CN103031331A

CN103031331A - OsCBL1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用

Info

Publication number: CN103031331A
Application number: CN2012105202227A
Authority: CN
Inventors: 王毅; 武维华; 李娟�; 龙雨
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-12-06
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2013-04-10

Abstract

本发明公开了OsCBL1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。本发明提供了一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤：将OsCBL1蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株；所述OsCBL1蛋白获自水稻（Oryza sativa），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明可用于提高植物耐低钾能力，为培育适用于钾贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。

Description

OsCBL1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及OsCBL1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。

背景技术

钾是植物生长发育所必需的营养元素，是植物体内含量最丰富的一价阳离子，约占植物干重的2%-10%。钾在植物体内具有分布广、含量高、移动性强等特点，主要集中在生命活动最旺盛的部位，通常优先分布于芽、幼叶、上部茎和根尖等生长活动旺盛的器官与组织中，当K⁺供应充足时，则更多的在下部茎、叶和根等组织中积累。

钾参与生命活动的方式与氮、磷不同。钾不参与任何有机物质的形成，但钾的许多生理作用却是其它元素所不可替代的。钾在植物体中的作用可以分成以下几类：调节酶的活性，促进氮的吸收和蛋白质合成，调节韧皮部溶质运输，影响光合作用，调节细胞膨压和渗透势，维持细胞电荷平衡等。

土壤中的钾是植物钾素最主要的来源。自然条件下植物吸收的钾元素除少部分来自灌溉水外，其余全靠土壤供给，即使在栽培作物施用钾肥的情况下，作物吸收的钾也有40-80%来自土壤。因此，土壤中钾的状况对植物的钾营养和钾肥施用效果有着极其重要的意义。土壤全钾含量一般占土壤总重的0.1%-3%，由于植物只能从土壤中吸收以离子形式存在的钾元素，因此其中只有大约2%的钾对植物直接有效，其余的钾都以不能被植物直接吸收利用的形式被固定在土壤矿物中。

对一般农作物而言，土壤溶液K⁺含量在40ppm（约1mmol/L）以上时能够基本满足作物生长的需要，实际土壤溶液中的K⁺含量在1-200ppm（约0.025-5mmol/L）之间的范围内，但植物根际的钾浓度因为土壤耗竭带和不可交换钾等原因的存在，通常低于0.3mmol/L。当植株每千克干重中的钾元素含量低于10g时，植株就会出现缺钾性状。如果在生长发育过程中钾供应不足，植株茎杆会变得柔弱、易倒伏，抗旱、抗寒性降低，叶片失水，蛋白质、叶绿素等物质被分解破坏，叶色变黄而且叶组织会逐渐衰老，最终明显影响产量。

目前我国农作物生产发展所面临的严峻状况是土壤缺钾且钾肥资源极其匮乏，因此从经济上和长远的战略上考虑，深入了解和认识植物对低钾胁迫的反应机制，提高农作物的耐低钾能力，对于提高农作物的产量和质量具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供OsCBL1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。

本发明提供了一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤：将OsCBL1 蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株；

所述OsCBL1蛋白获自水稻（Oryza sativa），是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列1衍生的蛋白质。

所述OsCBL1蛋白的编码基因为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）序列表中序列2自5’末端第1至639位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

所述OsCBL1蛋白的编码基因可通过表达载体导入所述目的植物。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述表达载体具体可为在1301-Ubiq质粒的多克隆位点（如BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点之间）插入所述OsCBL1蛋白的编码基因得到的重组质粒甲。

携带有所述OsCBL1蛋白的编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述基因可通过所述重组质粒甲导入所述目的植物中。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物可为水稻，如水稻品种“日本晴”。

所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。所述突变株具体可为cbl1cbl9双突变体。

所述“对低钾逆境胁迫耐受能力增强”体现为植株对K⁺的吸收能力增强和/或植株（植株的地下部分和/或地上部分）中的K⁺含量增加。

本发明还保护所述OsCBL1蛋白或所述OsCBL1蛋白的编码基因在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为水稻，如水稻品种“日本晴”。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。所述突变株具体可为cbl1cbl9双突变体。

以上任一所述“低钾”可为钾离子浓度为1mM以下，如100μM以下、10μM以下、5μM以下或0μM。

本发明还保护所述OsCBL1蛋白、所述OsCBL1蛋白的编码基因或以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为水稻，如水稻品种“日本晴”。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。所述突变株具体可为cbl1cbl9双突变体。

本发明公开了水稻OsCBL1蛋白及其编码基因的工程应用，特别公开了该基因在提高植物对土壤中有效钾利用效率方面的应用。OsCBL1蛋白在水稻中负责调控从土壤中吸收K⁺。OsCBL1基因的敲除突变体导致水稻对K⁺的吸收显著减少，并出现明显的缺钾褐斑。OsCBL1基因过表达植物对K⁺的吸收能力大大增加。本发明可用于提高植物耐低钾能力，为培育适用于钾贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。

附图说明

图1为oscbl1突变体植株中T-DNA的插入位置。

图2为实施例3中的PCR扩增产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳图。

图3为实施例3中各个株系中OsCBL1基因的相对表达量。

图4为实施例3中水稻品种“Dongjin”、oscbll突变体植株的全植株照片。

图5为实施例3中水稻品种“日本晴”和OsCBL1基因过表达植株的全植株照片。

图6为实施例3中钾离子含量的测定结果。

图7为实施例4中的PCR扩增产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳图。

图8为实施例4中各个株系的拟南芥培养7天后的照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

oscbl1突变体，在水稻品种“Dongjin”的OsCBL1基因中插入T-DNA得到的，获自Rice GE（http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE?JOB=TEXT&TYPE=GENE&QUERY＝Os10g41510，编号为PFG_4A-00665.R；oscbl1突变体植株的T-DNA的插入位置见图1，其中实心盒为外显子，线条为内含子，ATG为转录起始点。同样从RiceGE可以获得水稻品种“Dongjin”（野生型植株）。

哥伦比亚生态型拟南芥（Col-0）：TAIR网站（http://www.arabidopsis.org/）。

水稻品种“日本晴”：提及水稻品种“日本晴”的参考文献：Wenqiang Yang,Zhaosheng Kong,Edith Omo-Ikerodah,Wenying Xu,Qun Li,Yongbiao Xue.(2008)Calcineurin B-like interacting protein kinase OsCIPK23functions in pollination and drought stress responses in rice(Oryza sativa L.).J.Genet.Genomics35,531-543.。

cbl1cbl9双突变体：提及“cbl1cbl9双突变体”的参考文献：Xu J,Li HD,Chen LQ,Wang Y，Liu LL,Wu WH.(2006)A protein kinase,interacting with two calcineurin B-like proteins,regulates K⁺transporter AKT1inArabidopsis.Cell,125:1347-1360；该双突变体植株是由cbl1突变体植株（出发植株为哥伦比亚生态型拟南芥）和cbl9突变体植株（出发植株为哥伦比亚生态型拟南芥）杂交得到的纯和株系。

1301-Ubiq质粒：提及“1301-Ubiq质粒”的参考文献：Baisheng Yu,Zhongwei Lin1,Haixia Li,Xiaoj iao Li,Jiayang Li,Yonghong Wang,Xia Zhang,Zuofeng Zhu,Wenxue Zhai,Xiangkun Wang,Daoxin Xie and Chuanqing Sun.(2007)TAC1,a maj or quantitative trait locus controlling tiller angle in rice.The Plant Journal52,891-898；1301-Ubiq质粒是将ubiquitin启动子插入PCAMBIA1301的PstⅠ酶切位点得到的质粒。

农杆菌菌株EHA105：提及“农杆菌菌株EHA105”的参考文献：Jeroen S.C.van Roekel,Brigitte Damm,Leo S.Melchers,and Andr6Hoekema.(1993)Factors influencing transformation frequency of tomato(Lycopersicon esculentum).Plant Cell Reports,12:644-647。

农杆菌菌株GV3101：提及“农杆菌菌株GV3101”的参考文献：R.Berres,L.Otten,B.Tinland,E.Malgarini-Clog,B.Walter.(1992)Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant Cell Reports11,192-195.。

实施例1、OsCBL1蛋白及其编码基因的获得

在TIGR网站（http://rice.plantbiology.msu.edu）上输入LOC_10g41510，得到一段编码水稻钙感受基因的DNA序列。根据植物分子生物学国际植物基因命名法委员会，Commission for Plant Gene Nomenclature of the International Society for Plant Molecular Biology）的要求，将该DNA序列命名为OsCBL1基因，编码OsCBL1蛋白。OsCBL1蛋白如序列表的序列1所示（由213个氨基酸残基组成）。基因组DNA中，OsCBL1基因具有8个外显子和7个内含子。OsCBL1基因的开放阅读框如序列表的序列2所示（642bp）。

实施例2、过表达植株的获得

一、重组表达载体的构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤2合成的双链DNA分子为模板，用OsCBL1-F和OsCBL1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

OsCBL1-F：5’-A AGGATCCATGGGGTGCTTCCAGTCG-3’

OsCBL1-R：5’-AAGGTACCTGTGACGAGATCATCAA-3’

3、用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切1301-Ubiq质粒，回收载体骨架（约11800bp）。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在1301-Ubiq质粒的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第1至639位核苷酸所示的DNA分子。

二、OsCBL1基因过表达植株的构建

1、将重组质粒甲转化农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌甲。

2、将步骤1得到的重组农杆菌甲重悬于共培养液体培养基（将2.83g KNO₃、0.463g(NH₄)₂SO₄、0.185g MgSO₄·7H₂O、0.166g CaCl₂·2H₂O、0.4g KH₂PO₄、0.1g肌醇、1mgNico-acid、1mg Pyrido(B6)、10mg Thiamin(B1)、7.5g KI、30g H₃BO₃、100g MnSO₄、20g ZnSO₄·7H₂O、0.25g CuSO₄·5H₂O、0.25g CoCl₂、2.5g Na₂MoO₄·2H₂O、27.8mg FeSO₄·7H₂O、37.3mg Na₂-EDTA、2mg2,4-D、2g肌醇、0.5g水解酪蛋白、100mM乙酰丁香酮和30g蔗糖溶于水并用水定容至1L），得到OD600=0.3-0.5的重组农杆菌菌悬液。

3、将水稻品种“日本晴”的成熟胚愈伤组织与步骤2得到的重组农杆菌菌悬液共培养20min，然后倒掉菌液，用无菌滤纸洗去愈伤组织表面的菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的共培养固体培养基（在每升共培养液体培养基中加入2g植物凝胶）上，26℃暗培养2-3天。

4、抗性愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织经无菌转移至抗性筛选培养基平板（共培养固体培养基+50mg/mL潮霉素），26℃暗培养半个月，然后转移至新的抗性筛选培养基平板上继代培养一次。

5、将步骤4得到的抗性愈伤组织无菌转移至到预分化培养基（基本分化培养基+1mg/LNAA+5mg/LABA），26℃暗培养2个月；然后转移至分化培养基（基本分化培养基+0.5mg/L KT+0.25mg/L NAA+500mg/mL羧苄青霉素+50mg/mL潮霉素），在光周期为15小时光照/9小时黑暗的条件中培养（半月左右有绿点出现，一个月后进一步分化出小苗）。

基本分化培养基：将2.83g KNO₃、0.463g(NH₄)₂SO₄、0.185g MgSO₄·7H₂O、0.166gCaCl₂·2H₂O、0.4g KH₂PO₄、0.1g肌醇、1mg Nico-acid、1mg Pyrido(B6)、10mgThiamin(B1)、7.5g KI、30g H₃BO₃、100g MnSO₄、20g ZnSO₄·7H₂O、0.25gCuSO₄·5H₂O、0.25g CoCl₂、2.5g Na₂MoO₄·2H₂O、27.8mg FeSO₄·7H₂O、37.3mgNa₂-EDTA、0.5g Glutamine、0.1g肌醇、0.3g水解酪蛋白、0.5g Proline和30g蔗糖溶于水并用水定容至1L。

6、当步骤5的小苗长至约2cm时，转移至生根培养基（将0.825g NH₄NO₃、0.95gKNO₃、0.085g KH₂PO₄、0.185g MgSO₄·7H₂O、0.166g CaCl₂、0.1g肌醇、1mg Nico-acid、1mg Pyrido(B6)、10mg Thiamin(B1)、7.5g KI、30g H₃BO₃、100g MnSO₄、20gZnSO₄·7H₂O、0.25g CuSO₄·5H₂O、0.25g CoCl₂、2.5g Na₂MoO₄·2H₂O、27.8mgFeSO₄·7H₂O、37.3mg Na₂-EDTA和30g蔗糖溶于水并用水定容至1L），培养两周左右生根。

7、将步骤6中根系发达的小苗移入土中，先在温室条件缓苗一周左右，然后移至户外正常培养，即为T₀代植株。

8、将T₀代植株自交并收获种子（T₁代种子），将T₁代种子培育为T₁代植株。

9、将T₁代植株进行潮霉素抗性筛选（潮霉素浓度为50mg/mL），对于某一T₀代植株，如果其T₁代植株在潮霉素抗性筛选中显示3:1的分离比，该T₀代植株为单拷贝OsCBL1基因过表达植株。

10、将单拷贝OsCBL1基因过表达植株的T₁代植株自交并收获种子（T₂代种子），将T₂代种子培育为T₂代植株。

11、将T₂代植株进行潮霉素抗性筛选（潮霉素浓度为50mg/mL），对于某一T₁代植株，如果其T₂代植株均为潮霉素抗性植株，该T₁代植株为纯合的OsCBL1基因过表达植株，该植株及其自交后代为一个OsCBL1基因过表达株系。

12、将OsCBL1基因过表达株系的T₂代植株自交并收获种子（T₃代种子），将T₃代种子培育为T₃代植株。

13、将OsCBL1基因过表达株系的T₃代植株自交并收获种子（T₄代种子），将T₄代种子培育为T₄代植株。

三、转空载体植株甲的构建

用1301-Ubiq质粒代替重组质粒甲进行步骤二，得到转空载体植株甲。

实施例3、OsCBL1蛋白的功能验证

分别将水稻品种“Dongin”（用DJ表示）、oscbl1突变体、水稻品种“日本晴”（用Np表示）、实施例2得到的OsCBL1过表达植株的T₄代植株和实施例2得到的转空载体植株甲的T₄代植株进行如下鉴定：

一、分子鉴定

1、PCR鉴定

提取植株幼苗的总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，用Primer1和Primer2组成的引物对进行PCR扩增（靶序列约为650bp），以鉴定OsCBL1基因的表达量。采用OsACTIN基因为看家基因，用Primer3和Primer4组成的引物对进行PCR鉴定（靶序列约为600bp）。

Primer1：5’-AATCTAGAATGGGGTGCTTCCAGTCGA-3’；

Primer2：5’-AAGGTACCTCATGTGACGAGATCATCAA-3’。

Primer3：5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’；

Primer4：5’-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3’。

PCR扩增产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳图见图2。

2、Real-time PCR鉴定

提取植株幼苗的总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，采用Primer5和Primer6组成的引物对进行Real-time PCR，以鉴定OsCBL1基因的表达量。采用OsACTIN基因为看家基因，用Primer7和Primer8组成的引物对进行Real-time PCR鉴定。Real-time PCR中使用SYBR Green Master mix和ABI7500sequence detection system(Applied Biosystems)。数据的处理采用Comparative CT方法。以OsACTIN基因作为内对照对数据进行归一化。

Primer5：5’-CGATGGGCTCATCAATAAGG-3’；

Primer6：5’-CCCCCTTTTCTTCACATCAA-3’。

Primer7：5’-TGGTCGTACCACAGGTATTGTGTT-3’；

Primer8：5’-AAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3’。

以水稻品种“Dongjin”中OsCBL1基因的表达量作为1，其它各个株系中OsCBL1基因的相对表达量见图3。

步骤一的鉴定结果表明：OsCBL1基因在水稻品种“Dongjin”中正常表达，而在oscbl1突变体植株中表达量显著降低，与水稻品种“Dongjin”相比，oscbl1突变体植株中OsCBL1基因的表达量降低了75.50％；OsCBL1基因在水稻品种“日本晴”中正常表达，而在OsCBL1基因过表达植株中表达量显著升高，与水稻品种“日本晴”相比，OsCBL1基因过表达植株中OsCBL1基因的表达量升高了6827.10%。

二、OsCBL1蛋白的功能验证

1、分组处理

正常水培液的配制方法：114.25mg NH₄NO₃、50.38mg NaH₂PO₄·2H₂O、89.25mgK₂SO₄、110.75mg CaCl₂、405mg MgSO₄·7H₂O、1.88mg MnCl₂·4H₂O、92.5μg(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、1.17mg H₃BO₃、437μg ZnSO₄·7H₂O、388μg CuSO₄·5H₂O、34.75mgFeSO₄·7H₂O、46.53mg Na₂EDTA，用去离子水定容至1L，用NaOH调节pH为5.70-5.80。

正常水培液中的K⁺浓度约为1mM。

缺钾水培液的配制方法：不加入K₂SO₄，其它均同正常水培液。

缺钾水培液中的K⁺浓度为0mM。

对照组：将消毒后浸种并催芽的水稻种子放置于用去离子水浸湿的滤纸上，在光照培养箱中培养7天，然后将幼苗移至正常水培液中培养7天后拍照并检测钾离子含量。

实验组：将消毒后浸种并催芽的水稻种子放置于用去离子水浸湿的滤纸上，在光照培养箱中培养7天，然后将幼苗移至缺钾水培液中培养7天后拍照并检测钾离子含量。

2、表型观察

水稻品种“Dongjin”、oscbl1突变体植株的全植株照片见图4A，等位叶照片见图4B。在正常水培液中培养7天后，水稻品种“Dongjin”和oscbll突变体植株的全植株表型和叶片表型均一致，生长状态良好。在缺钾水培液中培养7天后，oscbl1突变体植株表现出叶片失绿并出现褐色的的缺钾斑，而水稻品种“Dongjin”的叶片仍保能保持绿色。

水稻品种“日本晴”和OsCBL1基因过表达植株的全植株照片见图5A，等位叶照片见图5B。在正常水培液中培养7天后，水稻品种“日本晴”和OsCBL1基因过表达植株的全植株表型和叶片表型均一致，生长状态良好。在缺钾水培液中培养7天后，水稻品种“日本晴”的叶片出现少量褐斑，而OsCBL1基因过表达植株的叶片未出现褐斑。在正常水培液中和在缺钾水培液中，转空载体植株甲的表型均与水稻品种“日本晴”一致。

以上结果表明，OsCBL1基因参与了低钾通路，是低钾耐受基因。

3、钾离子含量的测定

（1）将植株用双蒸水清洗干净，将地下部分（根部）和地上部分（冠部）分开，放置于80℃烘箱中烘干四天，至其重量恒定。

（2）将烘干的地下部分和地上部分分别在分析天平上称量并记录干重，然后分别放入坩埚内。

（3）将坩埚放入马弗炉中，300℃烘烤1小时，然后将温度调至575℃再烘烤7小时，关闭马弗炉，待其冷却至200℃以下后取出坩埚。

（4）每个坩埚中加10mL0.1M HCl水溶液，以溶解剩余物。

（5）将步骤（4）得到的溶液用0.1M HCl水溶液稀释后作为待测溶液。

（6）用Z5000型原子吸收分光光度计面积法测定稀释溶液的钾浓度。采用KCl制作标准曲线。

（7）换算每g干重的植物材料中含有多少mg钾离子。

进行三次重复实验，每次重复实验中每个株系取3株植株，结果取平均值。

结果见图6。在不同浓度钾离子浓度的水培液培养下，oscbl1突变体植株根部和冠部的钾离子含量都稍低于水稻品种“Dongjin”。在不同浓度钾离子浓度的水培液培养

下，OsCBL1基因过表达植株的根部和冠部的钾离子含量都稍高于水稻品种“日本晴”。在缺钾水培液中培养7天后，与水稻品种“Dongjin”相比，oscbl1突变体植株根部的钾离子含量降低了30.62％。在缺钾水培液中培养7天后，与水稻品种“日本晴”相比，

OsCBL1基因过表达植株根部的钾离子含量增加了7.32%。在不同浓度钾离子浓度的水培液培养下，转空载体植株甲的根部和冠部的钾离子含量都与水稻品种“日本晴”一致。以上结果表明，oscbl1突变体对低钾敏感，OsCBL1基因过表达植株对低钾耐受，即OsCBL1基因是低钾耐受基因。

实施例4、转基因拟南芥的获得和鉴定

一、转基因拟南芥的获得

1、将实施例2的步骤一得到的重组质粒甲转化农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌乙。

2、将步骤1得到的重组农杆菌乙通过花浸泡法转化cbl1cbl9双突变体，收获T₁代种子。

3、将T₁代植株自交并收获种子（T₂代种子），将T₂代种子培育为T₂代植株。

4、将T₂代植株在含50mg/L潮霉素的MS培养基上进行潮霉素抗性筛选，对于某一T₁代植株，如果其T₂代植株在潮霉素抗性筛选中显示3:1的分离比，该T₁代植株为单拷贝OsCBL1基因过表达植株。

5、将单拷贝OsCBL1基因过表达植株的T₂代植株自交并收获种子（T₃代种子），将T₃代种子培育为T₃代植株。

6、将T₃代植株在含50mg/L潮霉素的MS培养基上进行潮霉素抗性筛选，对于某一T₂代植株，如果其T₃代植株均为潮霉素抗性植株，该T₂代植株为纯合的OsCBL1基因过表达植株，该植株及其自交后代为一个OsCBL1基因过表达株系。

二、转空载体拟南芥的获得

用1301-Ubiq质粒代替重组质粒甲进行步骤一，得到转空载体植株乙。

三、分子鉴定

分别对如下植株进行鉴定：随机选取的4个转OsCBL1基因拟南芥单拷贝纯合株系（株系1、株系2、株系3和株系4）的T₃代种子、转空载体植株乙的T₃代种子、cbl1cbl9双突变体（简称双突变株）的种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子。

1、PCR鉴定

提取植株幼苗的总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，用Primer1和Primer2组成的引物对进行PCR扩增（靶序列约为650bp），以鉴定OsCBL1基因的表达量。采用AtEF基因为看家基因，用Primer9和Primer10组成的引物对进行PCR鉴定。

Primer9：5’-ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3’；

Primer10：5’-TTGGCGGCACCCTTACGTGGATCA-3’。

PCR扩增产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳图见图7。

四、耐逆性鉴定

将拟南芥种子放置于MS培养基上，22℃光照培养箱中连续光照（光强60μmol·m^-2·s^-1）4天，然后分成两组，分别移苗至MS培养基和低钾培养基（用LK表示）上，继续在光照培养箱中培养7天后拍照。

MS培养基配方：将1.65g NH₄NO₃、1.9g KNO₃、0.17g KH₂PO₄、0.37g MgSO₄·7H₂O、0.332g CaCl₂、22.3mg MnSO₄·4H₂O、8.6mg ZnSO₄·7H₂O、0.025mg CoCl₂·6H₂O、0.025mgCuSO₄·5H₂O、0.025mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.83mg KI、6.2mg H₃BO₃，27.8mg FeSO₄·7H₂O和37.3mg Na₂EDTA溶于水并用水定容至1L。

低钾培养基与MS培养基的差异在于：去除1.9g KNO₃、1.65g NH₄NO₃、0.332gCaCl₂和0.17g KH₂PO₄，加入706mg Ca(NO₃)₂和144mg NH₄H₂PO₄。

照片见图8。在MS培养基中，各个株系的表型均没有显著差异。在LK培养基中，各个转OsCBL1基因植株的生长状态显著优于双突变株，与哥伦比亚生态型拟南芥无显著差异，转空载体植株和双突变株的表型没有显著差异。

Claims

1.一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤：将OsCBL1蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株；

所述OsCBL1蛋白是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码基因为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）序列表中序列2自5’末端第1至639位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述编码基因通过表达载体导入所述目的植物。

4.如权利要求1或3中任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为水稻。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。

7.OsCBL1蛋白或其编码基因在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用；

所述OsCBL1蛋白是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）序列表中序列2自5’末端第1至639位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.权利要求1至6中任一所述方法在植物育种中的应用。