CN105524157A - 一种钾离子通道蛋白kc1-d及其编码基因和应用 - Google Patents

一种钾离子通道蛋白kc1-d及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为KC1-D蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。编码所述KC1-D蛋白的基因(KC1-D基因)也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述KC1-D基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物满足如下(d1)至(d3)中的至少一种表型：(d1)钾离子吸收能力高于所述目的植物；(d2)钾离子吸收速率高于所述目的植物；(d3)对低钾环境的耐逆性高于所述目的植物。本发明在作物分子改良中具有较大应用价值，对于培育耐受低钾胁迫的作物具有重要的理论意义和实践意义。

Description

一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用。
背景技术
钾是植物细胞中最丰富的阳离子之一，也是植物生长所必需的三大营养元素之一。钾在植物活细胞的诸多方面，如渗透势调节、电荷平衡、糖类转运、蛋白质合成以及细胞中多种酶活力的调控方面，都起到了不可替代的作用。钾在植物生长发育中发挥着重要作用，它参与了植物的诸多生理、生化代谢过程，对植物的正常生长发育及产量获得等具有重要影响。
我国作为农业大国，大部分耕地土壤呈现缺钾态势。然而我国钾矿储量低，钾肥严重匮乏，大约一半以上依赖进口。因而钾肥资源的匮乏已成为限制我国农业生产发展的重要因素之一。尽管提高钾肥施用量可以大幅度地提高作物产量，但大量进口钾肥无论从经济上还是从长远的战略意义上考虑，都有一定的局限性。因此，了解和认识植物对低钾胁迫的反应机制，挖掘能够提高农作物耐低钾能力的关键基因或优良等位变异，已成为提高农作物钾营养利用效率和粮食产量的重要研究工作。
针对我国土壤缺钾且钾肥资源极其匮乏这一问题，克隆植物耐低钾基因并对其功能进行研究，进而通过基因工程、同源基因等位变异、作物分子改良等方法获得钾营养高效的品种，对于培育耐低钾植物/作物品种有重要的实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，获自拟南芥，命名为KC1-D蛋白，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对低钾环境的耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的KC1-D蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
上述(b)中的KC1-D蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的KC1-D蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述KC1-D蛋白的基因(KC1-D基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物对低钾环境的耐逆性相关蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物对低钾环境的耐逆性相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有所述KC1-D基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有KC1-D基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用KC1-D基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用KC1-D基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为在Super1300载体的多克隆位点插入所述KC1-D基因得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为将Super1300载体XbaⅠ和SacⅠ之间的小片段取代为序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
本发明还保护所述KC1-D蛋白的应用，为如下(c1)至(c6)中的至少一种：
(c1)调控植物的钾离子吸收能力；
(c2)促进植物的钾离子吸收能力增加；
(c3)调控植物的钾离子吸收速率；
(c4)促进植物的钾离子吸收增加；
(c5)调控植物对低钾环境的耐逆性；
(c6)增加植物对低钾环境的耐逆性。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如kc1突变株拟南芥。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述KC1-D基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物满足如下(d1)至(d3)中的至少一种表型：
(d1)钾离子吸收能力高于所述目的植物；
(d2)钾离子吸收速率高于所述目的植物；
(d3)对低钾环境的耐逆性高于所述目的植物。
携带有所述KC1-D基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如kc1突变株拟南芥。
本发明还保护所述KC1-D蛋白、所述KC1-D基因、所述重组表达载体、所述表达盒、所述转基因细胞系、所述重组菌或以上任一所述方法在植物育种中的应用。
所述育种的目的为培育钾离子吸收能力高和/或钾离子吸收速率高和/或对低钾环境的耐逆性高的植物。
所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如kc1突变株拟南芥。
以上任一所述低钾具体可为钾浓度为100μM。
本发明中，通过试验证实了将KC1-D基因在目的植物中表达后，可以增加植物对低钾环境的耐受能力，增加植物对钾离子的吸收能力和吸收速度。本发明对培育耐低钾新品种，以及植物对低钾耐受的研究具有重要意义。本发明在作物分子改良中具有较大应用价值，对于培育耐受低钾胁迫的作物具有重要的理论意义和实践意义。
附图说明
图1为表型观察的照片。
图2为钾离子含量检测的结果。
图3为钾离子吸收速率检测的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Super1300载体：购自上海北诺生物科技有限公司，货号为addgene0595。
农杆菌菌株GV3101：CloughSJ,BentAF(1998)Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.16:735-743。
哥伦比亚生态型拟南芥，用Col表示。
从ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)购买编号为SALK_140579的T-DNA插入突变体(插入位置位于KC1基因中)，将其命名为kc1突变株拟南芥。经测序，kc1突变株拟南芥为纯合突变株，T-DNA取代了序列表的序列4第1505至1529位核苷酸之间的小片段，从而敲除了KC1基因全长的表达。
MS液体培养基(pH5.8)：每升含1650mgNH4NO3，1900mgKNO3，370mgMgSO4·7H2O，170mgKH2PO4，440mgCaCl2·2H2O，22.3mgMnSO4·4H2O，0.83mgKI，0.025mgCuSO4·5H2O，6.25mgH3BO5，0.025mgCoCl·6H2O，8.65mgZnSO4·7H2O，0.25mgNa2MoO4·2H2O，27.8mgFeSO4·7H2O和37.3mgNa2-EDTA，用电阻大于18MΩ的双蒸水定容至1L。MS培养基中钾浓度为20.7mM。MS固体培养基：在MS液体培养基的基础上，每升加入30g蔗糖、9g琼脂粉。
LK液体培养基(pH5.8)：每升含2300mg/LNH4NO3，370mg/LMgSO4·7H2O，144mg/LNH4H2PO4，440mg/LCaCl2·2H2O，22.3mgMnSO4·4H2O，0.83mgKI，0.025mgCuSO4·5H2O，6.25mgH3BO5，0.025mgCoCl·6H2O，8.65mgZnSO4·7H2O，0.25mgNa2MoO4·2H2O，27.8mgFeSO4·7H2O和37.3mgNa2-EDTA，用电阻大于18MΩ的双蒸水定容至1L。LK培养基中钾浓度为100μM。LK固体培养基：在LK液体培养基的基础上，每升加入30g蔗糖、9g琼脂粉。
1/4MS液体培养基：各个溶质的含量均为MS液体培养基的四分之一。
1/4LK液体培养基：各个溶质的含量均为LK液体培养基的四分之一。
LK1培养基：KCl的浓度为250μM，其它溶质的含量均为LK液体培养基的四分之一。
实施例1、KC1-D蛋白及其编码基因的获得
通过对EMS随机诱变的数十万株哥伦比亚生态型拟南芥幼苗进行低钾胁迫筛选，获得的具有耐低钾性状的突变体。经测序发现，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，该突变体在某一开放阅读框中发生了一个SNP突变(由G突变为A)。突变体中的相应开放阅读框如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。哥伦比亚生态型拟南芥中的相应开放阅读框如序列表的序列4所示，编码序列表的序列3所示的蛋白质。
与序列3相比，序列1的差异仅在于将序列3中的第322位氨基酸残基由甘氨酸突变为了天冬氨酸。与序列4相比，序列2的差异仅在于将序列4中的第965位核苷酸由G突变为了A。
将序列表的序列1所示的蛋白质命名为KC1-D蛋白。将编码KC1-D蛋白的基因命名为KC1-D基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。
将序列表的序列3所示的蛋白质命名为KC1蛋白。将编码KC1蛋白的基因命名为KC1基因，其开放阅读框如序列表的序列4所示。
实施例2、KC1-D蛋白的功能验证
一、构建重组质粒
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1得到的双链DNA分子为模板，采用Primer1和Primer2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，回收约2000bp的DNA片段。
Primer1：5'-GCTCTAGAATGTCTACGACGACTACTGAGG-3'；
Primer2：5'-TCGAGCTCTTAGAAAATATATAAATGATCGTT-3'。
3、用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切步骤2得到的DNA片段，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切Super1300载体，回收约10000bp左右的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：将Super1300载体XbaⅠ和SacⅠ之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
6、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
7、以步骤6得到的双链DNA分子为模板，采用Primer1和Primer2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，回收约2000bp的DNA片段。
8、用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切步骤7得到的DNA片段，回收酶切产物。
9、将步骤8的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：将Super1300载体XbaⅠ和SacⅠ之间的小片段取代为了序列表的序列4所示的双链DNA分子。
二、培育转基因植物
1、将重组质粒甲导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
2、采用花芽浸泡法(CloughandBent,Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJournal1998,16:735-743.)，用步骤1得到的重组农杆菌侵染kc1突变株拟南芥，收获T1代种子。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固体培养基平板上筛选T1代植株并进行T2代和T3代的分离比统计，在T3代得到转KC1-D基因拟南芥单拷贝纯合株系，随机取两个株系，命名为株系1和株系2。
3、将重组质粒乙导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
4、采用花芽浸泡法(CloughandBent,Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJournal1998,16:735-743.)，用步骤3得到的重组农杆菌侵染kc1突变株拟南芥，收获T1代种子。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固体培养基平板上筛选T1代植株并进行T2代和T3代的分离比统计，在T3代得到转KC1基因拟南芥单拷贝纯合株系，随机取两个株系，命名为株系3和株系4。
三、表型检测
待测植物分别为：株系1的T3代植株、株系2的T3代植株、株系3的T3代植株、株系4的T3代植株、kc1突变株拟南芥、哥伦比亚生态型拟南芥。
1、表型观察
(1)将待测植物的种子播种于MS固体培养基，培养4天。
(2)完成步骤(1)后，将幼苗分成两组，分别移苗至MS固体培养基和LK固体培养基，培养12天后拍照。
培养条件：22℃、24小时光照(光强60μmol/m2/s)。
每种待测植物进行三次重复试验，每次重复试验中每个待测植物取200粒种子。
部分照片见图1。在MS固体培养基中培养，各个待测植株的表型基本一致，没有显著差异。在LK固体培养基中培养，kc1突变株拟南芥、哥伦比亚生态型拟南芥冠部均开始表现出发黄的缺钾症状，株系3和株系4的表型与kc1突变株拟南芥一致(冠部均开始表现出发黄的缺钾症状)，株系1的冠部仍保能保持绿色，株系2的表型与株系1一致(冠部仍保能保持绿色)。结果表明，导入KC1-D基因可以增加植物对低钾环境的耐逆性。
2、钾离子含量检测
(1)将待测植物的种子播种于MS固体培养基，培养4天。
(2)完成步骤(1)后，将幼苗分成两组，分别移苗至MS固体培养基和LK固体培养基，培养10天，然后分地上部分(冠))和地下部分(根)取样。
(3)取步骤(2)得到的样品，用超纯水冲洗，然后在80℃烘箱中烘至恒重(称干重)，然后在马弗炉进行灰化处理(300℃炭化1h、575℃灰化5h)。
(4)取步骤(3)的产物，用10mL0.1MHCl水溶液溶解，室温放置2h后进行稀释，稀释液中的钾浓度位于30-200μM区间。
(5)通过安捷伦4100微波等离子体原子发射光谱仪测定步骤(4)得到的稀释液中的钾离子浓度，计算单位干重中的钾含量。
培养条件：22℃、24小时光照(光强60μmol/m2/s)。
每种待测植物进行三次重复试验，每次重复试验中每个待测植物取2000粒种子，结果取平均值。
部分结果见图2。在MS固体培养基中，株系1的根部的钾离子含量显著高于kc1突变株拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥，株系1和株系2根部的钾离子含量没有显著差异，株系3、株系4和kc1突变株拟南芥根部的钾离子含量没有显著差异。在MS固体培养基中，株系1的冠部的钾离子含量显著高于kc1突变株拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥，株系1和株系2冠部的钾离子含量没有显著差异，株系3、株系4和kc1突变株拟南芥冠部的钾离子含量没有显著差异。在LK固体培养基中，株系1的冠部的钾离子含量显著高于kc1突变株拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥，株系1和株系2冠部的钾离子含量没有显著差异，株系3、株系4和kc1突变株拟南芥冠部的钾离子含量没有显著差异。
3、钾离子吸收速度检测
(1)将待测植物的种子播种于MS固体培养基，培养5天。
(2)完成步骤(1)后，将幼苗转移至1/4MS液体培养基中，培养12小时。
(3)完成步骤(2)后，将幼苗转移至1/4LK液体培养基中，培养4天(每隔12小时更换新的1/4LK液体培养基)。
(4)完成步骤(3)后，将幼苗转移至LK1培养基中，培养，间隔时间取LK1培养基，检测其中的钾离子浓度。
部分结果见图3。培养株系1的LK1培养基中的钾离子浓度显著低于培养kc1突变株拟南芥的LK1培养基中的钾离子浓度，培养株系1的LK1培养基中的钾离子浓度与培养株系2的LK1培养基中的钾离子浓度没有显著差异，培养株系3的LK1培养基中的钾离子浓度和培养株系4的LK1培养基中的钾离子浓度均与培养kc1突变株拟南芥的LK1培养基中的钾离子浓度没有显著差异。结果表明，导入KC1-D基因可以增加植物吸收钾离子的速度。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物对低钾环境的耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物对低钾环境的耐逆性相关蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物对低钾环境的耐逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)至(c6)中的至少一种：
(c1)调控植物的钾离子吸收能力；
(c2)促进植物的钾离子吸收能力增加；
(c3)调控植物的钾离子吸收速率；
(c4)促进植物的钾离子吸收增加；
(c5)调控植物对低钾环境的耐逆性；
(c6)增加植物对低钾环境的耐逆性。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物满足如下(d1)至(d3)中的至少一种表型：
(d1)钾离子吸收能力高于所述目的植物；
(d2)钾离子吸收速率高于所述目的植物；
(d3)对低钾环境的耐逆性高于所述目的植物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因，或权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或，权利要求7或8所述方法，在植物育种中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述育种的目的为培育钾离子吸收能力高和/或钾离子吸收速率高和/或对低钾环境的耐逆性高的植物。
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