CN103388000B - 一种水稻分蘖制御因子己糖激酶编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻分蘖制御因子己糖激酶编码基因及其应用。所述基因编码水稻己糖激酶7（OsHXK7），该蛋白具有典型的己糖和ATP结合特性，并拥有激酶活性，在颖果发育后期的表达量高于前期。本发明用所述基因的RNAi载体转化水稻，获得营养生长正常、分蘖数明显增多的转化植株，从而为获得高分蘖水稻转基因材料提供了一种方法。

Description

一种水稻分蘖制御因子己糖激酶编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及水稻转基因新种质材料的创制，特别涉及一种与水稻分蘖调控相关的己糖激酶的编码基因在水稻高分蘖材料创制方面的应用。

背景技术

水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一。水稻的分蘖是决定产量的一个重要农艺性状。水稻的分蘖不仅是直接调控产量的一个关键农艺性状，同时也是决定株型建成的一个核心科学问题。因此，筛选拥有自主知识产权的水稻分蘖调控相关的基因资源，不仅可为阐明水稻株型建构的分子机制奠定理论基础，且可为开展分子设计新株型育种提供重要的科学依据。

分蘖是水稻生长发育过程中形成的一种特殊分枝特性，其发生状况显著影响水稻的穗数及库容量。深入认识水稻分蘖发生的分子机理，进而筛选调控水稻分蘖形成的相关功能基因资源，成为开展水稻分子设计新株型育种重要前提。近年来研究发现，一些水稻功能基因的表达与水稻分蘖芽的生长分化有密切关系。研究表明，OsTB1控制分蘖芽的萌发和生长，其过量表达的转基因水稻植株分蘖数目显著减少。OsD3是以多蘖型矮秆突变体Id3为材料分离的与水稻分蘖相关的基因，其缺失突变体分蘖数目显著增多。OsD10是MAX/RMS1的同源基因，可抑制分蘖芽生长OsD27缺失突变体分蘖，表现与OsD3缺失突变体相似，分蘖数目同样增多。MOC1编码一个植物特异的转录因子，控制分蘖芽的起始和生长等过程，是调控分蘖芽生长发育的主控因子，其突变后导致形成单分蘖水稻株型结构。进一步研究发现，水稻TAD1(TILLERING AND DWARF 1)编码一个细胞分裂后期启动复合物（anaphase-promoting complex，简称APC/C）的共激活蛋白，是一个在真核生物中功能高度保守的E3泛素连接酶作用于MOC1的上游，导致后者以依赖于细胞周期进程的方式降解而调控MOC1的活性。该项研究揭示了通过细胞周期调控分蘖以及植物株型建成的新机制。水稻分蘖由分蘖芽发育而成，生长素（IAA）和细胞分裂素（CTK）在分蘖芽分化和生长过程中起着关键作用。IAA类激素抑制分蘖芽的萌发，而CTK促进分蘖芽的萌发。IAA和CTK对植物侧芽生长的调控机理有所不同，CTK是调控植物侧芽生长的直接因子，直接进入侧芽调控其生长；然而，IAA并不是调控植物侧芽生长的直接因子，它需要CTK作为第二信使来协同控制侧芽生长。因此，水稻激素信号级联途径所介导的分蘖相关基因表达调控及株型建构分子机理的研究，具有重要的理论意义及应用价值。

己糖激酶（HXK）是植物糖代谢与转化的重要调节酶，其不仅能磷酸化己糖生成己糖-6-磷酸，而且还在糖感应及糖信号转导中起着非常重要的作用。Moore等（Moore,et al.，2003,Role of the Arabidopsis Glucose Sensor HXK1 in Nutrient,Light,and Hormonal Signaling.Science 300:332-336）对拟南芥己糖不敏感突变体gin2的研究表明，依赖AtHXK1的葡萄糖信号传导与生长素与细胞分裂素信号途径存在相互联系。拟南芥的gin2突变体及生长素信号缺失突变体axr1、axr2和tir1的幼苗，均表现出对生长素和高糖的不敏感。研究表明，细胞分裂素和葡萄糖信号具有相互拮抗关系，且与乙烯在葡萄糖响应中独立起作用。此外研究发现，由HXK介导的信号转导过程可能需要ABA信号传导途径的参与，而GA传导途径与糖感应途径之间的密切联系。植物可能通过ABA/GA之间的平衡来调控细胞的糖水平，进而影响导致植物体的糖感应过程。乙烯与葡萄糖则可能存在着相互拮抗作用。因此，植物HXK作为一个葡萄糖感应器，可能与营养、光以及激素信号网络共同调控植物的生长与发育。

目前，水稻中已发现10个OsHXK编码基因。已有学者对于OsHXK的亚细胞定位以及在水稻生长发育过程中的时空表达模式有所揭示（Cho,et al.,Structure,expression,andfunctional analysis of the hexokinase gene family in rice(Oryza sativa L.).Planta 224:598–611），而且OsHXK5和OsHXK6可以异源回补拟南芥葡萄糖感受器AtHXK1（定位于细胞核内，与核内转录因子形成复合体与）的突变体表型，进而推测OsHXK5和OsHXK6可能作为葡萄糖感受器（Cho,et al,2009,Role of the Rice Hexokinases OsHXK5 and OsHXK6 as GlucoseSensors Plant Physiology 149:745-759）。

发明内容

本发明的目的在于筛选与水稻分蘖调控相关的功能基因，以创制分蘖数增多的水稻材料。

本发明研究发现，水稻的OsHXK7基因编码的蛋白具有典型的己糖和ATP结合特性，拥有激酶活性，且拥有结合葡萄糖后二级结构发生蓝移的糖信号感应特性。此外，OsHXK7的转录受到葡萄糖较强的抑制。本发明通过RNAi技术在水稻中干扰OsHXK7的表达，获得了同对照相比水稻分蘖数显著增多的转基因材料。由此推测，利用转基因技术，干扰、沉默或敲除OsHXK7，可为开展分子设计新株型育种提供重要的科学依据。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。

本发明所涉及的己糖激酶基因，名称为OsHXK7，来源于水稻（Oryza sativa），编码下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质；

(ii)序列表中的SEQ ID No：1氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有己糖激酶功能。

序列表中的SEQ ID No：1由463个氨基酸残基组成，如图1所示，此蛋白具有典型的己糖激酶结构域，包括底物识别结构域（第139-156位）、两个磷酸盐结合结构域（第69-91位和第220-239位）和ATP作用结构域（第389-431位）。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非保守区域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法，以及对己糖激酶功能的检测均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白并检测其功能。

本发明的水稻己糖激酶基因OsHXK7可以是其cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQ IDNO：2所示的DNA序列。

本发明利用半定量RT-PCR方法，确定了水稻幼苗、成叶、雌蕊以及花药中均有OsHXK7不同程度的表达，且其表达量在颖果发育的后期要高于发育前期（图2A和B）。通过mRNA组织原位杂交方法，检测到水稻抽穗后第2天和第8天颖果OsHXK7中微弱的杂交信号（图2C-F），这与半定量RT-PCR检测的OsHXK7表达状况相一致。此外，利用半定量RT-PCR方法，发现水稻悬浮细胞OsHXK7的转录受到葡萄糖和蔗糖的强烈抑制，而甘露醇和异麦芽酮糖无此作用（图3A）。利用两步PCR方法对OsHXK7蛋白其中一个磷酸盐结合结构域的第76位氨基酸进行了点突变—G76D。通过己糖激酶活性测定表明，OsHXK7G76D突变体蛋白失去激酶活性。继而采用荧光光谱法检测了OsHXK7及其突变型OsHXK7G76D在结合葡萄糖后构象的变化。结果表明，OsHXK7和OsHXK7G76D蛋白结合葡萄糖后的荧光光谱均发生明显蓝移，而加入甘露醇和3-氧-甲基-葡萄糖的蛋白构象并不发生变化（图3C-D）。由此可见，OsHXK7具有典型糖感应特性，而且OsHXK7的第76位氨基酸的突变不影响葡萄糖的结合特性。

基于上述OsHXK7的生理生化特性，本发明通过RNAi技术成功地抑制了OsHXK7在水稻转化植株中的表达，所获得的转基因水稻拥有分蘖数相对对照明显增多的特异表型。首先，为构建OsHXK7的RNAi双元表达载体，我们选择此基因中较特异的一段核酸序列为RNAi的引导序列，即SEQ ID NO：2中218-820bp的序列。然后，将此核酸片断以正反两个方向插入到植物表达载体pTCK-303中构建成为OsHXK7的RNAi双元表达载体pTCK-HXK7i。如图4A所示，pTCK-HXK7i载体中的两个OsHXK7特异片断由一水稻内含子隔开，由玉米泛素启动子（ZmUBi promoter）引导表达。之后，将此质粒转入农杆菌EHA105，并经由农杆菌将此质粒转入水稻品种中花15号，T-DNA插入并整合到水稻染色体上。进而，通过RT-PCR方法对RNAi的效率进行了检测。结果显示，在R1至R5几个转化植株系中OsHXK7的表达均被有效抑制（图4B）。

本发明针对OsHXK7-RNAi转基因水稻植株进行了表型分析。调查结果表明，相比对照野生型植株，转化植株的株高、叶长、穗长和颖果数均未有明显改变。然而，转化植株的分蘖数要明显多于转化空载体的对照植株（图5）。

综上，本发明通过发现了水稻己糖激酶7（OsHXK7）调控分蘖性的新功能，并通过抑制OsHXK7的功能获得高分蘖水稻转基因材料。本发明的方法可为分子设计新株型水稻育种提供重要的科学依据与技术支撑。

附图说明

图1是OsHXK7编码蛋白的结构示意图，其中用上划线标出了OsHXK7的底物（hexose）识别结构域（SUGAR BINDING）、两个磷酸盐（phosphate）结合结构域（PHOSPHATE 1和PHOSPHATE 2）和ATP作用结构域（ADENOSINE）。

图2显示了水稻不同组织器官及颖果发育OsHXK7的表达模式，其中：A、水稻不同组织器官中OsHXK7表达的半定量RT-PCR检测结果；B、水稻抽穗后不同发育时期颖果中OsHXK7表达的半定量RT-PCR检测结果；C-F图为OsHXK7的颖果组织原位杂交结果，其中，C和D为抽穗2天的水稻颖果横切，E和F为抽穗8天的水稻颖果横切；C和E图为正义探针杂交结果，D和F为反义探针杂交结果，标尺为100μm。

图3显示了OsHXK7的激酶活性和糖感应特性检测结果，其中：A、水稻悬浮细胞中不同糖类处理后OsHXK7的半定量RT-PCR表达检测结果；B、OsHXK7及其点突变形式OsHXK7G76D的磷酸化葡萄糖的激酶活性测定结果；C和D分别是OsHXK7和OsHXK7G76D的荧光光谱测定结果。图3A中，Sta为不加糖的糖饥饿，Mit为甘露醇，Glu为D型葡萄糖，Suc为蔗糖，Pal为异麦芽酮糖；图3C和D中，Mannitol为甘露醇，3-o-M-G为3-氧-甲基-葡萄糖（葡萄糖的类似物），D-Glucose和L-Glucose分别是D型和L型葡萄糖。

图4是OsHXK7-RNAi双元表达载体构建模式图（A）和该载体转化水稻中OsHXK7的表达检测结果图（B），其中：A图中OsHXK7的RNAi引导序列以正反两个方向插入双元表达载体，UBI promoter表示玉米泛素基因启动子，Intron表示内含子，Nos表示终止子；B图中，R1-R5为RNAi转化子，control为对照转化植株，Actin为内参。

图5显示了OsHXK7-RNAi转基因水稻植株的表型，其中：A和B分别为水稻颖果成熟时期对照植株与OsHXK7-RNAi转化植株的株型，C和D分别为对照植株和OsHXK7-RNAi转化植株的穗型。

具体实施方式

下述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实验方法所用的试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。

植物材料：水稻粳稻品种中花15号（Oryza sativa L.ssp.japonica cv.Zhonghua 15）。

1、实验材料的获得和RNA的提取

（1）水稻不同组织和不同发育颖果的取材方法

水稻粳稻品种中花15号的栽培：4月中旬，用1%多菌灵浸泡种子室温过夜，次日换水，以后每日换水一次，直至胚根长出。将吸涨并开始萌芽的种子播入育苗池，盖上薄土并浇水后覆上塑料大棚。每日浇水养护。五月中旬，将3.5~4.0叶龄的秧苗按22.2株/m²密度移植到水田中。每株3棵，常规肥水管理。

RT-PCR所用材料：取抽穗后0、1、2、4、6、8、10、12、15和20天的水稻颖果，于冰上快速分离出初级颖果和次级颖果，装入预冷的并写好标签的塑料小袋中。液氮速冻后，转移到-80℃低温冰箱中保存，以用于RT-PCR分析。

原位杂交实验所用材料：在无RNA酶的环境中，将抽穗后2、4、6、8天的颖果放入盛有FAA固定液的青霉素小瓶中进行抽气固定，梯度脱水后石蜡包埋，4℃保存，用于OsHXKs组织水平上的表达分析。

（2）玻璃制品、塑料制品和电泳槽的去RNA酶处理

RNA相关实验过程中所用的玻璃制品在使用前于180℃烘烤8h。塑料制品，包括各种类型的枪头和离心管，用0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，高压灭菌后置于80℃干燥箱中干燥。用于RNA电泳的电泳槽经清洗后，用无水乙醇中浸泡30min，然后用30%H₂O₂中浸泡30min，最后用灭菌的DEPC处理水冲洗5次。

（3）水稻不同器官和不同发育期颖果总RNA的提取

取0.5g材料，在液氮中研磨成粉末并转移到装有3mL预冷的RNA提取缓冲液的离心管中，充分混匀后加入3mL缓冲液饱和酚和1mL氯仿，混匀。4℃、13,000rpm离心30min。上清转移至另一离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h。4℃13,000rpm离心10min，干燥沉淀。DEPC处理水溶解沉淀并转移至1.5mL离心管中，加入等体积8M LiCl，冰上放置1h后13,000rpm离心15min。沉淀溶于0.4mL DEPC处理水中。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后4℃13,000rpm离心15min。75%乙醇清洗RNA沉淀，室温干燥。加适量DEPC处理水溶解RNA。

（4）水稻悬浮细胞糖诱导及RNA提取

用新配制的NB培养基继代水稻悬浮细胞，26℃、150rpm培养3天使其处于对数生长期，用含1.64%（w/v）Mannitol的无糖NB培养基（饥饿培养基）冲洗悬浮细胞3次，一部分（约0.5g）经滤纸干燥后用离心管收集，液氮冻存；其余悬浮细胞用饥饿培养基培养48h耗尽内源糖，同样方法收集部分悬浮细胞；其余悬浮细胞平均分成7份，分别用含50mMMannitol、Glucose、Sucrose和Palatinose的NB培养基诱导培养。提取方法参见用普利莱基因技术有限公司的Plant RNA Exreaction Kit（K1050）。

（5）RNA质量检测

在GBC Cintra 10e紫外分光光度计上测RNA样品在260nm和280nm的光吸收值，通过吸收值计算RNA样品的浓度和判断RNA样品的纯度。RNA光吸收值和浓度换算公式：1OD260=40μg/mL。纯度判断方法：纯的RNA，其OD260/OD280为2.0，若污染了蛋白质或酚，OD260/OD280比值明显低于此值。然后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

（6）RNA样品中少量DNA的去除

通过无RNase的DNase消化RNA样品中残留的DNA，反应体系包括：1×RQ1RNase-free DNase Buffer、RNase inhibitor 20unit、RQ1 RNase-free DNase1μL、RNA样品50μg，用DEPC-H2O补足体系至50μL。上述体系于37℃温育30min。DNA酶解反应结束后，用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收RNA样品。

2、OsHXK7全长cDNA的克隆

提取抽穗0天颖果总RNA，逆转录为cDNA，并以此cDNA为模板PCR扩增OsHXK7全长序列。具体流程如下：

SS II逆转录总RNA：配制反应体系I：2μg总RNA、1μL Oligo dT15和6μL DEPC处理水，于65℃温育5min后迅速置于冰上。配制反应体系II：4μL 5×first-strand buffer、1μLRNase inhibitor、2μL 0.1M DTT、1μL 10mM dNTP Mixture和1μL SS II Reversetranscriptase。混合反应体系I和II，50℃逆转录反应60min，70℃处理15min灭活SS II反转录酶，置于冰上2min，加入1μL RNase H于37℃温育20min消化与cDNA链结合的mRNA。反应结束后70℃处理15min灭活RNase H，分装并保存于-20℃。

PCR扩增OsHXK7编码基因：使用高保真DNA聚合酶pfx扩增OsHXK7编码基因。反应体系如下：10×pfx Amplication Buffer 2.0μL、10×pfx Enhancer Buffer 2.0μL、50mMMgSO40.4μL、2.5mM dNTPs 2.4μL、上游引物OsHXK7-U 0.3μM、下游引物OsHXK7-L0.3μM、pfx DNA聚合酶0.2μL、cDNA 1.0μL，用dd H₂O补充反应体系至20.0μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，68℃延伸2min，30个循环；最后68℃延伸7min。其中，PCR所用引物序列如下：

上游引物OsHXK7-U：5’-GGTGGGGTTCTCCTCCT-3’（SEQ ID No：3）；

下游引物OsHXK7-L：5’-CTGTGTCTCATGCCTACT-3’（SEQ ID No：4）。

PCR产物的加A尾和T载体克隆：按Tiangen胶回收试剂盒使用说明切胶回收PCR产物。配置加A尾反应体系，于70℃温育30min进行加A尾反应。加A尾反应体系包括：1×Taq PCR buffer、胶回收产物7μL、Taq DNA聚合酶1μL和2mM dATP 1μL，总体积10μL。取上述加A产物按照Tiangen pGM-T载体试剂盒说明书进行T载体克隆，得到质粒pGMT-OsHXK7，转化菌株DH5α。

质粒pGMT-OsHXK7的小量提取：将转化有pGMT-OsHXK7质粒的DH5α菌株接至5mlLB/Amp培养基中培养过夜，次日离心13000rpm 1min收集菌体。加入300μL细胞重悬液，振荡混匀后，加入300μL裂解液，混匀，冰上放置5min至液体澄清。再加入300μL中和液，离心13000rpm 18min。吸取上清，加入1/2体积的异丙醇，室温静置4min。离心13000rpm 18min后，弃去上清，用75%乙醇洗涤沉淀，吹干后溶于20μLTE溶液。

质粒pGMT-OsHXK7的酶切检测：通过限制性内切酶双酶切检测T载体中插入片段大小。配置酶切反应体系于37℃温育2h进行酶切反应，电泳检测，阳性克隆送公司测序。酶切反应体系含1×内切酶反应缓冲液、0.05mg/mL BSA、0.5μg质粒、内切酶Kpn I、Xho I各1μL，以dd H₂O补足反应体系至20μL。

3、OsHXK7糖感应功能研究

（1）OsHXK7G76D和OsHXK7S148A催化活性突变位点的选取：

根据拟南芥丧失催化活性的突变体AtHXK1S177A并不影响其作为葡萄糖信号受体的功能（Moore,et al.，2003,Role of the Arabidopsis Glucose Sensor HXK1 in Nutrient,Light,andHormonal Signaling.Science 300:332-336），选取拟南芥AtHXK1第177位氨基酸S突变为A的突变体作为阳性对照。同时根据序列比对分析之后，确定了OsHXK7相对应的结构域，将227-228位核苷酸GA突变为AC，对应编码蛋白质序列的第76位甘氨酸G突变为天冬氨酸D。

pET28a-OsHXK7、pET28a-OsHXK7G76D和原核表达载体的构建：以pGMT-OsHXK7为模板，通过PCR扩增获得OsHXK7的ORF全序列，再通过融合PCR获得点突变的ORF序列，克隆至T载体并测序。通过NdeI和Xho I将OsHXK7的ORF亚克隆至pET28a载体，转化菌株DH5α。提取pET28a-OsHXK7、pET28a-OsHXK7G76D载体，并转化原核表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态细胞。

重组蛋白的诱导表达及可溶性检验：挑取阳性单克隆，接种到5mL的LB/Kana液体培养基中，37℃，240rpm振荡培养过夜，取0.3mL菌液接种到30mL的LB/Kana液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养至OD600=0.5，加入1M IPTG母液至终浓度0.6mM，20℃、160rpm继续培养12h。收集菌液，4℃、4,000×g离心20min，弃上清，用7mL Lysis Buffer重悬细菌沉淀，加入溶菌酶（终浓度1mg/ml），冰上静置30min后超声破碎。4℃，10,000×g离心20min，将上清液（可溶蛋白）转移至另一离心管中，放于冰上。用4mL Solution Buffer重悬沉淀（不可溶蛋白）。每个样品分别取20μL并加入5μL 5×SDS-PAGE Sample Buffer，煮沸5min，冷却后12,000rpm离心1min，最后进行SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白诱导情况以及重组蛋白可溶性结果显示诱导出了可溶性蛋白。

可溶性蛋白的纯化及透析：将Ni-NTA Agarose填料放入亲和层析柱中，高度约1cm，填料加入后先用10mL的Binding Buffer平衡柱子并排除填料内部的气泡。然后将超声破碎离心后的上清用0.45μm的滤膜进行过滤后再加入到亲和柱内，待液体流尽后，用50mLWashing Buffer洗涤，以吸取非特异结合蛋白。待液体流尽后用不同咪唑浓度的Elution Buffer洗脱目的蛋白，每个梯度洗脱3mL收集洗脱液。最后将洗脱效果最好的咪唑浓度的ElutionBuffer收集液装入透析袋中，放入盛有1L25mM、pH 7.5的Tris-HCl溶液中4℃搅拌透析过夜。透析后的蛋白溶液用Amicon Ultra-4滤膜超滤浓缩，最后用BSA Protein Assay Kit测定蛋白浓度。

纯化蛋白活性检测：在ATP存在条件下，己糖激酶将葡萄糖催化生成6-磷酸葡萄糖（G-6-P），之后6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PDH）又将G-6-P转变成6-磷酸葡萄糖酸，NADP结合此过程中产生的还原H并与之生成NADPH，通过测定340nm处NADPH的吸光值来确定己糖激酶活性。OsHXK7及其点突变形式OsHXK7G76D的磷酸化葡萄糖的激酶活性测定结果如图3B所示，表明OsHXK7G76D突变体蛋白失去激酶活性。

OsHXK7荧光发射光谱检测：首先将待测蛋白用不同种类的糖进行处理。分别配制1mM的甘露醇（Mannitol），3-氧-甲基-葡萄糖（3-o-M-G），D型葡萄糖（D-Glucose），L型葡萄糖（L-Glucose）。在500μL反应体系中加入450μL糖溶液以及50μL待测蛋白（约0.15mg）。37℃反应30min，将样品放入FluoroMax-4荧光光谱仪中，激发光波长280nm，记录荧光发射光谱范围295nm-400nm，3次重复。OsHXK7和OsHXK7G76D的荧光光谱测定结果分别如图3C和D所示，表明，OsHXK7和OsHXK7G76D蛋白结合葡萄糖后的荧光光谱均发生明显蓝移，而加入甘露醇和3-氧-甲基-葡萄糖的蛋白构象并不发生变化。由此可见，OsHXK7具有典型糖感应特性，而且OsHXK7的第76位氨基酸的突变不影响葡萄糖的结合特性。

4、半定量RT-PCR

将提取的RNA进行反转录PCR。反应体系中包含逆转录酶缓冲液、dNTPs、1μgRNA和100U M-MLV反转录酶和RNasin。37℃反应60min，75℃处理15min灭活M-MLV反转录酶，将最终得到的cDNA分装保存于-20℃，留待进行RT-PCR。

半定量RT-PCR结果如图2A和B所示，水稻幼苗、成叶、雌蕊以及花药中均有OsHXK7不同程度的表达（图2A），且其表达量在颖果发育的后期要高于发育前期（图2B）。

此外，利用半定量RT-PCR方法，发现水稻悬浮细胞OsHXK7的转录受到葡萄糖和蔗糖的强烈抑制，而甘露醇和异麦芽酮糖无此作用（图3A）

5、OsHXK7mRNA组织原位杂交

原位杂交探针制备：为使探针具有较好的通透性和特异性，本实验在OsHXK7的3’-UTR区近3’端355bp特异位置，设计带酶切位点的上、下游引物（酶切后产生5’突出末端，引物序列见下），进行PCR扩增，克隆至pGMT-easy vector测序。

OsHXK7-IF：5’-ACGCTCGAGCCAGGCGACAAGCGAAAGTC-3’（SEQ ID No：5，含有XhoI位点）；

OsHXK7-IR：5’-ACGTCTAGAACCAACACATTTGGCTTC-3’（SEQ ID No：6，含有Xba I位点）。

体外转录：提取测序正确的质粒，分别在插入片段的两端进行酶切（XhoI、Xba I）以线性化载体，通过QIAGEN胶回收试剂盒回收获得线性化质粒，并以此为模板利用载体本身的T7、T3RNA转录位点进行体外转录获得相应的RNA探针。体外转录体系包括：4μL5×transcription buffer、1μg线性化质粒、2μL T7或T3 RNA polymerase、2μL Nase inhibitor，用DEPC-H₂O补足至20L。以上反应体系于37℃反应2h。然后，进行质粒模板的消化和正反义探针的回收。在体外转录体系中加入2μL RNase free DNaseI，37℃反应15min以消化DNA模板，加入0.8μL 500mM EDTA终止反应，加入2.5μL 4M LiCl和75μl无水乙醇，-20℃沉淀过夜。次日，13000rpm离心，弃上清，70%乙醇洗涤两次，干燥。100μLDEPC-H₂O溶解沉淀，0.5×TBE电泳检测RNA探针质量，分装并于-80℃保存备用。

原位杂交探针的定量：将标准RNA样品及待测RNA探针进行梯度稀释，点于尼龙膜上，置于120℃烘箱中交联30min，马来酸缓冲液（MaB）中浸泡2min，blocking solution中室温封闭30min，抗体（anti-DIG-AP，1:5000稀释于blocking solution中）室温孵育30min，washing buffer室温洗15min，重复二次，TNM50洗膜3min，BCIP/NBP底物显色，通过与标准样品的颜色对比，对待测探针进行定量。

水稻颖果的固定及切片：水稻颖果去除颖壳后放于FAA固定液中，室温抽气2~8h，4℃固定12h以上。固定好的材料经各级酒精脱水至纯酒精，各级酒精的浓度分别为10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%、100%乙醇，每级酒精浓度处理30min。纯酒精中的材料用以下各级浓度的二甲苯和乙醇的混合液处理，25%二甲苯-75%乙醇、50%二甲苯-50%乙醇、75%二甲苯-25%乙醇、90%二甲苯-10%氯仿、90%二甲苯-10氯仿、90%二甲苯-10%氯仿，每级混合液中处理30min。浸蜡：将材料在50%石蜡-50%二甲苯混合液在42℃处理4-16h，重复一次。移入60℃烘箱，更换为100%纯蜡，60℃保温2天，期间更换4次纯蜡。固化前可以在60℃烘箱中保温30min以除气泡。包埋块可于4℃保存1年以上。将石蜡包埋的材料切成大小合适的梯形小块，用切片机将石蜡小块切成10μm厚的薄片。将多聚赖氨酸处理过的RNase free的载玻片置于42℃以下的展台上，用水将薄片延展平整，吸干水后，于42℃烘箱中放置2天以上。

OsHXK7mRNA组织原位杂交：脱蜡复水：将展好片的载玻片先以100%二甲苯室温处理20min，重复一次，再分别以下列混合液逐级复水，66%二甲苯-33%、33%二甲苯-66%、100%乙醇、100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、10%乙醇、H₂O、H₂O，每级在室温下处理2min。37℃预热K buffer后，加入PK（母液浓度为16.7mg/mL）至终浓度1~5μg/mL（我们选用2.5μg/mL），37℃处理15min。最后以无菌DEPC水室温洗3次。以2×SSC室温处理5min，重复一次。分别以下列各级酒精梯度脱水至纯酒精，10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇、100%乙醇，各级酒精梯度室温处理2min。42℃1h左右烘干载玻片。此步处理后可于-20℃保存一个月。杂交液A 77.2μL，杂交液B 22.8μL（RNA探针+DEPC水+tRNA+PolyA），80℃变性5min，立即置于冰上。42℃预热杂交液，100μL/片，均匀涂于载玻片上，加盖Parafilm膜。杂交在垫有0.3MNaCl-50%甲酰胺饱和的滤纸的湿室中进行。42℃杂交过夜。40mL4×SSC室温5-10min，重复三次。37℃预热RNase buffer，加入RNase A至终浓度25μg/mL，放入切片保温30min。RNase buffer 37℃洗15min，重复两次。2×SSC（650mL）室温低严谨洗片30min，重复一次，洗片时以小转子低速搅动溶液。1×PBT pH 7.5室温5min。0.5%的封闭液中室温封闭30~60min（我们选择封闭60min）。1×PBT pH 7.5室温1min。anti-DIG-AP（0.5μLanti-DIG-AP，10μL 10mg/mL BSA，90μL 1×PBT）室温孵育120min。以上操作在垫有1×PBT饱和的滤纸的湿室中进行。1×PBT（650mL）室温20min，重复一次。洗片时以小转子低速搅动溶液。1×TNM50室温5min。2%NBT/BCIP（用TNM50配制）室温黑暗中显色30min以上。镜检并拍照，然后脱水封片。

通过mRNA组织原位杂交方法，检测到水稻抽穗后第2天和第8天颖果OsHXK7中微弱的杂交信号（图2C-F），这与半定量RT-PCR检测的OsHXK7在水稻颖果发育的前期表达较弱（图2B）相一致。

6、OsHXK7基因沉默的转基因水稻的获得

基因沉默triger序列的克隆及测序：在OsHXK7的ORF框中选取特异性较高的603bpDNA片段（SEQ ID No：2自5’端第218至820位核苷酸），以OsHXK7的ORF序列为模板，使用NEB Phusion DNA Polymerase试剂盒，分别用TCK-HXK7RNAi-U（含有BamHI酶切位点）和TCK-HXK7RNAi-L（含有KpnI酶切位点）、TCK-HXK7RNAi-R-U（含有SacI酶切位点）和TCK-HXK7RNAi-R-L（含有SpeI酶切位点）两对引物进行PCR，得到用作RNAi的DNA片段，连接T载体并测序。将测序正确的基因沉默triger序列连接至pTCK303载体形成RNAi载体pTCK-HXK7i。其中各引物的序列如下：

TCK-HXK7RNAi-U：5’-GAT GGATCC ATCTTGGGGGAACAAACTT-3’（SEQ ID No：7）；

TCK-HXK7RNAi-L：5’-GAC GGTACC TAGTGCTTCATCATATTCT-3’（SEQ ID No：8）；

TCK-HXK 7RNAi-R-U：5’GAT GAGCTC ATCTTGGGGGAACAAACTT-3’（SEQ ID No：9）；

TCK-HXK7RNAi-R-L：5’GAC ACTAGTG CTTCATCATATTCT-3’（SEQ ID No：10）。

应用农杆菌侵染愈伤法将构建好的OsHXK7基因沉默转基因载体pTCK-HXK7i转入水稻，得到OsHXK7丛闪沉默的转基因水稻HXK7-RNAi。

如图4A所示，603bp的OsHXK7特异性DNA片段以正反两个方向插入到植物表达载体pTCK-303中构建形成OsHXK7的RNAi载体pTCK-HXK7i，两个特异片段由一水稻内含子隔开，由玉米泛素启动子驱动表达。

将pTCK-HXK7i质粒转入农杆菌EHA105，并经由农杆菌将此质粒转入水稻品种中花15号中。进而，通过RT-PCR方法对RNAi的效率进行了检测。结果显示，在R1至R5几个转化植株系中OsHXK7的表达均被有效抑制（图4B）。

7、转基因水稻的表观表型观察及统计

待水稻抽穗两周后，分别统计对照，HXK7-RNAi水稻植株的分蘖数，测量每一个株系中最高分蘖的株高，（每一种转基因品种的统计样本数大于52株），同时进行取材保存，并对明显的表型形状用Nikon S 10进行数码拍照。最终数据用SPSS软件进行统计学分析，同时用实体镜观察水稻花器官。

表1给出了OsHXK7-RNAi转化子和对照植株的表型比较数据，分蘖数于植株开花时统计，株高、每穗颖果数均在颖果成熟时统计。结果表明，相比对照野生型植株，转化子呈现出分蘖数多，植株较高的表型特征。

表1、OsHXK7-RNAi转化植株和对照植株的表型比较

特征	对照	OsHXK7-RNAi
			分蘖/每株	9.02±4.767	12.55±5.754
穗数/每株	3.30±1.460	3.92±2.040
			株高(cm)	85.62±8.211	91.79±10.173

数据呈现的是平均值±标准误(n≥125).分蘖数和株高均在植株成熟时统计。

图5显示了在水稻颖果成熟时期对照植株（A和C）与OsHXK7-RNAi转基因水稻植株（B和D）的株型和穗型，相比对照野生型植株，OsHXK7-RNAi转化植株的株高和颖果数均有明显改变。

Claims (9)

1.一种水稻己糖激酶基因在提高水稻分蘖数中的应用，通过转基因技术干扰、沉默或敲除所述水稻己糖激酶基因，获得分蘖数提高的转化植株，其中所述水稻己糖激酶基因编码序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻己糖激酶基因是OsHXK7基因的cDNA序列或基因组DNA序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水稻己糖激酶基因的序列如序列表中SEQID No：2所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，构建所述水稻己糖激酶基因的RNAi载体并转化水稻，获得该水稻己糖激酶基因的表达受干扰的、分蘖数提高的转基因水稻。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水稻己糖激酶基因的RNAi载体通过下述方法构建：以所述水稻己糖激酶基因的特异性核酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水稻己糖激酶基因的特异性核酸片段是序列表中SEQ ID No：2的第218-820位核苷酸序列。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水稻己糖激酶基因的RNAi载体中，两个插入方向相反的所述水稻己糖激酶基因特异性核酸片段由一个水稻内含子隔开，并由玉米泛素启动子驱动表达。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体是pTCK303。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水稻己糖激酶基因的RNAi载体是双元表达载体，经农杆菌介导转入水稻中。