CN102533760A - 提高水稻分蘖的小分子RNA Osa-miR393及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种提高水稻分蘖数的小分子microRNAOsa-miR393，同时涉及该小分子RNA和其作用的靶基因在转基因水稻中的应用。发明通过基因工程的方法得到超表达Osa-miR393的转基因水稻。此超表达水稻稳定表现出分蘖数显著性高于对照的表型，证实了Osa-miR393基因的功能。对其结合基因的表达分析表明，Osa-miR393通过影响靶基因LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460的表达具有调控植株分蘖的功能。通过基因工程技术提高或者降低Osa-miR393在水稻中的表达，能够调控水稻分蘖，从而控制植株的株型，以达到高产的目的。

Description

提高水稻分蘖的小分子RNA Osa-miR393及用途

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻分蘖的小分子microRNAOsa-miR393及其作用的靶基因LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460，同时涉及该microRNA和靶基因在转基因水稻中的应用。本发明利用网上microRNA数据库克隆了一种属于bHLB转录因子的小分子RNA Osa-miR393，将其导入pNW55载体后，通过酶切连入双元表达载体pCambial301，构建超量表达载体Ami393，并转入水稻中花11。该microRNA超表达后的T0、T1和T2代转基因植株均稳定出现分蘖数目显著性增加的现象。该基因及其与靶基因作用的模式对于阐述小分子RNA调控水稻的生长发育过程，控制植株分蘖及抗性能力方面具有重要的应用价值。 

背景技术

水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人以其为主食。为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍然是人们面临的巨大挑战。在产量构成因素穗数、穗粒数和粒重中，穗数的多少在很大程度上受制于分蘖的发生量，因而分蘖是影响水稻与小麦等主要农作物单产的重要农艺形状之一。同时，分蘖又是单子叶植物一种特殊的分枝现象，具有重要的发育生物学意义。探索控制水稻分蘖的分子机理将有助于生产上遗传调控分蘖并促进植物分枝的分子机理研究，而水稻中与分蘖相关基因的分离与鉴定是控制水稻分蘖的分子机理研究的瓶颈。一些参与调控水稻分蘖的重要基因与拟南芥都属于同源基因。如水稻MONOCULM1(MOC1)和Arabidopsis LATERAL SUPPRESSOR(LAS)是同源基因，分别在控制水稻和拟南芥花芽的分化方面具有重要意义。(Li X，Qian Q，Fu Z，et al.Control of tilleringin rice.Nature，2003，422：618-621.Greb T，Clarenz O，Schafer E，et al.Molecular analysis of theLATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillarymeristem formation.Genes Dev，2003，17：1175-1187.)已经得到了很多控制水稻和拟南芥分蘖的突变体，分别命名为more axillary growth(max)and dwarf(d)Mutants。这些突变体具有类似的表型：分蘖增加和植株变矮。这些突变体性状的形成都是由于独脚金萌发素内酯(strigolactone)的合成或者信号传导受限所导致的(Umehara M，Hanada A，Yoshida S，et al.Inhibition of shoot branching by new terpenoid planthormones.Nature，2008，455：195-200；Gomez-Roldan V，Fermas S，Brewer PB，et al.Strigolactone inhibition of shoot branching.Nature， 2008，455：189-194.)。至目前为止，已经克隆出多个与水稻分蘖相关的基因，1个就是我国李学勇等研究的MOC1基因(Fengli Sun，Weiping Zhang，Guosheng Xiong，Meixian Yan，QianQian，Jiayang Li，Yonghong Wang.Identification and functional analysis of the MOC1 interactingprotein 1 J.Genet.Genomics，2010，37：69-77.)。另两个则都是日本人研究的OsTB1基因和D3基因(Takeda T，Suwa Y，et al.The OsTB1 gene negatively regulates lateral branching in rice.Plant J，2003，33(3)：513-20.；Haifang Yan，Hiroaki Saika，et al.Rice tillering dwarf mutant dwarf3has increased leaf longevity during darkness-induced senescence or hydrogen peroxide-induced celldeath.Genes genetic systems，2007，82(4)：361-366)。MOC1基因是李家洋院士等以自然发生的一个单秆分蘖的突变体“moc1”为材料，采用图位克隆的方法分离出来的控制水稻分蘖的关键基因。MOC1基因控制着腋生分生组织的起始和分蘖芽的形成，同时还有促进分蘖芽生长的功能。水稻OsTB1基因，是Takeda等基于与玉米TB1(Teosinte branched 1)基因序列相似性采用同源克隆方法分离出来的。基因功能研究发现，OsTB1基因控制侧芽伸长。OsTB1的过量表达抑制侧芽的生长，过量表达的转基因水稻植株分蘖数目显著减少，而侧芽的起始不受影响。水稻中一个典型的突变体“fc1”(fine culm1)被发现缺失OsTB1功能，其表现为分蘖增多。D3基因是Ishikawa等最近以多蘖型矮秆突变体“Id3”为材料，采用图位克隆的方法分离出来的与水稻分蘖相关的又一新基因(Ishikawa S，Maekawa M，Arite T，et al.Suppression oftiller bud activity in tillering dwarf mutants of rice.Plant Cell Physiol，2005，46：79-86.)。张等研究发现Osa-MIR156e在水稻中的表达量高低影响了水稻的分蘖数。水稻的分蘖是一个复杂的发育性状，易受环境影响，故通常也被认为受数量性状位点(QTLs)控制。这方面的研究报道很多，至今至少已发现了27个影响分蘖数目的数量性状位点，分布在除第9染色体之外的其余11条染色体上，但不同研究者的结果很不一致，不仅QTL数目、在染色体上分布不一致，而且QTL的贡献率、效应也不同。目前对QTL的分析在相当程度上还是建立在统计分析的基础上，缺乏十分完善的分析方法及应用软件来分析基因之间的互作，从而难以精细定位单个QTL以及分析其效应和互作方式，进而进行位点克隆或获取目标QTL基因。控制分蘖数目的QTL也不例外，至目前为止还没有通过图位克隆的方法分离相关的QTL的报道，更未进行基因功能与表达调控分析。因此，现在各国都在创建各种突变体库，并以此为平台克隆基因，而更多的植物分蘖基因也有望通过此方法被克隆出来。 

MicroRNA与植物的生长发育有着密切的关系。MicroRNA的正常表达是植物正常生长发育所必需的。人们最初通过提高或降低植物体中microRNA的表达量，或者通过改变microRNA中核苷酸以降低与其靶基因中碱基配对程度来研究植物microRNA的功能。MicroRNA miR393是一类高度保守的microRNA，尽管miR393的前体在不同的植物种类中 差别很大，但是其成熟序列均是21个碱基。目前，在拟南芥，水稻，苹果，杨树，苜蓿及番茄中均发现了miR393基因(Sunkar R，Zhu JK.Novel and stress-regulated microRNAs andother small RNAs from Arabidopsis.Plant Cell，2004，16：2001-2019；Navarro L.，Dunoyer P，Jay F，et al，A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressingauxin signaling.Science，2006，312：436-439；Moxon S，Jing R，Szittya G，et al.Deepsequencing of tomato short RNAs identifies microRNAs targeting genes involved in fruitripening.Genome Res，2008，18：1602-1609.)。miR393通过调控IAA途径中部分生长素受体mRNA的表达调控着植物的生长发育(Navarro L，Dunoyer P，Jay F，et al，A plant miRNAcontributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.Science，2006，312：436-439)。同时miR393被认为正向调控了植物应对对病毒侵染、低温、干旱、高盐和ABA胁迫(Sunkar R，Zhu JK.Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAsfrom Arabidopsis.Plant Cell，2004，16(8)：2001-2019；Navarro L，Dunoyer P，Jay F，et al.Aplant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling.Science，2006，312(5772)：436-439.Gao P，Bai X，Yang L，et al.osa-MIR393：a salinity-andalkaline stress-related microRNA gene.Mol Biol Rep，2011，38：237-242)。虽然对miR393的功能进行了一定的研究，但是都集中于植物应对胁迫诱导，未见miR393调控植物分蘖的报导，同时也未见miR393通过调控生长素受体蛋白基因mRNA的表达调控植物分蘖的报导。同时，植物中的microRNA及其对植物生长发育的影响是植物生物学研究领域中的一个热点，它为植物生物学的研究提出了新的研究思路。但是随着研究的深入，越来越多的问题摆在人们面前有待解决，如microRNA对多个靶基因的网络调控具体机制是怎样的，microRNA作用过程中是否有放大效应，植物中究竟有多少microRNA，如何查清楚植物中的microRNA并找出它们的靶基因和揭示它们的功能。只有揭示其作用的靶基因后才能更好地进行功能研究，从而才可以弄清楚它在生命活动中的作用。就目前的研究来看，虽然各个物种中发现的microRNA数量已不少，但能说明microRNA的靶基因及其功能的直接证据并不多，而且多数是通过筛选突变体获得的。相信，随着microRNA研究技术的不断成熟，将有更多的microRNA及其靶基因被鉴定出来，并进行更为详细的生物学功能的研究。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制水稻分蘖的基因Osa-miR393在转基因水稻中的应用。通过控制Osa-miR393或其靶基因及其同源基因在水稻的表达量来控制水稻分蘖数，从而形成理 想株型，达到增产的目的。本基因的克隆还对阐明Osa-miR393基因家族的生物学功能有重要意义以及对植物分蘖的分子机理研究将具有极大的推动作用。 

实现本发明的技术如下： 

1.人工超表达microRNA Osa-miR393载体的构建 

通过网站http://www.mirbase.org找到Osa-miR393的序列，把此microRNA序列输入microRNA的设计应用网站 http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Home；project＝stdwmd自动合成四条引物，通过多轮PCR扩增，将microRNA片段连入适合于构建水稻人工干涉RNA的载体pNW55，同时通过酶切的方式连入植物双元表达载体pCambia 1301，命名为Ami393。 

2.创建超表达Osa-miR393的转基因水稻(T0，T1和T2代) 

构建超表达载体Ami393，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11，最后获得超表达的组培苗67株，用载体上的引物序列O27和G4369进行PCR扩增检测后共得到60株转基因阳性植株，阳性率为89.6％。作为对照的由正常粳稻品种中花11愈伤分化的组培苗30株，都种于大田。结果显示超表达组培苗出现分蘖增多的表型。将Ami3933T1代和T2代种子种植于大田后，分别在晚季和早季出现分蘖数目较对照中华11和转空载体植株p1301显著性增加的现象，说明Osa-miR393基因具有控制水稻分蘖的功能。 

3.Osa-miR393的应用 

单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合植株，超表达植株的开花提前、分蘖数显著性提高。有望通过调控Osa-miR393的表达从而达到控制水稻的分蘖数的目的，从而根据不同的水稻品种要求增加或者减少水稻的分蘖数，形成理想的水稻株型，达到提高水稻的产量的目的。 

4.Osa-miR393靶基因的分析及Ami393中靶基因的表达分析 

通过网站http://bioinfo3.noble.org/miRNA/miRU.htm对Osa-miR393作用的靶基因进行了分析，网站预测有11个靶基因(见表1)。设计引物，用定量q-PCR的方法对其作用的靶基因在Ami393转基因材料中的表达进行了分析，发现T1代和T2代都只有两个生长素受体基因LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460(LOC_Os04g32460.1和LOC_Os04g32460.2)在Ami393中被显著性的下调。表明Osa-miR393可能通过参与这两个基因的表达，从而调控了植株的分蘖。 

表1：Osa-miR393作用的靶基因预测分析 

5.萘乙酸(1-naphthlcetic acid，NAA)敏感性实验 

分别用1x10^-3和1x10^-4不同浓度的NAA浸泡种子，种子在26±2℃每天光照14小时的条件下萌发10天后测量对照和Ami393转基因植株种子萌发主根的长度及根的数量，发现Ami393植株对NAA的敏感度降低，在两个不同的浓度下均主根长度明显长于对照，根的数量也显著性多于对照。 

6.用不同浓度的2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)诱导愈伤结果图。 

分别用2mg/L，3mg/L和4mg/L的2，4-D诱导愈伤。结果发现Ami393植株比对照的愈伤诱导率明显要少，更易长出芽，Bar＝0.5cm。D：2，4-D处理21天后愈伤诱导率的统计结果。证明Ami393转基因植株对2，4-D的敏感要差。 

本发明的优点和效果： 

1.虽然现在对miR393的研究较多，但是以往的研究都注重于其在逆境中的功能，未见其控制植株分蘖的报导。本发明显示水稻的microRNA Osa-miR393能成功的控制水稻的分蘖数，这对于植物分蘖的分子调控机理研究将具有极大的推动作用。 

2.Osa-miR393的超量表达不仅使得水稻的分蘖显著性增加，而且还使得水稻的开花提前 了1O天左右，因此该基因对于植物重要农艺性状的研究具有重要的意义。 

3.Osa-miR393的超表达能使水稻的分蘖数显著性增加，说明Osa-miR393基因对于改变分蘖效果很明显，通过基因工程技术提高或者减弱Osa-miR393的表达能够控制植物分蘖或分枝的数量，从而有利于育成理想株型，达到增产的目的。 

4.在11个Osa-miR393作用的候选靶基因中只有两个生长素受体基因的mRNA在T1和T2代均显著性的被下调。证明Osa-miR393是通过与OsTIR1基因(LOC_Os05g05800.1)和OsAFB2(LOC_Os04g32460)mRNA的结合，抑制这两个基因的表达，从而调控植株的分蘖数。 

附图说明

图1：人工干涉RNA中间载体的构建示意图，其编码的miRNA形成的茎环结构。 

a)：通过第一轮PCR载体pNW55上的原始的miRNA528和miRNA*序列(绿色)被人工miRNA序列(红色)代替。黄色代表载体上的引物，多克隆位点用蓝色表示。 

b)：以pNW55为模板的三个PCR反应(G4368+II，I+IV，III+G4368)产生了三个PCR反应产物。 

c)：以以上3个PCR反应产物为模板，用引物G4368和G4369扩增产生的的DNA片段即为所需要的克隆。 

引物序列： 

I miR-s：agTCCAAAGGGATCGCATTGATCcaggagattcagtttga 

II miR-a：tgGATCAATGCGATCCCTTTGGActgctgctgctacagcc 

III miR*s：ctGATCATTGCCATCCCTTTGGAttcctgctgctaggctg 

IV miR*a：aaTCCAAAGGGATGGCAATGATCagagaggcaaaagtgaa 

G4368：CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGG TAA C 

G4369：GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG GAA ACA G 

PCR反应条件见下表：所有的PCR反应均用Takara公司的高保真酶Ex-Taq 

图2：超表达Osa-miR393构建的Ami393载体示意图。Ami393载体是双元表达载体。 

图3：部分Ami393植株T0代检测结果图。T0代部分转基因植株的PCR检测电泳结果。M：代表分子量marker；+：代表质粒正对照；-：代表未加模板的负对照。阿拉伯数字代表不同的转基因植株。 

图4：部分Ami393植株T1代转基因植株的PCR检测图。T1代部分转基因植株的PCR检测电泳结果。M：代表分子量marker；+：代表质粒正对照；-：代表未加模板的负对照。阿拉伯数字代表不同的转基因植株。 

图5：部分Ami393植株T2代转基因植株的PCR检测图。T1代部分转基因植株的PCR检测电泳结果。M：代表分子量marker；+：代表质粒正对照；-：代表未加模板的负对照。阿拉伯数字代表不同的转基因植株。 

图6：A和B：开花期及乳熟期植株的表型，开花提前月一周，分蘖明显增多；C：不同发育阶段Ami393植株分蘖数比较统计结果。横坐标示水稻移栽后的生长天数，纵坐标示不同株系水稻的平均分蘖数。ZH11：中花11；p1301：1301空载体转基因对照；*和**表示显著性和极显著性差异；6_6，7_5，10_4，31_2示不同的Ami393转基因株系。 

图7：中花11孕穗期不同组织(A)和转基因T2代植株中microRNA393的表达(B)。R：根；C：茎；L：叶；P：穗；Sh：叶鞘；ZH11：中花11；p1301：空载体p1301转基因植株；7-5，31-2，10-4，6-6代表不同的转基因植株，根据结果可以看出Osa-miR393的表达显著性的提高。 

图8：中花11孕穗期不同组织中microRNA393作用目标基因的表达。R：根；C：茎；L：叶；P：穗；Sh：叶鞘，5800：LOC_Os05g05800.1；32460.1：LOC_Os04g32460.1；32460.2：LOC_Os04g32460.2，Actin1：内参。 

图9：用定量PCR方法检测microRNA作用靶基因T1代和T2代在Ami393转基因植株中的相对表达图，用Actin1作为内参。A，B：分别示T1和T2代中LOC_Os05g05800.1的表达，C，D：分别示T1和T2代中LOC_Os04g32460.1的表达；E，F：分别示T1和T2代中LOC_Os04g32460.2的表达。可见这三个靶基因在Ami393植株中都被显著性的下调了。 

图10：分别用0，10^-3，10^-4mg/L的萘乙酸(1-naphthlcetic acid，NAA)浸泡种子，萌发10天后测量主根长度和根的数量。可见转基因植株对NAA的敏感度降低，NAA对其抑制减弱，所以主根的长度和根数量明显强于对照。萘乙酸浸泡种子萌发10天后主根发育统计结果。 

图11：2，4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)处理愈伤的结果图。分别用2mg/L(A)，3mg/L(B)和4mg/L的2，4-D诱导愈伤。结果发现Ami393植株比对照的愈伤诱导率明细要少，更易长出芽，Bar＝0.5cm。D：2，4-D处理21天后愈伤诱导率的统计结果。 

具体实施方式

实施例1：克隆小分子RNA Osa-miR393 

通过网站http://www.mirbase.org找到Osa-miR393的序列，把此microRNA序列输入microRNA的设计应用网站 http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi？page＝Home；project＝stdwmd自动合成四条引 物，通过多重PCR扩增，扩增得到表达Osa-miR393茎环结构的PCR产物片段。 

实施例2：Osa-miR393功能的验证和应用 

1.遗传转化载体的构建 

超表达所用载体是本实验室构建的Ami393。Ami393是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun et al.Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzaein rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.2004，37：517-527)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米35S启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(图2)。将克隆得到的Osa-miR393片段连入pGEMT-easy载体，用AflII和BglII双酶切连入双元表达载体pCambia1301，并替换掉载体内部的Gus表达基因。构建好的最终载体命名Ami393。 

2.遗传转化 

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryzasativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)将载体导入正常中花11水稻品种。农杆菌介导的遗传转化步骤如下： 

1)愈伤诱导 

成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，5％的次氯酸钠溶液消毒50min；灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上；置于黑暗处培养5周，温度25-28℃。 

2)愈伤继代 

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25-27℃。 

3)农杆菌培养 

在带有卡那霉素和链霉素的YEB培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105 2d，温度28℃；将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-4h。 

4)农杆菌侵染 

将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子里；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀＝0.1-0.4；将愈 伤在农杆菌悬浮液中浸泡20min；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2-3d，温度25-27℃。 

5)愈伤洗涤和选择培养 

用含500mg/L的头孢霉素的灭菌水洗涤愈伤4-5次，每次5min直到看不见农杆菌；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。 

6)分化及生根 

将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7d；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(2000lx)下培养，温度25-27℃，5-7周。 

7)移栽 

待愈伤分化成苗并生根后，洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗先用自来水室温浸泡根部1-2天，然后移入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。 

8)转基因植株及突变体植株的分子检测 

待转基因植株长大后，剪取叶子提DNA，并用引物O27F和G4369对其进行PCR检测，从成活的67株组培苗中最后获得超表达植株60株，超表达植株出现开花提前、分蘖数显著性增加的现象。单株收种并种植，直至T2代检测出纯合植株。 

总之，本发明以水稻的一个microRNA Osa-miR393为研究对象，通过超量表达小分子RNAOsa-miR393，使正常的水稻分蘖能力显著性增加，开花提前。对其作用的靶基因的分析发现，在Ami393转基因材料中，两个生长素受体基因LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460被显著性的下调。分析Osa-miR393可能通过与这两个靶基因的mRNA的结合降低其表达从而增加了植株的分蘖。LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460分别属于TR1(TRANSPORTINHIBITOR RESPONSE 1)和AFB(AUXIN SIGNALING F-BOX 2)基因家族，它能抑制植物侧根的发育。 

附农杆菌介导的遗传转化试剂和配方 

试剂和溶液缩写 

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthaleneacetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6大量元素；N6微量元素；MS大量元素；MS微量元素 组织培养的溶液配方 

1)N6大量母液[10倍浓缩液(10×)] 

逐一溶解，然后在20-25℃下定容至1000ml。 

2)N6微量元素母液[100倍浓缩液(100×)] 

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。 

3)Fe₂-EDTA储存液(100×) 

在一个大三角烧瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g，在另一个大三角烧瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g，在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2h，定容至1000ml，4℃保存备用。 

4)维生素储存液(100×) 

加水定容至1000ml，4℃保存备用。 

5)MS大量元素母液(10×) 

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。 

6)MS微量元素母液(100×) 

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。 

7)AAM培养基母液 

a.AAM I(10X) 

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)    1.5g 

氯化钾(KCl)                 30g 

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。 

b.AAM II(100X) 

氯化钙(CaCl₂.2H₂O)          1.5g 

在20-25℃下溶解并定容至1000ml。 

c.AAM III(100X) 

MgSO₄.7H₂O                  2.5g 

d.AAMIV(200X) 

e.AAMIV(20X) 

f.AAM V(1000X)VI 

CuSO₄.5H₂O                  0.005g 

CoCl₂.6H₂O                  0.005g 

Na₂.MoO₄.2H₂O               0.05g 

8)2，4-D储存液(1mg/ml) 

2，4-D 100mg 

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。 

9)6-BA储存液(1mg/ml) 

6-BA 100mg 

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。 

10)NAA储存液(1mg/ml) 

NAA 100mg 

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在4℃下保存备用。 

11)IAA储存液(1mg/ml) 

IAA 100mg 

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在4℃下保存备用。 

12)葡萄糖储存液(0.5mg/ml) 

葡萄糖125g 

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。 

13)AS储存液 

AS          0.392g 

DMSO        10ml 

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。 

14)1N氢氧化钾储存液 

氢氧化钾    5.6g 

蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25℃下保存备用。 

15)KT储存液(1mg/ml) 

KT          100mg 

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。 

培养基配方 

1)诱导培养基 

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。 

2)侵染培养基(农杆菌悬浮液) 

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.8，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖储存液和100ul AS储存液。 

3)选择培养基 

加蒸馏水至250ml，调节pH值到5.8，封口灭菌，待培养基温度降至50-60℃，加入125μl的100mg/L的潮霉素和500mg/L头孢霉素，分别倒入培养皿中(25ml/皿)。 

4)预分化培养基 

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和500mg/L头孢霉素，封口灭菌，待培养基温度降至50-60℃，分装倒入培养皿中(25ml/皿)使用前溶解培养基， 

5)分化培养基 

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口灭菌。 

Claims (2)

1.小分子RNA Osa-miR393在调控转基因水稻分蘖中的应用。

2.小分子RNA Osa-miR393作用的靶基因LOC_Os05g05800.1和LOC_Os04g32460在调控转基因水稻分蘖中的应用。

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