CN110643630B - Knat1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，本发明通过实验证明了所述KNAT1基因具有提高植物盐胁迫抗性的功能。本发明通过基因工程技术获得了KNAT1基因的超表达载体pBI121‑KNAT1，并由此获得了拟南芥的超表达株系，在经过筛选后最终获得KNAT1基因超表达纯合株系。在盐胁迫下，所述纯合株系具有明显提高植物盐胁迫抗性的能力，不仅能够增加种子萌发率和子叶展开率，缩短种子萌发和子叶展开时间，而且可以提高成苗期株系的存活率。本发明通过实验确认了KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性方面具有潜在的应用价值，并为利用KNAT1基因培育耐盐、高产的农作物品种奠定良好的理论和应用基础。

Description

KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用。

背景技术

盐胁迫是影响农作物产量的非生物胁迫因子之一，主要因为在农作物种植过程中，大面积的盐碱地和盐渍化土壤会使部分农作物品种受到不同程度的盐害影响，进而难以发挥出农作物自身的产量潜力。而植物的抗盐性是一个由多基因决定的复杂的数量性状，且不同植物的耐盐方式和耐盐机理是存在区别的，其组织或细胞的耐盐反应也均有不同。随着耕地面积不断地减少以及人口不断地增长，为了农作物具有更高的产量和性状，研究农作物的耐盐机理、培育耐盐农作物品种对开发和有效利用盐碱地或盐渍化土壤具有重要的现实意义。

同源异型盒基因(homeobox genes)是一类广泛存在于动植物和酵母中高度保守的DNA序列，用于编码转录调控因子(同源异型盒蛋白)，在细胞增殖分化中起着精密的调节作用。最早的同源异型盒基因在果蝇中被发现，但研究者第一次从植物中分离出来的同源异型盒基因是KNOTTED1(KN1或ZmKN1)，它是从玉米(Zea mays)功能获得性突变体中得到的，而该突变体可以使玉米叶脉附近形成手指状突起结构。自此以后，人们陆续从拟南芥、水稻、大麦、番茄等植物中克隆到大量类似于ZmKN1的基因，并将这些基因形成一个家族，称之为KNOX家族。根据基因核苷酸序列及其所编码蛋白质同源结构域中氨基酸序列的相似性、表达模式的不同，研究者将KNOX分为两类亚家族：I类KNOX亚家族(KNOX I)和II类KNOX亚家族(KNOX II)。两类亚家族成员之间具有比较大的结构差异性，且每个亚家族内的蛋白质结构都具有高度的保守性。

KNAT1基因属于KNOX I亚家族，该基因与拟南芥调控发育及形态相关，比如可以调控拟南芥果荚与花序茎的夹角，其CDS长度为1197bp，编码含有399个氨基酸的转录因子。在现有研究中，KNOX I亚家族可以在植物的分生组织中表达，是分生组织发生与维持所必需的关键基因，还可以调控与器官发生相关的细胞分化，进而影响侧生器官的形态建成，其单基因突变表现出较为强烈的发育及形态上的变化。但至今，有关KNAT1基因在植物非生物胁迫中的功能及作用的相关报道却尚未发现。

发明内容

针对上述现有技术的情况，本发明的目的在于提供了KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，本发明通过KNAT1基因获得KNAT1基因超表达载体pBI121-KNAT1，并进而获得了KNAT1基因超表达纯合株系，所述超表达株系具有很好的盐胁迫抗性。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用。

进一步的，所述应用的方法为：将含有所述KNAT1基因的超表达载体通过花絮侵染法转化到植物中而获得具有盐胁迫抗性的植物。

进一步的，所述超表达载体为pBI121-KNAT1。

进一步的，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁迫下的种子萌发率明显高于野生型株系及突变体。

进一步的，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁迫下的子叶展开率明显高于野生型株系及突变体。

进一步的，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁迫下的成苗存活率明显高于野生型株系及突变体。

进一步的，所述植物为拟南芥。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：本发明通过基因工程技术获得了KNAT1基因的超表达载体pBI121-KNAT1，并通过筛选获得了KNAT1基因超表达纯合株系，在盐胁迫下，这些株系具有明显的提高植物盐胁迫抗性的能力，进而能够增加植物种子的萌发数量和速度、缩短子叶展开的时间，提高成苗期株系的存活率。本发明通过实验首次确认了KNAT1基因可以提高拟南芥的盐胁迫性，并鉴于KNAT1基因在盐胁迫中的应用，可以认为该基因对提高植物盐胁迫性具有潜在的应用价值，同时本发明也为利用KNAT1基因培育耐盐、高产的农作物品种奠定良好的理论和应用基础。

附图说明

图1为本发明的KNAT1基因的核苷酸序列和氨基酸序列。

图2为本发明的KNAT1基因超表达纯合株系表达量的检测电泳图。

图3为本发明的野生型WT、KNAT1基因突变株knat1-11和knat1-12及KNAT1基因超表达纯合株系OE-18和OE-19的种子萌发及子叶展开结果；其中图3A：上述株系在正常条件(CK)及盐胁迫下的种子萌发及子叶展开表型；图3B：萌发率统计结果；图3C：子叶展开率统计结果。

图4为本发明的野生型WT、KNAT1基因突变株knat1-11和knat1-12及KNAT1基因超表达纯合株系OE-18和OE-19成苗存活率结果；其中图4A：上述株系在正常条件(CK)及盐胁迫下的成苗表型；图4B：存活率统计结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

以下实验中用到的试剂购自TAKARA、Sigma等生物公司；蛭石培养基质和营养液也均为市售产品。

实施例1：KNAT1基因突变体和超表达纯合株系的获得

在拟南芥TAIR数据库中获得KNAT1基因的CDS序列，其长度为1197bp，编码含有399个氨基酸的蛋白质，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一、KNAT1基因突变体株系的获得

KNAT1基因X-射线诱变突变体knat1-11通过拟南芥生物资源中心(ABRC)获得；KNAT1基因突变体knat1-12经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得，具体为使用0.5％EMS浸泡拟南芥种子12h后再对其进行纯合体筛选、表达、分析并最终进行鉴定，鉴定结果显示EMS诱变成功，获得拟南芥knat1-12突变体，而在突变体中KNAT1基因几乎无表达。

二、KNAT1基因超表达纯合株系的获得

1、KNAT1基因超表达株系的获得

(1)根据上述获得的KNAT1基因的序列，设计基因特异引物，其序列如下：

KNAT1-F：5’-ATGGAAGAATACCAGCATGACAACAGC-3’(SEQ ID No：1)

KNAT1-R：5’-TGGACCGAGACGATAAGGTC-3’(SEQ ID No：2)

通过PCR技术扩增KNAT1基因，并将其扩增产物进行回收、纯化后克隆到pMD18-TSimple克隆载体上，获得pMD18-T-KNAT1重组质粒，经测序确认后，使用限制性内切酶BamHI与SacI对pMD18-T-KNAT1重组质粒和pBI121质粒进行双酶切，将KNAT1基因连接到pBI121中35S启动子后面获得超表达载体pBI121-KNAT1。

(2)将步骤(1)得到的超表达载体pBI121-KNAT1转化至农杆菌GV3101中，并利用花絮侵染法(将农杆菌重悬于含有5％蔗糖溶液和0.1％的表面活性剂Silwet L-77的侵染液中，选择盛开的拟南芥花絮，浸入侵染液中10秒，在暗箱中培养24小时后，将侵染过的拟南芥置于正常光照条件下培养)获得KNAT1I基因超表达株系。

2、KNAT1基因超表达纯合株系的筛选

(1)将KNAT1超表达株系的种子做为T₀代；

(2)将T₀代种子在含有卡那霉素(终浓度为50mg/L)的培养基上培养，由于转基因后的拟南芥具有卡那霉素抗性，可以正常生长，因此叶片为绿色，而非转基因的拟南芥无卡那霉素抗性，因此叶片变为黄色，此时需挑选绿苗种在蛭石培养基质中，单株收到的种子为T₁代；

(3)将T₁代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选后代绿苗：黄苗分离比为3：1的株系中的绿苗种在蛭石培养基质中，单株收到的种子为T₂代；

(4)将T₂代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选后代均是绿苗的株系种在基质中，收到的种子即为KNAT1基因超表达纯合株系的种子，并选取其中5株分别标记为OE3、OE5、OE7、OE18和OE19。

3、RT-PCR检测

对KNAT1基因纯合株系种子OE3、OE5、OE7、OE18和OE19提取DNA后进行RT-PCR实验，其中RT-PCR实验所使用的引物为：

KNAT1-RT-F：5’-ATCCTGATGGGAAGAGTGACA-3’(SEQ ID No：3)

KNAT1-RT-R：5’-TGCAGACCATCCATCACCATG-3’(SEQ ID No：4)

实验结果如图2所示，KNAT1基因在纯合株系中的表达水平均有增加，而在纯合株系OE-18和OE-19中基因表达水平增加的最明显。

实施例2：盐胁迫下KNAT1基因对种子萌发及子叶展开的影响

1、培养基的制备

(1)用于植物组织培养的1/2MS(-)培养基的配置：称取2.37g药品MS，15g蔗糖，溶解于超纯水中并定容至1000ml，用1M KOH溶液和稀盐酸调节pH至5.80。

高盐培养基的配置：在1/2MS(-)培养基配方的基础上再添加58.44g氯化钠，即可配置成含有175mM NaCl的高盐培养基。

(2)分装：每次量取200ml的1/2MS(-)液体培养基分装于250ml三角瓶中，再向每个三角瓶中加入1.6g琼脂后置于121℃下高压灭菌20分钟。

(3)灭菌结束后，待培养基冷却至50-60℃时，倒入玻璃培养皿中，每200m1分装10个玻璃培养皿。待培养基凝固后，标记浓度，密封于无菌袋备用。

2、种子萌发和子叶展开检测

以野生型株系WT及实施例1中获得的2株突变体knat1-11、knat1-12和2株超表达纯合株系OE-18、OE-19的种子作为处理材料。

选取同时期的大小一致、籽粒饱满的实验种子，将上述种子的表面用氯气消毒5h。将培养基分为2组，分别加入1/2MS(-)培养基和高盐培养基作为对照组CK和盐胁迫组，再将上述培养皿平均划分为五区，每区播种一种株系种子，每种播种28粒种子，并在培养皿上做好标记，同时做4个平行实验，将培养皿密封，在4℃下黑暗层积三天，然后在22℃下横培生长，观察种子的生长情况并每12h统计一次萌发率。一周后5种株系的种子萌发及子叶展开表型结果如图3A所示，在正常(CK)条件下，所有种子在2d已全部萌发；而在盐胁迫条件下，所有种子需要3.5d才能全部萌发。萌发率的结果如图3B所示，同时间内，盐胁迫组中的种子萌发率比对照组中的低，但在盐胁迫组中，超表达株系的种子萌发率明显高于野生型株系及knat1突变体。另外，萌发一周后统计各株系子叶展开数量并统计子叶展开率，结果如图3C所示，超表达株系的子叶展开率明显高于野生型株系及knat1突变体。上述结果说明盐胁迫能够显著减少植物的种子萌发和子叶展开，而KNAT1基因却可以明显提高植物的盐胁迫抗性，提高了植物的萌发率和子叶展开，进而增加了植物种子的萌发以及株系子叶的展开能力，缓解种子遭受的盐胁迫。

实施例3：盐胁迫下KNAT1基因对成苗生长表型及存活率的影响

1、培养基质制备

选择用于植物生长的蛭石培养基质，根据实验所需配制植物生长所需营养液及含有100mM NaCl的高盐营养液。

2、成苗生长及存活率检测

以野生型株系WT以及实施例1中获得的2株突变体knat1-11、knat1-12和2株超表达纯合株系OE-18、OE-19的种子作为处理材料。

选取同时期的大小一致、籽粒饱满的实验种子，将上述种子的表面用氯气消毒5h后均匀分散的铺于1/2MS(-)培养基上，然后密封，在4℃下黑暗层积三天，再在22℃下竖培生长5天，将幼苗种植于蛭石培养基质中生长两周后分为2组，一组补充营养液作为对照组CK，另一组补充高盐营养液作为盐胁迫组，之后每三天补充一次，共处理三次。处理完成后，观察不同处理下拟南芥各株系的存活表型并统计存活数目，结果如图4A和4B所示，盐胁迫组的成苗存活率明显低于对照组，而在盐胁迫组中，超表达株系的成苗存活率明显高于野生型株系及knat1突变体，说明盐胁迫能够显著阻碍植物的成苗存活，而KNAT1基因却可以明显提高植物的盐胁迫抗性，提高了植物的存活率，增加植物成苗存活能力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaagaat accagcatga caacagc 27

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggaccgaga cgataaggtc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcctgatgg gaagagtgac a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcagaccat ccatcaccat g 21

<210> 5

<211> 1197

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 5

atggaagaat accagcatga caacagcacc actcctcaaa gagtaagttt cttgtactct 60

ccaatctctt cttccaacaa aaacgataac acaagtgata ccaacaacaa caacaacaat 120

aataatagta gcaattatgg tcctggttac aataatacta acaacaacaa tcatcaccac 180

caacacatgt tgtttccaca tatgagctct cttctccctc aaacaaccga gaattgcttc 240

cgatctgatc atgatcaacc caacaacaac aacaacccat ctgttaaatc tgaagctagc 300

tcctcaagaa tcaatcatta ctccatgtta atgagagcca tccacaatac tcaagaagct 360

aacaacaaca acaatgacaa cgtaagcgat gttgaagcca tgaaggctaa aatcattgct 420

catcctcact actctaccct cctacaagct tacttggact gccaaaagat tggagctcca 480

cctgatgtgg ttgatagaat tacggcggca cggcaagact ttgaggctcg acaacagcgg 540

tcaacaccgt ctgtctctgc ctcctctaga gacccggagt tagatcaatt catggaagca 600

tactgtgaca tgttggttaa atatcgtgag gagctaacaa ggcccattca ggaagcaatg 660

gagtttatac gtcgtattga atctcagctt agcatgttgt gtcagagtcc cattcacatc 720

ctcaacaatc ctgatgggaa gagtgacaat atgggatcat cagacgaaga acaagagaat 780

aacagcggag gggaaacaga attaccggaa atagacccga gggccgaaga tcgggaactc 840

aagaaccatt tgctgaagaa gtatagtgga tacttaagca gtttgaagca agaactatcc 900

aagaagaaaa agaaaggtaa acttcctaaa gaagcacggc agaagcttct cacgtggtgg 960

gagttgcatt acaagtggcc atatccttct gagtcagaga aggtagcgtt ggcggaatca1020

acggggttag atcagaaaca aatcaacaat tggttcataa accaaagaaa gcgtcactgg1080

aaaccatctg aagacatgca gttcatggtg atggatggtc tgcagcaccc gcaccacgca1140

gctctgtaca tggatggtca ttacatgggt gatggacctt atcgtctcgg tccataa 1197

Claims (5)

1.KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，其特征在于：所述KNAT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将含有所述KNAT1基因的超表达载体通过花序侵染法转化到植物中而获得具有盐胁迫抗性的植物。

3.根据权利要求2所述的KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述超表达载体为pBI121-KNAT1。

4.根据权利要求1所述的KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁迫下的子叶展开率明显高于野生型株系及所述KNAT1基因无表达的突变体。

5.根据权利要求1所述的KNAT1基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，其特征在于，含有所述KNAT1基因的植物超表达纯合株系在盐胁迫下的成苗存活率明显高于野生型株系及所述KNAT1基因无表达的突变体。

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