CCT CAC ACA GAG CAC TCA AGC CAA CAT TTC-3' (sequence 5);
  • Primer 4 GmSDCl-NGSP: 5'- ⁇ CAC ATG GAA GAG GTC TCG GAA GAGG-3' (SEQ ID NO: 6).
  • RNA was reversed to cDNA. 5
  • the RACE method was used to clone the 5' and 3' unknown sequences of the gene fragment, and the RACE was performed according to the SMART RACE (CLO TECH) kit. Proceed as follows:
  • 5'-RACE is: ⁇ ⁇ total RNA, primer 1 and primer 2 each 1 ⁇ 1, ⁇ SMART II oUgo primer ( ⁇ ) and 2 ⁇ 1 sterilized water.
  • 3 '-RACE is: ⁇ ⁇ Total RNA, Primer 3 and Primer 4 1 ⁇ 1, and 3 ⁇ 1 sterilized water.
  • PCR Jl was initiated on a Perkin-Elmer (PE) DNA Thermal Cycler 9600 with 5 x (94 ° C 30 s, 72 ° C 3 min), 5 (94 ° C 30 s, 70 ° C 30 s, 72 ° C 3 min), 25 (94 °C 5s, 68 °C 10s, 72 °C 2min).
  • the first amplified product was diluted 20-fold and used as a template for the second amplification.
  • Figure 1 shows the results of electrophoresis of fragments obtained by 5'-RACE and 3'-RACE, wherein 1: marker; 2: 5'-RACE obtained fragment; 3: 3'-RACE obtained fragment.
  • 5'-RACE yielded a single band of approximately 800 bp
  • 3'-RACE yielded a single band of approximately 350 bp.
  • Two fragments were recovered from the gel, purified and ligated into the pGEM-TEasy vector.
  • the sequence to be tested is spliced with a known sequence to obtain a splicing sequence S.
  • the end of PolyA is present at the end "f", and at the 3' end of the splicing sequence S, there is a PolyA sequence ⁇
  • the 5th end of the splicing sequence S has a signal peptide. From NCBIBLAST analysis.
  • the splicing sequence S is a ⁇ ! gene sequence.
  • the obtained GmSIK1 sequence was 2275 bp, wherein the 5' non-coding region was 43 bp, the 3' non-coding region was 87 bp, and the coding region was composed of 2145 glycosides. Its encoded protein contains 714 acids.
  • a pair of specific primers were designed based on the gene sequence as follows:
  • the leaf cDNA of soybean Nannong 1138-2 seedlings was used as a template for PCR amplification.
  • the PCR product was subjected to 0.8% agarose sword electrophoresis, and a band of about 2.7 kb was obtained, which was expected.
  • the fragment was recovered using agarose; I Cross Recovery Kit (TIANGEN).
  • the recovered fragment was ligated to pGEM-T Easy (Promega), and the ligated product was transformed into Bacillus subtilis DH5 competent cells according to the method of Cohen et al. (Proc Natl Acad Sci, 69: 2110), according to the carboxy group on the pGEM-T Easy carrier.
  • the pGEM-T Easy vector having the gene shown in SEQ ID NO: 1 was named pTE ⁇ GmSIKl.
  • the GmSDCl protein was composed of 714; the domain of the protein was predicted by SMART software, indicating that the GmSDCl protein encapsulated the peptide (from the 1st to the 33rd JJ» base), and the three transmembrane regions (respectively from the basal end 5 to 27, 294 to 313, 333 to 355 ttl ⁇ tt) and the intracellular kinase domain (from terminal 392 to 662 ⁇ ittl ⁇ tt) have typical characteristics of receptor-like kinase structures.
  • the receptor-like kinase family can be divided into different subfamilies according to the evolutionary relationship of the kinase domain. 4 According to this classification method, GmSDCl belongs to the LRK-10L subfamily, and its The domain ( Figure 2).
  • the primers were: 5,-AAC CTC CTC CTCATC GTACT -3' (sequence 9) and 5,-GAC AGCATC AGC CAT GTT CA-3' (sequence 10).
  • Fig. 3 The expression characteristics of Qw57f 7 gene in different tissues and organs are shown in Fig. 3. Among them, 1: root; 2: stem; 3: flower; 4: leaf; 5: pod. It was shown that G is strongly expressed in leaves and weakly expressed in other tissues and organs.
  • Soybean Nannong 1138-2[G/_yd «e max (L.) Merr] was sown in pots filled with vermiculite, grown for 2 weeks (5-6 true leaves were grown) and seedlings were taken as follows Stress:
  • Abscisic acid (ABA) treatment complete root; 3 ⁇ 4 ⁇ ABA solution; 2) ⁇
  • Primers were: 5'-AAC CTC CTC CTCATC GTACT -3' (sequence 9) and 5'-GAC AGCATC AGC CAT GTT CA-3' (sequence 10).
  • GmSIK1 gene under different stresses are shown in Fig. 4.
  • A shedding ⁇ t rational
  • B water 3 ⁇ 4 (SA) treatment
  • C drought threat i ⁇ t rational
  • D ⁇ threatening i ⁇ t rational
  • E salt threat i ⁇ t rational
  • F control.
  • the GmSK1 gene was excised from the recombinant vector pTE-Qw57f7 with the restriction enzymes egH and I, and inserted into the 'wH I and Kpn I sites of the pBIN438 vector to make the gene of interest in the dual CAMV35S promoter and The expression is guided by the ⁇ sequence, and the recombinant plasmid obtained by correctly inserting the gene GmSIK1 is named The structure of the recombinant vector is shown in Figure 5. Knife and sequencing confirmed that the orientation and sequence of the inserted gene GmSK1 in the constructed recombinant vector pBIN438-QwS ⁇ 7 were correct.
  • the pBIN438-QwS ⁇ 7 was transformed into the Agrobacterium GV3101 strain by electroporation.
  • Agrobacterium transformed into recombinant vector pBIN438-Ow57 7 was transformed into Leo ( lotus corniculatus L. X)
  • the transformation method is as follows: Take the stem section of the sterile seedling with good growth state, infect it with Agrobacterium for 20-30 min, transfer to induction medium, and raise for 25 days. Then, the cells were transferred to MS for culture for 30 days, and then changed to the MS screening medium of kanamycin 80 mg/mL. The selected anti-strains are induced to root, moved to the greenhouse, and moved to the farm when the season is appropriate. A total of 70 resistant strains were obtained by screening.
  • MS culture ⁇ purchased from Qingdao Gaokeyuan Sea 3 ⁇ 4 objects 3 ⁇ 4 ⁇ [7 ⁇ Division, Brand: Qingdao; Model: HB8469.
  • composition of the induction medium Sugar was added to the MS medium to a concentration of 30 g L, naphthaleneacetic acid (NAA) and 6-benzylhydrazine (BAP), and the concentration of naphthaleneacetic acid (NAA) in the induction medium was 0.5 mg L, The concentration of BAP in the induction medium is 0.5 mg L;
  • Composition of MS screening medium BAP, cephalosporin and kanamycin were added to MS medium; the concentration of BAP in MS screening medium was 0.2 mg L, and the concentration of ceftin in MS screening medium was rich. ⁇ 500mg L, the screening agent kanamycin in MS screening medium concentrated 50mg L;
  • the transposon vector pBIN438 was transformed into the radix chinensis as a control strain (recorded CK (CK)), and the method was prepared in the same manner as the transgenic plants.
  • RT-PCR identified the above 70 # ⁇ t'l ⁇ Zhu (the 70 lines were deuterated), and the RT-PCR method was as follows: The leaves of the ear were extracted from the leaves, RNA was extracted, and then RT-PCR was performed. as follows:
  • the 1# strain, the 2# strain, the 3# strain and the empty vector control plant (CK) grown in Daejeon were taken from the fresh-born side of 13-15 cm long, and the apricot was raised in the bottle. Young roots.
  • the method of cultivating the side branch water of the radix chinensis cutting the side branches of the eye-like position, and immersing in the water for seven days to grow the radicle.
  • the growth conditions of the 1 # strain, 2 # strain, 3 # strain and the empty vector control plant were carried out as follows.
  • Survival rate number of surviving plantations/10 strain X 100%.
  • CK and control both indicate the control group, 1, 2, and 3 respectively indicate 1# strain, 2# strain, and 3# strain
  • A is a phenotypic photograph of the salt treated 24 plants; Panel B shows a comparison of plant survival rates.
  • Soluble with PEG to ⁇ ⁇ to soil arid ring PEG acts as a osmotic adjustment substance, and does not pass through the cell wall to the cells, producing a texture similar to soil drought.
  • Three transgenic lines (1# strain, 2# strain, 3# strain) grown in the field were transplanted into the empty vector control plant (CK), and taken 13-15 cm long. The newborn side is 3 ⁇ 4 ⁇ dry, placed in a bottle of apricot, seven ⁇ ⁇ grow out of the root. Place the baby in a 3 ⁇ 4 v40% PEG solution, 1 and photograph. Then 'fe was watered for 5 days, phenotype and photographed, and survival statistics were also performed. A total of three replicates were performed in the experiment, and each strain was repeated 10 times each time, and the total data was the mean standard deviation of three replicate experiments.
  • survival ⁇ survival is straight # ⁇ /10 strain X 100%.
  • Fig. 9 both CK and control indicate the control group, 1, 2, and 3 respectively indicate the 1# strain, 2# strain, and 3# strain
  • the map is PEG treatment for 1 day (top) and rehydration 5
  • the phenotypic photograph of the straight plant after the day (bottom); B is the comparison of the survival rate of the plant.

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Description

植物耐逆性相关蛋白 GmSIKl及其编码基因与应用 技术领域
本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白 GmSIKl及其编码基因与应用，特 别是来源于大豆的耐逆性相关蛋白 GmSIKl及其编码基因与应用。 背景技术
植物的生长发育与外界环境密切相关，植物的各个生长发育阶段都会经 受各种逆境胁迫， 包括生物胁迫和非生物胁迫。 非生物胁迫如干旱、 盐渍、 低温等是制约植物生长、降低农作物产量与质量的重要因素。在农业生产中， 由非生物胁迫造成的作物产量的损失使得全球主要农作物的平均产量减少
50%以上。 经过漫长的进化过程， 植物具备了适应不同逆境的机制。 其中重 要的机制之一就是诱导相关基因的表达。 参与非生物胁迫应答的基因通常可 分为两大类， 一类是功能性基因， 它们编码那些直接保护植物细胞免受逆境 伤害的效应蛋白， 如生物合成渗透保护剂涉及的酶类、 晚期胚胎富集蛋白 ( LEA ), 抗冻蛋白、 伴侣蛋白、 解毒蛋白、 水孔蛋白等； 另一类则是调控基 因， 它们的产物调控植物在非生物胁迫反应中的基因表达和信号传递， 包括 转录因子、 蛋白激酶和参与磷酸肌醇代谢的相关酶类。
受体类激酶是植物蛋白激酶家族中最大的一个基因家族。植物受体类激 酶和胞质激酶同属于受体类激酶基因家族。 受体类激酶家族是根据其各成员 激酶结构域的系统进化关系进行分类的。 目前， 已在超过 20种开花植物中克 隆到全长的受体类激酶基因。 植物受体类激酶按其功能可分为两大类。 一类 为在正常生长情况下， 参与调控植物体的生长发育过程。 另一类为参与逆境 胁迫应答和植物与微生物的相互作用。
认识植物中逆境胁迫信号的传递过程是了解与调控植物耐逆性的关键， 而蛋白激酶尤其是受体类激酶在信号传递过程中起着关键的作用， 但是由于 对植物受体类激酶的认识较晚， 有关它作用机制的资料还相当缺乏。 因此， 研究受体类激酶的耐逆机制， 具有重要的理论意义。
大豆作为最重要的油料作物和植物蛋白质的主要来源，提高其耐逆性具 有重要的理论及现实意义。 发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植物耐逆性相关的蛋白及其编码基因。 本发明所提供的蛋白， 名称为 GmSIKl (Stress Inducible Kinase 1), 来源 于大豆， 具体为如下 （a ) 、 ( b ) 、 (c)或 （d )所示的蛋白：
( a )序列表中序列 2所示的 酸序列自 N端起第 34-714位氨基酸残 基组成的蛋白质；
( b ) 由序列表中序列 2所示的 酸序列组成的蛋白质；
(c)将序列表中序列 2 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和 /或缺失和 /或添加且与植物耐逆性相关的由 （a )衍生的蛋白质；
( d ) 由与序列表中序列 2所示的 酸序列至少具有 75%、 至少具有
80%、 至少具有 85%、 至少具有 90%、 至少具有 95%、 至少具有 96%、 至少 具有 97%、至少具有 98%或至少具有 99%同源性的氨基酸序列组成的且与植 物耐逆性相关的蛋白质。
序列表中的序列 2由 714个氨基酸残基组成， 包含信号肽（自氨基末端 第 1至 33位氨基酸残基 ) , 3个跨膜区 (分别自氨基末端第 5至 27、 294至 313、 333至 355位氨基酸残基）和胞内激酶结构域（自氨基末端第 392至 662 位氨基酸残基） 。 具有受体类激酶结构的典型特征。 受体类激酶家族根据激 酶结构域的进化关系可分为不同的亚家族，按照这种分类方法， GmSIKl属 于 LRK-10L亚家族， 其胞外没有已知的结构域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和 /或添加是指在（ a )或（ b ) 所述序列的任何位置进行取代和 /或缺失和 /或添加， 优选为 1-20个氨基酸残 基的取代和 /或缺失和 /或添加， 更优选为 1-15个氨基酸残基的取代和 /或缺失 和 /或添加， 更优选为 1-10个氨基酸残基的取代和 /或缺失和 /或添加， 最优选 为 1-5个氨基酸残基的取代和 /或缺失和 /或添加。
为了使（a ) 、 ( b ) 、 (c)或（d )的蛋白便于纯化， 可在所述蛋白的 N 端或 C端连接上如表 1所示的标签。
表 1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为 5个 ) RRRRR
Poly-His 2-10 (通常为 6 HHHHHH
个） FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（a) 、 （b) 、 （c)或（d) 中的蛋白可人工合成， 也可先合成其编 码基因， 再进行生物表达得到。 上述 (c)或（d) 中的蛋白的编码基因可通过 将序列表中序列 1所示的 DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和 /或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和 /或在其 5'端和 /或 3'端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。
上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、 替换和 /或添 加， 有的是由于自然发生的变异引起的， 有的是由人工诱变处理引起。
本发明所提供的编码基因具体可为如下 1)或 2)或 3)所示的基因：
1 )序列表中序列 1所示的 DNA分子；
2 )在严格条件下与 1 )限定的 DNA分子特异性杂交且编码所述植物耐 逆性相关蛋白的 DNA分子；
3 )与 1 ) 限定的 DNA序列至少具有 70%、 至少具有 75%、 至少具有 80%、 至少具有 85%、 至少具有 90%、 至少具有 95%、 至少具有 96%、 至 少具有 97%、 至少具有 98%或至少具有 99%同源性且编码所述植物耐逆性 相关蛋白的 DNA分子。
所述特异性杂交条件可为如下： 50°C, 在 7%十二烷基硫酸钠（SDS) 、 0.5MNaPO4和 ImMEDTA的混合溶液中杂交，在 50 °C, 2 X SSC, 0.1% SDS 中漂洗； 还可为： 50°C, 在 7%十二烷基硫酸钠 (SDS) 、 0.5M NaPO4和 ImM EDTA的混合溶液中杂交， 在 50°C, 1 X SSC, 0.1% SDS中漂洗； 还 可为： 50°C , 在 7 %十二烷基石克酸钠 (SDS) 、 0.5M NaP04和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交， 在 50°C, 0.5 X SSC, 0.1%SDS中漂洗； 还可为： 50°C, 在 7 %十二烷基硫酸钠 ( SDS ) 、 0.5M NaP04和 ImM EDTA的混合溶液中 杂交， 在 50°C, 0.1 X SSC, 0.1% SDS中漂洗； 还可为： 50 °C, 在 7%十二 烷基硫酸钠 ( SDS )、 0.5M NaP04和 ImM EDTA的混合溶液中杂交，在 65 °C , 0.1 X SSC, 0.1% SDS中漂洗。
上述特异性杂交条件也可为在 6 X SSC, 0.5% SDS的溶液中， 在 65°C 下杂交,然后用 2 SSC,0.1% SDS和 1 X SSC,0.1% SDS各洗膜一次。
序列表中的序列 1由 2145个脱氧核糖核苷酸组成。 含有上述任一所述编码基因的重组载体、 重组菌、 转基因细胞系或表达 盒也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为在 pBin438的 BamHI和 Kpnl位点间插入自 序列表中序列 1的自 5'末端的第 1-2145位脱氧核苷酸得到的。
可用现有的植物表达载体构建含有 GmSIKl基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体 等。 所述植物表达载体还可包含外源基因的 3， 端非翻译区域， 即包含聚腺 苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的 DNA片段。 所述聚腺苷 酸信号可引导聚腺苷酸加入到 mRNA前体的 3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti) 质粒基因 (如胭脂合成酶 Nos基因）、 植物基因 （如大豆贮存蛋白基因） 3' 端 转录的非翻译区均具有类似功能。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达 载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化 合物的基因 （GUS基因、 萤光素酶基因等）、 具有抗性的抗生素标记物（庆 大霉素标记物、 卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因 （如抗除莠剂 基因）等。 从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标记基因， 直接 以逆境筛选转化植株。
扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明 的保护范围。
所述引物对具体可为如下 1 ) 、 2 )或 3 )或 4 ) :
1 )一条引物的序列如序列表中序列 7所示， 另一条引物的序列如序列 表中序列 8所示； 此引物是扩增基因全长的引物；
2 )一条引物的序列如序列表中序列 9所示， 另一条引物的序列如序列 表中序列 10所示； 此引物是扩增基因部分片段的引物；
3 )一条引物的序列如序列表中序列 3所示， 另一条引物的序列如序列 表中序列 4所示； 此引物是扩增基因部分片段的引物；
4 )一条引物的序列如序列表中序列 5所示， 另一条引物的序列如序列 表中序列 6所示。 此引物是扩增基因部分片段的引物。
本发明的最后一个目的是提供一种培育耐逆性植物的方法。
本发明所提供的培育耐逆性植物的方法，是向植物中导入上述任一所述 的编码基因， 培育， 得到耐逆性植物。 上述任一所述蛋白或上述任一所述的编码基因在培育耐逆性植物中的 应用也属于本发明的保护范围。
上述方法和应用中，所述耐逆性为耐盐和 /或耐干旱； 所述植物为双子叶 植物， 优选为大豆、 苜蓿、 百脉根或拟南芥。
转化的细胞、 组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物， 也包含 其转基因子代。
本发明中所述的 "多核苷酸" 、 "多核苷酸分子" 、 "多核苷酸序列" 、
"编码序列" 、 "开放阅读框 (ORF)" 等包括单链或双链的 DNA和 RNA分 子， 可包含一个或多个原核序列， cDNA序列， 包含外显子和内含子的基因 组 DNA序列， 化学合成的 DNA和 RNA序列， 以及有义和相应的反义链。
本发明基因可通过如下方式导入宿主中： 将本发明基因插入表达盒中， 再将表达盒通过植物表达载体、 非致病自我复制的病毒或弄杆菌导入宿主。 携带本发明基因的表达载体可通过使用 Ti质粒、 Ri质粒、 植物病毒载体、 直接 DNA转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导等常规生物学方法转化植物 细包或组织。
所述耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性， 如耐盐和 /或耐干旱。 上述任一所述方法和应用中， 所述植物可以是单子叶植物或双子叶植 物， 包括但不限于玉米， 小麦， 大麦， 黑麦， 甘薯， 豆， 豌豆， 菊苣， 莴苣， 甘蓝， 花椰菜， 花茎甘蓝， 芜菁， 萝卜， 菠菜， 芦笋， 洋葱， 大蒜， 胡椒， 芹菜， 笋瓜， 南瓜， 大麻， 夏南瓜， 苹果， 梨， 温梓， 瓜， 李子， 樱桃， 桃 子， 油桃， 杏， 草莓， 葡萄， 木莓， 黑莓， 菠萝， 鳄梨， 蕃木瓜， 芒果， 香 蕉， 大豆， 番茄， 高粱， 甘蔗， 甜菜， 向日葵， 菜籽油菜， 三叶草， 烟草， 胡萝卜， 棉花， 苜蓿， 稻， 马铃薯， 茄子， 黄瓜， 拟南芥属和木本植物如针 叶树和落叶树。 特别优选的是水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 燕麦、 黑麦、 百脉 根、 拟南芥、 黄瓜、 番茄、 杨树、 草坪草或苜宿。
转入本发明基因的植物， 可以在该物种中繁殖该基因， 也可用常规育种 技术将该基因转移进入相同物种的其它品种， 特别包括商业品种中。
转入本发明基因的植物中，会有相应的本发明的植物耐逆性相关蛋白的 生物合成， 进而使转入本发明基因的植物产生改良性状。
本发明的基因可以在序列 1的基础上进行以下修饰， 再导入宿主中， 以 达到更好的表达效果： 1 )为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列， 本发明核苷酸序列可 根据实际需要进行修饰和优化。 如可根据受体植物所偏爱的密码子， 在保持 本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱 性。 而且， 优化过程中， 最好能使优化后的编码序列中保持一定的 GC含量， 以最好地实现植物中导入基因的高水平表达， 其中 GC含量可为 35 % , 优选 为多于 45 % , 更优选为多于 50 % , 最优选多于约 60 %。
2 )为了翻译的有效起始， 可以修饰邻近起始曱硫氨酸的基因序列。 例 如， 利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。
3 )将本发明基因与各种植物表达的启动子连接， 以利于其在植物中的 表达。 所述启动子可包括组成型、 诱导型、 时序调节、 发育调节、 化学调节、 组织优选和组织特异性启动子。 启动子的选择将随着表达时间和空间需要而 变化， 而且也取决于靶物种。 例如组织或器官的特异性表达启动子， 根据需 要受体在发育的什么时期耐逆而定。 尽管证明了来源于双子叶植物的许多启 动子在单子叶植物中是可起作用的， 反之亦然， 但是理想地， 选择双子叶植 物启动子用于双子叶植物中的表达， 单子叶植物的启动子用于单子叶植物中 的表达。
优选的组成型启动子包括 CaMV 35S和 19S启动子。所述启动子还可为 来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中的启动子。 另一个优 选的组成型启动子为泛素启动子。
上述启动子还可为在根、 木髓、 叶或花粉中引导表达的启动子， 即组织 特异性启动子。 棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子 （美国专利 US 6,040,504 ) 、 水稻蔗糖合酶启动子（美国专利 US 5,604,121 ) 、 夜香树黄化 叶卷曲病毒启动子（WO 01/73087 ) 。
化学诱导型启动子可为 Rab29A启动子（美国专利 US 5,614,395 ) 。 4 )将本发明基因与适合的转录终止子连接， 也可以提高本发明基因的 表达效率。 例如来源于 CaMV的 tml, 来源于 rbcS的 E9。 任何已知在植物 中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
5 )可向本发明基因中引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于 Adhl 和 bronzel )和病毒前导序列 （例如来源于 TMV,MCMV和 AMV ) 。
在实际操作中， 也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。 可利用本领域 现有的技术实现。 例如， 将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序 列融合， 再导入植物细胞中， 就可定位了。
上述重组载体中的出发载体可根据所使用的转化技术及靶植物物种的 特性进行选择。 上述选择可体现在载体中的抗性标记的选择上。 对于一些靶 物种， 可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。 通常用在转化中的选择 性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的 基因，赋予对除草剂膦 丝菌素抗性的 tor基因，， 赋予对抗生素潮霉素抗性的 基因， 和赋予对 methatrexate抗性的 /r基因， 赋予对草甘磷抗性的 EPSPS基因， 和提供代 谢甘露糖能力的甘露糖 -6-磷酸异构酶基因。
在另一个优选的实施方式中， 将本发明的核苷酸序列直接转化到质体基 因组中。质体转化的主要优点是质体通常不需要实质修饰就能表达细菌基因， 并且质体能表达单启动子控制下的多个开放读框。 通过同源重组将基因插入 每个植物细胞中存在的所有几千个环形质体基因组拷贝中的质体表达利用了 拷贝数大大高于核表达基因的优势， 使得表达水平可以容易地超过总可溶植 物蛋白质的 10 %。 将本发明基因插入到质体靶向载体中， 并且转化进入期望 的植物宿主质体基因组中。 获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因组 而言属同质的植物， 该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。
实验证明， 本发明的蛋白及其编码基因能显著提高植株的耐盐性和耐旱 性， 转入本发明基因的植物的抗逆性明显高于未转入本发明基因的植物， 如 转基因百脉根， 经过高盐处理或干旱处理后， 转基因植物的恢复情况明显好 于未转基因百脉根， 且存活率都较对照组有显著提高。 本发明的耐逆性相关 蛋白及其编码基因对培育耐逆植物品种， 特别是培育耐 ^生物胁迫如耐干旱 和 /或耐盐植物品种， 从而提高农作物产量具有重要意义。 因此， 本发明蛋白 及其编码基因在培育抗逆性植物、 作物育种等领域中将有广阔的应用前景。 附图说明
图 1为 5'-RACE (左）和 3'-RACE (右）获得的片段的电泳结果。
图 2为 GmSIKl蛋白的结构示意图。
图 3为 G S/f7基因在不同组织器官中的表达特征。
图 4 为 G S/f 7基因在不同逆境胁迫下的表达特征。
图 5为植物过量表达载体 pBin438-G S/f 7示意图。
图 6为 GmSIKl高表达的转基因百脉根 RT-PCR检测。 图 Ί为转 GmSIKl基因百脉根正常条件下的生长情况。
图 8转 GmSIKl基因百脉根盐胁迫下的生长状况和存活率。
图 9为转 GmSIKl基因百脉根干旱胁迫下的生长状况和存活率。 具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
^[Glycine max (L.) Meir]南农 1138-2的种子，获耳 径： 植物，赠送； 直接 来源： 为非釆集方式， 获取时间为 1998年 6月，才是供者名称为南京^ k大学国家大 豆改良中心， 提供者联系方式为 025-84395331 , 提供者地址为中国南京玄武区卫岗
1号。 原始来源不清楚。
^[Glycine max (L.) Meir]南农 1138-2的种子 (罗庆云、於丙军、 刘友良, 大 豆苗期耐盐性鉴定指标的检验， 科学, 2001 20(3) ) (中国科学院遗传与发育生 物学研究所)；
pBIN438载体上（李太 田颖川,秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究， 中国 科学 (B辑), 1994,24(3):276-282.) (中国科学院遗传与发育生物学研究所)；
农杆菌 GV3101菌株"佘品三刘岚夏秀英 ,农杆菌介导东方百合 "西伯利亚" 遗传转化体系建立， 理工大学学报, 200848f5) ) (中国科学院遗传与发育生物 学研究所 )；
百^ ^艮（ oft^ co o^ft^ L. ) Leo的种子（关宁、 王涌鑫、 李聪、 苗丽宏、 张博，含石 MJJtt因植物表达载体的构建 ^于百 M艮的转化， ^^植物育种， 2009 年， 第 7卷， 第 2期， 第 257-263页）（中国科学院遗传与发育生物学研究所)。
实施例 1、 大豆耐逆' 1·生相关受体激酶基因 GmSIKl的筛选及其 cDNA的克隆 一、 GmSIKl的筛
^^基因组测序工作的完成为研究发现新的耐逆 因提供了有利 牛。根据 发明人测定的 3万条 EST序列和 GenBank下载的 28万多条序列 ^进行 EST聚类， 得到 56,147个单一基因 (imigenes),其中包括 32,278个重叠 ^(Contigs)和 23,869个单 拷贝序列 (singleton)。在拟南芥已有的单一基因 (imigenes)注释的^出上，对 的单 一基因 (imigenes)的功能进行分类注释。 根据已知的 受体类激酶序列与^ ^单一 基因 (imigenes)进行] ^于， 得到了 486个 ^^受体类激 美: ½因。 选择序列较完整 的 338个基因片段设计 RT-PCR引物，分析它们在盐、干旱、冷和 ABA处理等胁迫 下的应答 J½。 筛选得到一种基因片段， 其表达明显受盐胁迫的诱导。 二、 GmSIKl的获得
1、 Qw57f7拼接序列的获得
经 EST拼接得到的基因片段长度为 1315bp, 根据 1315bp序列设计用于 5'-RACE和 3'-RACE的基因嵌 异引物如下：
用于 5'-RACE基因特异引物：
引物 1： GmSD l-GSP: 5'- TAGACGTGTAGCTCAAAGAGCGCACCAA-3' (序 列 3 );
引物 2: GmSD l-NGSP: 5'- TGT GGG AAAGGC GTAGCC AGG GAT GTTT -3' (序列 4 )。
用于 3'-RACE基因特异引物：
引物 3: GmSDCl-GSP: 5，-CCT CAC ACA GAG CAC TCA AGC CAA CAT TTC-3' (序列 5 );
引物 4: GmSDCl-NGSP: 5'- ΑΓΤ CAC ATG GAA GAG GTC TCG GAA GAGG-3' (序列 6 )。
将大豆 max (L.) Meir]南农 1138-2种子置于培养 mi中，培养室中生长 2-3 周， 收集 lg新鲜叶片， 在液氮中研碎， 悬于 4mol/L硫氢酸胍中， 用酸性苯酚、 氯 仿^^是， 上清中力 水乙醇 定总 RNA。
将 RNA用逆转 ^^成 cDNA。釆用 RACE方法克隆基因片段的 5'和 3'端未 知序列， 乍依照 SMART RACE ( CLO TECH )试剂盒进行。 步骤如下：
1 )逆转录
5'-RACE为： Ιμΐ ^^总 RNA、 引物 1和引物 2各 1μ1、 Ιμΐ SMART II oUgo引 物（ΙΟμΜ )和 2μ1灭菌水。 3 '-RACE为： Ιμΐ ^^总 RNA、 引物 3和引物 4各 1μ1、 和 3μ1灭菌水。 混匀后， 70°C加热 2min, 置水上冷却 2min。 力口入 2μ1 5 χ緩冲液， Ιμΐ DTT ( 20Μ ), Ιμΐ dNTP ( 10M )和 Ιμΐ owerscript逆转 。 42 °C逆转录 90mins, 72°C加热 2min终止½。
2 ) PCR扩增
以通用引物混 勿 UPM和基因特异引物进行 "Touchdown" PCR扩增。 在 Perkin-Elmer(PE) DNA Thermal Cycler 9600启动 PCR Jl, 牛为： 5 x ( 94°C 30s,72°C 3min ), 5 ( 94°C 30s, 70 °C 30s, 72 °C 3min ),25 ( 94°C 5s, 68 °C 10s, 72 °C 2min )。 将第一次扩增的产物稀释 20倍后作为第二次扩增的模板。 图 1为 5'-RACE和 3'-RACE获得的片段的电泳结果， 其中， 1: marker; 2: 5'-RACE获得的片段； 3: 3'-RACE获得的片段。
5'-RACE得到约 800bp单一条带， 3'-RACE得到约 350bp的单一条带。从胶中 回收两个片段， 纯化后连接到 pGEM-TEasy载体进 ί则序。所测序列与已知序列进 行拼接， 获得拼接序列 S。
在成熟 mRNA 3，端 "f 存在 PolyA的尾巴， 在拼接序列 S的 3，端有 PolyA序 歹 |J。 经 SMART软件分析，拼接序列 S的 5，端有信号肽。 从 NCBIBLAST分析进行 s., 拼接序列 S为^!基因序列。
获得的 GmSIKl序列 2275bp, 其中 5'非编码区为 43bp, 3'非编码区为 87bp, 编码区由 2145个 糖核苷酉^且成。 其编码的蛋白含 714个 酸。
2、 G 57f7 cDNA的克隆
根据^基因序列设计一对特异引物如下：
引物 GmSIKi ~CGC GGATCCATG TGT GTC TTACTT CCT TCC-3' (序列 7 )和 GmSKlFR 5'-CGG GGTACC TCAAGAGTT GTT CTC CAG TG-3' (序列 8 ) 扩增出 2145bp GmSIKl全长基因。
以大豆南农 1138-2幼苗的叶片 cDNA为模板进行 PCR扩增,对 PCR产物进行 0.8%琼脂糖劍交电 佥测， 得到^^量约为 2.7kb的条带， 与预期结 目符。 用琼 脂糖; I交回收试剂盒（TIANGEN )回收该片段。 将该回收片段与 pGEM-T Easy (Promega )连接， 参照 Cohen等的方法（Proc Natl Acad Sci, 69:2110 ), 将连接产 物转化 ^杆菌 DH5 感受态细胞,根据 pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标 记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的 T7和 SP6 启动子序列为引物对其进 ¾苷 列测定。 测序结 明， 扩增到的基因的核苷 酉 列如序列表中序列 1所示，该基因由 2145个脱 亥糖核苷酉 成，该基因编码 的蛋白的 tt i^列如序列表中序列 2所示。 将序列 1 所示所示的基因命名为 GmSIKl ,将序列 2所示的蛋白命名为 GmSDCl , ^^有序列 1所示基因的 pGEM-T Easy载体命名为 pTE~GmSIKl。 GmSDCl蛋白由 714个 成； 用 SMART软 件预测该蛋白的结构域，表明， GmSDCl蛋白包^言号肽（自 末端第 1至 33位 JJ»基)， 3个跨膜区（分别自 基末端第 5至 27、 294至 313、 333至 355位 ttl^tt )和胞内激酶结构域 (自 末端第 392至 662 ^ittl^tt ),具有受 体类激酶结构的典型特征,。受体类激酶家族根据激酶结构域的进化关系可分为不同 的亚家族， 4要照这种分类方法， GmSDCl属于 LRK-10L亚家族， 其 卜没有已知 的结构域（图 2 )。
实施例 2、 GmSIKl在不同组织器官中的表达特征
分别提取两周龄^ ^南农 1138-2的幼苗的根、 茎、 叶和田间^ ^南农 1138-2 的花和豆荚的 RNA, RT-PCR分析 Qw57f7的表达量。 用 bM/ «基因作为对照， 引 物为： 5，-AAC CTC CTC CTCATC GTACT -3' (序列 9 )和 5，-GAC AGCATC AGC CAT GTT CA-3' (序列 10 )。
Qw57f 7基因在不同组织器官中的表达特征见图 3。 其中， 1: 根； 2: 茎； 3: 花； 4: 叶； 5: 豆荚。 结 明， G 在叶中表达很强， 在其它组织器官中表达较弱。
实施例 3、 不同逆 办迫下 QwS/^/基因的表达特征
将大豆南农 1138-2[G/_yd«e max (L.) Merr]播种于装满蛭石的花盆中， 生长 2个 星期（长出 5-6片真叶）后取幼苗进行如下胁 理：
1)脱落酸 (ABA )处理： 将根完全; ¾ ΙΟΟμΜ ABA溶液中； 2) ^|¾SA) 处理： 用 2mM 7j %酸喷洒幼苗的叶片； 3)干旱胁 理： 将 幼苗放置于室温 空气中干旱； 4 )低温（4°C )胁迫处理： 将根完全浸入水溶液中， 水溶液保持 4°C; 5 )盐胁 理： 将根完全; ¾ v200mMNaCl溶液中。 6 )对照： 将根完全; ¾ 水溶 液， 水溶液呆持室温。
经i 述各处?½, 进行光照培养， 分别在上述各种处理 0、 1、 3、 6、 12、 24 小时时取叶片， 提取 RNA, 用 bM/ «基因作为对照， RT-PCR分析 Qw57f7的表达 量。
引物为： 5'-AAC CTC CTC CTCATC GTACT -3' (序列 9 )和 5'-GAC AGCATC AGC CAT GTT CA-3' (序列 10 )。
GmSIKl基因在不同胁迫下的表达特征见图 4。 其中： A:脱落^ t理； B:水 ¾(SA)处理； C:干旱胁 i^t理； D: ^显胁 i^t理； E:盐胁 i^t理； F:对照。
结 明： 1 ) ABA处理： G 57f7的表达在 3小时时即至峰值， 然后下降； 2 )水杨酸处理： GmSIKl的表达 1小时即有升高， 之后下降至 24小时时猛增到高 峰； 3)旱胁迫： Qw57f7在胁迫 1小时时即明显升高， 至 12小时达到高峰， 24小 时略下降； 4) 显胁迫： GmSIKl的表达在 1小时升高至 3小时达到最大值，之后有 所降低，至 24小时回升； 5)盐胁迫： GmSIKl的表达自胁迫 1小时始明显逐步上升， 至 12小时 最高， 24小时 下降； 6 ) GmSIKl的表 i½加水对照组几无变化。 实施例 4、 转 GmSKl基因植株的获得和耐逆性鉴定
一、 QwS/^/表达载体 pBin438-QwS^7的构建
用限制性内切酶 fewH I和 Kpn I从重组载体 pTE-Qw57f7切下 GmSKl基因， 并将其正向插入 pBIN438载体的 &»wH I和 Kpn I位点,使目的基因在双 CAMV35S 启动子和 Ω序列引导下表达， 将正确插入基因 GmSIKl得到的重组质粒命名为
Figure imgf000013_0001
该重组载体的结构见图 5。 刀和测序验证， 结果表明构建的重 组载体 pBIN438-QwS^7中插入的基因 GmSKl的方向及序列正确。
二、 转 Qw57f7基因百月 艮的获得和耐逆性鉴定
1、 转 QwS^7基因百 M艮的获得
将 pBIN438-QwS^7用电转化的方法转入农杆菌 GV3101菌株中。用转入重组 载体 pBIN438-Ow57 7的农杆菌转化百 艮 Leo ( lotus corniculatusL. X
转化方法为： 取生长状态良好的无菌苗的茎节， 用农杆菌侵染 20-30min后， 转入诱导培养基， 25 养 3天。 然后转入 MS筛选培养 杏养 30天，再更换到 针那霉素 80mg/mL的 MS筛选培养基。筛选到的抗' 株经诱导生根,移到温室， 待到季节合适时移到农场。 共筛选获得 70株抗性株系。
MS培;^购自青岛高科园海 ¾物¾^[7 ^司 , 品牌： 青岛; 型号： HB8469。
诱导培养基的组成： 向 MS培养基中添加 糖至浓度为 30g L、 萘乙酸 (NAA) 和 6-苄 嘌呤 (BAP ), 萘乙酸 (NAA)在诱导培养基中的浓度为 0.5mg L, BAP在 诱导培养基中的浓度为 0.5mg L;
MS筛选培养基的组成： 向 MS培养基中添加 BAP、 头 素和卡那霉素得到 的； BAP在 MS筛选培养基中的浓度为 0.2mg L, 头孢審素在 MS筛选培养基中的 浓^ 500mg L, 筛选剂卡那霉素在 MS筛选培养基中的浓^ 50mg L;
同时， 将转空载体 pBIN438转化百脉根作为对照株系 （记怍（CK ) ), 方法同 转基因植株制备。
RT-PCR鉴定上述 70 #^t'l^朱系（此 70株系为 Ί代 ), RT-PCR鉴定方法如下： 耳又各才直株的叶片， 提取 RNA, 然后进行 RT-PCR, 引物如下：
5'-AAC CTC CTC CTCATC GTACT -3' (序列 9 )
5'-GAC AGC ATC AGC CAT GTT CA-3' (序列 10 )
结果， 从上述 70 #^t'l^朱系中鉴定出 7个株系有 GmSIKl基因的过量表达， 进一步筛选出表达量较高 «不同的 3株 (分别记作 1#株系、 2#株系和 3#株系） (此 3株系为 Tl代）进一步作功能¾¾全。 此 3株系的 RT-PCR鉴定结果如图 6 ( CK表 示对照， 1、 2、 3分别表示 1#株系、 2#株系和 3#株系）。 所选择的 3个转基因植株中 基因 GmSIKl均有不同程度的异源过量表达， 转空载体对照植株中没有 GmSIKl基 因的表达。
2、 转 QwS/^/基因植 常 牛下的生长情况
大田生长的 1#株系、 2#株系、 3#株系和转空载体对照的植株（CK ),取 13-15cm 长的新生侧 ^干， 在瓶中 杏养， 七^:长出幼根。
第 8天植株的生长状况见图 7, 结果显示， 正常糾下， 转基因的 3个株系、 与转空载体对照植株生长状况无明显差异。
百脉根侧枝水培养的方法： 剪 目似位置的侧枝，浸泡于水中七天后即可长出 幼根。
3、 转 QwS/^/基因植株的耐逆' lii佥测
以下分别抬则 1#株系、 2#株系、 3#株系和转空载体对照植^ ^逆 办迫下的生 长状况。
1 )耐盐性微
将大田生长的 3个转基因株系 （1#株系、 2#株系、 3#株系）植# ^口转空载体对 照植株（CK ), 取 13-15cm长的新生侧 干，放在瓶中 杏养， 七^^长出幼根。 分别将幼 * 入 lOOmMNaCl溶液，处理 24 再置于正常 牛下恢复生长 3天， ¾S表型并拍照同时进行存活率统计。 实险共设三次重复， 每次重复每个株系检测 10株， ¾¾全数据为三次重复实验的平均值士标准差。
每次重复存活率的计算公式： 存活率 =存活的植林数目 /10株 X 100%。
结果如图 8所示（CK和对照均表示对照组， 1、 2、 3分别表示 1#株系、 2#株 系、 3#株系）， A图为盐处理 24 植株的表型照片； B图为植株的存活率比较。
结果表明， NaCl处理 24天后， 对照植株大部分叶片枯萎， 顶端新生叶枯死； 而转基因植株中只有少部分侧枝出 古萎， 大部分植株虽出现叶片增厚，叶子变黄, ^sit株仍在生长， 表现为较好的耐盐性； GmSIKl转基因株系 1#株系、 2#株系、 3 株系的存活率依次为 80%、 80%、 52%, 均在 50%以上， 而对照仅约 10%。
2 )耐旱性鉴定
用 PEG水溶^ ^以土壤干旱环 。 PEG作为渗透调节物质， ^^量大不会 透过细胞壁对细胞， 产生类似于土壤干旱的 ^¾έ。 将大田生长的 3个转基因株 系 （1#株系、 2#株系、 3#株系）植# ^口转空载体对照植株（CK ), 取 13-15cm长的 新生侧 ¾ ^干，放在瓶中 杏养， 七^ ^长出幼根。 分别将幼^ ¾ v40%PEG溶液 中， 1 并拍照。 然后' fe 浇水 5天， 表型并拍照， 同时进行存活率统 计。 实验共设三次重复，每次重复每个株系^ ί则 10株， ¾¾全数据为三次重复实验的 平均值士标准差。
每次重复存活率的计^^式： 存活^ =存活的才直 #史目 /10株 X 100%。
结果如图 9 (CK和对照均表示对照组， 1、 2、 3分别表示 1#株系、 2#株系、 3#株系）， Α图为 PEG处理 1天（上）和复水 5天后（下）才直株的表型照片； B图 为植株的存活率比较。
结絲明， PEG ^t¾^, 所有的材料叶片出 蔫，表型无明显差异。 复 水后， 约 80%的对照材料叶片由于 导致干枯， 顶端不能继续生长； 在转基因植 株中， 受 PEG脱水而萎蔫的叶片大部分能重新吸^ ^分， 'fe 正常生长， 三个株系 ( 1#株系、 2#株系、 3#株系）的存活率分别约为 75%、 68%和 60%, 而对照的存活 率仅为 20 %。
上述实验表明， Qw57f7在百^ ^艮中的异源表达提高了转基因植株的耐旱、 耐 盐性。 GmSD l ^了植物耐逆性信号传导。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种蛋白， 选自如下 （a)、 （b)、 (c)或 （d):
(a)序列表中序列 2所示的氨基酸序列自 N端起第 34-714位氨基酸残 基组成的蛋白质；
(b) 由序列表中序列 2所示的 酸序列组成的蛋白质；
(c)将序列表中序列 2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 /或缺失和 /或添加且与植物耐逆性相关的由 （a)衍生的蛋白质；
(d) 由与序列表中序列 2 所示的 酸序列至少具有 75%、 至少具有 80%、 至少具有 85%、 至少具有 90%、 至少具有 95%、 至少具有 96%、 至少 具有 97%、至少具有 98%或至少具有 99%同源性的氨基酸序列组成的且与植 物耐逆性相关的蛋白质。
2、 权利要求 1所述蛋白的编码基因。
3、 根据权利要求 2所述的编码基因， 其特征在于： 所述编码基因为如下 1 )或 2)或 3)所示的基因：
1 )序列表中序列 1所示的 DNA分子； 性相关蛋白的 DNA分子；
3 )与 1 )限定的 DNA序列至少具有 70%、至少具有 75%、至少具有 80%、 至少具有 85%、 至少具有 90%、 至少具有 95%、 至少具有 96%、 至少具有 97%、 至少具有 98%或至少具有 99%同源性且编码所述植物耐逆性相关蛋 白的 DNA分子。
4、 含有权利要求 2或 3所述编码基因的重组载体、 重组菌、 转基因细胞 系或表达盒。
5、 扩增权利要求 2或 3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
6、 根据权利要求 5所述的引物对， 其特征在于： 所述引物对为如下 1 ) 或 2)或 3)或 4)所示：
1 )一条引物的序列如序列表中序列 7所示， 另一条引物的序列如序列表 中序列 8所示；
2)一条引物的序列如序列表中序列 9所示， 另一条引物的序列如序列表 中序列 10所示; 3 )一条引物的序列如序列表中序列 3所示， 另一条引物的序列如序列表 中序列 4所示；
4 )一条引物的序列如序列表中序列 5所示， 另一条引物的序列如序列表 中序列 6所示。
7、 一种培育耐逆性植物的方法， 是向植物中导入权利要求 2或 3中所述 的编码基因， 培育， 得到耐逆性植物。
8、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 所述耐逆性为耐盐和 /或耐 干旱。
9、 根据权利要求 8或 9所述的方法， 其特征在于： 所述植物为双子叶植 物， 优选为大豆、 苜蓿、 百脉根或拟南芥。
10、 权利要求 1 中所述蛋白或权利要求 2或 3所述编码基因在培育耐逆 性植物中的应用。
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