CN110468128B - 一株高抗褐飞虱及耐盐的水稻突变体miR393am及其应用 - Google Patents

一株高抗褐飞虱及耐盐的水稻突变体miR393am及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株高抗褐飞虱及耐盐的水稻突变体miR393am及其应用，具体地，本发明提供了一种miR‑393a抑制剂的用途，用于(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性，或制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性。在本发明中，降低植物中miR‑393a或miR‑393a活性片段的表达或活性，可显著(i)抗褐飞虱(如降低蜜露量和/或虫增重)，和/或(ii)增强植物抗逆性(如耐盐性)。

Description

一株高抗褐飞虱及耐盐的水稻突变体miR393am及其应用
技术领域
本发明涉及作物遗传学领域，更具体地涉及一株高抗褐飞虱及耐盐的水稻突变体miR393am及其应用。
背景技术
miRNAs在植物的生长发育和抗逆方面发挥着重要的作用，但是在水稻抗褐飞虱方面还未曾报导。
目前可用于水稻抗褐飞虱育种的基因资源非常有限，而且大多需要传统的杂交育种技术将其应用于抗虫育种，育种周期较长，而转基因技术还没有被公众所接受。
并且miRNAs的种类非常多，功能也各异，生物体也很复杂，因此，对miRNA的上调和下调所带来的结果很难预见。
因此本领域迫切需要开发一种用Crisper技术(RNA编辑技术)敲除水稻中的miR93a基因，从而改良水稻性状的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供株高抗褐飞虱及耐盐的水稻突变体miR393am及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种miR-393a或其活性片段的抑制剂的用途，用于(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性性，或制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性。
在另一优选例中，所述抗逆性选自下组：抗旱性、耐冷性、耐盐性、耐渗透压、耐热性、或其组合。
在另一优选例中，所述制剂或组合物还用于上调SA信号通路的合成酶基因的表达。
在另一优选例中，所述合成酶基因选自下组：EDS1、NPR1、ICS1、PAD4、或其组合。
在另一优选例中，所述的miR-393a来源于水稻。
在另一优选例中，所述的miR-393a抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述抗褐飞虱包括(a)降低褐飞虱的蜜露量和/或(b)降低褐飞虱的增重。
在另一优选例中，所述组合物为农用组合物。
在另一优选例中，所述组合物包含(a)miR-393a或其活性片段的抑制剂；和(b)农学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
在另一优选例中，所述植物包括包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)；优选地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥。
在另一优选例中，所述的植物包括：水稻、小麦、玉米、高粱、十字花科植物(卷心菜)。
在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻、或其组合。
在另一优选例中，所述的miR-393a的序列如SEQ ID NO.:1所示。
本发明第二方面提供了一种(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性的方法，包括步骤：
降低植物中miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性。
在另一优选例中，所述的降低植物中miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性是通过以下方式实现：在所述植物中导入miR-393a或其活性片段的抑制剂。
在另一优选例中，所述的miR-393a或其活性片段的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述“降低”是指miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性降低满足以下条件：
A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；其中，A1为miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性。
在另一优选例中，所述的降低指与野生型miR-393a或miR-393a活性片段的表达水平E0相比，所述植株中miR-393a或miR-393a活性片段的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％。
在另一优选例中，所述的降低植株中miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术、或其组合。
在另一优选例中，所述的降低植株中miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性通过用1个或多个sgRNA介导的Cas9核酸酶对miR-393a或miR-393a活性片段进行基因编辑。
本发明第三方面提供了一种(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性的组合物，所述组合物包括：(a)miR-393a或其活性片段的抑制剂；和(b)农学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。
在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的组分(a)，以所述组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述组合物还包括其他可以(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性的物质。
在另一优选例中，所述其他可以(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性的物质选自下组：顺-12-氧-植物二烯酸(OPDA)、水杨酸(SA)、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物还包括其他可以(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性的基因或其促进剂。
在另一优选例中，所述基因选自下组：Bph18、Bph14、Bph26、Bph29、Bph3、Bph9、Bph32、Bph6、或其组合。
本发明第四方面提供了一种本发明第三方面所述的组合物的用途，用于(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性。
本发明第五方面提供了一种制备基因工程的植物组织或植物细胞的方法，包括步骤：
降低植物组织或植物细胞中的miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性，从而获得基因工程的植物组织或植物细胞。
本发明第六方面提供了一种制备转基因植物的方法，包括步骤：
将本发明第五方面所述方法制备的基因工程的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得转基因植物。
本发明第七方面提供了一种转基因植物，所述的植物是用本发明第六方面所述的方法制备的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了miR393am植株中的碱基缺失位置。其中，A：miR393am突变体的测序结果其与野生型的差异；B：miR393a在野生型和突变体中的序列。
图2显示了qRT-PCR方法检测miR393am中OsTIR1和OsAFB2基因的表达情况。其中，统计数据经过t-检验后呈现显著差异和极显著差异分别用(**表示P<0.01)。
图3显示了单株法测定miR393am突变体植株对褐飞虱的抗性结果。
图4显示了单虫蜜露法测定褐飞虱取食前后的蜜露量和虫增重的变化情况。其中，A：褐飞虱取食前后的蜜露量的变化；B：褐飞虱取食前后的虫增重的变化。统计数据经过t-检验后呈现极显著差异(**表示P<0.01)。
图5显示了miR393am植株中SA合成相关基因的变化情况。
图6显示了水稻miR393am和野生型的耐盐性分析。其中，A:野生型植株(Nip)和miR393am处理前、200mM Nacl处理3天、复水3天的表型；B：复水3天后的存活率分析。统计数据经过t-检验后呈现极显著差异(**表示P<0.01)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现，降低植物中miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性，可显著(i)抗褐飞虱(如降低蜜露量和/或虫增重)，和/或(ii)增强植物抗逆性(如耐盐性)，此外，本发明通过大量筛选，意外的筛到一株(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性效果最优的miR393am突变体植株。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
miRNA及其前体
本发明提供了一类涉及与i)抗褐飞虱(如降低蜜露量和/或虫增重)，和/或(ii)增强植物抗逆性(如耐盐性)相关的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
水稻来源的miRNA可被从水稻细胞或组织中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA为miR393a，在水稻中，其序列为：UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUC(SEQ ID NO.:1)。本发明还包括miR393a的变体和衍生物，本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miR393a进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：烃基修饰、糖基化修饰、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰等。其中，糖基化的修饰基团包括：2-甲氧基-糖基、烃基-糖基、糖环基等。为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。
miR393或其活性片段的抑制剂
本发明还提供了一种针对miR393或其活性片段的miR393或其活性片段的抑制剂，所述miR393或其活性片段的抑制剂可抑制miR393或其活性片段的表达或活性。在本发明中，所述miR393或其活性片段的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。
用途
本发明还提供了miR393a或其活性片段的抑制剂的用途，它们被用于(i)抗褐飞虱(如降低蜜露量和/或虫增重)，和/或(ii)增强植物抗逆性(如耐盐性)。在本发明中，miR393a具有如SEQ ID NO.:1所述的序列，来源于水稻。
在本发明中，可通过基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术等技术抑制miR393a的表达或活性。
在一优选实施方式中，可通过用1个或多个sgRNA介导的Cas9核酸酶对miR-393a或miR-393a活性片段进行基因编辑。
植物(如水稻)改良
本发明还提供了一种改良植物(如水稻)的方法，所述的改良包括：(i)抗褐飞虱(如降低蜜露量和/或虫增重)，和/或(ii)增强植物抗逆性(如耐盐性)，包括步骤：降低植物中miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性、添加miR-393a或其活性片段的抑制剂。
在本发明中，还可进一步用常规方法将其他可以(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性的基因或其促进剂处理植物或植物种子，从而改良对应植物的性状。
在一优选实施方式中，所述基因选自下组：Bph18、Bph14、Bph26、Bph29、Bph3、Bph9、Bph32、Bph6、或其组合。
在本发明中，还可进一步用其他可以(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性的物质处理植物，从而改良对应植物的性状。
在一优选实施方式中，所述其他可以(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性的物质选自下组：顺-12-氧-植物二烯酸(OPDA)、水杨酸(SA)、或其组合。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次发现，降低植物中miR-393a或miR-393a活性片段的表达或活性，可显著(i)抗褐飞虱(如降低蜜露量和/或虫增重)，和/或(ii)增强植物抗逆性(如耐盐性)。
(b)本发明通过大量筛选，首次筛到一株(i)抗褐飞虱，和/或(ii)增强植物抗逆性效果最优的miR393am突变体植株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
1.miR393a-CAS9载体的构建：利用表1设计的引物，首先将双链片段构建到pOs-sgRNA载体上，然后转移到pH-Ubi-cas9载体上，载体的具体信息参考文献[1]。
2.水稻遗传转化参照文献[2]中的方法进行，稍加改进。
3.单株法抗褐飞虱鉴定：种子经过催芽后，分单株播种于小的塑料盆钵中，正常生长管理，约1个月后，待苗子将进入分蘖期，进行抗虫鉴定。预先制备高40cm，直径约8cm的透塑料罩子，在罩子一侧留有6x10cm大小的通风口，用纱网遮盖。用罩子将苗子罩住，以纱网罩住顶部。鉴定时，将每个罩子中接入15头左右3龄若虫。第二天重复数虫一次。正常生长管理条件下，待5-8天，观察苗子的存活状况。
4.单株蜜露法抗虫鉴定参照文献[3]进行。
实施例1水稻miR393am突变体的获得
本发明以miR393a为靶标，设计特异的小引导RNA(sg-RNA)，并根据该sgRNA的序列设计特异引物(表1)，经退火后形成双链，连入Crisper(UBI,OsU6)载体，通过农杆菌介导的遗传转化法转入野生型水稻品种日本晴(简称Nip)中，通过分子生物学检测获得纯合突变植株若干。通过测序分析发现了一株突变体，与野生型相比，该突变体在成熟miR393a的编码位置缺失了5个碱基(图1A，B)，我们将其命名为miR393am。
表1.miR393a特异的sgRNA序列(粗体下划线标记的碱基为接头)
Figure BDA0001656444990000081
实施例2水稻miR393am突变体植株靶基因的检测
本发明用qRT-PCR方法检测了miR393am植株中OsTIR1和OsAFB2这两个基因的表达，发现与野生型日本晴相比，miR393am植株中OsTIR1和OsAFB2的基因表达被明显上调(图2)。该结果一方面证明了OsTIR1和OsAFB2的确是miR393a的靶基因，另一方面证明了miR393a的确被敲除了。
实施例3 miR393am水稻突变体对褐飞虱呈高抗表型
本发明首先用单株法检测了miR393am对褐飞虱的抗性。分别将分蘖期的野生型(日本晴Nip)和miR393am的种子经催芽后播于小塑料盆钵中，每盆1苗，当水稻生长至分蘖期时，用直径8cm，高40cm留有通风纱窗的透明塑料罩子罩住水稻苗，并接入15头三龄褐飞虱若虫，每个品系设置8个重复，观察植株的受害程度。当野生型(日本晴Nip)全部死亡后，miR393am的植株依然鲜绿，呈现出对褐飞虱明显的抗性(图3)。
为了进一步明确突变体miR393am对褐飞虱的抗性程度，我们采用单头虫蜜露分泌量测定法和单头虫增重法对突变体进行了抗虫鉴定。因为蜜露是褐飞虱的分泌物，其分泌量的多少可以在很大程度上反映褐飞虱的取食情况。而稻飞虱在抗虫和感虫品种上取食前后的增重情况，可以更直接地反映水稻是否具有抗性。
我们采用单虫蜜露法测定了褐飞虱取食野生型和突变体前后蜜露量的变化以及单头虫体重的变化，结果发现，与野生型(日本晴nip)相比，褐飞虱在取食miR393am植株后，无论是蜜露量还是虫增重，都具有显著性下降(图4A,B)。依据虫增重的比例进行判定，miR393am突变体植株对褐飞虱的抗性级别达到了高抗乃至免疫的水平。
实施例4水稻miR393am高抗褐飞虱的可能机理
本发明通过RT-PCR的方法检测了SA合成通路中的几个关键合成酶基因EDS1、NPR1、ICS1、PAD4的表达变化，发现这几个基因的表达在miR393am植株中均被明显上调，因此，推测miR393am植株对褐飞虱的抗性很可能是通过激活SA信号通路实现的。
实施例5水稻miR393am突变株提高了对盐离子的抗性
本发明测试了水稻miR393am突变体对盐胁迫的响应情况。将野生型幼苗、miR393am株系在去掉底部的96孔板中水培生长10天，接着用200mM NaCl处理3天，随后将盐溶液更换成正常水营养液再生长3天。与野生型相比，水稻miR393m长势良好，并且有较高的成活率，表现出显著的耐盐性(图6)。
实施例6水稻miR393am突变株中4个抗逆相关基因的表达水平显著提高
本发明还测试了水稻miR393am突变体中4个抗逆相关基因EDS1,NPR1,ICS1和PAD4的表达水平。结果表明，与野生型的日本晴(Nip)相比，这4个基因的表达水平均显著提高，说明miR393am突变后，水稻抗逆性提高的与抗性相关基因的表达水平提高密切相关(图5)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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uccaaaggga ucgcauugau c 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tgtgtgagga tcaatgcgat ccctt 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aaacaaggga tcgcattgat cctca 25

Claims (9)

1.一种miR-393a的抑制剂的用途，其特征在于，用于抗水稻褐飞虱，或制备用于抗水稻褐飞虱的制剂或组合物，所述的miR-393a来源于水稻。
2.一种抗褐飞虱的方法，其特征在于，包括步骤：
降低植物中miR-393a的表达或活性，所述植物为水稻。
3. 一种组合物的用途，所述组合物包括：(a) miR-393a的抑制剂，所述的miR-393a来源于水稻；和(b)农学上可接受的载体，其特征在于，用于抗水稻褐飞虱。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述组合物还包括其他可以抗褐飞虱的物质。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述其他可以抗褐飞虱的物质选自下组：顺-12-氧-植物二烯酸（OPDA）、水杨酸（SA）、或其组合。
6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述组合物还包括其他可以抗褐飞虱的基因或其促进剂。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述基因选自下组：Bph18、Bph14、Bph26、Bph29、Bph3、Bph9、Bph32、Bph6、或其组合。
8.一种制备基因工程的抗褐飞虱的植物组织或植物细胞的方法，其特征在于，包括步骤：
降低植物组织或植物细胞中的miR-393a的表达或活性，从而获得基因工程的抗褐飞虱的植物组织或植物细胞，所述植物为水稻。
9.一种制备抗褐飞虱的转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：
将权利要求8所述方法制备的基因工程的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得抗褐飞虱的转基因植物。
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