CN108977445B - 拟南芥microRNA400在调控植物耐镉性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了拟南芥microRNA400/拟南芥microRNA400前体MIR400在调控植物耐镉性中的应用/制备转基因植物中的应用，其中，所述拟南芥microRNA400的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述拟南芥microRNA400前体MIR400的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从拟南芥中克隆了包括microRNA400内含子在内的MIR400，并验证了该microRNA在拟南芥幼苗期具有调节植株抗镉作用，经试验，通过降低该microRNA的表达可以获得比野生型更抗镉的转基因拟南芥。本发明的microRNA可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。

Description

拟南芥microRNA400在调控植物耐镉性中的应用

技术领域

本发明涉及拟南芥microRNA400在调控植物耐镉性中的应用，属于分子生物学和基因工程领域。

背景技术

随着工业发展，工矿企业产生的工业废弃物及农业生产中农药的大量应用，使人类赖以生存的土壤和水源受到严重污染。农田土壤中的镉不仅影响作物的产量和品质，还可通过食物链影响人类的健康。农产品中镉的残留和富集给人类健康带来极大的安全隐患。更危险的是，土壤镉污染具有不可逆转性，被镉污染的土壤可能要100～200年甚至更长的时间才能够恢复。镉是这些废弃物及农药中的一种有毒重金属，对动植物健康和生态系统有很大危害(de Vries et al.,2007)。因此，镉污染已成为全球非常重要且急需解决的环境问题之一。人们在关注如何用物理、化学和生物技术对污染的环境进行修复的同时,也在关注如何提高植物和作物抗重金属镉的能力。通过农作物及产品摄入是镉进入人体并危害人类身心健康的重要来源之一，因此培育在污染土壤上生长的无镉或低镉作物新品种成为生物学家关注的重点。镉不是高等植物必需的成分，无任何生物功能。土壤中的镉可通过植物阳离子Zn和Fe的转运蛋白或者非特异的Nramp家族蛋白吸收并在各种组织中积累(Grossoehme et al.,2006)。在一定浓度范围外，重金属胁迫才会使植物生理生化过程及代谢异常。植物在重金属作用下可产生大量活性氧自由基，这些活性氧自由基与细胞膜上的不饱和脂肪酸相互作用，使细胞膜透性增加，膜两侧物质无阻力进出细胞膜，致使细胞生理生化过程紊乱。重金属胁迫也会对植物细胞核膜造成损伤，凝集染色质、核仁解体、细胞膜通透性增加、线粒体的呼吸作用和叶绿体的光合作用异常等镉积累会使叶绿素合成降低,光合器官受损,植物光合作用明显减弱(Bi et al.,2009)。镉降低氮等营养吸收，破坏碳和氮代谢，导致生长发育延缓甚至死亡，其中镉诱导过氧化物积累被认为可能是导致植物细胞伤害的重要原因(Rodriguez-Serrano et al.,2009)。目前,已有的遗传学证据和基因组表达谱分析结果显示,拟南芥中络合素(PCs)和谷胱甘肽(GSH)很可能在植物降低镉毒害中起关键作用(Majumdar et al.,2018)。但对植物细胞如何消解重金属镉的毒害作用及植物在生理生化、细胞尤其分子水平的响应机制还知之甚少。模式植物拟南芥为进行上述几个层面的研究提供了有力的途径。最近已经发现拟南芥无论是萌发还是幼苗生长对于镉的响应都非常显著,而这种响应过程伴随过氧化物的积累及相关酶活性的改变(Garnieret al.,2006)，说明植物对镉的响应有保守的机制(Garnier et al.,2006)。

microRNA是一类长度大约为18～25核苷酸的单链RNA，其本身不编码蛋白质，不具有开放性阅读框，以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中(Sunkar et al.,2012)。miRNA广泛存在于广大真核生物中，miRNA不编码蛋白质；成熟miRNA5′端为磷酸修饰后的基团，3′端为羟基尾巴，避免其与大多数寡核苷酸及RNA的片段一样降解；miRNA的长度通常在20～24个核苷酸之内，长度大部分集中在21nt；miRNA含有自身的启动子，可受不同启动子元件调控；多数miRNA还具有保守性、时序性和组织特异性等特征(Bartel,2004)。

拟南芥miR400以单拷贝形式位于拟南芥1号染色体上，在开花植物物种之间相对保守，目前仅仅在拟南芥和芜菁中被发现，在水稻、玉米、烟草等其他开花植物中未被发现。对miR400序列位置分析显示，miR400不像大多数植物中的miRNA一样位于基因间区域，而是位于另外一个未知功能基因(at1g32583)的内部。一般来说，我们将来自于内含子的miRNA所在的基因称为宿主基因。miR400位于其宿主基因内长度为约1500bp左右的5′端非编码区，即基因内部第一个内含子中，距离编码区1128bp，所在的内含子为306bp。miR400确实作为宿主基因的一部分，位于整个基因的5′非编码区，作为同一个转录单元共同参与转录(Yan et al.,2012)。

目前对miR400的研究仅限于拟南芥miR400家族受高温、低温等非生物胁迫的调节，并且在高温胁迫时，出现可变剪切的现象(Yan et al.,2012)；以及miR400参与调控植物病毒防御过程(Park et al.,2014)。研究表明，高温胁迫触发的可变剪切使得pri-miR400的积累影响了miR400前体的表达，进而影响miR400成熟体的表达。在miR400参与植物病毒防御过程中，miR400通过靶向抑制PPR1和PPR2mRNA使得拟南芥对致病细菌和真菌更加敏感。miR400响应高温的可变剪切以及通过靶向抑制PPR1和PPR2mRNA的表达进而参与植物对致病真菌和细菌的防御，但是关于miR400如何参与Cd胁迫还未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了拟南芥microRNA400的一种新用途——拟南芥microRNA400在调控植物耐镉性中的应用，本发明还提供了可调控拟南芥microRNA400表达的重组载体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

拟南芥microRNA400，其核苷酸如SEQ ID NO.1所示。拟南芥microRNA400前体MIR400(at1g32583的第一个内含子，长306bp)，其核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

拟南芥microRNA400在调控植物耐镉性中的应用，在制备转基因植物中的应用。本发明通过研究发现，拟南芥microRNA400能够显著降低植物在根的伸长量上的抗镉性，降低microRNA400的表达，可提高植物的耐镉性，获得具有抗镉性能的植物(比野生型植株更抗镉)，过表达microRNA400，可降低植物的耐镉性，获得抗镉性能弱的植物(比野生型植株更不抗镉)。

一种植物表达载体，其含有上述拟南芥microRNA400或拟南芥microRNA400前体MIR400。优选的，所述植物表达载体所用的质粒为PBI121。

一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述植物表达载体，或其基因组中插入了拟南芥microRNA400或拟南芥microRNA400前体MIR400。

所述遗传工程化的宿主细胞的构建方法为常规技术手段，将植物表达载体导入宿主细胞，使植物表达载体/拟南芥microRNA400在宿主细胞中有效表达。

上述植物表达载体、遗传工程化的宿主细胞在制备转基因植物(抗镉性能更强或更弱)中的应用。所述植物包括拟南芥。

本发明通过CTAB法提取拟南芥基因组，以拟南芥基因组为模板，通过特异引物进行PCR扩增，回收纯化PCR产物，并测序，得到包括miR400内含子在内的miR400基因，将其连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，数据显示该microRNA能够显著降低转基因拟南芥在根的伸长量上的抗镉性。同时通过降低该microRNA的表达，获得了比野生型植株更抗镉的转基因拟南芥。microRNA可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源，有助于从根本上改善经济作物的抗镉性能。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：转基因拟南芥与野生型拟南芥在正常1/2MS培养基、含有95μM CdSO₄的1/2MS培养基上的根的伸长情况，其中，A：正常1/2MS培养基；B：含有95μM CdSO₄的1/2MS培养基。WT代表野生型拟南芥，STTM3、STTM5代表转基因拟南芥。

图2：转基因拟南芥与野生型拟南芥在正常1/2MS培养基、含有95μM CdSO₄的1/2MS培养基上的根的伸长统计情况，其中，A：正常1/2MS培养基；B：含有95μM CdSO₄的1/2MS培养基。横坐标表示不同株系拟南芥，纵坐标表示根的伸长量；WT代表野生型拟南芥，STTM3、STTM5代表转基因拟南芥。

图3：转基因拟南芥与野生型拟南芥在正常1/2MS培养基、含有95μM CdSO₄的1/2MS培养基上的根的伸长情况，其中，A：正常1/2MS培养基；B：含有95μM CdSO₄的1/2MS培养基。WT代表野生型拟南芥，OE12、OE23代表转基因拟南芥。

图4：转基因拟南芥与野生型拟南芥在正常1/2MS培养基、含有95μM CdSO₄的1/2MS培养基上的根的伸长统计情况，其中，A：正常1/2MS培养基；B：含有95μM CdSO₄的1/2MS培养基。横坐标表示不同株系拟南芥，纵坐标表示根的伸长量；OE12、OE23代表转基因拟南芥。

图5A：miR400基因表达量的检测(表达)。

图5B：miR400基因表达量的检测(过表达)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1：拟南芥MIR400的克隆

(1)拟南芥基因组的提取。

(2)MIR400基因的PCR扩增：以拟南芥基因组为模板，根据MIR400基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序，得到其前体MIR400。引物为：

正向引物：5’-GTTCTGAGGATTGTTTATGAGAGT-3’(SEQ ID NO.3)。

反向引物：5’-GTTAAATGGAAGATGCTT-3’(SEQ ID NO.4)。

(2)PCR反应体系和扩增条件如表1所示。

表1

(4)测序送交生工公司进行测序。回收和纯化PCR扩增产物的具体操作如下：凝胶电泳后，用干净的刀片将带有目的片段的胶切割下来，放入到离心管中，胶不要切得过大，以避免回收时DNA片段溶液含有大量的杂质。向离心管中加入等体积的XP2(BindingBuffer)溶液(体积/胶质量)后，在55℃条件下温浴10min，直到胶完全融化；将离心管中的溶液移到2ml的吸附柱中，离心1min，弃去液相；再次向吸附柱中加入0.5ml的XP2溶液，离心1min，弃去液相；向吸附柱加入0.70ml的SPW Wash Buffer溶液，离心1min，弃去液相；再次加入0.70ml的SPW Wash Buffer溶液，离心1min，弃去液相；再次离心1min后，将吸附柱放置在一个新的离心管上，静置10min，加入30μl的溶解液，静置1min，最后离心1min，得到的液相即为回收的DNA溶液。

实施例2：重组表达载体的构建与转基因植物的制备

(1)重组表达载体的构建

根据拟南芥MIR400基因序列设计引物，PCR反应采用EVO高保真酶进行PCR克隆得到拟南芥MIR400基因。并通过T4DNA连接到pEASY-Blunt simple Cloning Kit载体(购买自TransGen公司)中。将连接产物转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含有卡纳抗性的LB平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养确认后提取阳性克隆的质粒，酶切，电泳并将目的条带回收。回收的目的条带连入到双子叶植物双元表达载体PBI121。反应产物转化大肠杆菌后涂板、筛选阳性克隆、提取质粒，然后进行农杆菌转化等实验。

(2)农杆菌转化

冰浴融化农杆菌LBA4404/GV3101感受态细胞；加入3μL表达载体质粒，冰浴30min，液氮中冻1min，然后在37℃水浴5min；加入950μL无抗生素的YEP培养基，28℃，200rpm，振荡培养4h；10000rpm离心1min以浓缩菌液，用100μLYEP回溶菌体；将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的固体YEP培养基上，28℃培养36～48h。菌液PCR检测阳性克隆。

(3)培养转基因植株

挑取农杆菌单菌落，加入6mL LB(Kan)培养基中，培养过夜；室温下，6000rpm，离心5min，收集菌体；用8～10mL侵染液(5％蔗糖，0.03～0.05％silwetL)悬浮菌体，混匀；将拟南芥的花序浸到侵染液中，侵染10～15s，然后将拟南芥取出放入暗箱中，上面覆膜，黑暗培养12h；将拟南芥取出，在长日照下正常培养，每隔5～7d侵染一次，一般侵染3～4次；收获侵染后成熟的拟南芥种子，干燥后储存。

(4)转基因植物筛选

选取拟南芥种子，用70％乙醇消毒5min，再用2.6％的NaClO消毒10min，用无菌水漂洗3～5遍，除净残留的NaClO溶液；将消毒的拟南芥种子平铺到含有50mg/L Kan的1/2MS培养基上，4℃黑暗处理2d；成层处理后，将培养皿置于光照培养箱中，22℃，生长7d左右，选取子叶仍为绿色的拟南芥幼苗转移到培养基质中培养；三周后，从每株上选取叶片，提取基因组DNA，进行鉴定。

实施例3：miR400Knock down株系与野生型在95μM镉浓度下的生长特性比较

miR400Knock down植株具有较强的镉胁迫耐性。利用short tandem targetmimic(STTM)技术(现有技术中已有的常规技术)，降低miR400的表达量并阻碍其功能发挥，将获得的两个miR400Knock down株系分别命名为STTM3、STTM5。通过qRT-PCR对miR400的表达量进行检测，鉴定其为miR400Knock down株系，见图5A。将野生型拟南芥、STTM3、STTM5分别在正常1/2MS培养基、含有95μM CdSO₄1/2MS培养基上培养，结果如下：野生型和STTM株系在正常1/2MS培养基上长势相同，见图1A、图2A，说明该基因表达量下降不会影响植物的正常生长发育过程。野生型和STTM株系生长在含有95μM CdSO₄1/2MS培养基上的时候，野生型植株根的伸长量要比STTM株系要短，见图1B、图2B。这些结果说明miR400基因参与到植物耐镉过程。

实施例4：拟南芥miR400基因在野生型拟南芥中过表达的效果验证试验

将MIR400基因转基因到野生型植株中，进行过表达，得两个株系，分别命名为OE12、OE23。通过qRT-PCR对miR400表达量进行检测，鉴定其为超表达株系，见图5B。将野生型拟南芥、OE12、OE23S分别在正常1/2MS培养基、含有95μM CdSO₄1/2MS培养基上培养，结果如下：野生型与两个过表达miR400基因的植株(OE12、OE23)生长在正常1/2MS培养基上的时候长势几乎相同，见图3A、图4A。生长在含有95μM CdSO₄1/2MS培养基上的时候，超表达株系的根的伸长量要比野生型短要短，见图3B、图4B。该实验结果说明在拟南芥中过表达miR400基因会降低植物的耐镉性。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 拟南芥microRNA400在调控植物耐镉性中的应用

<141> 2018-06-28

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

tatgagagta ttataagtca c 21

<210> 2

<211> 306

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

gtaaattctt taactgttct gaggattgtt tatgagagta ttataagtca ctacatttgg 60

taagcaaagt gttgtttctc aaacgaagtg acttatgata atctcatgaa tggattttgc 120

aactcttaaa gagagcatag ttcttgtggt gcggcttctt gatattagga tctagagcat 180

tttggtagat ggttaatgtg attatggtaa ggtagagaaa acattagttg atatgcagca 240

gctaaagcgt gaaatggatt cttggttttt agtatattat catctttttg tgtgtttgta 300

atgcag 306

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gttctgagga ttgtttatga gagt 24

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gttaaatgga agatgctt 18

Claims (4)

1.拟南芥microRNA400和/或拟南芥microRNA400前体MIR400在调控植物耐镉性中的应用和/或在制备耐镉转基因植物中的应用，其中，所述拟南芥microRNA400的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述拟南芥microRNA400前体MIR400的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：具体应用时，将含有拟南芥microRNA400和/或拟南芥microRNA400前体MIR400的植物表达载体导入植物细胞或种子，或利用STTM技术降低miR400的表达量并阻碍其功能发挥，使拟南芥microRNA400和/或拟南芥microRNA400前体MIR400过表达或表达下调，从而获得抗镉性能强于/弱于野生型植株的转基因植株。

3.植物表达载体在制备转基因植物中的应用，所述转基因植物的抗镉性能强于/弱于野生型植株；所述植物表达载体，其含有拟南芥microRNA400或拟南芥microRNA400前体MIR400；所述拟南芥microRNA400的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述拟南芥microRNA400前体MIR400的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.遗传工程化的宿主细胞在制备转基因植物中的应用，所述转基因植物的抗镉性能强于/弱于野生型植株；所述遗传工程化的宿主细胞，其基因组中插入了拟南芥microRNA400或拟南芥microRNA400前体MIR400；所述拟南芥microRNA400的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述拟南芥microRNA400前体MIR400的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

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