KR20200070357A - 식물에서의 도복 저항성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 라카아제의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함하여, 옥수수에서 도복 저항성을 변화시키는 방법이 제공된다. 또한, 변화된 도복 저항성을 갖는 형질전환 식물 및 상기 식물을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

식물에서의 도복 저항성
본 발명은 옥수수에서 내도복성 (resistance to lodging)을 변화시키는 방법, 변화된 내도복성을 갖는 형질전환 식물 및 상기 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
콘 (옥수수)은 세계에서 가장 중요한 식량 작물 중 하나이고, 현재 세계 인구의 약 3분의 1에 의해 주요 식량으로 소비되고 있다. 콘은 쌀에서 보다 단백질 함량이 높고, 지방 함량은 밀가루, 쌀 및 수수 (millet) 보다 높고, 칼로리 함량은 밀가루, 쌀 및 수수 보다 높다. 이와 같이, 많은 개발된 지역에서, 콘은 필수 식량이다. 콘 가공 산업의 발전과 함께, 소비용 콘의 품질은 계속해서 개선되어 왔고 새로운 콘 식품, 예를 들어, 콘플레이크, 콘 가루, 콘 그리트, 특수 콘 가루 및 인스턴트 콘 등이 생산되어 왔고, 이들은 라면, 빵, 비스킷 등으로 추가로 가공될 수 있다. 콘은 또한 콘 단백질, 콘 오일, 일나트륨 글루타메이트, 대두 소스 및 화이트 와인 등으로 가공될 수 있다. 콘은 또한 공급 중에 으뜸이다. 100 kg의 콘의 공급가는 135 kg의 귀리, 120 kg의 수수 또는 150 kg의 인디카 쌀과 동등한 것으로 보고된다. 부산물 콘 스토버 또는 실제로 전체 식물 (이삭/콥 + 스토버)은 또한 사일리지 (silage)로 만들어질 수 있다. 전세계에서 콘의 약 65-70% 및 선진국에서 80% 이하는 사료로서 사용되고, 따라서 콘은 가축 산업 발전을 위한 중요한 토대이다.
높은 수확량을 얻기 위해, 농부는 흔히 과도한 양의 화학 질소 (N) 비료를 적용한다. 예를 들어, 중국에서, 합성 N 비료 적용은 1997년에 707만 톤에서 2005년에 2621만 톤으로 증가하였다 (참조: Ju et al., 2009). 감소하는 N-사용 효율과 조합된 외부 N의 이러한 큰 투입은 환경 문제 (참조: Ju et al., 2009; Guo et al., 2010; Liu et al., 2013)를 초래하고 또한 "N-럭셔리" 조건하에 도복으로 인한 수율 손실 (참조: Zhang et al., 2016; Shah et al., 2017; Khan et al., 2018)을 초래한다. 과도한 N 비료 적용은 작물 무게 중심의 높이를 증가시키고 줄기 직경 및 기저 절간 (basal internode)의 세포벽 두께를 감소시킴에 의해 불량한 도복 저항성 (lodging resistance)을 악화시킨다 (참조: Wang et al., 2012; Zhang et al., 2014). 그러나, 도복을 조절하는 분자 기전은 탐구되어야 할 것으로 남아있다.
곡류 식물 도복은 뿌리 도복 및 줄기 도복을 포함한다 (참조: Zhang et al., 2016). 줄기 강도는 줄기 도복 저항성에 중요한 역할을 한다 (참조: Zuber et al., 1999). 셀룰로스 후 두번 째로 가장 풍부한 생물학적 중합체로서, 리그닌은 줄기 강성 및 강도, 및 해충 및 병원체에 대한 내성에 중요하다 (참조: Boerjan et al., 2003; Bhuiyan et al., 2009; Zhang et al., 2014; Barros et al., 2015). 리그닌은 식물 세포 벽에서 하기의 3개의 모노리그놀 전구체의 산화 중합에 의해 생성되는 페닐프로파노이드-유래된 중합체이다: p-쿠마릴 알코올 (H 유닛), 코니페릴 알코올 (G 유닛), 및 시나필 알코올 (S 유닛) (참조: Vanholme et al., 2008). 퍼옥시다제에 추가로, 라카아제는 모노리그놀의 산화 중합을 통한 리그닌 중합에 필요하다 (참조: Berthet et al., 2011; Zhao et al., 2013; Bryan et al., 2016).
다수의 연구는 리그닌 생합성이 다운스트림 표적 유전자를 활성화시키는 전사 인자의 발현을 변형시킴에 의해 변화될 수 있음을 보고하였다. 이들 전사 인자는 NAC, WRKY, 및 MYB를 포함한다 (참조: Mitsuda et al., 2007; Zhou et al., 2009; Wang et al., 2010). 마이크로RNA (miRNA) 및 다른 소형 RNA는 전사후 유전자 사일런싱, 해독 억제 또는 이종염색질 변형을 통한 유전자 조절에 중요한 것으로 알려져 있다 (참조: Vaucheret et al., 2006). 최근의 연구는 miR397 및 miR857이 포플러 및 애기장대 각각에서 리그닌 생합성 및 도관 조직의 2차 성장에서 중요한 역할을 한다 (참조: Lu et al., 2013; Wang et al., 2014; Zhao et al., 2015).
miR528은 외떡잎 식물-특이적 miRNA이다. 벼에서, miR528은 L-아스코르베이트 옥시다제 (AO), 플라스토시아닌-유사 단백질, RING-H2 핑거 E3 유비퀴틴 리가제 VirE2-상호작용 단백질 2, 및 F-박스 도메인 및 류신-풍부 반복체-함유 단백질 DWARF3을 표적화한다 (참조: Wu et al., 2017). 벼가 바이러스에 의해 감염되는 경우, miR528은 우선적으로 AGO18과 연합하여 AO 활성이 증진되고 기본 활성 산소 종 축적이 증가하고 항바이러스 방어가 향상된다 (참조: Wu et al., 2017). 벼 miR528의 항상성 발현은 AAO (아스코르베이트 산 옥시다제) 및 CBP1 (구리 이온 결합 단백질 1) 전사체를 억제함에 의해 크리핑 벤트그래스 (creeping bentgrass)에서 염분 스트레스와 N 기아에 대한 내성을 증진시킨다 (참조: Yuan et al., 2015). 그러나, 옥수수에서 miR528의 기능적 중요성은 ZmmiR528의 예측된 잠재적 목표가 벼에서의 목표와 상이하기 때문에 불명확한 상태로 남아있다.
따라서, 콘과 같은 가치있는 작물에서 도복을 조절할 필요가 있다. 본 발명은 상기 필요성을 해결한다.
발명의 요약
본 출원에서, 본원 발명자들은 식물에서 도복 저항성을 개선시키기 위한 방법을 기재한다. 도복은 일반적으로 성장시기중 상당히 늦은 시기 즉 ,식물이 날아갈 정도로 충분히 크고 (그리고 작물을 재배하는데 상당한 자원이 소비되어진 경우) 기계적인 수단으로 작물을 완전히 수확할 수 없도록 하는 시기, 에 발생한다. 따라서, 도복 예방은 경제적으로 크게 중요하다. 더욱이, 도복을 위한 조건이 성장 시기에 일어나지 않는 한, 사육자, 농부, 작물 시험자 등이 변종이 내도복성인지 여부를 결정하기가 어렵다. 이와 같이, 도복을 위한 조건이 발생하는 경우, 개별 식물 또는 변종이 내도성인지 여부를 결정할 수 있는 것 또한 매우 가치가 있을 수 있다.
본원 발명자들은 옥수수에서 리그닌 조성 및 함량이 N 공급에 의해 상당한 영향을 받고 ZmLACCASE3 (ZmLAC3) 및 ZmLACCASE5 (ZmLAC5)가 ZmmiR528의 실제 표적임을 발견하였다. 본원 발명자들은 라카아제, 특히 LAC3 (ZmMZS) 및 LAC5가 리그닌 중합의 조절에 관여하여 리그닌 함량의 변화를 초래하고 따라서 식물의 기계적 강도를 변화시킨다는 것을 보여준다. 본원 발명자들은 이들 라카아제의 과발현이 식물에서 리그닌 함량의 증가를 촉진시켜 도복 저항성을 개선시킴을 보여준다. 반대로, 라카아제의 발현 억제는 식물에서 리그닌 함량을 감소시킬 수 있고, 이는 바이오에너지를 생성하기 위한 원료로서 그리고 가축용 사료로서 식물의 유용성을 증가시킨다. 본원 발명자들은 또한 ZmLAC3 및 ZmLAC5 mRNA의 풍부함을 음성으로 조절함에 의해 ZmmiR528이 리그닌 생합성 및 도복 저항성에 영향을 미친다는 것을 입증한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 식물에서 내도복성을 변화시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴에 의해 식물에서 내도복성을 증가시킨다. 보다 바람직하게, 라카아제 유전자는 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 상기 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체 및/또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화한다.
바람직한 구현예에서, 상기 라카아제 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 상기 라카아제 5를 암호화하는 핵산은 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현함을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 조절 서열은 항상성 또는 강한 프로모터이다.
하나의 구현예에서, miR528의 활성은 적어도 하나의 miR528 억제제를 사용하여 감소된다. 바람직하게, miR528 억제제는 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자이다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하고, 여기서, 상기 라카아제 폴리펩타이드는 miR528 결합 부위에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게, 라카아제 유전자는 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 라카아제 3 유전자는 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 라카아제 5 유전자는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화한다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 라카아제 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 라카아제 5를 암호화하는 핵산은 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 서열번호 3의 위치 1 내지 12로부터 선택되는 적어도 하나의 위치, 또는 서열번호 2의 위치 191 내지 211로부터 선택되는 적어도 하나의 위치 또는 서열번호 6의 위치 48 내지 68로부터 선택되는 적어도 하나의 위치로 도입된다. 보다 바람직하게, 상기 돌연변이는 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입된다. 대안적으로, 돌연변이는 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입된다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 증가시킴에 의해 식물에서 내도복성을 감소시킨다.
하나의 구현예에서, 라카아제 유전자는 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 라카아제 3 유전자는 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 라카아제 5 유전자는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화한다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 라카아제 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 라카아제 5를 암호화하는 핵산은 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자 및/또는 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하고, 여기서, 상기 돌연변이는 야생형 또는 대조군 폴리펩타이드와 비교하여 라카아제 핵산의 발현을 감소시킨다. 추가의 구현예에서, 상기 방법은 바람직하게 miR528의 발현 (전구체 서열 또는 성숙한 서열)이 감소되거나 폐지되도록 miR528 및/또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함한다.
바람직하게, 상기 돌연변이는 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입된다. 대안적으로, 돌연변이는 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입된다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 RNA 간섭을 사용하여 적어도 하나의 라카아제 핵산, 바람직하게 라카아제 3 및/또는 5 핵산의 발현을 감소시키거나 폐지시킴을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현함을 포함하고, 여기서, 상기 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 10에 정의된 바와 같은 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 암호화한다. 대안적으로, 상기 방법은 서열번호 9 (또는 15)를 포함하는 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 도입함을 포함한다.
바람직하게, 상기 식물은 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 증가된 리그닌 함량을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준 및/또는 miR528의 발현 또는 활성은 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 변화된다. 또 다른 구현예에서, 뿌리 도복 저항성은 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 변화된다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 수확량, 종자 품질 및 줄기 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함한다.
본 발명의 추가의 양상에서, 식물에서 리그닌 함량을 변화시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 유전학적으로 변화된 식물, 이의 일부 또는 식물 세포가 제공되고, 상기 식물은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 변화된 발현 또는 수준 및/또는 miR528의 변화된 발현 또는 활성을 특징으로 한다. 대안적인 구현예에서, 상기 식물은 변화된 리그닌 함량을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서, 상기 식물은 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여, 적어도 하나의 라카아제 유전자의 증가된 발현 및/또는 miR528의 감소된 발현 또는 활성을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 식물은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 발현하고, 여기서, 상기 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체 및/또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화한다.
보다 바람직하게, 라카아제 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 라카아제 5를 암호화하는 핵산은 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 식물은 적어도 하나의 miR528 억제제를 발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 식물은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 작제물을 발현한다. 또 다른 구현예에서, 상기 식물은 적어도 하나의 miR528 억제제를 발현하고, 상기 miR528 억제제는 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자이다.
또 다른 구현예에서, 상기 식물은 라카아제 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 중에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게, 여기서, 상기 라카아제 핵산은 라카아제 3 및 5로부터 선택되고, 상기 돌연변이는 miR528 결합 부위에 있다. 바람직하게, 상기 돌연변이는 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입된다. 대안적으로, 상기 돌연변이는 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입된다.
하나의 구현예에서, 상기 돌연변이는 서열번호 3의 위치 1 내지 12로부터 선택되는 적어도 하나의 위치, 또는 서열번호 6의 위치 48 내지 68로부터 선택되는 적어도 하나의 위치로 도입된다.
하나의 구현예에서, 상기 식물은 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여, 적어도 하나의 라카아제 유전자의 감소된 발현 및/또는 miR528의 증가된 발현 또는 활성을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서, 상기 식물은 적어도 하나의 miR528를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 발현한다. 바람직하게, 상기 miR528은 조절 서열에 작동적으로 연결된 서열번호 10에 정의된 것 또는 이의 기능적 변이체이거나, 상기 식물은 서열번호 9를 포함하는 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 발현한다.
바람직하게, 상기 식물은 라카아제 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 핵산에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게, 상기 라카아제 핵산은 라카아제 3 및 5로부터 선택되고, 상기 돌연변이는 야생형 또는 대조군 폴리펩타이드와 비교하여 라카아제 핵산의 발현을 감소시킨다. 보다 바람직하게, 상기 핵산은 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하고/하거나 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화한다.
추가의 구현예에서, 상기 식물은 바람직하게 miR528의 발현 (전구체 서열 또는 성숙한 서열)이 감소되거나 폐지되도록 miR528 및/또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되거나, 상기 돌연변이는 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입된다.
또 다른 구현예에서, 상기 식물은 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 적어도 하나의 라카아제 3 및/또는 5 핵산의 발현을 감소시키는 RNAi 분자를 발현한다.
바람직한 구현예에서, 식물은 옥수수이다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 식물에서 변화된 내도복성을 갖는 식물을 생산하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 식물은 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 변화된 리그닌 함량을 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 식물은 식물에서 증가된 내도복성을 갖고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 상기 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체 및/또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화한다. 바람직하게, 라카아제 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 라카아제 5를 암호화하는 핵산은 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현함을 포함한다. 바람직하게, 조절 서열은 항상성 또는 강한 프로모터이다.
대안적인 구현예에서, miR528의 활성은 적어도 하나의 miR528 억제제를 사용하여 감소된다. 바람직하게, miR528 억제제는 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자이다.
또 다른 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하고, 여기서, 상기 라카아제 폴리펩타이드는 miR528 결합 부위에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게, 상기 라카아제 유전자는 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택되고, 여기서, 상기 라카아제 3 유전자는 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 라카아제 5 유전자는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화한다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 돌연변이는 서열번호 3의 위치 1 내지 12로부터 선택되는 적어도 하나의 위치, 또는 서열번호 6의 위치 48 내지 68로부터 선택되는 적어도 하나의 위치로 도입된다.
하나의 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되거나, 상기 돌연변이는 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입된다.
또 다른 구현예에서, 상기 식물은 감소된 내도복성을 갖고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 증가시킴을 포함한다. 바람직하게, 라카아제 유전자는 라카아제 3 및/또는 라카아제 5로부터 선택되고, 여기서, 상기 라카아제 3 유전자는 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 라카아제 5 유전자는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자 및/또는 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하고, 여기서, 상기 돌연변이는 야생형 또는 대조군 폴리펩타이드와 비교하여 라카아제 핵산의 발현을 감소시킨다.
바람직하게, 상기 돌연변이는 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되거나, 상기 방법은 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입된다. 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 RNA 간섭을 사용하여 적어도 하나의 라카아제 핵산, 바람직하게 라카아제 3 및/또는 5 핵산의 발현을 감소시키거나 폐지시킴을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현함을 포함하고, 여기서, 상기 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 10에 정의된 바와 같은 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 암호화한다. 대안적으로, 상기 방법은 서열번호 9 또는 15를 포함하는 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 도입함을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 바람직하게 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 도복에서의 변화를 측정함을 추가로 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 방법은 식물을 재생하고 도복에서의 변화에 대한 스크리닝을 추가로 포함한다.
바람직한 구현예에서, 식물은 옥수수이다.
발명의 또 다른 양상에서, 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 식물이 제공된다.
추가의 양상에서, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 miR528 억제제 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 또한, 본원에 기재된 핵산 작제물을 포함하는 벡터가 제공된다.
또 다른 양상에서, 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자를 포함하는 miR528 억제제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 또는 본원에 기재된 바와 같은 miR528 억제제가 제공된다. 바람직하게, 숙주 세포는 세균 또는 식물 세포이다.
또 다른 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물, 벡터 또는 miR528 억제제를 발현하는 형질전환 식물이 제공된다. 가장 바람직하게, 식물은 옥수수이다.
또 다른 양상에서, 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 식물에서 도복 저항성을 증가시키기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물, 벡터 또는 miR528 억제제의 용도가 제공된다. 또한, 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여, 식물에서 리그닌 합성을 조절하고, 리그난 함량을 조절하고/하거나 리그닌 합성을 촉진시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물, 벡터 또는 miR528 억제제의 용도가 제공된다. 바람직하게, 상기 핵산 작제물, 벡터 또는 miR528 억제제는 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 식물에서 리그닌 합성을 증가시키고/시키거나 리그닌 함량을 증가시킨다. 보다 바람직하게, 리그닌 합성 및/또는 리그닌 함량은 식물 줄기 및/또는 뿌리에서 증가된다. 가장 바람직하게, 식물은 옥수수이다.
본 발명의 추가의 양상에서, 적어도 하나의 miR528 유전자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 DNA-결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 대안적으로, LAC3 또는 LAC5 유전자에 결합하여 miR528 결합 부위에서 miR528의 결합을 억제하거나 예방할 수 있는 적어도 하나의 DNA-결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다. 보다 바람직하게, 라카아제 활성은 영향을 받지 않는다.
하나의 구현예에서, 핵산 서열은 적어도 하나의 프로토스페이서 요소를 암호화하고, 여기서, 상기 프로토스페이서 요소의 서열은 서열번호 34, 37, 41, 44, 또는 이의 변이체로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 핵산 서열은 적어도 하나의 프로토스페이서 요소를 암호화하고, 여기서, 상기 프로토스페이서 요소의 서열은 서열번호 52, 55, 58 또는 61, 또는 이의 변이체로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 작제물은 CRISPR RNA (crRNA) 서열을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서, 상기 crRNA 서열은 프로토스페이서 요소 서열 및 추가의 뉴클레오타이드를 포함한다.
보다 바람직하게, 상기 작제물은 트랜스활성화 RNA (tracrRNA)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서, 바람직하게 상기 tracrRNA는 서열번호 31로 정의되거나 또는 이의 기능적 변이체이다.
추가의 구현예에서, 상기 작제물은 적어도 하나의 단일-가이드 RNA (sgRNA)를 암호화하고, 여기서, 상기 sgRNA는 tracrRNA 서열 및 crRNA 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, sgRNA는 서열번호 35, 38, 42, 45 또는 이의 기능적 변이체로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 추가의 구현예에서, 상기 sgRNA는 서열번호 53, 56, 59 또는 62 또는 이의 기능적 변이체로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
하나의 구현예에서, 프로토스페이서 요소 또는 sgRNA는 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 여기서, 바람직하게 상기 조절 서열은 프로모터, 보다 바람직하게, 항상성 프로모터이다.
추가의 구현예에서, 상기 핵산 작제물은 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게, CRISPR 효소는 Cas 또는 Cpf1 단백질이다. 보다 바람직하게, Cas 단백질은 Cas9 또는 이의 기능적 변이체이다.
대안적인 구현예에서, 핵산 작제물은 TAL 이펙터를 암호화한다. 바람직하게, 상기 핵산 작제물은 엔도뉴클레아제 또는 이의 DNA-절단 도메인을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 엔도뉴클레아제는 FokI이다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 단일 가이드 (sg) RNA 분자가 제공되고, 여기서, 상기 sgRNA는 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, crRNA 서열은 서열번호 33, 36, 40, 43 또는 이의 변이체로부터 선택되는 적어도 하나의 서열에 결합할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 sgRNA는 서열번호 51, 54, 57 또는 60 또는 이의 변이체로부터 선택되는 적어도 하나의 서열에 결합할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 핵산 작제물 또는 본원에 기재된 적어도 하나의 sgRNA로 형질감염된 단리된 식물 세포가 제공된다. 하나의 구현예에서, 단리된 식물 세포는 본원에 기재된 바와 같은 프로토스페이서 요소 또는 sgRNA를 포함하는 적어도 하나의 핵산 작제물 및 제2 핵산 작제물로 형질감염시키고, 여기서, 상기 제2 핵산 작제물은 Cas 단백질, 바람직하게 Cas9 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 구현예에서, 상기 제2 핵산 작제물은 sgRNA 작제물로 형질감염 전, 후 또는 이와 동시에 형질감염시킨다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 유전학적으로 변형된 식물이 제공되고, 여기서, 상기 식물은 본원에 기재된 형질감염된 세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, sgRNA를 암호화하는 핵산 및/또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 안정한 형태로 통합된다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 식물에서 내도복성을 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 식물에서 본원에 기재된 핵산 작제물, 또는 본원에 기재된 sgRNA를 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 바람직하게, 상기 증가는 대조군 또는 야생형 식물에 상대적이다.
추가의 양상에서, 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 식물이 제공된다.
또 다른 양상에서, 식물에서 내도복성을 증가시키기 위해 본원에 기재된 핵산 작제물 또는 본원에 기재된 sgRNA의 용도가 제공된다. 바람직하게, 핵산 작제물 또는 sgRNA는 식물에서 miRNA528의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다.
본 발명의 추가의 양상에서, 본원에 기재된 유전학적으로 변형된 식물을 수득하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 식물의 일부를 선택하는 단계;
b) 본원에 기재된 핵산 작제물 또는 본원에 기재된 sgRNA 분자로 문단 (a)의 식물의 일부의 적어도 하나의 세포를 형질감염시키는 단계;
c) 형질감염된 세포 또는 세포들로부터 유래된 적어도 하나의 식물을 재생하는 단계;
d) 상기 식물에서 적어도 하나의 miRNA528 핵산의 감소된 발현을 보여주는 문단 (c)에 따라 수득된 하나 이상의 식물을 선택하는 단계.
또 다른 양상에서, 바람직하게 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 증가된 도복 저항성을 가질 식물을 동정하고/하거나 선택하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 식물 또는 식물 생식질에서 라카아제 3 유전자 및/또는 프로모터, 라카아제 5 유전자 및/또는 프로모터 또는 miR528a 및/또는 b 유전자 및/또는 프로모터에서 적어도 하나의 다형태 또는 돌연변이를 검출하는 단계로서, 상기 다형태 또는 돌연변이가 상기 돌연변이가 없는 식물과 비교하여 라카아제 3 및/또는 5의 증가된 발현 및/또는 miR528의 감소된 발현/활성을 유도하는, 단계; 및 상기 식물 또는 이의 후손을 선택하는 단계를 포함한다.
발명의 또 다른 양상에서, 하기의 단백질이 제공된다:
(a) 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(b) 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 내에, 이로부터 또는 이에 하나 이상의 아미노산 잔기들의 치환 및/또는 결실 및/또는 첨가에 의해 서열번호 1로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 식물 리그닌 합성-관련 단백질.
또한, 상기 기재된 단백질의 암호화 유전자가 제공되고, 여기서, 바람직하게 상기 암호화 유전자는 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 DNA 분자이다:
(1) 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 암호화 영역을 갖는 DNA 분자;
(2) 엄중 조건하에서 (1)의 DNA 서열과 하이브리드화하고 식물 리그닌 합성-관련 단백질을 암호화하는 DNA 분자; 및
(3) (1)의 DNA 서열과 적어도 90% 상동성이고 식물 리그닌 합성-관련 단백질을 암호화하는 DNA 분자.
또한, 상기 기재된 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 발현 카세트, 형질전환 세포주 또는 재조합 종이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 하기 중 적어도 하나에서 본원에 기재된 단백질의 용도가 제공된다:
(d1) 식물에서 리그닌 합성의 조절;
(d2) 식물 줄기에서 리그닌 합성의 조절;
(d3) 식물에서 리그닌 함량의 조절;
(d4) 식물 줄기에서 리그닌 함량의 조절;
(d5) 식물에서 리그닌 합성의 촉진;
(d6) 식물 줄기에서 리그닌 합성의 촉진;
(d7) 식물에서 리그닌 함량의 증가의 촉진; 및
(d8) 식물 줄기에서 리그닌 함량의 증가의 촉진.
또한, 상기 기재된 유전자를 출발 식물에 도입하여 형질전환 식물을 수득하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되고, 여기서, 상기 출발 식물과 비교하여 상기 형질전환 식물은 (f1) 증가된 리그닌 함량; 또는 (f2) 줄기에서 증가된 리그닌 함량의 표현형을 갖는다.
또한, 출발 식물에서 상기 기재된 유전자의 발현을 억제하여 형질전환 식물을 수득하는 단계를 포함하는, 형질전환 식물을 생산하기 위한 방법이 제공되고, 여기서, 상기 출발 식물과 비교하여 상기 형질전환 식물은 적어도 (g1) 감소된 리그닌 함량; 또는 (g2) 줄기에서 감소된 리그닌 함량의 표현형을 갖는다.
또한, 표적 식물에서 리그닌 함량을 증가시키거나 표적 식물의 줄기에서 리그닌 함량을 증가시키도록, 표적 식물에서 본원에 기재된 단백질의 함량 및/또는 활성을 증가시킴에 의해 식물 육종 방법이 제공된다.
또한, 표적 식물에서 리그닌 함량을 감소시키거나 표적 식물의 줄기에서 리그닌 함량을 감소시키도록, 표적 식물에서 본원에 기재된 단백질 함량 및/또는 활성을 감소시킴에 의해 식물 육종 방법이 제공된다.
또한, 식물 육종에서 상기 기재된 단백질, 유전자의 용도, 재조합 발현 벡터 또는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 상이한 리그닌 함량을 갖는 형질전환 식물을 육종하기 위한 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 특정 DNA 분자 I를 출발 식물에 도입하여 출발 식물 보다 낮은 리그닌 함량을 갖는 형질전환 식물을 수득하는 단계를 포함하는, 감소된 리그닌 함량을 갖는 식물을 육종하는 방법이 제공되고, 여기서, 상기 특이적 DNA 분자 I는 DNA 분자 A 또는 DNA 분자 B이고, 여기서, 상기 DNA 분자 A는 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA를 암호화하고, 상기 DNA 분자 B는 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 전구체 RNA를 암호화한다.
또한 "서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 전구체 RNA"가 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA인, 상기 기재된 방법이 제공된다.
하나의 양상에서, 특이적 DNA 분자 I는 구체적으로 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 특이적 DNA 분자 I는 구체적으로 재조합 플라스미드 I에 의해 출발 식물에 도입될 수 있다. 재조합 플라스미드 I는 구체적으로 특이적 DNA 분자 I를 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입함에 의해 수득된 재조합 플라스미드일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 기재된 방법으로부터 수득된 형질전환 식물은 줄기의 감소된 리그닌 함량 및 감소된 천공 강도를 갖고, 바이오에너지를 생성하기 위한 원료로서 사용될 수 있다.
또한, 특이적 DNA 분자 II를 출발 식물에 도입하여 출발 식물 보다 높은 리그닌 함량을 갖는 형질전환 식물을 수득하는 단계를 포함하는, 증가된 리그닌 함량을 갖는 형질전환 식물을 육종시키기 위한 방법이 제공되고, 여기서, 상기 특이적 DNA 분자 II는 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 발현을 억제하는 DNA 분자이다. 하나의 구현예에서, 특이적 DNA 분자 II는 구체적으로 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 특이적 DNA 분자 II는 구체적으로 재조합 플라스미드 II에 의해 출발 식물에 도입될 수 있다. 재조합 플라스미드 II는 구체적으로 특이적 DNA 분자 II를 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입함에 의해 수득된 재조합 플라스미드일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 기재된 방법으로부터 수득된 형질전환 식물은 증가된 리그닌 함량, 증가된 줄기 천공 강도 및 개선된 내도복성을 갖는다.
하나의 구현예에서, 상기 언급된 임의의 출발 식물은 단자엽 식물일 수 있다. 단자엽 식물은 벼과 식물, 및 특히 콘, 예를 들어, 옥수수 변종 31일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA가 제공된다. 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 전구체 RNA가 제공된다. 바람직하게, 전구체 RNA는 구체적으로 서열번호 14에 나타낸 서열을 갖는 RNA이다.
서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA가 제공된다.
또한, 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA 또는 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA를 암호화하는 유전자가 제공된다. 바람직하게, 상기 유전자는 구체적으로 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자이다.
또한, 상기 기재된 바와 같은 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
또한, 감소된 리그닌 함량을 갖는 식물의 육종에서 상기 기재된 miRNA, RNA 또는 유전자의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 증가된 리그닌 함량을 갖는 식물의 육종에서 상기 기재된 miRNA 또는 RNA의 발현을 억제하는 물질의 용도가 제공된다.
또한, 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다. 재조합 벡터는 구체적으로 상기 유전자를 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입함에 의해 수득된 재조합 플라스미드이다. 또한, 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 재조합 플라스미드가 제공된다.
또 다른 양상에서, 증가된 리그닌 함량을 갖는 식물의 육종에서 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA 또는 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA의 발현을 억제하는 화합물의 용도가 제공된다. 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA 또는 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA의 발현을 억제하는 화합물은 구체적으로 간섭 벡터이다. 간섭 벡터는 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자를 함유하는 재조합 플라스미드이다. 간섭 벡터는 구체적으로 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자를 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입함에 의해 수득된 재조합 플라스미드이다.
또한, 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자를 함유하는 재조합 플라스미드인, 재조합 플라스미드 (간섭 벡터)가 제공된다. 간섭 벡터는 구체적으로 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자를 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입함에 의해 수득된 재조합 플라스미드이다.
상기 식물 중 임의의 식물은 단자엽 식물일 수 있다. 단자엽 식물은 벼과 식물, 특히 콘, 예를 들어, 옥수수 변종 31일 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면에서 추가로 설명된다:
도 1은 실시예 1에서 ZmMZS 유전자의 상대적 발현 수준을 보여준다.
도 2는 실시예 1에서 조직학적 염색 후 현미경사진을 보여준다.
도 3은 실시예 1에서 결정된 리그닌 함량을 보여준다.
도 4는 실시예 2에서 뿌리의 조직학적 염색 후 현미경사진을 보여준다.
도 5는 실시예 2에서 제1 절간의 조직학적 염색 후 현미경사진을 보여준다.
도 6은 실시예 2에서 결정된 리그닌 함량을 보여준다.
도 7은 확인된 miRNA 발현 수준을 보여준다.
도 8은 중간 뿌리 부분의 조직학적 염색 후 현미경사진을 보여준다.
도 9는 제1 절간의 조직학적 염색 후 현미경사진을 보여준다.
도 10은 결정된 리그닌 함량을 보여준다.
도 11은 결정된 줄기의 천공 강도를 보여준다.
도 12는 분 실험 (pot experiment)에서의 태슬링 단계 (tasseling stage)에서 식물의 사진을 보여준다.
도 13은 노던 블롯 분석 (Northern Blot analysis) 결과를 보여준다.
도 14는 N 공급에 의한 ZmmiR528 및 ZmLAC 발현의 조절을 보여준다. N 공급에 의한 (A) ZmmiR528 및 (B 및 C) 이의 표적의 조절. 식물은 RNA가 잎과 뿌리로부터 단리되기 전에 지시된 시간 동안 0.02, 2, 또는 4 mM Ca(NO3)2를 함유하는 영양액 중에서 수경법으로 재배하였다. ZmmiR528 및 이의 표적의 발현 수준은 ZmUBQ1의 발현 수준으로 정규화시켰다. NL, NS, 및 ND는 각각 N 럭셔리, N 충분, 및 N 결핍을 나타낸다. 값은 4개의 생물학적 레플리케이트의 평균 ± SE이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 최소 유의차 (LSD) 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다.
도 15는 ZmLAC3 및 ZmLAC5가 ZmmiR528에 의해 조절되는 것을 보여준다. (A) 엔. 벤타미아나 (N. benthamiana) 잎에서 ZmMIR528b 및 ZmLAC3 또는 ZmLAC5를 함유하는 작제물의 동시-발현. 실시간 RT-PCR에 의해 결정된 발현 수준은 타바코 18S rRNA의 발현 수준으로 정규화되었다. 값은 3개의 생물학적 레플리케이트의 평균 ± SE이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다. (B) 5' RACE에 의해 결정된 ZmLAC3 및 ZmLAC5 mRNA 절단 부위. 숫자는 각각의 부위에서 절단의 빈도를 나타낸다.
도 16은 동일 반응계 하이브리드화 분석에 의해 결정된 ZmmiR528 및 ZmLAC5의 발현 패턴을 보여준다. 수경법으로 재배된 옥수수의 뿌리, 줄기 및 새싹에서 (A) ZmmiR528 및 (B) ZmLAC5 전사체의 축적. 상응하는 센스 프로브는 음성 대조군으로서 사용하였다. 대표적인 식물을 사진촬영하였다. (A) 및 (B)에서 스케일 바는 각각 100 μm 및 50 μm를 나타낸다.
도 17은 옥수수 도복 저항성이 ZmmiR528 풍부함에 의해 영향을 받는 것을 보여준다. (A) 토양-재배된 ZmmiR528-과발현 형질전환 옥수수는 야생형 또는 형질전환 ZmmiR528 녹-다운 주 보다 N-럭셔리 조건하에서 도복에 보다 민감하였다. 대표적인 식물을 사진촬영하였다. WT, 야생형. (B) 토양-재배된 옥수수 줄기의 껍질 침입도계 저항성에 대한 ZmmiR528 풍부함의 효과. 각각의 유전자형의 10개의 식물을 측정하였다. (C 및 D) 토양-재배된 옥수수의 줄기에서 AcBr 리그닌 (C), 셀룰로스, 및 헤미셀룰로스 (D) 함량에 대한 ZmmiR528 풍부함의 효과. DW는 건조 중량을 나타낸다. 값은 4개의 생물학적 레플레이트에 대한 평균 ± SE이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다. (E) 소형 RNA 노던 블롯에 의해 지시된 바와 같은 WT, TM, 및 OE 형질전환 옥수수에서 ZmmiR528 수준. 각각의 샘플 기원의 5 마이크로그램의 소형 RNA가 레인당 부하되었다. U6은 부하 대조군으로서 나타냈다. 각각의 레인 아래의 숫자는 상대적 발현 비율을 나타낸다. (F) AcBr 리그닌 함량에 대한 ZmmiR528 풍부함의 효과, 값은 4개의 생물학적 레플리케이트의 평균 ± 표준 오차이다. DW는 건조 중량을 나타낸다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다. (G) 실시간 RT-PCR에 의해 지시된 바와 같이 WT, TM, 및 OE 형질전환 옥수수에서 상응하는 ZmLAC3 및 ZmLAC5 유전자 전사체의 검출. 정량은 ZmUBQ1의 발현으로 정규화되었다. 값은 3개의 생물학적 레플리케이트의 평균 ± 표준 오차이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다.
도 18은 ZmLAC3 과발현이 토양-재배된 옥수수에서 리그닌 함량을 증가시킴을 보여준다. (A) ZmLAC3-과발현 형질전환 옥수수의 줄기의 플로로글루시놀 염색. 대표적인 식물을 사진촬영하였다. 스케일 바는 75 μm를 나타낸다. (B-E) ZmLAC3-과발현 형질전환 옥수수의 AcBr 리그닌 함량 (B), 껍질 침입도계 저항성 (C), 셀룰로스 함량 (D), 및 헤미셀룰로스 함량 (E). DW는 건조 중량을 나타낸다. 값은 4개의 생물학적 레플레이트에 대한 평균 ± SE이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다.
도 19는 (A) ZmLAC3OE 형질전환 옥수수에서 ZmLAC3의 mRNA 수준을 보여준다. 실시간 RT-PCR 정량은 ZmUBQ1의 발현으로 정규화되었다. 값은 4개의 생물학적 레플리케이트의 평균 ± 표준 오차이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다. 또한, (B) ZmLAC3OE 형질전환 옥수수에서 ZmPALs 전사체를 보여준다. 발현 수준은 ZmUBQ1의 수준으로 정규화되었다. 값은 3개의 생물학적 레플리케이트의 평균 ± 표준 오차이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다.
도 20은 WT, TM, 및 OE 형질전환 옥수수에서 ZmPAL 전사체 수준에 대한 N 공급의 효과를 보여준다. ZmPAL 전사체 수준에 대한 ZmmiR528 풍부함 및 N 공급의 효과. 발현 수준은 ZmUBQ1의 수준으로 정규화되었다. 값은 3개의 생물학적 레플리케이트의 평균 ± SE이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따라 p <0.01에서 유의적으로 상이하지 않다. NL, NS, 및 ND는 각각 N 럭셔리, N 충분, 및 N 결핍을 지적한다.
도 21은 N-럭셔리 조건하에서 옥수수 도복 저항성에서 ZmmiR528의 역할에 대해 제안된 모델을 보여준다. miR528의 증가된 수준 및 ZmLAC 및 ZmPAL의 감소된 풍부함은 N-럭셔리 조건하에 옥수수의 감소된 도복 저항성을 설명할 수 있다. 화살표는 양성 조절을 나타내고 뭉툭한-말단 바는 억제를 나타낸다.
도 22는 실시예 7에 사용된 sgRNA 및 hSpCas9의 도식적 다이아그램을 보여준다.
도 23은 도복-경향 식물과 miR527 녹다운 형질전환 식물을 교배시키는 도복 저항성에 대한 효과를 보여준다.
본 발명은 이제 추가로 기술될 것이다. 하기 구절에서, 발명의 상이한 양상은 보다 상세히 정의된다. 이와 같이 정의된 각각의 양상은 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로서 나타낸 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로서 나타낸 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계 기술 내에 있는 식물학, 미생물학, 조직 배양, 분자 생물학, 화학, 생화학 및 재조합 DNA 기술, 생물 정보학의 종래의 기술을 이용할 것이다. 상기 기술은 문헌에서 충분히 설명되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산", "핵산 서열", "뉴클레오타이드", "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자 (예를 들어, mRNA), 자연 발생, 돌연변이된, 합성 DNA 또는 RNA 분자 및 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 이것은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 구조적 유전자의 암호화 서열, 안티-센스 서열 및 mRNA 또는 단백질 생성물을 암호화하지 않는 비-암호화 조절 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 용어는 또한 유전자를 포괄한다. 용어 "유전자" 또는 "유전자 서열"은 생물학적 기능과 연합된 DNA 핵산을 지칭하기 위해 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손을 포함할 수 있거나, cDNA에서와 같이 암호화 서열만을 포함할 수 있고/있거나 조절 서열과 조합된 cDNA를 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 임의의 길이의 중합체 형태의 아미노산을 지칭한다.
용어 "miR528"은 마이크로(mi) RNA 분자를 지칭한다. 성숙한 miR528의 RNA 서열은 서열번호 9 및 15로 나타낸다. 성숙한 miR528을 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 10으로 나타낸다. 하나의 예에서, miR528은 본원에서 "ZmmiR528"로서 언급되는 옥수수 miR528이다. 옥수수에서, 각각의 상이한 유전자좌에 의해 암호화된 miR528의 2개의 구성원 miR528a 및 miR528b가 있다. 각각의 유전자좌는 상이한 전구체 서열 (각각 miR528a 및 b에 상응하는 서열번호 32 및 39로서 나타냄)을 갖는 miR528을 생성하지만, 상기 생성된 성숙한 서열은 동일하다. 용어 "전구체"는 숙주 세포 내에서 프로세싱되어 하나의 가닥이 성숙한 miRNA인 짧은, 부분 이중 가닥의 RNA를 생성하는 전구체 RNA 또는 전구-miRNA를 지칭한다.
본 발명의 양상은 재조합 DNA 기술을 포함하고, 전통적인 육종 방법에 의한 식물 생성에만 기초한 구현예를 배제한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 식물에서 내도복성을 변화시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함한다.
하나의 구현예에서, "변화"는 내도복성을 증가시킴을 의미할 수 있다. 대안적인 구현예에서, "변화"는 내도복성을 감소시킴을 의미할 수 있다. 하나의 구현예에서, 증가 또는 감소는 대조군 식물과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 또는 95% 이하일 수 있거나 그 이상일 수 있다. 하나의 예에서, 증가 수준은 12 내지 20%일 수 있다.
하나의 구현예에서, 내도복성은 높은 질소 또는 질소-풍부 조건하에서 변화된다. 하나의 예에서, 높은 N은 300 kg 우레아/ha 초과인 것으로 간주될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 내도복성은 정상 (예를 들어, 240-300 kg 우레아/ha) 또는 낮은 질소 조건 (180 kg 우레아/ha 이하, 바람직하게 180 내지 120 kg 우레아/ha)하에서 변화된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "내도복성" 또는 "도복 저항성"은 또한 "수확능 (harvestability)"으로서 지칭될 수 있고, 식물 줄기의 굽힘 또는 파손, 또는 식물의 기울어짐을 지칭할 수 있다. 대안적으로, 내도복성에서의 증가는 도복의 감소와 동등한 것으로 간주될 수 있고, 내도복성 감소는 도복에서의 증가와 동등한 것으로 간주될 수 있다.
하나의 구현예에서, 도복은 식물의 줄기 및/또는 식물의 뿌리에서 증가되거나 감소된다.
하나의 예에서, 도복 심각도는 플롯에 대해 가시적으로 스코어링될 수 있고, 여기서, 줄기 도복은 이삭에서 또는 이삭 아래에서 줄기가 파손되어 가시적일 수 있고, 뿌리 도복은 30℃를 초과하는 각도로 옥수수 줄기가 기울어짐으로써 가시적일 수 있다.
또 다른 예에서, 도복 저항성은 줄기 강도의 측정으로부터 결정될 수 있다. 줄기 강도의 하나의 척도는 껍질 침입 또는 침입도계 저항성 또는 RPR (이는 스파이크 또는 바늘로 줄기 껍질을 천공하는데 필요한 힘의 척도이다)이다. 다수의 연구는 껍질 침입 저항성이 상기 분야에서 줄기 도복과 음으로 상호관련 있음이 입증되었다. 하나의 구현예에서, RPR은 대조군 식물과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 또는 95% 이하거나 그 이상으로 증가되거나 감소될 수 있다. 하나의 예에서, 증가 수준은 12 내지 20%일 수 있다.
추가의 예에서, 도복 저항성은 식물에서, 바람직하게 식물의 줄기 및/또는 뿌리에서 리그닌 함량에서의 증가에 의해 결정될 수 있다. 셀룰로스 이후 제2의 가장 풍부한 생물학적 중합체로서, 리그닌은 줄기 강성 및 강도 및 해충 및 병원체에 대한 내성을 위해 중요하다 (참조: Boerjan et al., 2003; Bhuiyan et al., 2009; Zhang et al., 2014; Barros et al., 2015). 리그닌은 식물 세포 벽에서 하기의 3개의 모노리그놀 전구체의 산화 중합에 의해 생성되는 페닐프로파노이드-유래된 중합체이다: p-쿠마릴 알코올 (H 유닛), 코니페릴 알코올 (G 유닛), 및 시나필 알코올 (S 유닛) (참조: Vanholme et al., 2008). 하나의 예에서, 총 리그닌 중합체 함량을 결정하기 위해, 식물 재료는 아세틸 브로마이드 (AcBr)에 의한 가수분해에 적용되고 리그닌 함량을 분석하였다. 이것은 AcBr 방법으로서 공지되어 있고, 문헌 (참조: Fukushima and Hatfield (2004))에 의해 기재되어 있다. 하나의 구현예에서, 리그닌 함량은 대조군 식물과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 또는 95% 이하거나 그 이상으로 증가되거나 감소될 수 있다. 하나의 예에서, 증가 수준은 12 내지 20%일 수 있다.
추가의 예에서, 도복 저항성은 식물에서, 바람직하게 식물의 줄기 및/또는 뿌리에서 셀룰로스 및/또는 헤미셀룰로스 함량에서의 증가로부터 결정될 수 있다. 하나의 예에서, 셀룰로스 및/또는 헤미셀룰로스 함량은 변형된 NREL 절차를 사용하여 결정될 수 있다 (문헌 (참조: Sluiter et al., 2008)에 기재된 바와 같은). 하나의 구현예에서, 셀룰로스 및/또는 헤미셀룰로스 함량은 대조군 식물과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 또는 95% 이하이거나 그 이상으로 증가되거나 감소될 수 있다. 하나의 예에서, 증가 수준은 12 내지 20%일 수 있다.
따라서, 하나의 예에서, 도복 저항성은 하기 중 임의의 하나 또는 이의 조합의 측정으로부터 결정될 수 있다: 도복 심각도의 가시적 스코어, 껍질 침입도계 저항성, 리그닌 함량 및/또는 셀룰로스/헤미셀룰로스 함량. 도복 저항성을 측정하기 위한 다른 파라미터는 당업자에게 공지되어 있다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 수준 또는 발현을 증가시킴에 의해 식물에서 내도복성을 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 특히 도복 조건하에 또는 식물이 야생형 또는 대조군 식물에서 도복을 유도하는 조건에 노출된 경우, 수확량 및/또는 줄기 강도를 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함한다. 하나의 예에서, 도복 조건은 임의의 환경 조건, 예를 들어, 야생형 또는 대조군 식물에서 도복을 유발하는 높은 바람, 비, 과밀집단, 폭풍 손상 등이다.
용어 "수확량"은 일반적으로, 전형적으로 특정 작물, 지역 및 일정 기간과 관련된 경제적 가치의 측정 가능한 생산을 의미한다. 개별 식물 부분은 직접적으로 이들의 수, 크기 및/또는 중량에 기초한 수확량에 기여한다. 실제 수확량은 연간 작물에 대한 평방 미터 당 수확량으로, 연간 총 생산량 (수확된 생산량과 평가된 생산량 둘 모두를 포함함)을 심은 평방 미터로 나누어 결정된다.
수확량은 대조군 또는 야생형 식물에 상대적으로 증가된다. 예를 들어, 수확량은 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%로 증가한다.
본 발명의 추가의 양상에서, 식물에서 리그닌 함량을 변화시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 식물에서, 바람직하게 식물의 줄기 또는 뿌리에서 리그닌 함량을 증가시킴을 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함한다. 하나의 구현예에서, 리그닌 함량은 대조군 식물과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 또는 95% 이하거나 그 이상으로 증가되거나 감소될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "발현을 증가시키는"은 뉴클레오타이드 수준에서의 증가를 의미하고, 본원에 사용된 바와 같은 "수준을 증가시키는"은 적어도 하나의 라카아제의 단백질 수준에서의 증가를 의미한다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 라카아제의 발현 또는 수준 또는 활성은 야생형 또는 대조군 식물에서의 수준과 비교하는 경우 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이하 또는 이상으로 증가된다. 라카아제 뉴클레오타이드 발현 또는 단백질 수준을 결정하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특히, 증가는 당업자에게 알려진 임의의 표준 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 라카아제의 발현 및/또는 단백질 수준에서의 증가는 단백질 및/또는 핵산 수준의 측정을 포함할 수 있고 이에 제한되지 않지만 겔 전기영동 또는 크로마토그래피 (예를 들어, HPLC)의 임의의 형태와 같은 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 측정될 수 있다.
라카아제는 구리-함유 옥시다제 효소이다. 본원에 사용된 바와 같은 라카아제는 또한 식물 리그닌 합성-관련 단백질로 지칭될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 라카아제는 라카아제 3 (또는 LAC3) 및 라카아제 5 (또는 LAC5)로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 식물은 옥수수이고 라카아제는 ZmLACCASE 3 (ZmLAC3) 또는 ZmLACCASE 5 (ZmLAC5)로 지칭될 수 있다. 대안적으로, ZmLAC3은 본원에서 ZmMNS 또는 ZmMZS로 지칭될 수 있다.
발명의 하나의 양상에서, 라카아제 단백질이 제공되고, 여기서, 상기 단백질은
(a) 서열번호 1 또는 4에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(b) 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 내에, 이로부터 또는 이에 하나 이상의 아미노산 잔기들의 치환 및/또는 결실 및/또는 첨가에 의해 서열번호 1로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 식물 리그닌 합성-관련 단백질이다.
(b)에서 단백질의 정제 및 검출을 용이하게 하기 위해, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 N 또는 C 말단은 표 1에 나타낸 바와 같은 태그와 부착될 수 있다.
[표 1] 태그 서열:
Figure pct00001
(b)에서 단백질은 인공적으로 합성될 수 있거나, 이의 암호화 유전자를 합성함에 이어서 생물학적 발현에 의해 수득될 수 있다. (b)에서 단백질의 암호화 유전자는 하나 이상의 아미노산 잔기의 코돈(들)을 결실시키고/시키거나 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 DNA 서열에서 하나 이상의 염기쌍의 미스센스 돌연변이를 진행하고/하거나 상기 표 1에 나타낸 바와 같은 태그를 이의 암호화 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 부착시킴에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 단리된 라카아제 핵산 또는 DNA 분자가 또한 제공된다. 하나의 구현예에서, DNA 분자는 다음 중 어느 하나로부터 선택된다:
(1) 서열번호 3 또는 6에 나타낸 바와 같은 암호화 영역을 갖는 DNA 분자;
(2) 서열번호 2 또는 5에 나타낸 바와 같은 게놈 서열을 갖는 DNA 분자;
(3) 엄중 조건하에서 (1) 또는 (2)의 DNA 서열과 하이브리드화하고 식물 리그닌 합성-관련된 또는 라카아제 단백질을 암호화하는 DNA 분자; 및
(4) (1), (2) 또는 (3)의 DNA 서열과 적어도 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99% 상동성 (또는 "동일성)이고 식물 리그닌 합성-관련 단백질 또는 라카아제를 암호화하는 DNA 분자.
바람직하게, 상기 엄중 조건은 65℃에서 DNA 또는 RNA 하이브리드화 실험에서 0.1x SSPE (또는 0.1x SSC) 및 0.1% SDS 용액 중에서 하이브리드화 및 세척을 포함할 수 있다.
발명의 또 다른 양상에서, 재조합 발현 벡터 (본원에서 "핵산 작제물"로도 지칭됨), 발현 카세트, 본원에 기재된 단백질, 핵산 또는 DNA 분자, 바람직하게 ZmMZS를 포함하는 형질전환 세포주 또는 재조합 종이 제공된다.
본원에 기재된 바와 같은 라카아제 핵산, 바람직하게 LAC3 (바람직하게 ZmMZS) 또는 LAC5를 포함하는 재조합 발현 벡터는 기존의 발현 벡터를 사용함에 의해 작제될 수 있다. 상기 발현 벡터는 이원 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 벡터 및 미세가속 충격을 위한 벡터를 포함한다. 재조합 발현 벡터가 라카아제 유전자로 작제되는 경우, 임의의 증진된, 항상성, 조직-특이적 또는 유도성 프로모터는 전사 개시 뉴클레오타이드 앞에 연결될 수 있고 이는 단독으로 또는 다른 식물 프로모터와 조합하여 사용될 수 있다. 더욱이, 재조합 발현 벡터는 라카아제 유전자로 작제되는 경우, 해독 인핸서 또는 전사 인핸서를 포함하는 인핸서가 포함될 수 있다. 이들 인핸서 영역은 ATG 개시 코돈 또는 인접한 영역의 개시 코돈일 수 있지만, 전체 서열의 적당한 해독을 보장하기 위해 암호화 서열과 동시 프레임될 필요가 있다. 해독 대조군 신호 및 개시 코돈은 광범위하게 가용할 수 있고, 천연이거나 합성될 수 있다. 해독 개시 영역은 전사 개시 영역 또는 구조적 유전자로부터 기원할 수 있다. 형질전환 식물 또는 형질전환 미생물의 동정 및 스크리닝을 촉진시키기 위해, 사용되는 발현 벡터는, 예를 들어, 식물 또는 미생물에서 색 변화를 생성하는 효소 또는 발광 화합물을 발현하는 유전자, 내성 항생제 마커 또는 화학적 내성 마커 유전자를 부가함에 의해 프로세싱될 수 있다. 전이유전자의 안정성을 고려하여, 상기 식물 또는 미생물은 선택적 마커 유전자를 부가하는 것 없이 표현형 선택에 의해 직접 형질전환될 수 있다.
구체적으로, 재조합 발현 벡터는 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위로 임의의 서열번호 2, 3, 5 또는 6에 나타낸 바와 같은 DNA 분자를 삽입함에 의해 수득된 재조합 플라스미드 pCUB-ZmMZS일 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현함을 포함하고, 여기서, 상기 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 상기 기재된 라카아제 3 및/또는 라카아제 5 폴리펩타이드를 암호화한다. 상기 기재된 핵산 작제물의 사용은 핵산이 도입된 식물에서 라카아제 3 및/또는 라카아제 5의 발현, 바람직하게는 과발현을 유도한다.
바람직하게, 라카아제 3 폴리펩타이드는 서열번호 1에 정의된 것 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 라카아제 3 핵산은 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화한다. 보다 바람직하게, 라카아제 3 핵산은 서열번호 2 또는 3 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이들로 이루어진다.
바람직하게, 라카아제 5 폴리펩타이드는 서열번호 4에 정의된 것 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 라카아제 5 핵산은 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화한다. 보다 바람직하게, 라카아제 5 핵산은 서열번호 5 또는 6 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하거나 이들로 이루어진다.
임의의 서열번호 1 내지 47을 참조로 본원에 사용된 용어 "변이체" 또는 "기능적 변이체"는 전체 비-변이체 서열의 생물학적 기능을 보유하는 변이체 유전자 서열 또는 상기 유전자 서열의 일부를 지칭한다. 기능적 변이체는 또한 관심 대상의 유전자 변이체를 포함하고 이는, 예를 들어, 비-보존된 잔기에서 기능에 영향을 미치지 않는 서열 변화를 갖는다. 실질적으로 동일한, 즉, 본원에 나타낸 바와 같이 야생형 서열과 비교하여, 예를 들어, 비-보존된 잔기에서 일부 서열 변형만을 갖고 생물학적으로 활성인 변이체도 포함된다. 암호화된 폴리펩타이드의 기능적 성질에 영향을 미치지 않는 소정의 부위에서 상이한 아미노산의 생산을 초래하는 핵산 서열에서의 변형은 당업계에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 아미노산 알라닌, 소수성 아미노산에 대한 코돈은 또 다른 소수성이 덜한 잔기, 예를 들어, 글라이신, 또는 소수성이 보다 큰 잔기, 예를 들어, 발린, 류신 또는 이소류신을 암호화하는 코돈에 의해 치환될 수 있다. 유사하게, 하나의 음으로 하전된 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 예를 들어, 아스파르트산의 글루탐산으로의 치환 또는 하나의 양으로 하전된 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 예를 들어, 라이신의 아르기닌으로의 치환을 유도하는 변화는 또한 기능적으로 동등한 생성물을 생성할 것으로 예상될 수 있다. 폴리펩타이드 분자의 N-말단 및 C-말단부의 변형을 초래하는 뉴클레오타이드 변화는 또한 폴리펩타이드의 활성을 변화시키지 않을 것으로 예상된다. 제안된 변형 각각은 암호화된 생성물의 생물학적 활성의 보유의 결정과 같이 당업계의 통상의 기술 내에 있다.
본원에 기재된 본 발명의 임의의 양상에서 사용된 바와 같이, "변이체" 또는 "기능적 변이체"는 비-변이체 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%의 전체 서열 동일성을 갖는다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드는 각각 2개의 서열에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 서열이 하기된 바와 같이 최대 상응성을 위해 정렬되는 경우, 동일한 경우 "동일한" 것으로 일컬어 진다. 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정된 바와 같이, 비교 윈도우 상에서 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬되는 경우, 동일하거나 특정 퍼센트의 아미노산 잔기 또는 동일한 뉴클레오타이드를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질 또는 펩타이드와 관련하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치가 흔히 보존성 아미노산 치환 (여기서, 아미노산 잔기는 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환된다)에 의해 상이하여, 분자의 기능적 성질을 변화시키지 않는 것으로 인지된다. 서열이 보존성 치환으로 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존성 성질에 대해 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 상기 조정을 수행하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 이와 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우, 서브서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열과 상대적으로 시험 서열에 대한 백분율 서열 동일성을 계산한다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하에 적합한 알고리즘의 비제한적인 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다.
추가의 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 변이체는 본원에 정의된 바와 같은 엄중 조건하에서 서열번호 2, 3, 5 또는 6 중 임의의 하나로 하이브리드화할 수 있는, 본원에 정의된 바와 같은 라카아제 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 서열의 하이브리드화는 엄중 조건하에서 수행될 수 있다. "엄중 조건" 또는 "엄중 하이브리드화 조건"은 프로브가 다른 서열 보다 검출 가능하게 보다 큰 정도 (예를 들어, 기본 보다 적어도 2배)로 이의 표적 서열에 하이브리드화하는 의도된 조건이다. 엄중 조건은 서열 의존적이고, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 하이브리드화 및/또는 세척 조건의 엄중도를 조절함에 의해, 프로브에 100% 상보성인 표적 서열은 동정될 수 있다 (상동성 프로빙). 대안적으로, 엄중도 조건은 서열에서 일부 미스매칭되도록 조정되어 보다 낮은 정도의 유사성이 검출될 수 있도록 한다 (이종성 프로빙). 일반적으로, 프로브는 길이가 약 1000개 미만인 뉴클레오타이드, 바람직하게 길이가 500개 미만인 뉴클레오타이드이다.
전형적으로, 엄중 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M 미만의 Na 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 60℃인 조건일 것이다. 하이드리드화의 지속 기간은 일반적으로 약 24시간 미만, 보통 약 4 내지 12시간이다. 엄중 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화 제제의 첨가로 달성될 수 있다. 하나의 예에서, 상기 엄중 조건은 65℃에서 DNA 또는 RNA 하이브리드화 실험에서 0.1x SPPE (또는 0.1x SSC) 및 0.1% SDS 용액 중에서 하이브리드화 및 세척을 포함할 수 있다.
상기 방법을 포함하고 하기에 기재된 바와 같은 식물, 방법 및 용도를 포함하는 발명의 모든 양상에 따라, 용어 "조절 서열"은 본원에서 "프로모터"와 상호교환적으로 사용되고, 모든 용어는 광범위한 의미에서 이들이 연결된 서열의 발현을 실행시킬 수 있는 조절 핵산 서열을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "조절 서열"은 또한 세포, 조직 또는 기관에서 핵산 분자의 발현을 부여하거나, 활성화시키거나, 증진시키는 합성 융합 분자 또는 유도체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 항상성이거나 강한 프로모터일 수 있다.
"항상성 프로모터"는 적어도 하나의 세포, 조직 또는 기관에서 필연적으로 모두는 아니지만 성장 및 발육의 대부분의 단계 동안에 및 대부분의 환경 조건하에서 전사적으로 활성인 프로모터를 지칭한다. 항상성 프로모터의 예는 콜리플라워 모자이크 바이러스 프로모터 (cauliflower mosaic virus promoter) (CaMV35S 또는 19S), 벼 액틴 프로모터, 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 루비스코 소형 서브유닛, 옥수수 또는 알팔파 H3 히스톤, OCS, SAD1 또는 2, GOS2 또는 증진된 발현을 부여하는 임의의 프로모터를 포함한다.
"강한 프로모터"는 유전자의 증가된 발현 또는 과발현을 유도하는 프로모터를 지칭한다. 강한 프로모터의 예는 CaMV-35S, CaMV-35Somega, 아라비도프시스 유비퀴틴 UBQ1, 벼 유비퀴틴, 액틴, 또는 옥수수 알코올 데하이드로게나제 1 프로모터 (Adh-1)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"은 상기 프로모터 서열이 관심 대상의 유전자의 전사를 개시할 수 있도록, 프로모터 서열과 관심 대상의 유전자 간의 기능적 연결을 지칭한다.
하나의 구현예에서, 자손 식물은 본원에 기재된 핵산 작제물로 안정하게 형질전환시키고 식물 세포에서 유전적으로 유지되는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 방법은 작제물이 안정하게 통합되었음을 입증하기 위한 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 선택된 자손 식물로부터 종자를 수거하는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴에 의해 식물에서 내도복성을 증가시킨다.
miR528은 외떡잎 식물-특이적 miRNA이다. 벼에서, miR528은 L-아스코르베이트 옥시다제 (AO), 플라스토시아닌-유사 단백질, RING-H2 핑거 E3 유비퀴틴 리가제 VirE2-상호작용 단백질 2, 및 F-박스 도메인 및 류신-풍부 반복체-함유 단백질 DWARF3을 표적화한다 (참조: Wu et al., 2017). 벼가 바이러스에 의해 감염되는 경우, miR528은 우선적으로 AGO18과 연합하여 AO 활성이 증진되고 기본 활성 산소 종 축적이 증가하고 항바이러스 방어가 향상된다 (참조: Wu et al., 2017). 벼 miR528의 항상성 발현은 AAO (아스코르베이트 산 옥시다제) 및 CBP1 (구리 이온 결합 단백질 1) 전사체를 억제함에 의해 크리핑 벤트그래스에서 염분 스트레스와 N 기아에 대한 내성을 증진시킨다 (참조: Yuan et al., 2015). 그러나, 옥수수에서 miR528의 기능적 중요성은 ZmmiR528의 예측된 잠재적 목표가 벼에서의 목표와 상이하기 때문에, 불명확한 상태로 남아있다. 추가로, 옥수수에서 miR528 - miR529a 및 miR528b의 2개의 구성원 각각은 상이한 유전자좌에 의해 암호화된다. 각각의 유전자좌는 상이한 전구체 서열 (본원에서 서열번호 32 및 39로서 나타냄)을 갖는 miR528을 생성하지만, 생성된 성숙한 서열은 동일하다 (성숙한 miR528의 RNA 및 DNA 서열은 각각 서열번호 9 및 10으로 나타낸다). 여기서, 본원 발명자들은 옥수수에서 리그닌 조성 및 함량이 N 공급에 의해 상당한 영향을 받고 ZmLACCASE3 (ZmLAC3) 및 ZmLACCASE5 (ZmLAC5)가 ZmmiR528의 실제 표적임을 보여준다. 본원 발명자들은 또한 ZmLAC3 및 ZmLAC5 mRNA의 풍부함을 음성으로 조절함에 의해 ZmmiR528이 옥수수 리그닌 생합성 및 도복 저항성에 영향을 미침을 입증한다.
miR528의 "발현을 감소시키는"은 대조군 식물과 비교하여 miR528의 뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA) 수준에서의 감소를 의미한다. 하나의 예에서, miR528의 활성은 라카아제 3 및/5 단백질 또는 RNA 수준에 의해 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서, 적어도 하나의 miR528의 발현 또는 활성은 야생형 또는 대조군 식물에서의 수준과 비교하는 경우 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이하 또는 초과로 감소된다. "폐지된"이란 어떠한 miR528도 발현되지 않거나 검출 가능하게 발현될 수 없음을 의미한다. miR528 뉴클레오타이드 발현을 결정하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특히, 감소는 당업자에게 알려진 임의의 표준 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 발현 수준에서의 감소는 핵산 수준의 측정을 포함할 수 있고 이에 제한되지 않지만 겔 전기영동 또는 크로마토그래피 (예를 들어, HPLC)의 임의의 형태와 같은 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 miR528이 본원에 정의된 바와 같이 발현되지 않거나 (즉, 발현은 폐지된다) 발현이 감소되도록 적어도 하나의 miR528 유전자 (예를 들어, 서열번호 32, 39, 49 또는 50에서 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 전구체 서열 또는 성숙한 miR528 서열) 및/또는 프로모터 서열로 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함할 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 돌연변이는 변화된 유전자가 기능적 생성물을 발현하지 않도록, 즉 이것이 LAC3 및/또는 LAC5에 결합할 수 없도록 miR528에 도입될 수 있다. 상기 방식으로, miR528의 활성은 감소되거나 폐지된 것으로 간주될 수 있다. 바람직하게, miR528의 발현은 폐지된다. 상기 방식으로, 돌연변이는 녹-아웃 돌연변이이다.
대안적인 구현예에서, miR528의 활성을 감소시키는 것은 miR528이 이의 표적-LAC3 및 LAC5에 결합하는 부위를 돌연변이시켜 miR528이 LAC3 및/또는 LAC5 mRNA에 결합하고 분해할 수 없도록 하는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 이것은 LAC3 및 LAC5의 단백질 수준을 증가시킨다.
따라서, 하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 miR528 결합 부위에 적어도 하나의 돌연변이를 도입시킴을 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 방법은 LAC3 및/또는 LAC5의 miR528 결합 부위에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함한다. 하나의 구현예에서, 돌연변이는 LAC3 및 LAC5 miR528 결합 부위 둘 다에 도입된다.
LAC3에서 miR528 결합 부위는 다음과 같다:
CUCUGCUGCAUGCCCCUUCGA (서열번호 20)
LAC5에서 miR528 결합 부위는 다음과 같다:
CUUCUCCGCAUGUCCCUUCCU (서열번호 21)
바람직하게, 상기 돌연변이는 miR528의 LAC3 및/또는 LAC5로의 결합을 방지하는 임의의 돌연변이이다. 하나의 예에서, 돌연변이는 상기 기재된 서열번호 20 및/또는 21에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및 치환으로부터 선택될 수 있다. 하나의 예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오타이드는 결실되거나 삽입된다. 하나의 구현예에서, 상기 돌연변이는 사일런트 돌연변이이다. 보다 바람직하게, 상기 돌연변이는 또한 단백질의 라카아제 (예를 들어, 옥시다제) 활성에 영향을 미치지 않는다.
하나의 구현예에서, 상기 돌연변이는 돌연변이 유발 또는 표적화된 게놈 편집을 사용하여 도입된다. 즉, 하나의 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 유전자 조작 방법에 의해 생성되고 자연 발생 변종을 포함하지 않는 방법 및 식물에 관한 것이다.
표적화된 게놈 변형 또는 표적화된 게놈 편집은 표적화된 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 사용하여 상동성 재조합 (HR)-매개된 재조합 반응을 통해 게놈 편집을 자극하는 게놈 조작 기술이다. 부위-특이적 DNA DSB의 도입을 통한 효과적인 게놈 편집을 달성하기 위해, 4개의 주요 부류의 조작 가능한 DNA 결합 단백질이 사용될 수 있다: 미생물 이동 유전자 요소들로부터 유래된 메가뉴클레아제, 진핵 세포 전사 인자에 기초한 ZF 뉴클레아제, 크산토모나스 (Xanthomonas) 세균으로부터 기원하는 전사 활성화인자-유사 이펙터 (TALE) 및 II형 세균 입양 면역계 CRISPR (클러스터된 정규적 간격을 둔 짧은 팔린드롬 반복체)로부터의 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 Cas9. 메가뉴클레아제, ZF, 및 TALE 단백질 모두는 단백질-DNA 상호작용을 통해 특이적 DNA 서열을 인지한다. 메가뉴클레아제는 뉴클레아제 및 DNA-결합 도메인을 통합하지만, ZF 및 TALE 단백질은 각각 3개 또는 1개의 DNA의 뉴클레오타이드 (nt)를 표적화하는 개별 모듈로 이루어진다. ZF 및 TALE는 목적하는 조합으로 어셈블리되고 FokI의 뉴클레아제 도메인에 부착되어 특이적 게놈 유전자좌로 핵산분해 활성을 지시할 수 있다.
세균 III형 분비 시스템을 통해 숙주 세포로의 전달시, TAL 이펙터는 핵으로 진입하고 숙주 유전자 프로모터에서 이펙터-특이적 서열에 결합하고 전사를 활성화시킨다. 이들의 표적화 특이성은 탠덤 33 내지 35개 아미노산 반복체의 중심 도메인에 의해 결정된다. 이어서, 이것에 20개 아미노산의 단일 절단된 반복체가 있다. 조사된 다수의 자연 발생 TAL 이펙터는 12 내지 27개 완전 반복체를 갖는다.
이들 반복체는 2개의 인접한 아미노산, 이들의 반복체-가변성 이-잔기 (RVD)에 의해서만 서로 상이하다. TAL 이펙터가 인지하는 것이 어느 단일 뉴클레오타이드인지를 결정하는 RVD: 하나의 RVD는 하나의 뉴클레오타이드에 상응하고, 4개의 가장 통상적인 RVD 각각은 우선적으로 4개의 염기 중 하나와 연합한다. 자연 발생 인지 부위는 TAL 이펙터 활성을 위해 요구되는 T에 균일하게 선행된다. TAL 이펙터는 FokI 뉴클레아제의 촉매 도메인에 융합되어 TAL 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 생성할 수 있고 이는 생체내 게놈 편집을 위해 표적화된 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 만든다. 게놈 편집에서 이 기술의 사용은 당업계에서, 예를 들어, US 8,440,431, US 8,440,432 및 US 8,450,471에 널리 기재되어 있다. 문헌 (참조: Cermak T et al.)은 다중 DNA 단편을 어셈블리하기 위해 골든 게이트 클로닝 방법과 함께 사용될 수 있는 조작된 플라스미드 세트를 기재한다. 본원에 기재된 바와 같은, 골든 게이트 방법은 IIS형 제한 엔도뉴클레아제를 사용하고 이는 이들의 인지 부위 외부에서 절단하여 독특한 4bp 오버행을 생성한다. 클로닝은 올바른 어셈블리가 효소 인지 부위를 제거하기 때문에 동일한 반응 혼합물에서 분해 및 연결에 의해 촉진된다. 커스텀 TALEN 또는 TAL 이펙터 작제물의 어셈블리는 2개의 단계를 포함한다: (i) 1 내지 10개 반복체의 중재 어레이로의 반복 모듈의 어셈블리 및 (ii) 최종 작제물을 제조하기 위한 중재 어레이의 골격으로의 연결. 따라서, 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 LAC3 및/또는 LAC5에서 miR528 유전자 또는 프로모터 또는 miR528 결합 서열을 표적화하는 TAL 이펙터를 디자인할 수 있다.
본 발명의 다양한 양상에 따라 사용될 수 있는 또 다른 게놈 편집 방법은 CRISPR이다. 게놈 편집에서 이 기술의 사용은 당업계에서, 예를 들어, US 8,697,359 및 본원에 인용된 참조문헌에 널리 기재되어 있다. 요컨대, CRISPR은 공격 파아지에 대한 방어에 관여하는 미생물 뉴클레아제 시스템 및 플라스미드이다. 미생물 숙주에서 CRISPR 유전자좌는 CRISPR-매개된 핵산 절단의 특이성을 프로그램화할 수 있는 비-암호화 RNA 요소 (sgRNA) 뿐만 아니라 CRISPR-연합된 (Cas) 유전자의 조합을 포함한다. 3개 유형 (I-III)의 CRISPR 시스템은 광범위한 세균 숙주에 걸쳐 동정되었다. 각각의 CRISPR 유전자좌의 하나의 주요 특성은 비-반복 서열의 짧은 스트레치 (스페이서)에 의해 이격된 반복 서열 어레이 (직접적인 반복체)의 존재이다. 비-암호화 CRISPR 어레이는 전사되고 Cas 뉴클레아제를 표적 부위로 지시하는 개별 스페이서 서열 (프로토스페이서)을 포함하는 짧은 crRNA로의 직접적인 반복체 내에서 절단된다. II형 CRISPR은 가장 잘 특징 분석된 시스템 중 하나이고, 4개의 순차적 단계에서 표적화된 DNA 이중 가닥 절단을 수행한다. 첫째로, 2개의 비-암호화 RNA, 프레-crRNA 어레이 및 tracrRNA는 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 둘째로, tracrRNA는 프레-crRNA의 반복 영역에 하이브리드화하고 프레-crRNA의 개별 스페이서 서열을 포함하는 성숙한 crRNA로의 프로세싱을 매개한다. 셋째로, 성숙한 crRNA:tracrRNA 복합체는 crRNA 상의 스페이서와, 표적 인지를 위한 요건인 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 인접한 표적 DNA 상의 프로토스페이서 간의 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 지시한다. 최종적으로, Cas9는 표적 DNA의 균열을 매개하여 프로토스페이서 내 이중 가닥 절단을 생성한다.
통상적인 유전자 표적화 및 다른 프로그램 가능한 엔도뉴클레아제와 비교하여 CRISPR-Cas9 시스템의 한가지 주요 이점은 멀티플렉싱의 용이하다는 점이고, 여기서, 다중 유전자는 단순히 각각 상이한 유전자를 표적화하는 다중 sgRNA를 사용함에 의해 동시에 돌연변이될 수 있다. 추가로, 게놈 영역을 플랭킹하여 2개의 sgRNA가 사용되는 경우, 중재 섹션은 결실되거나 반전될 수 있다 (참조: Wiles et al., 2015).
따라서, Cas9는 II형 CRISPR-Cas 시스템의 홀마크 단백질이고, 2개의 비암호화 RNA의 복합체에 의해 PAM (프로토스페이서 인접한 모티프) 서열 모티프에 인접한 DNA 표적 서열로 가이드된 대형 단량체성 DNA 뉴클레아제이다: CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA). Cas9 단백질은 RuvC 및 HNH 뉴클레아제와 상동성인 2개의 뉴클레아제 도메인을 함유한다. HNH 뉴클레아제 도메인은 상보성 DNA 가닥을 절단하는 반면, RuvC-유사 도메인은 비-상보성 가닥을 절단하고, 결과로서 평활 절단이 표적 DNA에 도입된다. sgRNA와 함께 Cas9의 이종성 발현은 부위-특이적 이중 가닥 절단 (DSB)을 다양한 유기체 기원의 생존 세포의 게놈 DNA로 도입할 수 있다. 진핵 세포 유기체에서의 적용을 위해, 본래 세균 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터 기원하는 Cas9의 코돈 최적화된 버전이 사용되어 왔다.
단일 가이드 RNA (sgRNA)는 Cas9 뉴클레아제와 복합체를 형성하는 CRISPR/Cas 시스템의 제2 성분이다. sgRNA는 crRNA를 tracrRNA와 융합시킴에 의해 생성된 합성 RNA 키메라이다. 이의 5' 말단에 위치한 sgRNA 가이드 서열은 DNA 표적 특이성을 부여한다. 따라서, 가이드 서열을 변형시킴에 의해, 상이한 표적 특이성을 갖는 sgRNA를 생성할 수 있다. 가이드 서열의 정규 (canonical) 길이는 20 bp이다. 식물에서, sgRNA는 U6 및 U3과 같은 식물 RNA 폴리머라제 III 프로모터를 사용하여 발현되었다. 따라서, 당업계에 공지된 기술을 사용하여, LAC3 및/또는 LAC5 유전자에서 miR528a 및/또는 b 또는 miR528 결합 부위를 표적화하는 sgRNA 분자를 디자인할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 상기 적합한 CRISPR 작제물의 예는 하기에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 표적화된 SNP 또는 돌연변이를 miR528 유전자에 도입하기 위해 하기 상세히 정의된 sgRNA (및 주형 또는 공여자 DNA) 작제물을 사용한다. 바람직하게, 돌연변이는 miR528의 발현을 감소시키거나 폐지시킨다. 대안적으로, 돌연변이의 결과로서, miR528은 LAC3 및/또는 5에 더 이상 결합할 수 없다. 하기 설명된 바와 같이, 이중 가닥 DNA에서 sgRNA-매개된 절단 후 주형 DNA 가닥의 도입은 상동성 지시된 복구를 사용하여 유전자 내 특이적 표적화된 돌연변이 (즉, SNP)를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, sgRNA (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이)는 효소, 예를 들어, 데아미나제, 예를 들어, 시티딘 데아미나제, 또는 TadA (tRNA 아데노신 데아미나제) 또는 ADAR 또는 APOBEC와 같이, "염기 편집기"에 융합된 닉카제 Cas9 또는 nCas9 또는 "데드 (dead)" Cas9 (dCas9)와 같이 변형된 Cas9 단백질과 함께 사용될 수 있다. 이들 효소는 하나의 염기를 또 다른 염기로 치환할 수 있다. 결과로서, 어떠한 DNA도 결실되지 않지만, 단일 치환이 이루어진다 (참조: Kim et al., 2017; Gaudelli et al. 2017).
하나의 예에서, 돌연변이는 서열번호 35, 38, 42 및/또는 45에 나타낸, 본원에 기재된 바와 같은 하기의 sgRNA 서열을 사용하여 miRNA528a 및/또는 miRNA528b에 도입된다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 sgRNA 작제물을 사용하여 적어도 하나의 돌연변이를 LAC3 및/또는 LAC5 유전자 내 miRNA 528 결합 부위에 도입한다. 대안적으로, CRISPR 시스템을 사용하여 LAC3 또는 LAC5 내 miRNA528 결합 부위를 인공 또는 공여자 서열로 대체할 수 있다. 바람직하게, 인공 서열은 동의 돌연변이 (즉, 핵산 서열을 변화시키지만 아미노산 서열은 변화시키지 않는다)인 miRNA 결합 부위에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 이와 같이, miRNA528은 결합할 수 없거나 적은 효율로 결합하지만, 라카아제의 단백질 기능은 영향을 받지 않는다. 이러한 방식으로, miRNA528의 활성은 본원에 기재된 바와 같이 감소된 것으로 간주될 수 있다. 표적화된 DNA 대체물 또는 공여자 서열을 도입하기 위해 CRISPR을 사용하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Zhao et al. 2016 and Zhang et al. 2018). 그러나, 하나의 예에서, sgRNA 작제물이 제공되고, 여기서, sgRNA 작제물은 서열번호 51 (LAC3), 54 (LAC3), 57 (LAC5) 또는 및 60 (LAC5)으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열 또는 이의 변이체 (상기 정의된 바와 같이)를 표적화하는 (이에 결합할 수 있는) 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, sgRNA 작제물은 적어도 하나의 프로토스페이서 서열을 포함하고, 여기서, 상기 프로토스페이서 서열은 서열번호 52 (LAC3), 55 (LAC3), 58 (LAC5) 및 61 (LAC5)로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게, sgRNA 작제물은 서열번호 53 (LAC3), 56 (LAC3), 59 (LAC5) 및 62 (LAC5) 중 하나로부터 선택되는 sgRNA 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 핵산 서열은 바람직하게 이의 예가 본원에 기재된 프로모터와 같은 조절 서열에 작동적으로 연결된다. sgRNA 작제물은 또한 Cas, 바람직하게 Cas9 또는 Cpf1과 같은 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 효소를 포함할 수 있다. 이 예에서, 상기 표적 서열이 서열번호 51 (LAC3) 또는 57 (LAC5)로부터 선택되거나, 프로토스페이서 서열이 서열번호 52 (LAC3) 또는 서열번호 58 (LAC5)로부터 선택되거나, sgRNA 핵산 서열이 서열번호 53 (LAC3) 또는 서열번호 59 (LAC5)로부터 선택되는 경우, CRISPR 효소는 Cas 단백질, 바람직하게 Cas9이다. 대안적으로, 상기 표적 서열이 서열번호 54 (LAC3) 또는 60 (LA5)으로부터 선택되거나, 프로토스페이서 서열이 서열번호 55 (LAC3) 또는 서열번호 61 (LAC5)로부터 선택되거나, sgRNA 핵산 서열이 서열번호 56 (LAC3) 또는 서열번호 562 (LAC5)로부터 선택되는 경우, CRISPR 효소는 Cpf1이다.
추가로, 또한 LAC3 또는 LAC5 유전자 내 miRNA528 결합 부위를 대체하기 위해 공여자 서열을 포함하는 공여자 서열 작제물이 제공된다. 하나의 예에서, 공여자 서열은 서열번호 65를 포함하고, 바람직하게 여기서, 상기 표적은 LAC3이다. 또 다른 예에서, 공여자 서열은 서열번호 66을 포함하고, 바람직하게 여기서, 상기 표적 서열은 LAC5이다. 바람직한 예에서, 공여자 서열은 본원에 기재된 임의의 프로모터와 같이 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 그러나, 대안적인 구현예에서, 공여자 서열은 sgRNA 서열과 동일한 작제물 상에 그리고 동일하거나 분리된 조절 서열의 제어하에 존재할 수 있다.
"crRNA" 또는 CRISPR RNA란 프로토스페이서 요소 및 tracrRNA에 상보적인 추가의 뉴클레오타이드를 함유하는 RNA의 서열을 의미한다.
"tracrRNA" (트랜스활성화 RNA)는 crRNA와 하이브리드화하고 Cas9와 같은 CRISPR 효소에 결합하여 뉴클레아제 복합체를 활성화하여 적어도 하나의 miRNA528 핵산의 게놈 서열 또는 프로모터 서열 내 특이적 부위에서 이중 가닥 절단을 도입하는 RNA 서열을 의미한다.
"프로토스페이서 요소"란 일반적으로 길이가 약 20개 뉴클레오타이드인 게놈 DNA 표적 서열에 상보적인 crRNA (또는 sgRNA)의 일부를 의미한다. 이것은 또한 스페이서 또는 표적화 서열로서 공지된 것일 수 있다.
"sgRNA" (단일-가이드 RNA)란, 단일 RNA 분자 내 tracrRNA와 crRNA의 조합을 의미하고, 바람직하게 또한 링커 루프 (tracrRNA와 crRNA를 단일 분자로 연결하는)를 포함한다. "sgRNA"란 또한 "gRNA"로 지칭될 수 있고, 본원에서 상기 용어는 상호교환될 수 있다. sgRNA 또는 gRNA는 Cas 또는 Cpf1 뉴클레아제에 대한 표적화 특이성 및 스캐폴딩/결합 능력 둘 다를 제공한다. gRNA는 crRNA 분자 및 tracrRNA 분자를 포함하는 이중 RNA 분자를 언급할 수 있다.
"공여자 서열"이란, 바람직하게 상동성-지시된 복구 또는 HDR을 사용하여 특이적 치환 또는 서열을 표적 서열에 도입하기 위해 필요한 모든 요소들을 함유하는 핵산 서열을 의미한다. 하나의 구현예에서, 공여자 서열은 적어도 하나, 바람직하게 표적 서열과 각각 동일한 좌측 아암 및 우측 아암에 의해 플랭킹되어 있다. 아암 또는 아암들은 또한 공여자 서열이 Cas9/gRNA에 의해 방출될 수 있도록 PAM 모티프를 포함하는 2개의 gRNA 표적 서열에 의해 추가로 플랭킹될 수 있다.
"TAL 이펙터" (전사 활성화인자-유사 (TAL) 이펙터) 또는 TALE란, 게놈 DNA 표적 서열 (예를 들어, LAC3 또는 LAC5에서 miRNA528 유전자 또는 프로모터 서열 또는 miR528 결합 부위 내 서열)에 결합할 수 있고 TAL 이펙터 뉴클레아제 또는 TALENS를 생성하기 위해 FokI와 같은 엔도뉴클레아제 또는 메가 TAL을 생성하기 위해 메가뉴클레아제의 절단 도메인과 융합될 수 있는 단백질 서열을 의미한다. TALE 단백질은 DNA 결합에 관여하는 중심 도메인, 핵-위치화 신호 및 표적 유전자 전사를 활성화시키는 도메인으로 구성된다. DNA-결합 도메인은 단량체들로 이루어지고, 각각의 단량체는 표적 뉴클레오타이드 서열에서 하나의 뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 단량체는 33-35개 아미노산의 탠덤 반복체이고, 이중에 위치 12 및 13에 위치한 2개의 아미노산은 고도로 가변성 (반복체 가변 이잔기, RVD)이다. 단일 특이적 뉴클레오타이드의 인지에 관여하는 것은 RVD이다. HD는 사이토신을 표적화하고; NI는 아데닌을 표적화하고, NG는 티민을 표적화하고, NN은 구아닌을 표적화한다 (그러나, NN은 또한 보다 낮은 특이성으로 아데닌에 결합할 수 있다).
또 다른 발명의 양상에서, 핵산 작제물이 제공되고, 여기서, 상기 핵산 작제물은 적어도 하나의 DNA-결합 도메인을 암호화하고, 여기서, 상기 DNA-결합 도메인은 miRNA528 유전자 내 서열에 결합할 수 있고, 상기 서열은 서열번호 33, 36, 40 또는 43으로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 양상에서, 적어도 하나의 DNA-결합 도메인을 암호화하는 핵산 작제물이 제공되고, 여기서, 상기 DNA-결합 도메인은 LAC3 또는 LAC5 유전자 내 서열에 결합할 수 있고, 바람직하게 상기 서열은 서열번호 51 (LAC3), 54 (LAC3), 57 (LAC5) 및 60 (LAC5)으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 상기 작제물은 Fokl와 같은 (SSN) 서열-특이적 뉴클레아제 또는 Cas 또는 Cpf1 단백질과 같은 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 핵산 작제물은 적어도 하나의 프로토스페이서 요소를 암호화하고, 여기서 상기 프로토스페이서 요소의 서열은 서열번호 34, 37, 41, 44, 또는 이의 변이체로부터 선택된다. 대안적으로, 적어도 하나의 프로토스페이서 요소는 서열번호 52, 55, 58 및 61 또는 이의 변이체로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 핵산 작제물은 crRNA-암호화 서열을 포함한다. 상기 정의된 바와 같이, crRNA 서열은 상기 정의된 바와 같은 프로토스페이서 요소 및 바람직하게 tracrRNA에 상보적인 추가의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 추가의 뉴클레오타이드에 대해 적당한 서열은 이들이 Cas 또는 Cpf1 단백질의 선택에 의해 정의되므로 당업자에게 공지될 것이다. 그러나, 하나의 예에서, crRNA의 서열 또는 추가의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 핵산 작제물은 tracrRNA 서열을 추가로 포함한다. 또한, 적당한 tracrRNA 서열은, 상기 서열이 Cas 단백질의 선택에 의해 정의되므로 당업자에게 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 하나의 예에서, 상기 서열은 서열번호 31에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 변이체를 포함하거나 이들로 이루어진다.
추가의 구현예에서, 핵산 작제물은 sgRNA (또는 gRNA)를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 또한, 이미 논의된 바와 같이, sgRNA는 전형적으로 crRNA 서열, tracrRNA 서열 및 바람직하게 링커 루프에 대한 서열을 포함한다. 하나의 예에서, sgRNA 서열은 서열번호 48 또는 이의 변이체, 및 바람직하게 본원에서와 같이 정의된 임의의 서열과 같은 프로토스페이서 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 핵산 작제물은 임의의 서열번호 35, 38, 42, 45 또는 이의 변이체에 의해 정의된 바와 같이 sgRNA 서열을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 핵산 작제물은 임의의 서열번호 53, 56, 59 및 62 또는 이의 변이체에 의해 정의된 바와 같이 sgRNA 서열을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.
추가의 구현예에서, 핵산 작제물은 엔도리보뉴클레아제 절단 부위를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 엔도리보뉴클레아제는 Csy4 (Cas6f로도 공지된)이다. 핵산 작제물이 다중 sgRNA 핵산 서열을 포함하는 경우, 상기 작제물은 동일한 수의 엔도리보뉴클레아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 절단 부위는 sgRNA 핵산 서열의 5'이다. 따라서, 각각의 sgRNA 핵산 서열은 엔도리보뉴클레아제 절단 부위에 의해 플랭킹된다.
전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 용어 '변이체'는 뉴클레오타이드가 실질적으로 상기 서열 중 하나와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 변이체는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 치환 또는 결실과 같은 변형에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 변이체는 상기 기재된 서열 중 임의의 하나와 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 서열 동일성은 적어도 90%이다. 또 다른 구현예에서, 서열 동일성은 100%이다. 서열 동일성은 당업계에서 임의의 하나의 공지된 서열 정렬 프로그램에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 적합한 식물 프로모터에 작동적으로 연결된 이들 핵산 서열들 중 하나를 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이다. 적합한 식물 프로모터는 항상성 또는 강한 프로모터일 수 있거나, 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 하나의 구현예에서, 적합한 식물 프로모터는 세스트럼 옐로우 잎 컬링 바이러스 (cestrum yellow leaf curling virus) (CmYLCV) 프로모터 또는 스위치그래스 유비귀틴 1 프로모터 (PvUbi1) 밀 U6 RNA 폴리머라제 III (TaU6) CaMV35S, 밀 U6 또는 옥수수 유비퀴틴 (예를 들어, Ubi1) 프로모터로부터 선택되되지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 프로모터는 ZmUbi (서열번호 46)이다.
본 발명의 핵산 작제물은 또한 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. "CRISPR 효소"란, CRISPR 시스템과 연합할 수 있는 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제를 의미한다. 구체적으로, 상기 효소는 tracrRNA 서열에 결합한다. 하나의 구현예에서, CRIPSR 효소는 Cas 단백질 ("CRISPR 연합된 단백질), 바람직하게 Cas 9 또는 Cpf1, 보다 바람직하게 Cas9이다. 특정 구현예에서, Cas9는 코돈 최적화된 Cas9이고, 보다 바람직하게는 서열번호 47에 기재된 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 갖는다. 대안적인 구현예에서, 상기 CRISPR 효소는 Cpf1이고, 서열번호 64에 정의된 바와 같은 Cpf1 단백질 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, Cpf1 서열은 서열번호 63 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하거나 이들로 이루어진다. 또 다른 실험에서, CRISPR 효소는 부류 2 후보물 단백질의 계열 기원의 단백질, 예를 들어, C2c1, C2C2 및/또는 C2c3이다. 하나의 구현예에서, Cas 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터 기원한다. 대안적인 구현예에서, Cas 단백질은 스타필로코커스 아우레우스, 나이세리아 메닌기티데스 (Neisseria meningitides), 스트렙토코커스 써모필 (Streptococcus thermophiles) 또는 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola) 중 임의의 하나로부터 기원할 수 있다.
Cas9 또는 Cpf1과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "기능적 변이체"는 전체 비-변이체 서열의 생물학적 기능을 보유하고, 예를 들어, DNA 엔도뉴클레아제로서, 또는 인지 또는/및 DNA로의 결합으로서 작용하는 변이체 Cas9 또는 Cpf1 유전자 서열 또는 상기 유전자 서열의 일부를 지칭한다. 기능적 변이체는 또한 기능에 영향을 미치지 않는 서열 변화를 갖는 관심 대상의 유전자의 변이체, 예를 들어, 비-보존된 잔기를 포함한다. 실질적으로 동일한, 즉, 본원에 나타낸 바와 같이 야생형 서열과 비교하여, 예를 들어, 비-보존된 잔기에서 단지 일부 서열 변형을 갖고 생물학적으로 활성인 변이체도 포함된다. 하나의 구현예에서, 서열번호 47 또는 63의 기능적 변이체는 서열번호 47 또는 63으로 나타낸 아미노산과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 전체 서열 동일성을 갖는다. 추가의 구현예에서, Cas9 단백질은 활성을 개선시키도록 변형되었다.
적합한 동족체 또는 동원체는 서열 비교 및 보존된 도메인의 확인에 의해 동정될 수 있다. 동족체 또는 동원체의 기능은 본원에 기재된 바와 같이 동정될 수 있고, 따라서 당업자는 식물에서 발현되는 경우 기능을 확인할 수 있다.
추가의 구현예에서, Cas9 단백질은 활성을 개선시키기 위해 변형되었다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, Cas9 단백질은 D10A 아미노산 치환을 포함하 수 있고, 상기 닉카제는 gRNA에 상보적이고 이에 의해 인지되는 DNA 가닥만을 절단한다. 대안적인 구현예에서, Cas9 단백질은 대안적으로 또는 추가로 H840A 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 닉카제는 sRNA와 상호작용하지 않는 DNA 가닥만을 절단한다. 상기 구현예에서, Cas9는 한 쌍 (즉, 2개) sgRNA 분자 (또는 상기 쌍을 발현하는 작제물)와 함께 사용될 수 있고, 결과로서 반대 DNA 가닥 상에 표적 영역을 절단할 수 있고, 100 내지 1500배 까지 특이성을 개선시킬 가능성이 있다. 추가의 구현예에서, Cas9 단백질은 D1135E 치환을 포함할 수 있다. Cas9 단백질은 또한 VQR 변이체일 수 있다. 대안적으로, Cas 단백질은 뉴클레아제 도메인 둘 다, HNH 및 RuvC-유사체에서 돌연변이를 포함할 수 있고, 따라서 촉매 불활성이다. 표적 가닥을 절단하는 것 보다는 상기 촉매 불활성 Cas 단백질은 전사 연장 프로세스를 차단하여 sgRNA 분자와 동시 발현되는 경우 불완전하게 해독된 단백질의 기능 상실을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 촉매 불활성 단백질의 예는 RuvC 및/또는 HNH 뉴클레아제 도메인에서 점 돌연변이에 의해 유발되는 데드 Cas9 (dCas9)이다 (참조: Komor et al., 2016 and Nishida et al., 2016).
추가의 구현예에서, Cas9와 같은 Cas 단백질은 상기 기재된 바와 같이 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하기 위해 시티딘 데아미나제 (참조: Komor et al.2016)와 같은, 히스톤-변형/DNA 메틸화 효소 또는 염기 편집기와 같이 리프레션 이펙터와 추가로 융합될 수 있다. 후자에서, 시티딘 데아미나제 효소는 dsDNA 절단을 유도하지 않지만 시티딘의 우리딘으로의 전환을 매개함으로써 C를 T로 (또는 G를 A로) 치환을 수행한다.
추가의 구현예에서, 핵산 작제물은 엔도리보뉴클레아제를 포함한다. 바람직하게 엔도뉴클레아제는 Csy4 (Cas6f로도 공지됨이고, 보다 바람직하게는 코돈 최적화된 csy4이다. 하나의 구현예에서, 핵산 작제물이 cas 단백질을 포함하는 경우, 핵산 작제물은 Cas9와 같은 cas 단백질로의 5' 말단 P2A 융합체 (자가-절단 펩타이드로서 사용되는)로서 발현되는 Csy4와 같은 엔도뉴클레아제의 발현을 위한 서열을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, cas 단백질, 엔도리보뉴클레아제 및/또는 엔도리보뉴클레아제-cas 융합 서열은 적합한 식물 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 적합한 식물 프로모터는 이미 상기 기재되어 있지만, 하나의 구현예에서 Zea Mays 유비퀴틴 1 프로모터일 수 있다.
CRISPR 핵산 및 벡터 시스템을 제조하기 위해 적합한 방법은 공지되어 있고 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 (참조: Molecular Plant (Ma et al., 2015, Molecular Plant, DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007))에 공개되어 있다.
발명의 대안적 양상에서, 핵산 작제물은 TAL 이펙터를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고, 여기서, 상기 이펙터는 서열번호 33, 36, 40 또는 43으로부터 선택되는 miRNA528 서열, 또는 서열번호 51 및 54로부터 선택되는 LAC3에서 miRNA528 결합 부위, 또는 서열번호 57 및 60으로부터 선택되는 LAC5에서 miRNA528 결합 부위를 표적화한다. TAL 이펙터를 디자인하기 위한 방법은 표적 서열이 주어지면 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 적합한 방법의 예는 둘 다 본원에 참조로 인용되는 문헌 (참조 Sanjana et al., 및 Cermak T et al.)에 기재되어 있다. 바람직하게, 상기 핵산 작제물은 TALEN 쌍을 제조하기 위해 TAL 이펙터를 암호화하는 2개의 핵산 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 핵산 작제물은 서열-특이적 뉴클레아제 (SSN)를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 SSN은 Fokl과 같은 엔도뉴클레아제이다. 추가의 구현예에서, TALEN은 단일 플라스미드 또는 핵산 작제물에서 골든 게이트 클로닝 방법에 의해 어셈블리된다.
발명의 또 다른 양상에서, sgRNA 분자가 제공되고, 상기 sgRNA 분자는 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열을 포함하고, 상기 crRNA 서열은 서열번호 33, 36, 40 또는 43으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 서열 또는 이의 변이체에 결합할 수 있다. 바람직하게, sgRNA 분자는 서열번호 35, 38, 42 및 45를 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 72 내지 75로부터 선택되는 RNA 서열을 갖는다.
대안적으로, sgRNA 분자가 제공되고, 여기서, 상기 sgRNA 분자는 서열번호 51, 54, 57 및 60으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적 서열에 결합할 수 있다. 바람직하게, sgRNA 분자는 서열번호 53, 56, 59 및 62를 포함하는 핵산 서열 및 서열번호 76 내지 79로부터 선택되는 RNA 서열을 갖는다.
"변이체"는 본원에 정의된 바와 같다. 하나의 구현예에서, sgRNA 분자는 예를 들어, 이의 안정성 및/또는 표적 서열로의 또는 tracrRNA 서열에 대한 crRNA로의 결합 친화성을 증진시키는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 (참조: Rahdar et al., 2015)에 기재된 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 예에서, crRNA는 2'-플루오로 (2'-F), 2'-O-메틸 (2'-O-Me) 및 S-함유된 에틸 (cET) 치환과 같은 포스포로티오에이트 골격 변형을 포함할 수 있다.
발명의 또 다른 양상에서, 프로토스페이서 요소 (서열번호 34, 37, 41 및 44 또는 이의 변이체에 의해 정의된 바와 같은)를 암호화하는 단리된 핵산 서열이 제공된다.
발명의 또 다른 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 작제물로 형질감염된 식물 또는 이의 일부 또는 적어도 하나의 단리된 식물 세포가 제공된다. Cas9 및 sgRNA는 조합되거나 별도의 발현 벡터 (또는 핵산 작제물, 상기 용어는 상호교환적으로 사용된다)로 있을 수 있다. 다시 말해, 하나의 구현예에서, 단리된 식물 세포는 상기 상세히 기재된 바와 같이 sgRNA 및 Cas9 둘 다를 포함하는 단일 핵산 작제물로 형질감염시킨다. 대안적인 구현예에서, 단리된 식물 세포는 2개의 핵산 작제물, 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 sgRNA를 포함하는 제1 핵산 작제물 및 Cas9 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하는 제2 핵산 작제물로 형질감염시킨다. 제2 핵산 작제물은 제1 핵산 작제물 전, 후 또는 이와 동시에 형질감염될 수 있다. cas 단백질을 포함하는 별도의 제2 작제물의 이점은 적어도 하나의 sgRNA를 암호화하는 핵산 작제물이 본원에 기재된 바와 같이 임의의 유형의 cas 단백질과 쌍을 형성할 수 있다는 것이고, 따라서 단일 cas 기능으로 제한되지 않는다 (cas 및 sgRNA 둘 다가 동일한 핵산 작제물 상에 암호화된 경우에서와 같이).
발명의 또 다른 양상에서, 상기 상세히 기재된 바와 같은 sgRNA 및 Cas9 둘 다, 또는 sgRNA, Cas9 및 공여자 DNA 서열을 포함하는 단일 핵산 작제물로 형질감염된 식물 또는이의 일부 또는 적어도 하나의 단리된 식물 세포가 제공된다. 대안적인 구현예에서, 단리된 식물 세포는 2개 또는 3개의 핵산 작제물, 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 sgRNA를 포함하는 제1 핵산 작제물, Cas9 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하는 제2 핵산 작제물 및 상기 정의된 바와 같은 공여자 DNA 서열을 포함하는 제3 핵산 작제물로 형질감염시킨다. 또한, 제2 및/또는 제3 핵산 작제물은 제1 및/또는 제2 핵산 작제물 전, 후 또는 이와 동시에 형질감염될 수 있다.
하나의 구현예에서, CRSIPR 효소를 포함하는 핵산 작제물을 먼저 형질감염시키고 적어도 하나의 sgRNA 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 사용한 제2 형질감염 전에 게놈에 안정적으로 혼입된다. 대안적인 구현예에서, 식물 또는 이의 일부, 또는 적어도 하나의 단리된 식물 세포는 Cas 단백질을 암호화하는 mRNA로 형질감염시키고 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 작제물로 동시-형질감염시킨다.
본 발명에 사용하기 위한 Cas9 발현 벡터는 당업계에 기재된 바와 같이 작제될 수 있다. 하나의 예에서, 발현 벡터는 서열번호 47에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하고, 여기서, 상기 핵산 서열은 적합한 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 적합한 프로모터의 예는 액틴, CaMV35S, 밀 U6 또는 옥수수 유비퀴틴 (예를 들어, Ubi1) 프로모터를 포함한다.
또한, 본 발명의 범위에는 상기 기재된 핵산 작제물 (CRISPR 작제물) 또는 상기 기재된 임의의 방법에서의 SgRNA 분자의 용도가 포함된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 miRNA528 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 상기 CRISPR 작제물 또는 sgRNA 분자의 용도가 제공된다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상에서, miRNA528 발현 및/또는 활성을 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기 기재된 작제물 중 어느 하나를 식물로 도입하고 발현시키거나 또한 상기 기재된 바와 같이 sgRNA 분자를 식물에 도입함을 포함한다. 다시 말해, 본원에 기재된 바와 같은 miRNA528 발현 및/또는 활성을 감소시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 CRISPR/Cas9, 및 구체적으로, 본원에 기재된 CRISPR (핵산) 작제물을 사용하여 적어도 하나의 돌연변이를 내인성 miRNA528 유전자 및/또는 프로모터에 도입하거나 LAC3 및/또는 LAC5 유전자에서 miRNA528 결합 부위에 도입함을 포함한다.
본 발명의 대안적 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 sgRNA 분자로 형질감염된 단리된 식물 세포가 제공된다.
발명의 추가의 양상에서, 본원에 기재된 형질감염된 세포를 포함하는 유전학적으로 변형되거나 편집된 식물이 제공된다. 하나의 구현예에서, 핵산 작제물 또는 작제물들은 안정한 형태로 통합될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 핵산 작제물 또는 작제물들은 통합되지 않는다 (즉, 일시적으로 발현된다). 따라서, 바람직한 구현예에서, 유전학적으로 변형된 식물은 임의의 sgRNA 및/또는 Cas/Cpf 1 단백질 핵산이 없다. 다시 말해, 식물은 전이유전자가 없다.
본원에서 언급된 용어 "도입", "형질감염" 또는 "형질전환"은 전달을 위해 사용되는 방법과 상관없이 외인성 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포로의 전달을 포함한다. 기관발생이든 배아발생이든 이에 의한 후속 클론 증식이 가능할 수 있는 식물 조직은 본 발명의 유전자 작제물로 형질전환될 수 있고 이로부터 전체 식물이 재생될 수 있다. 선택된 특정 조직은 형질 전환되는 특정 종에 가용하고 이에 가장 적합한 클론 증식 시스템에 따라 다양할 것이다. 예시적인 조직 표적은 엽편, 꽃가루, 배아, 자엽, 배축, 자성배우체, 유합 조직 (callus tissue), 기존의 분열 조직 (meristematic tissue) (예를 들어, 정단 분열 조직, 액아 (axillary bud), 및 뿌리 분열 조직), 및 유도된 분열 조직 (예를 들어, 자엽 분열조직 및 배축 분열 조직)을 포함한다. 이어서, 생성된 형질전환된 식물 세포를 사용하여 당업자에게 알려진 방식으로 형질전환된 식물을 재생시킬 수있다.
외래 유전자의 식물의 게놈으로의 전달은 형질전환이라 불리운다. 식물의 형질전환은 현재 많은 종에서 통상의 기술이다. 당업자에게 알려진 임의의 여러 형질전환 방법을 사용하여 관심 대상의 핵산 작제물 또는 sgRNA 분자를 적합한 선조 세포로 도입할 수 있다. 식물 조직 또는 식물 세포 기원의 식물의 형질전환 및 재생에 대해 기재된 방법은 일시적이거나 안정한 형질전환을 위해 사용될 수 있다.
형질전환 방법은 리포좀, 전기천공, 유리된 DNA 취득을 증가시키는 화학물질, DNA의 식물로의 직접적인 주입 (마이크로주입), 실시예에 기재된 바와 같은 유전자 총 (또는 바이오리스틱 (biolistic) 입자 전달 시스템 (바이로리스틱스)), 지질감염, 바이러스 또는 꽃가루를 사용한 형질전환 및 마이크로주입의 사용을 포함한다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 초음파-매개된 유전자 형질감염, 광학적 또는 레이저 형질감염, 탄화규소 섬유를 사용한 형질감염, 원형질체의 전기천공, 식물 재료로의 마이크로주입, DNA 또는 RNA-코팅된 입자 충격, (비-통합적) 바이러스 등을 사용한 감염으로부터 선택될 수 있다. 형질전환 식물은 또한 아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 매개된 형질전환을 통해 제조될 수 있고, 이는 본원에 참조로 포함된 문헌 (참조: Clough & Bent (1998))에 기재된 바와 같은 플로럴 딥/아그로박테리움 진공 침윤 방법을 사용함을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
따라서, 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 작제물 또는 sgRNA 분자는 상기 기재된 임의의 방법을 사용하여 적어도 하나의 식물 세포에 도입될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 핵산 작제물은 먼저 전사되어 사전 어셈블리된 Cas9-sgRNA 리보뉴클레오단백질을 형성하고, 이어서 임의의 상기 기재된 방법, 예를 들어, 지질감염, 전기천공 또는 마이크로주입을 사용하여 적어도 하나의 식물 세포로 전달될 수 있다.
임의로, 형질전환된 식물을 선택하기 위해, 형질전환에서 수득된 식물 재료는 통상적으로 선택적인 조건에 적용되어 형질전환된 식물이 형질전환되지 않은 식물과 구분될 수 있도록 한다. 예를 들어, 상기 기재된 방식으로 수득된 종자는 심을 수 있고, 초기 성장 기간 후, 분무에 위한 적합한 선택에 적용될 수 있다. 추가의 가능성은 종자를 적절한 경우 멸균 후, 단지 형질전환된 종자만이 식물로 성장할 수 있도록 적합한 선택 제제를 사용하여 한천 플레이트 상에서 성장시킨다. 실시예에 기재된 바와 같이, 적합한 마커는 바-포스피노트리신 또는 PPT일 수 있다. 대안적으로, 형질전환된 식물은, 이에 제한되지 않지만, GFP, GUS (β-글루쿠로니다제)와 같은 선택 가능한 마커의 존재에 대해 스크리닝된다. 다른 예는 당업자에게 용이하게 알려질 것이다. 대안적으로, 어떠한 선택도 수행되지 않고, 상기 기재된 방식으로 수득된 종자를 심고 성장시키고, miRNA528 발현, 단백질 수준 또는 LAC3 또는 LAC5로의 결합은 당업계에서의 표준 기술을 사용하여 적절한 시점에서 측정하였다. 전이유전자의 도입을 회피하는 이 대안은 전이유전자-유리된 식물을 생산하기에 바람직할 수 있다.
DNA 전달 및 재생 후, 형질전환된 식물은 또한, 예를 들어, 관심 대상의 유전자의 존재, 카피수 및/또는 게놈 구성을 검출하기 위해 PCR을 사용하여 추정적으로 평가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 새롭게 도입된 DNA의 통합 및 발현 수준은 써던, 노던 및/또는 웨스턴 분석을 사용하여 모니터링될 수 있고, 이들 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
생성된 형질전환된 식물은 클론 증식 또는 고전적 육종 기술과 같은 다양한 수단에 의해 증식될 수 있다. 예를 들어, 제1 세대 (또는 T1) 형질전환된 식물은 선택된 자가 및 동형접합성 제2-세대 (또는 T2) 형질전환체일 수 있고, T2 식물은 이어서 고전적 육종 기술을 통해 추가로 증식될 수 있다.
상기 기재된 CRISPR 작제물을 사용하기 위한 특정 프로토콜은 당업자에게 잘 알려져 있다. 하나의 예로서, 적합한 프로토콜은 본원에 참조로 포함된 문헌 (참조: Ma & Liu ("CRISPR/Cas-based multiplex genome editing in monocot and dicot plants"))에 기재되어 있다.
본 발명의 추가의 관련 양상에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전학적으로 변형된 식물을 수득하는 방법이 또한 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함한다
a. 식물의 일부를 선택하는 단계;
b. 상기 기재된 형질감염 또는 형질전환 기술을 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 작제물 또는 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 sgRNA 분자로 문단 (a)의 식물의 일부의 적어도 하나의 세포를 형질감염시키는 단계;
c. 상기 형질감염된 세포 또는 세포들로부터 유래된 적어도 하나의 식물을 재생하는 단계;
d. miRNA528 또는 miR528의 감소된 결합을 보여주는 라카아제 3 또는 5의 감소된 발현 또는 기능을 보여주는, 문단 (c)에 따라 수득된 하나 이상의 식물을 선택하는 단계.
추가의 구현예에서, 상기 방법은 또한 miRNA528 유전자 또는 프로모터 서열에서 또는 LAC3 또는 LAC5의 miR528 결합 부위에서 SSN (바람직하게, CRISPR)-유도된 돌연변이에 대해 유전학적으로 변형된 식물을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 형질전환된 식물로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계 및 DNA 증폭을 수행하여 적어도 하나의 miRNA528 유전자 또는 프로모터 서열 내 돌연변이를 검출하는 단계를 포함한다.
추가의 구현예에서, 상기 방법은 바람직하게 돌연변이 (즉, 적어도 하나의 miRNA528 유전자 또는 프로모터 서열 내 또는 LAC3 또는 LAC5의 miR528 결합 부위 내에서의 돌연변이)에 대해 동형접합성인 안정한 T2 식물을 생산하는 단계를 포함한다.
적어도 하나의 miRNA528 유전자 서열 내 또는 LAC3 또는 LAC5의 miR528 결합 부위 내 돌연변이를 갖는 식물은 또한 적어도 하나의 miRNA528 유전자 내 또는 LAC3 또는 LAC5 서열의 miR528 결합 부위 내 적어도 하나의 상이한 돌연변이를 함유하는 또 다른 식물과 교배시켜 miRNA528 유전자 서열 내 추가의 돌연변이를 갖는 식물을 수득할 수 있다. 상기 조합은 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 상기 방법을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 형질전환된 단일 T1 식물 내 동족체 돌연변이의 수와 비교하는 경우, 모든 또는 증가된 수의 동족체 상에 돌연변이를 갖는 T2 식물을 생성할 수 있다.
상기 기재된 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 식물은 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 유전학적으로 변형된 식물은 또한, 예를 들어, 본원에 기재된 유전학적으로 변형된 식물의 꽃가루를 사용하여 교배하여 야생형 또는 대조군 식물을 수분시키거나 본원에 기재된 식물의 암술군을, miRNA528 유전자 또는 프로모터 서열의 적어도 하나에서 또는 LAC3 또는 LAC5의 miR528 결합 부위 내 돌연변이를 함유하지 않는 다른 다른 꽃가루로 수분시킴에 의해 본 발명의 임의의 서열을 전이시킴에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 식물을 수득하기 위한 방법은 상기 문단에 기재된 방법으로만 제한되지 않으며; 예를 들어, 밀의 이삭으로부터 생식 세포의 유전학적 형질전환은 언급된 바와 같이 수행될 수 있지만, 이후 식물을 재생할 필요는 없다.
대안적으로, 보다 통상적인 돌연변이 유발 방법을 사용하여 적어도 하나의 돌연변이를 miR528 유전자 및/또는 프로모터 또는 LAC3 및/또는 LAC5 miR528 결합 서열에 도입할 수 있다. 이들 방법은 물리적 및 화학적 돌연변이 유발 둘 다를 포함한다. 당업자는 추가의 접근법이 상기 돌연변이체를 생성하기 위해 사용될 수 있음을 알 것이고, 돌연변이 유발 및 폴리뉴클레오타이드 변형을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 문헌 (Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; U.S. Patent No. 4,873,192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York))을 참조한다.
하나의 구현예에서, 삽입 돌연변이유발은, 예를 들어, T-DNA 돌연변이유발 (아그로박테리움 투메파시엔스 T-플라스미드로부터의 T-DNA 조각을 DNA로 삽입하여 유전자 기능의 상실 또는 유전자 기능 돌연변이의 획득을 유발하는), 부위-지시된 뉴클레아제 (SDN) 또는 돌연변이유발제로서 트랜스포존을 사용하여 사용된다. 삽입 돌연변이유발은 유전자 기능을 파쇄하는 대안적 수단이고, 관심 대상의 유전자로의 외래 DNA의 삽입에 기초한다 (참조: Krysan et al, The Plant Cell, Vol. 11, 2283-2290, December 1999). 따라서, 하나의 구현예에서, T-DNA는 miR528이 결합할 수 없도록 miR528 a 또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터 또는 LAC3 및/또는 LAC5 miR528 결합 서열을 파괴하기 위한 삽입 돌연변이 유발제로서 사용된다. 아라비도프시스 ARE1 유전자를 파괴하기 위한 T-DNA 돌연변이유발을 사용하는 하나의 예는 문헌 (참조: Downes et al. 2003)에 기재되어 있다. T-DNA는 이것이 삽입되는 유전자의 발현을 방해할 뿐만 아니라 돌연변이의 후속 동정을 위한 마커로서 작용한다. 삽입된 요소의 서열이 공지되어 있기 때문에, 삽입이 일어난 유전자는 다양한 클로닝 또는 PCR-기반 전략을 사용하여 회수될 수 있다. 길이가 5 내지 25 kb 정도인 T-DNA 조각의 삽입은 일반적으로 유전자 기능의 파괴를 생성한다. T-DNA 형질전환된 세포주의 대형의 충분한 집단이 생성되는 경우, 관심 대상의 임의의 유전자 내 T-DNA 삽입체를 갖는 형질전환 식물을 발견할 합리적으로 양호한 기회가 있다. T-DNA를 사용한 포자의 형질전환은 식물 세포 및 조직을 아그로박테리움 세포의 현탁액에 노출시킴을 포함하는, 아그로박테리움-매개된 방법에 의해 달성된다.
상기 방법의 세부사항은 당업자에게 잘 알려져 있다. 요약하면, 아그로박테리움에 의한 식물 형질전환은 세균 플라스미드 상에 함유된, T-DNA로 불리우는 서열의 핵 게놈으로 통합된다. T-DNA 형질전환의 사용은 안정한 단일 삽입을 유도한다. 생성된 형질전환된 세포주의 추가의 돌연변이체 분석은 간단하고, 각각의 개별 세포주는 삽입을 플랭킹하는 DNA의 직접적인 서열 확인 및 분석으로 신속하게 특징 분석될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 돌연변이 유발은 물리적 돌연변이유발, 예를 들어, 자외선 방사선, X-선, 감마선, 고속 또는 열 중성자 또는 양성자의 적용이다. 이어서, 표적화된 집단은 스크리닝하여 miR528 결합 부위에서 돌연변이를 갖는 식물을 동정할 수 있다.
발명의 다양한 양상의 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 돌연변이 유발제를 사용하여 식물 집단을 돌연변이 유발시킴을 포함한다. 돌연변이 유발제는, 예를 들어, 하기의 비제한 목록으로부터 선택되는 고속 중성자 조사 또는 화학적 돌연변이 유발제일 수 있다: 에틸 메탄설포네이트(EMS), 메틸메탄 설포네이트 (MMS), N-에틸-N-니트로소우레아 (ENU), 트리에틸멜라민 (1'EM), N-메틸-N-니트로소우레아 (MNU), 프로카바진, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 디에틸 설페이트, 아크릴아미드 단량체, 멜팔란, 질소 머스타드, 빈크리스틴, 디메틸니토사민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘 (MNNG), 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12 디메틸-벤즈(아)안트라센 (DMBA), 에틸렌 옥사이드, 헥사메틸포스포라미드, 바이설판, 디에폭시알칸 (디에폭시옥탄 (DEO), 디에폭시부탄 (BEB) 등), 2-메톡시-6-클로로-9 [3-(에틸-2-클로로에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디하이드로클로라이드 (ICR-170) 또는 포름알데하이드. 또한, 이어서, 표적화된 집단은 miR528 a 또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터에서 또는 LAC3 또는 LAC5에서의 miR528 결합 부위에서 돌연변이를 갖는 식물을 동정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 돌연변이를 생성하고 분석하기 위해 사용되는 방법은 문헌 (참조: Henikoff et al, 2004)에서 검토된 게놈에서의 유도된 국소 병변 (TILLING)을 표적화한다. 상기 방법에서, 종자는 화학적 돌연변이 유발제, 예를 들어, EMS로 돌연변이 유발된다. 생성된 M1 식물은 자가-수정되고 개체의 M2 세대를 사용하여 돌연변이 스크리닝을 위해 DNA 샘플을 제조한다. DNA 샘플을 풀링하고 미세역가 플레이트 상에서 정렬시키고 유전자 특이적 PCR에 적용하였다. PCR 증폭 생성물은 야생형과 돌연변이 유전자 간에 이종이합체를 동정하는 임의의 방법을 사용하여 miR528 a 또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터 또는 miR528 결합 부위에서의 돌연변이를 위해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 변성 고압 액체 크로마토그래피 (dHPLC), 일정한 변성 모세관 전기영동 (CDCE), 온도 구배 모세관 전기영동 (TGCE) 또는 화학적 절단을 사용한 단편화에 의한 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, PCR 증폭 생성물은 야생형과 돌연변이 서열 간의 이종이합체 내 미쓰매치를 우선적으로 절단하는 엔도뉴클레아제로 항온처리된다. 절단 생성물은 자동 서열분석 겔 장치를 사용하여 전기영동하고, 겔 이미지는 표준 상업 이미지-처리 프로그램을 사용하여 분석된다. miR528 또는 LAC3/LAC5에 특이적인 임의의 프라이머를 사용하여 풀링된 DNA 샘플 내 miR528 또는 LAC3/LAC5 핵산 서열을 증폭시킬 수 있다. 겔 상에서 PCR 생성물의 검출을 촉진시키기 위해, PCR 프라이머는 임의의 통상적인 표지화 방법을 사용하여 표지화될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 돌연변이를 생성하고 분석하기 위한 방법은 EcoTILLING이다. EcoTILLING는 TILLING과 유사한 분자 기술이지만 단 이의 목적은 유도된 돌연변이와는 반대로 소정의 집단에서 자연적 변이를 밝히는 것이다. EcoTILLING 방법의 제1 집단은 문헌 (참조: Comai et al.2004)에 기재되어 있다.
따라서, 신속한 고 처리량 스크리닝 과정은, miR528 결합에 대한 내성을 부여하거나, 상응하는 돌연변이 유발되지 않은 야생형 식물과 비교하여 감소된 miR528 발현을 부여하는 돌연변이를 동정하기 위한 증폭 생성물의 분석을 가능하게 한다. 일단 돌연변이가 관심 대상의 유전자에서 동정되면, 상기 돌연변이를 함유하는 M2 식물의 종자는 성체 M3 식물로 성장시키고 스크리닝한다.
miR528 a 또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터 또는 LAC3 및/또는 LAC5의 miR528 결합 부위 내 돌연변이를 함유하는 상기 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 식물은 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
추가의 구현예에서, 상기 방법은 miR528 억제제를 사용하여 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함한다. miR528 억제제는 miR528의 발현을 감소시키거나 이의 활성을 감소시킬 수 있는 임의의 분자이다. 하나의 구현예에서, miR528 억제제는 miRNA 기능을 억제하는 핵산-기반 분자이다. 합성 miRNA 억제제는 성숙한 miRNA의 역 상보체인 서열을 갖는 RNA를 분자를 포함할 수 있고, 추가로 RISC-유도된 절단을 방지하고 결합 친화성을 증진시키고 핵산 분해에 대해 내성을 제공하도록 화학적으로 변형된다. 합성 miRA 억제제가 miRNA528에 결합하는 경우, 이의 결합은 비가역적이고, 따라서, 상기 억제제는 실제로 내인성 miRNA를 격리시켜 정상 기능에 이용할 수 없게 한다 (참조: Robertson et al. 2010). 따라서, 하나의 구현예에서, miR528 억제제는 miRNA에 결합하고 격리시킴에 의해 miRNA528의 활성을 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, miRNA 발현은 본원에 기재된 바와 같이 유전자 편집을 통해 감소될 수 있고, 여기서, miR528 단일 녹아웃 식물은 유전자 편집에 의해 생성되고, 이어서 교배하여 miR528 이중 녹아웃 식물을 생산한다.
하나의 구현예에서, miR528 억제제는 짧은 탠덤 표적 모사체이고, 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체 (본원에 정의된 바와 같은) 및 서열번호 7에 정의된 바와 같은 DNA 서열 또는 이의 기능적 변이체 (다시 본원에 정의된 바와 같은)를 포함한다.
따라서, 하나의 구현예에서, 상기 방법은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시킴을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 분자 또는 이의 기능적 변이체를 도입함을 포함한다.
발명의 또 다른 구현예에서, miR528 억제제를 암호화하는 단리된 핵산이 제공되고, 여기서, 상기 miR528 억제제는 본원에 정의된 바와 같은 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
추가의 양상에서, RNA 분자를 포함하는 miR528 억제제가 제공되고, 여기서, 상기 RNA 분자는 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
추가의 양상에서, 조절 서열에 작동적으로 연결된 상기 기재된 바와 같은 miR528 억제제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다.
또한, 단리된 세포, 바람직하게, 조절 서열에 작동적으로 연결된, miR528 억제제를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 발현하는 식물 세포 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 세포가 제공된다. 추가로, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 작제물 또는 miR528 억제제를 발현하는 단리된 식물 세포 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 세포를 포함하는 배양 배지에 관한 것이다.
또한, 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여, 식물에서 도복 저항성, 리그닌 함량 및/또는 합성 중 적어도 하나를 증가시키기 위한, 상기 기재된 단리된 핵산, miR528 억제제, 핵산 작제물 또는 벡터의 용도가 제공된다. 리그닌 함량 및/또는 합성은 식물의 줄기 및/또는 뿌리에서 증가될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 식물에서 내도복성을 감소시키고, 즉, 도복성이 증가된다. 바람직하게, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 증가시킴을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 도복상 감소는 식물이 바이오에너지 사용을 위한 원료의 공급원으로서 사용되어야만 하는 경우 또는 상기 식물이 가축을 위한 사료로서 사용되어야만 하는 경우 유용할 수 있다. 바람직하게, 상기 식물은 바이오원료 생성을 위한 식물의 사용이 리그닌의 제거를 요구하고 사료에 대해 리그닌이 사료 작물의 소화성에 영향을 미치기 때문에 감소된 리그닌 함량을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 식물은 옥수수이다.
추가의 구현예에서, 라카아제 유전자는 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택되고, 여기서, 상기 라카아제 3 유전자는 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 라카아제 5 유전자는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체를 암호화한다. 보다 바람직하게, 라카아제 3 유전자는 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 유사하게, 바람직한 구현예에서, 라카아제 5 유전자는 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자 및/또는 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하고, 여기서, 상기 돌연변이는 야생형 대조군과 비교하여 라카아제 핵산의 발현 또는 활성을 감소시키거나 폐지시킨다. 하나의 구현예에서, 발현 또는 활성은 야생형 또는 대조군 식물에서의 수준과 비교하는 경우 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이하 또는 초과로 감소된다. "폐지된"이란, 어떠한 LAC3 및/또는 LAC5도 발현되지 않거나 검출 가능하게 발현될 수 없음을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 상기 기재된 바와 같이 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입된다. 대안적인 구현예에서, 상기 돌연변이는 돌연변이유발, 바람직하게 또한 상기 기재된 바와 같이 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입된다. 상기 구현예에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 유전자 조작 방법에 의해 생성되고 자연 발생 변종을 포함하지 않는 방법 및 식물에 관한 것이다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 RNA 간섭을 사용하여 적어도 하나의 라카아제 핵산, 바람직하게 라카아제 3 및/또는 5 핵산의 발현을 감소시키거나 폐지시킴을 포함한다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 라카아제 핵산의 발현은, 이에 제한되지 않지만, LAC3 및/또는 5에 대한 소형 간섭 핵산 (siRNA)의 사용과 같은 당업자에게 알려진 다수의 유전자 사일런싱 방법을 사용하여 감소되거나 사일런싱될 수 있다. "유전자 사일런싱"은 RNA 분자에 의해 매개된 서열-특이적 상호작용을 통한 유전자의 발현의 억제를 언급하기 위해 일반적으로 사용되는 용어이다. 감소 정도는 암호화된 유전자 생성물의 생성을 완전하게 폐지시키기 위한 것일 수 있지만, 보다 일반적으로, 발현의 폐지는 부분적이고 일부의 발현 정도는 유지된다. 따라서, 상기 용어는 발현의 완전한 "사일런싱"을 요구하는 것으로 고려하지 말아야 한다.
하나의 구현예에서, siNA는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 소형 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 안타고미르 (antagomir) 및 소형 헤어핀 RNA (shRNA)를 포함할 수 있다.
발현 및/또는 활성의 억제는 당업자에게 잘 알려진 기술 (예를 들어, 노던 블롯팅, RT-PCR 등)을 사용하여 라카아제 3 및/또는 5 전사체의 존재 및/또는 양을 결정함에 의해 측정될 수 있다.
전이유전자를 사용하여 내인성 식물 유전자를 억제할 수 있다. 이것은 본래에 일반적으로 페튜니아에서 칼콘 신타제 전이유전자가 용이하게 가시적인 색소 변화에 의해 지적된 내인성 칼콘 신타제 유전자의 억제를 유발하는 경우 발견되었다. 후속적으로, 전부는 아니지만 얼마나 많은 모든 식물 유전자가 전이유전자에 의해 "사일런싱"될 수 있는지가 기재되었다. 유전자 사일런싱은 전이유전자와 사일런싱하게된 유전자 간의 서열 유사성을 요구한다. 상기 서열 상동성은 사일런싱된 표적 유전자의 프로모터 영역 또는 암호화 영역을 포함할 수 있다. 암호화 영역이 포함된 경우, 유전자를 사일런싱시킬 수 있는 전이유전자는 암호화 서열 RNA의 센스 또는 안티센스 배향 중 하나를 전사시키는 프로모터로 수행되었다. 유전자 사일런싱의 다양한 예가 널리 이해되지 않는 상이한 기전을 포함할 가능성이 있다. 상이한 예에서, 전사 또는 전사 후 유전자 사일런싱이 있을 수 있고, 이들 둘 다는 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.
유전자 사일런싱의 기전 및 유전자 조작에서 이들의 적용은 1990년 초반에 식물에서 최초로 발견되었고, 이어서 카에노르하디티스 엘레강스 (Caenorhabditis elegans)에서 나타나고 문헌에 광범위하게 기재되어 있다.
본 발명의 방법에 따른 RNA-매개된 유전자 억제 또는 RNA 사일런싱은 동시-억제를 포함하고, 여기서, 라카아제 3 및/또는 5 센스 RNA 또는 mRNA인 표적 센스 RNA 또는 mRNA의 과발현은 관련된 유전자의 발현 수준을 감소시킨다. 전이유전자 및 상동성의 내인성 유전자의 RNA는 조화롭게 억제된다. 본 발명의 방법에 사용되는 다른 기술은 식물에서 내인성 표적 유전자의 전사체 수준을 감소시키기 위해 안티센스 RNA를 포함한다. 상기 방법에서, RNA 사일런싱은 유전자좌의 전사에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 표적 mRNA의 서열-특이적 분해를 유발한다. "안티센스" 핵산 서열은 라카아제 단백질 또는 상기 단백질의 일부를 암호화하는 "센스" 핵산 서열에 상보적인, 즉, 이중 가닥 cDNA 분자의 암호화 가닥에 상보적이거나 mRNA 전사체 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 안티센스 핵산 서열은 바람직하게 사일런싱될 내인성 라카아제 유전자에 상보적이다. 상기 상보성은 유전자의 "암호화 영역" 및/또는 "비-암호화 영역"에 위치할 수 있다. 용어 "암호화 영역"은 아미노산 잔기로 해독되는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열 영역을 지칭한다. 용어 "비-암호화 영역"은 전사되지만 아미노산으로 해독되지 않는 암호화 영역 (5' 및 3' 비해독 영역으로도 지칭됨)을 플랭킹하는 5' 및 3' 서열을 지칭한다.
안티센스 핵산 서열은 왓슨 및 크릭 염기쌍 형성 법칙에 따라 디자인될 수 있다. 상기 안티센스 핵산 서열은 또한 본원에 정의된 바와 같이 전체 라카아제 3 또는 5 핵산 서열에 상보적일 수 있지만, 또한 핵산 서열 (mRNA 5' 및 3' UTR을 포함하는)의 단지 일부에 안티센스인 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 전사체의 해독 개시 부위를 둘러싼 영역에 상보적일 수 있다. 적합한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열의 길이는 당업계에 공지되어 있고, 약 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10개 뉴클레오타이드 길이 이하에서 시작할 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 핵산 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용하는 화학적 합성 및 효소적 연결 반응을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 서열 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열)은 자연 발생 뉴클레오타이드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스와 센스 핵산 서열 간에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다앙하게 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있는데, 예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘-치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산 서열을 생성하기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드의 예는 당업계에 잘 알려져 있다. 안티센스 핵산 서열은 핵산 서열이 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수 있다 (즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 관심 대상의 표적 핵산에 대해 안티센스 배향일 것이다). 바람직하게, 식물에서 안티센스 핵산 서열의 생성은 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 안정하게 통합된 핵산 작제물에 의해 일어난다.
본 발명의 방법에서 사일런싱을 위해 사용되는 핵산 분자는 mRNA 전사체와 하이브리드화하거나 이에 결합하고/하거나 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 DNA에 삽입됨으로써, 예를 들어, 전사 및/또는 해독을 억제함에 의해 단백질의 발현을 억제한다. 하이브리드화는 통상적인 뉴클레오타이드 상보성에 의해 안정한 듀플렉스를 형성하거나, 예를 들어, 안티센스 핵산 서열의 경우에, 이는 이중 나선의 주요 그루브에서 특정 상호작용을 통해 DNA 듀플렉스에 결합할 수 있다. 안티센스 핵산 서열은 형질전환에 의해 또는 특정 조직 부위에서 직접적인 주사에 의해 식물에 도입될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 핵산 서열은 선택된 세포를 표적화하도록 변형될 수 있고, 이어서 전신 투여될 수 있다. 예를 들어, 전신 투여의 경우, 안티센스 핵산 서열은 이들이, 예를 들어, 상기 안티센스 핵산 서열을 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩타이드 또는 항체에 연결시킴에 의해, 선택된 세포 표면 상에서 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다. 안티센스 핵산 서열은 또한 벡터를 사용하여 세포에 전달될 수 있다.
RNA 간섭 (RNAi)은 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 또 다른 전사 후 유전자-사일런싱 현상이다. 이것은 dsRNA에 상동성인 mRNA는 특이적으로 분해되는 이중-가닥 RNA에 의해 유도된다. 이것은 소형 간섭 RNA (siRNA)에 의해 매개되는 서열-특이적 전사 후 사일런싱의 프로세스를 지칭한다. RNAi의 프로세스는 효소, DICER가 dsRNA와 접하게 되어 이를 소형-간섭 RNA (siRNA)로 불리우는 조각으로 절단되는 경우 개시한다. 이 효소는 RNase III 뉴클레아제 패밀리에 속한다. 단백질 복합체는 이들 RNA 잔류물을 모으고 가이드로서 이들의 코드를 사용하여 표적 mRNA와 같은 일치하는 서열을 갖는 세포 내 임의의 RNA를 검색하고 파괴한다.
인공 및/또는 천연 마이크로RNA (miRNA)를 사용하여 유전자 발현 및/또는 mRNA 해독을 녹아웃 시킬 수 있다. 마이크로RNA (miRNA) miRNA는 전형적으로 19 내지 24개 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 소형 RNA이다. 대부분의 식물 miRNA는 이들의 표적 서열과 완벽하거나 거의 완벽한 상보성을 갖는다. 그러나, 5개 이하의 미쓰매치를 갖는 천연 표적이 있다. 이들은 Dicer 패밀리의 이중 가닥 특이적 RNase에 의해 특징적인 폴딩 백 구조를 갖는 보다 긴 비-암호화 RNA로부터 프로세싱된다. 프로세싱시, 이들은 이의 주요 성분인 아고나우테 (Argonaute) 단백질에 결합함에 의해 RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)에 혼입된다. miRNA는 이들이 염기쌍을 형성하여 세포질에서 핵산, 대부분 mRNA를 표적화하기 때문에, RISC의 특이성 성분으로서 작용한다. 후속적 조절 반응 (event)들은 표적 mRNA 절단 및 파괴 및/또는 해독 억제를 포함한다. 따라서, miRNA 과발현의 효과는 흔히 표적 유전자의 감소된 mRNA 수준에 반영된다. 인공 마이크로RNA (amiRNA) 기술은 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 및 다른 식물에 적용되어 관심 대상의 표적 유전자를 효율적으로 사일런싱하였다. amiRNA에 대한 디자인 원리는 일반화되었고 웹-기반 도구로 통합되었다 (http://wmd.weigelworld.org).
따라서, 본 발명의 다양한 양상에 따라, 식물은 형질전환되어 라카아제 핵산 서열의 발현을 표적화하고 유전자의 발현 또는 이의 전사체의 안정성을 선택적으로 감소시키거나 억제하도록 디자인된 RNAi, shRNA, snRNA, dsRNA, siRNA, miRNA, ta-siRNA, amiRNA 또는 동시억제 분자가 도입될 수 있다. 바람직하게, 발명의 다양한 양상에 따라 사용되는 RNAi, snRNA, dsRNA, shRNA siRNA, miRNA, amiRNA, ta-siRNA 또는 동시 억제 분자는 적어도 17 nt, 바람직하게 22 내지 26 nt의 단편을 포함하고, 임의의 서열번호 2, 3, 5 또는 6에 나타낸 정보에 기반하여 디자인될 수 있다. 효과적인 siRNA를 디자인하기 위한 지침서는 당업자에게 공지되어 있다. 간략하게, 표적 유전 서열 (예를 들어, 길이가 19-40개 뉴클레오타이드)의 짧은 단편은 발명의 siRNA의 표적 서열로서 선택된다. 표적 유전자 서열의 짧은 단편은 표적 유전자 mRNA의 단편이다. 바람직한 구현예에서, 표적 유전자 mRNA로부터의 서열 단편이 후보물 siRNA 분자인 것으로 선택하기 위한 기준은 1) 본래의 mRNA 분자의 5' 또는 3' 말단으로부터 적어도 50 내지 100개 뉴클레오타이드인 표적 유전자 mRNA로부터의 서열, 2) 30% 내지 70%, 가장 바람직하게 약 50%의 G/C 함량을 갖는 표적 유전자 mRNA로부터의 서열, 3) 반복 서열 (예를 들어, AAA, CCC, GGG, TTT, AAAA, CCCC, GGGG, TTTT)를 포함하지 않는 표적 유전자 mRNA로부터의 서열, 4) mRNA에서 접근가능한 표적 유전자 mRNA로부터의 서열, 5) 표적 유전자에 특유한 표적 유전자 mRNA로부터의 서열, 6) 출발 코돈의 75개 염기 내 영역을 회피를 포함한다. 표적 유전자 mRNA로부터의 서열 단편은 상기 동정된 기준 중 하나 이상을 충족할 수 있다. 선택된 유전자는 최적의 올리고뉴클레오타이드의 디자인을 위해 상기 기재된 모든 변수를 고려하는 예측 프로그램에서 뉴클레오타이드 서열로서 도입된다. 상기 프로그램은 siRNA에 의해 표적화되기 쉬운 영역에 대한 임의의 mRNA 뉴클레오타이드 서열을 스캔한다. 상기 분석 출력은 가능한 siRNA 올리고뉴클레오타이드의 공급원이다. 최고 스코어는 전형적으로 화학적 합성에 의해 제조된 이중 가닥의 RNA 올리고뉴클레오타이드를 디자인하기 위해 사용된다. mRNA 표적 영역에 상보적인 siRNA에 추가로, 퇴행성 siRNA 서열은 상동성 영역을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다. RNA는 바람직하게 적당히 보호된 리보뉴클레오타이드 포스포르아미디트 및 통상의 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성된다. 추가로, siRNA는 상업적 RNA 올리고뉴클레오타이드 합성 공급업체로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 양상에 따른 siRNA 분자는 이중 가닥일 수 있다. 하나의 구현예에서, 이중 가닥의 siRNA 분자는 평활 말단을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이중 가닥의 siRNA 분자는 오버행 뉴클레오타이드 (예를 들어, 1-5 뉴클레오타이드 오버행, 바람직하게 2 뉴클레오타이드 오버행)를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이고; siRNA 분자의 2개의 가닥은 링커 영역 (예를 들어, 뉴클레오타이드 링커 또는 비-뉴클레오타이드 링커)에 의해 연결될 수 있다. 본 발명의 siRNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 비-포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다. 당업계에 잘 알려진 화학적 변형은 siRNA의 안정성, 가용성 및/또는 세포 취득을 증가시킬 수 있다. 당업자는 RNA 분자에 혼입될 수 있는 다른 유형의 화학적 변형을 인지할 것이다.
또 다른 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현함을 포함하고, 여기서, 상기 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 10에 정의된 바와 같은 miRNA 또는 이의 기능적 변이체를 암호화한다. 바람직하게, 핵산 작제물은 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고, 여기서, 상기 핵산 서열은 서열번호 9, 32 또는 39로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 핵산 작제물은 서열번호 32 및 39로부터 선택되는 2개의 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 또는 각각의 핵산 서열(들)은 조절 서열, 예를 들어, 프로모터에 작동적으로 연결된다. 적합한 프로모터의 서열의 예는 당업자에게 공지되어 있지만 상기에 또한 기재되어 있다.
추가의 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 서열번호 9를 포함하는 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 도입함을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 유전학적으로 변화된 식물, 이의 일부 또는 식물 세포가 제공되고, 여기서, 상기 식물은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 변화된 발현 또는 수준 및/또는 miR528의 변화된 발현 또는 활성을 특징으로 한다. 바람직하게, 식물은 또한 변형된 리그닌 함량을 특징으로 할 수 있다. 다시, 상기 기재된 바와 같이, "변형"은 증가 또는 감소인 것으로 간주될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 식물은 상기 기재된 바와 같이, 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여, 적어도 하나의 라카아제 유전자의 증가된 발현 또는 miR528의 감소된 발현 또는 활성을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서, 식물은 성적 교배 이외의 임의의 수단에 의해 식물로 도입되는, 폴리뉴클레오타이드인 개별 식물에 "외인성" 또는 "내인성"인 폴리뉴클레오타이드를 발현한다. 이것이 달성될 수 있는 수단의 예는 아래에 기재되어 있다. 하나의 구현예에서, 외인성 핵산은 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하는 핵산 및/또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 작제물인 식물에서 발현되고, 여기서, 라카아제 서열 둘 다는 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있다.
바람직하게, 라카아제 3을 암호화하는 핵산은 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 바람직하게, 상기 라카아제 5를 암호화하는 핵산은 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 식물은 miR528 억제제를 발현한다. 구체적으로, 하나의 예에서, 상기 식물은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 작제물을 발현할 수 있다. 조절 서열은 상기 기재되어 있다. 또 다른 예에서, miR528 억제제는 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자이다.
대안적인 구현예에서, 상기 식물은 라카아제 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 중에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게, 여기서, 상기 라카아제 핵산은 라카아제 3 및 5로부터 선택되고, 상기 돌연변이는 miR528 결합 부위에 있다. 하나의 구현예에서, 돌연변이는 LAC3 및 LAC5 miR528 결합 부위 둘 다에 도입된다. 돌연변이는 상기 기재된 임의의 돌연변이 유발 방법을 사용하여 도입될 수 있다.
LAC3에서 miR528 결합 부위는 다음과 같다:
CUCUGCUGCAUGCCCCUUCGA (서열번호 20)
LAC5에서 miR528 결합 부위는 다음과 같다:
CUUCUCCGCAUGUCCCUUCCU (서열번호 21)
바람직하게, 상기 돌연변이는 miR528의 LAC3 및/또는 LAC5로의 결합을 방지하는 임의의 돌연변이이다. 하나의 예에서, 돌연변이는 상기 기재된 서열번호 20 및/또는 21에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 및 치환으로부터 선택될 수 있다. 하나의 예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오타이드는 결실되거나 삽입된다.
추가의 대안적인 구현예에서, 상기 식물은 miR528a의 발현이 감소되거나 폐지되도록 miR528 a 및/또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 또한, 돌연변이는 상기 기재된 임의의 돌연변이 유발 방법을 사용하여 도입될 수 있다.
발명의 또 다른 양상에서, 상기 식물이 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여, 적어도 하나의 라카아제 유전자의 감소된 발현 및/또는 miR528의 증가된 발현 또는 활성을 특징으로 하는 유전학적으로 변형된 식물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 식물에서 변화된 내도복성을 갖는 식물을 생산하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함한다. 바람직하게, 상기 식물은 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 변화된 리그닌 함량을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 상기 식물은 식물에서 증가된 내도복성을 갖고, 상기 방법은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함한다. 바람직하게, 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키는 단계는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 상기 핵산은 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체 및/또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화한다.
대안적인 구현예에서, miR528의 활성을 감소시키는 것은 식물에서 miR528 억제제를 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시키거나 miR528 억제제를 발현시킴을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 핵산 작제물은 조절 서열에 작동적으로 연결된, miR528 억제제를 암호화하는 핵산 서열 (여기서, 상기 miR528 억제제의 서열은 서열번호 7 또는 16에 정의되어 있다) 또는 기능적 변이체를 포함한다. 조절 서열은 상기 기재되어 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, miR528 억제제는 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자이다.
본 발명의 형질전환 식물을 생산하기 위한 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 다양한 양상에 따라, 본원에 기재된 임의의 핵산 작제물은 식물에 도입되고 전이유전자로서 발현된다. 핵산 작제물은 형질전환이라 불리우는 프로세스를 통해 상기 식물에 도입된다. 본원에서 언급된 용어 "도입" 또는 "형질전환"은 전달을 위해 사용되는 방법과 상관없이 외인성 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포로의 전달을 포함한다. 기관발생이든 배아발생이든 이에 의한 후속 클론 증식을 할 수 있는 식물 조직은 본 발명의 유전자 작제물로 형질전환될 수 있고 이로부터 재생된 전체 식물일 수 있다. 선택된 특정 조직은 형질 전환되는 특정 종에 가용하고 이에 가장 적합한 클론 증식 시스템에 따라 다양할 것이다. 예시적인 조직 표적은 엽편, 꽃가루, 배아, 자엽, 배축, 자성배우체, 유합 조직, 기존의 분열 조직 (예를 들어, 정단 분열 조직, 액아, 및 뿌리 분열 조직), 및 유도된 분열 조직 (예를 들어, 자엽 분열조직 및 배축 분열 조직)을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에 일시적으로 또는 안정적으로 도입될 수 있고, 예를 들어, 플라스미드와 같이 비-통합된 상태로 유지될 수 있다. 대안적으로, 이것은 숙주 게놈에 통합될 수 있다. 이어서, 생성된 형질전환된 식물 세포를 사용하여 당업자에게 알려진 방식으로 형질전환된 식물을 재생시킬 수 있다.
식물의 형질전환은 현재 많은 종에서 통상의 기술이다. 유리하게, 임의의 여러 형질전환 방법을 사용하여 관심 대상의 유전자를 적합한 선조 세포에 도입할 수 있다. 식물 조직 또는 식물 세포 기원의 식물의 형질전환 및 재생을 위해 기재된 방법은 일시적이거나 안정한 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 형질전환 방법은 리포좀, 전기천공, 유리된 DNA 취득을 증가시키는 화학물질, DNA의 식물로의 직접적인 주입, 입자 총 충격 및 바이러스 또는 꽃가루를 사용한 형질전환 및 마이크로주입의 사용을 포함한다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법, 원형질체의 전기천공, 식물 재료로의 마이크로주입, DNA 또는 RNA-코팅된 입자 충격, (비-통합적) 바이러스 등을 사용한 감염으로부터 선택될 수 있다. 유전자전이 재배 식물을 포함하는 형질전환 식물은 바람직하게 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 매개된 형질전환을 통해 생산된다.
형질전환된 식물을 선택하기 위해, 형질전환에서 수득된 식물 재료는 선택적인 조건에 적용되어 형질전환된 식물이 형질전환되지 않은 식물과 구분될 수 있도록 한다. 예를 들어, 상기 기재된 방식으로 수득된 종자는 심을 수 있고, 초기 성장 기간 후, 분무에 의해 적합한 선택을 받을 수 있다. 추가의 가능성은 종자를 적절한 경우 멸균 후, 단지 형질전환된 종자만이 식물로 성장할 수 있도록 적합한 선택 제제를 사용하여 한천 플레이트 상에서 성장시킨다. 대안적으로, 형질전환된 식물은 선택 가능한 마커의 존재에 대해 스크리닝된다. DNA 전달 및 재생 후, 추정적으로 형질전환된 식물은 또한, 예를 들어, 관심 대상의 유전자의 존재, 카피수 및/또는 게놈 구성에 대해, 예를 들어, 서던 블롯 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 새롭게 도입된 DNA의 발현 수준은 노던 및/또는 웨스턴 분석을 사용하여 모니터링될 수 있고, 이들 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
생성된 형질전환된 식물은, 예를 들어, 클론 증식 또는 고전적 육종 기술에 의해 다양한 수단에 의해 증식될 수 있다. 예를 들어, 제1 세대 (또는 T1) 형질전환된 식물은 선택된 자가 및 동형접합성 제2-세대 (또는 T2) 형질전환체일 수 있고, 이어서, T2 식물은 고전적 육종 기술을 통해 추가로 증식될 수 있다. 생성된 형질전환된 유기체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 이들은 형질전환된 세포 및 비-형질전환된 세포의 키메라; 클론 형질전환체 (예를 들어, 발현 카세트를 함유하도록 형질전환된 모든 세포); 형질전환된 및 비형질전환된 조직의 이식편 (예를 들어, 식물에서, 비형질전환된 자손으로 이식된 형질전환된 근경 (rootstock))일 수 있다.
상기 방법은 식물 또는 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재생하는 단계 (여기서, 상기 형질전환 식물은 이의 게놈에서 서열번호 2, 3, 5, 6 및 7로부터 선택된 핵산 서열 또는 서열번호 1 또는 4에 정의된 바와 같은 라카아제 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다) 및 형질전환 식물로부터 유래된 자손 식물을 수득하는 단계 (여기서, 상기 자손은 도복 저항성, 리그닌 함량 및 수확량 중 적어도 하나에서 증가를 나타낸다)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전학적으로 변형된 식물을 생산하기 위한 방법이 제공된다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 바람직하게 본원에 기재된 임의의 돌연변이 유발 기술을 사용한 적어도 하나의 식물 세포의 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 LAC3 및/또는 LAC5 핵산의 miR528 결합 부위로 적어도 하나의 돌연변이를 도입하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 방법은 돌연변이된 식물 세포로부터 식물을 재생하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, 하나의 구현예에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a. 식물의 일부를 선택하는 단계;
b. 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 작제물 또는 miR528 억제제로 문단 (a)의 식물의 일부의 적어도 하나의 세포를 형질감염시키는 단계; 또는
c. 상기 형질감염된 세포 또는 세포들로부터 유래된 적어도 하나의 식물을 재생하는 단계;
d. LAC3 및/또는 LAC5의 증가된 발현 또는 감소된 miR528 활성을 보여주는, 문단 (c)에 따라 수득된 하나 이상의 식물을 선택하는 단계.
상기 방법은 바람직하게 추가의 증식을 위해, 하나 이상의 돌연변이된 식물 세포 또는 식물을 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 선택된 식물은 적어도 하나의 LAC3 및/또는 LAC5 핵산의 miR528 결합 부위에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 식물은 바람직하게 줄기 및/또는 뿌리에서, 도복 저항성의 증가된 수준 (또는 도복에서의 감소) 또는 리그닌 함량의 증가된 수준을 특징으로 한다.
선택된 식물은, 예를 들어, 클론 증식 또는 고전적 육종 기술에 의해 다양한 수단에 의해 증식될 수 있다. 예를 들어, 제1 세대 (또는 T1) 형질전환된 식물은 선택된 자가 및 동형접합성 제2-세대 (또는 T2) 형질전환체일 수 있고, 이어서, T2 식물은 추가로 고전적 육종 기술을 통해 증식될 수 있다. 생성된 형질전환된 유기체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 이들은 형질전환된 세포 및 비-형질전환된 세포의 키메라; 클론 형질전환체 (예를 들어, 발현 카세트를 함유하도록 형질전환된 모든 세포); 형질전환된 및 비형질전환된 조직의 이식편 (예를 들어, 식물에서, 비형질전환된 자손으로 이식된 형질전환된 근경)일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 추가의 구현예에서, 상기 방법은 상기 기재된 바와 같이, 유전자전이 또는 유전학적으로 변형된 식물의 표현형을 평가하는 단계, 도복 저항성, 리그닌 함량, 껍질 침입도계 저항성 및 및 셀룰로스/헤미셀룰로스 함량에서의 증가 중 적어도 하나를 측정하는 단계 중 적어도 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 다시 말해, 상기 방법은 목적하는 표현형에 대해 식물을 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 기재된 임의의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 식물이 제공된다.
본 발명의 추가의 최종 양상에서, 식물 집단을 스크리닝하고 라카아제 3 및/또는 5의 증가된 발현 및/또는 miR528의 감소된 발현/활성 및/또는 라카아제 3 및/또는 5의 miR528 결합 부위 내 돌연변이를 갖는 식물을 동정하고/하거나 선택하는 방법이 제공된다. 상기 식물은 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 증가된 리그닌 함량 및 따라서 내도복성의 증가된 수준을 갖는다. 상기 논의된 바와 같이, 상기 스크리닝 방법은 도복을 위한 조건이 성장 시기에 일어나지 않는 한, 사육자, 농부, 작물 시험자 등이 변종이 도복에 내성인지를 결정하기가 어렵기 때문에 특히 가치가 있다. 이와 같이, 심기 전에 개체 식물 또는 변종이 도복 저항성인지를 결정할 수 있는 것은 상당한 경제적 이득을 가질 잠재력을 갖는다.
특히, 상기 방법은 라카아제 3 및/또는 5 유전자 및/또는 프로모터 내 적어도 하나의 다형태 또는 돌연변이를 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 돌연변이는 라카아제 3 및/또는 5 발현의 증가된 수준을 유도하거나, 상기 돌연변이는 miR528 결합 부위에 있고 이와 같이 miR528이 라카아제 3 및/또는 5에의 결합을 방지한다. 발현에서의 증가 또는 miR528 결합에서의 감소는 돌연변이를 함유하지 않는 식물에서의 이의 증가에 상대적일 수 있다. 상기 식물을 사용하여 이에 대한 수준이 스크리닝될 식물에서 비교될 수 있는 역치 값을 결정할 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 miR528 발현이 감소되거나 폐지되거나 miR528이 이의 표적-라카아제 3 및/또는 5에 결합할 수 없도록 하는 miR528 a 및/또는 b 유전자 및/또는 프로모터 내 적어도 하나의 다형태 또는 돌연변이를 검출함을 포함할 수 있다. 또한, 발현 또는 활성의 수준은 돌연변이를 함유하지 않는 식물에 상대적일 수 있다. 돌연변이는 적어도 하나의 첨가, 치환 또는 결실일 수 있다.
다형태 또는 돌연변이의 존재를 평가하기 위해 적합한 시험은 당업자에게 잘 알려져 있고, 이소자임 전기영동, 제한 단편 길이 다형태 (RFLP), 무작위로 증폭된 다형태 DNA (RAPD), 임의적 프라이밍된 폴리머라제 연쇄 반응 (AP-PCR), DNA 증폭 핑거프린팅 (DAF), 서열 특징분석된 증폭 영역 (SCAR), 증폭된 단편 길이 다형태 (AFLP), 단순 서열 반복체 (SSR-이는 미세부수체로도 지칭됨), 및 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 경쟁적 대립유전자 특이적 PCR (KASP) 유전형질 분석이 사용된다.
하나의 구현예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 식물로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계 및
b) 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 하나 이상의 라카아제 3 유전자 및/또는 프로모터, 라카아제 5 유전자 및/또는 프로모터 또는 miR528 a 및/또는 b 유전자 및/또는 프로모터 대립유전자의 핵산 증폭을 수행하는 단계.
추가의 구현예에서, 상기 방법은 상기 높은-라카아제 3 또는 라카아제 5 또는 낮은 miR528-발현/활성 다형태를 포함하는 염색체 영역을 제2 식물 또는 식물 생식질에 유전자 이입하여 유전자이입된 식물 또는 식물 생식질을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 라카아제 3 또는 라카아제 5의 발현 또는 활성은 증가되거나, 상기 제2 식물에서 miR528의 발현 또는 활성은 감소되거나 폐지되고 (대조군 또는 야생형 식물과 비교하여), 보다 바람직하게, 상기 제2 식물은 상기 기재된 도복 저항성에서의 변형을 나타낼 것이다.
발명의 추가의 양상에서, 식물에서 도복 저항성을 변형시키는, 바람직하게 증가시키는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a. 상기 기재된 다형태 또는 돌연변이 중 적어도 하나로 적어도 하나의 식물에 대한 식물 집단을 스크리닝하는 단계;
b. 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 라카아제 3 및/또는 5의 발현을 추가로 증가시키거나, 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 적어도 하나의 miR528 핵산의 발현 또는 활성을 추가로 감소시키거나 폐지시키는 단계.
"추가로 증가시키는" 또는 "추가로 감소시키는"이란, 상기 기재된 다형태의 적어도 하나로 식물에서의 것 보다 각각 높거나 낮은 수준으로 발현 또는 활성 수준을 증가시키거나 감소시킴을 의미한다. 발현 및/또는 활성에서 증가 또는 감소는 대조군 식물에서의 수준과 비교하는 경우 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이하일 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 모든 양상에 따른 식물은 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물일 수 있다. 바람직하게, 식물은 농작물 또는 벼과 식물이다. 농작 식물이란, 사람 또는 동물 소비 또는 사용을 위한 상업적 규모로 성장시킨 임의의 식물을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 식물은 곡물이다.
바람직한 구현예에서, 식물은 옥수수이다. 하나의 예에서, 상기 옥수수는 "옥수수 변종 zong 31" 또는 "옥수수 B73"일 수 있다. "옥수수 변종 Zong 31"에 대해, 문헌 (Yang Hui, Wang Guoying, Dai Jingrui, Research on the transformation of elite maize inbred lines Zong 3 and 31, Journal of Agricultural Biotechnology, 2001, No. 04)을 참조한다. "옥수수 B73"에 대해, 문헌 (Gong Fuquan, Li Pinghua, Cloning of pyruvate phosphate dikinase gene in maize inbred line B73 and the effect of low nitrogen on the expression of PPDK, Journal of Tropical Biology, 2014, No. 4)을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "식물"은 전체 식물, 식물의 조상 및 자손 및 식물의 일부를 포함하고, 이는 종자, 과실, 새싹, 줄기, 잎, 뿌리 (덩이줄기를 포함함), 꽃, 조직 및 기관을 포함하고, 여기서, 상기 언급된 각각은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하거나, 본원에 개시된 돌연변이를 함유한다. 용어 "식물"은 또한 식물 세포, 현탁 배양물, 유합 조직, 배아, 분열조직 영역, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 소포자를 포함하고, 또한 여기서, 상기 언급된 각각은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물 또는 돌연변이를 포함한다. 하나의 예에서, 단지 식물 세포는 광합성을 할 수 없는 세포이다. 예를 들어, 식물 세포는 엽록체가 부재일 수 있다. 상기 세포는 또한 엽편, 꽃가루, 배아, 자엽, 배축, 자성배우체, 유합 조직, 기존의 분열 조직 (예를 들어, 정단 분열 조직, 액아, 및 뿌리 분열 조직), 및 유도된 분열 조직 (예를 들어, 자엽 분열조직 및 배축 분열 조직)을 포함하는 하기의 조직 유형 중 하나로부터 기원할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재되어 있지만 종자, 잎, 과실, 꽃, 줄기, 뿌리, 뿌리줄기, 덩이줄기 및 알뿌리로 제한되지 않는 본 발명의 식물의 수확 가능한 일부로 확장된다. 본 발명의 양상은 또한 상기 식물의 수확 가능한 부분으로부터 유래되거나, 바람직하게 직접적으로 유래된 생성물, 예를 들어, 건조 펠렛 또는 분말, 오일, 지방 및 지방산, 전분 또는 단백질로 확장된다. 본 발명의 식물의 수확 가능한 부분으로부터 유래될 수 있는 또 다른 생성물은 바이오디젤이다. 본 발명은 또한 본 발명의 식물 또는 이의 일부를 포함하는 식료품 및 식품 보충제에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 식료품은 동물 사료일 수 있다. 발명의 또 다른 양상에서, 본원에 기재된 바와 같은 식물로부터 또는 이의 일부로부터 유래된 생성물이 제공된다.
가장 바람직한 구현예에서, 식물 일부 또는 수확 가능한 생성물은 종자 또는 곡물이다. 따라서, 본 발명의 추가의 양상에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전학적으로 변형된 식물로부터 생성된 종자가 제공된다.
대안적인 구현예에서, 상기 식물 일부는 본원에 기재된 유전학적으로 변형된 식물의 꽃가루, 주아 (propagule) 또는 후손이다. 따라서, 본 발명의 추가의 양상에서, 본원에 기재된 바와 같이 유전학적으로 변형된 식물로부터 생성된 꽃가루, 주아 또는 후손이 제공된다.
본 발명의 모든 양상에 따라 본원에 사용된 바와 같은 대조군 식물은 본 발명의 방법에 따라 변형되지 않은 식물이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 대조군 식물은 적어도 하나의 라카아제 유전자의 변형된 발현 또는 수준을 갖지 않고/않거나 상기 기재된 바와 같이 miR528의 변형된 발현 또는 활성을 갖지 않는다. 대안적인 구현예에서, 식물은 상기 기재된 바와 같이 유전학적으로 변형되지 않았다. 하나의 구현예에서, 대조군 식물은 야생형 식물이다. 대조군 식물은 전형적으로, 바람직하게 변형된 식물과 동일한 유전학적 배경을 갖는 동일한 식물 종이다.
이전의 개시내용은 본 발명을 제조하고 사용하는 방법 및 이의 최선의 방식을 포함하여 본 발명의 범위 내에 포함되는 주제의 일반적인 설명을 제공하지만, 하기 실시예는 당업자가 본 발명을 추가로 수행하고 그리고 그 완전한 기재 내용을 제공할 있도록 제공된다. 그러나, 당업자는 이들 실시예의 특정 사항이 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안되며 이의 범위는 본원 개시내용에 첨부된 청구범위 및 이의 등가물로부터 이해되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 다양한 추가의 양상 및 구현예는 본원 개시내용의 관점에서 당업자에게 자명할 것이다.
본원에 사용되는 경우 "및/또는"은 다른 것의 유무에 관계없이 2개의 특정 특성 또는 성분들 각각의 특정 개시내용으로서 취해야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 개별적으로 본원에 제시된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B의 각각의 특정 개시내용으로서 취해진다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 상기 제시된 특성의 기재사항 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양상 또는 구현예로 제한되지 않고, 기재된 모든 양상 및 구현예에 균등하게 적용된다.
본원에 인용되거나 이들의 진행 동안에 인용된 이전의 출원 및 모든 문헌 및 참조 승인 번호 ("출원에 인용된 문헌") 및 인용된 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌들은 ("본원에 인용된 문헌들"), 및 본원에 인용된 문헌들에 인용되거나 참조된 모든 문헌 및 임의의 제조업자의 지침서, 기재 사항, 제품 사양 및 본원에 언급된 임의의 생성물에 대한 생성물 시트 또는 본원에 참조로 포함된 임의의 문헌과 함께 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 모든 참조 문헌들은 각각의 개별 문헌이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.
본 발명은 지금부터 하기의 비제한적인 실시예에 설명된다.
실시예 1: 과발현 식물의 생성 및 동정
I. 재조합 플라스미드의 작제
1. 총 RNA는 옥수수 B73으로부터 추출하였고 역전사에 적용하여 cDNA를 수득하였다.
2. PCR 증폭은 주형으로서 단계 1에서 수득된 cDNA를 사용하고 F1 및 R1로 이루어진 프라이머 쌍을 사용함에 의해 수행하여 PCR 증폭 생성물을 수득하였다. PCR 증폭 생성물은 서열 분석되어 서열번호 12에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다.
F1 (서열번호 22): 5'-GACTCTAGAGGATCCATGCCCCTTCGACAACGTC-3'; 및
R1 (서열번호 23): 5'-GGTACCCGGGGATCCTCAGCACTTGGGCATGTTAGG-3'.
3. pCUB 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 BamHI에 의해 효소적으로 절단하여 선형화된 벡터를 수득하였다.
4. 단계 3에서 수득된 선형화된 벡터는 단계 2에서 수득된 PCR 증폭 생성물과 인-퓨전 기반 상동성 재조합에 적용하여 재조합 플라스미드 pCUB-ZmMZS를 수득하였다. 서열 분석 후, 재조합 플라스미드 pCUB-ZmMZS는 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자가 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입된 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다.
II. 형질전환 식물의 생성
옥수수 변종 Zong 31은 출발 식물로서 사용하였다. 옥수수 변종 Zong 31은 또한 야생형 식물로서 공지되어 있고, 도면에서 WT로서 나타냈다.
재조합 플라스미드 pCUB-ZmMZS는 출발 식물에 형질전환시켜 T0 세대의 형질전환 식물을 수득하였다. T0 세대의 유전자 전이 식물은 교배하여 T1 세대의 식물을 수득하였다. T1 세대의 식물은 추가로 교배하여 T2 세대의 식물을 수득하였다. T2 세대에서 수득된 동형접합성 유전자전이 종은 ZmMZS 유전자-과발현 종으로서 지정하였다. ZmMZS 유전자를 과발현하는 2개의 종 (종 #3 및 #4)은 무작위로 선택하였고, 후속 시험에서 사용하였다.
pCUB 벡터는 출발 식물에 형질전환시켜 T0 세대의 형질전환 식물을 수득하였다. T0 세대의 유전자 전이 식물은 교배하여 T1 세대의 식물을 수득하였다. T1 세대의 식물은 추가로 교배하여 T2 세대의 식물을 수득하였다. T2 세대에서 수득된 동형접합성 유전자전이 종은 공 (empty) 벡터 형질전환된 종으로서 지정하였다.
III. 실시간 형광성 정량 PCR에 의한 검출
시험 식물은 종 #3의 T2 세대의 식물, 종 #4의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다.
각각의 종의 3개의 식물이 사용되었고, 상기 결과를 평균화하였다.
총 RNA는 수경재배 배양 조건하에서 7일 (발아일로부터) 동안 성장한 시험 식물의 잎으로부터 추출하였고, PCR 증폭은 F2 및 R2로 이루어진 프라이머 쌍을 사용함에 의해 수행하여 ZmMZS 유전자의 상대적 발현 수준을 동정하였다. Ubi 유전자는 내부 참조 유전자로서 사용하였다 (여기서, 내부 표준 유전자를 동정하기 위한 프라이머 쌍은 F3 및 R3으로 이루어져 있다).
F2 (서열번호 24): 5'-GCGTGTTGTTGTTAGCATTTGG-3';
R2 (서열번호 25): 5'-GGGTGATGTTCTTGTAGCCCTG-3'.
F3 (서열번호 26): 5'-GCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3';
R3 (서열번호 27): 5'-CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3'.
상기 결과는 도 1에 나타낸다. 야생형 식물과 비교하여, 종 #3 및 #4의 식물에서 ZmMZS 유전자의 상대적 발현 수준은 유의적으로 증가한다.
IV. 조직화학적 염색
시험 식물은 종 #3의 T2 세대의 식물, 종 #4의 T2 세대의 식물, 빈 (empty) 벡터-형질전화된 종의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다.
수경재배 배양 조건하에서 (발아일로부터) 30일 동안 성장한 시험 식물의 제1 절간, 잎 및 뿌리의 성숙 영역을 슬라이싱하고 (여기서, 슬라이스의 두께는 50 μm였다), 2분 동안 5% 플로로글루신으로 염색시키고, 1 방울의 염산을 첨가하고, 현미경하에 관찰하였다.
뿌리의 현미경사진은 도 2a에 나타낸다 (여기서, 스케일 바는 75 μm이다).
잎의 현미경사진은 도 2b에 나타낸다 (여기서, 스케일 바는 75 μm이다).
제1 절간의 현미경사진은 도 2c에 나타낸다 (여기서, 스케일 바는 75 μm이다).
종 #3 및 #4의 식물의 지상 부분 및 뿌리 둘 다에서 염색 강도는 야생형 식물과 비교하여 보다 어두운 색이다 (즉, 리그닌 함량은 증가된다). 빈 벡터 형질전환된 종의 식물의 지상 부분 및 뿌리 둘 다에서 염색 강도는 야생형 식물의 염색 강도와 일치한다.
V. 리그닌 함량의 결정
시험 식물은 종 #3의 T2 세대의 식물, 종 #4의 T2 세대의 식물, 빈 벡터-형질전화된 종의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다. 각각의 종의 3개의 식물이 사용되었고, 상기 결과를 평균화하였다.
성숙한 시기에 수분 후 7일 째에, 시험 식물의 제3 절간은 일정한 중량으로 80℃에서 건조시키고, 이어서 으깨고 40-메쉬 체를 통해 체질하여 분말을 수거하였다. 약 5 mg의 분말은 10 ml 유리 시험 튜브에서 칭량하고, 리그닌 함량은 제조원 (Suzhou Keming Science and Technology Co., Ltd)으로부터 시판되는 리그닌 함량 검정 키트를 사용하여 측정하였다 (아세틸 브로마이드 방법, 특정 과정에 대한 지침을 참조한다).
리그닌 함량 (mg/g으로, 여기서, mg은 리그닌의 질량 단위이고, g는 건조 기반의 분말의 질량 단위이다) = 0.0735* (ΔA-0.0068)/W*T (여기서, A: 280 nm에서 흡광도; ΔA = 블랭크 튜브의 시험 튜브-A의 A; W: g의 샘플 질량; 및 T: 희석 인자).
상기 결과는 야생형 식물과 비교하여 도 3에 나타내고, 리그닌 함량은 종 #3의 식물의 줄기에서 21.62%까지 그리고 종 #4의 식물의 줄기에서 40.10%까지 증가한다. 야생형 식물과 비교하여, 빈 벡터 형질전환된 종의 식물의 줄기에서 리그닌 함량에서 어떠한 유의적 변화도 없다.
실시예 2: 소발현 식물의 생성 및 동정
I. 재조합 플라스미드의 작제
서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 이중 가닥 DNA 분자를 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입하여 재조합 플라스미드 pCUB-ZmMZS-Ri를 수득하였다. 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 이중 가닥 DNA 분자는 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA 분자를 발현한다. 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA 분자는 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA의 전구체 RNA이다. 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA는 ZmMZS 유전자를 표적화하는 miRNA이다.
II. 전이유전자 식물의 생성
옥수수 변종 Zong 31은 출발 식물로서 사용하였다. 옥수수 변종 Zong 31은 또한 야생형 식물로서 공지되어 있고, 도면에서 WT로서 나타냈다.
재조합 플라스미드 pCUB-ZmMZS-Ri는 출발 식물에 형질전환시켜 T0 세대의 형질전환 식물을 수득하였다. T0 세대의 유전자 전이 식물은 교배하여 T1 세대의 식물을 수득하였다. T1 세대의 식물은 추가로 교배하여 T2 세대의 식물을 수득하였다. T2 세대에서 수득된 동형접합성 유전자전이 종은 ZmMZS 유전자-소발현 종으로서 지정하였다. ZmMZS 유전자-소발현 종 (종 #5)은 무작위로 선택하고, 후속 시험에서 사용하였다.
pCUB 벡터는 출발 물질에 형질전환시켜 T0 세대의 형질전환 식물을 수득하였다. T0 세대의 유전자 전이 식물은 교배하여 T1 세대의 식물을 수득하였다. T1 세대의 식물은 추가로 교배하여 T2 세대의 식물을 수득하였다. T2 세대에서 수득된 동형접합성 유전자전이 종은 빈 벡터 형질전환된 종으로서 지정하였다.
III. 조직화학적 염색
시험 식물은 종 #5의 T2 세대의 식물, 빈 벡터-형질전환된 종의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다.
수경재배 배양 조건하에서 (발아일로부터) 30일 동안 성장한 시험 식물의 제1 절간 및 뿌리의 성숙 영역을 슬라이싱하고 (여기서, 슬라이스의 두께는 50 μm였다), 2분 동안 5% 플로로글루신으로 염색시키고, 1 방울의 염산을 첨가하고 현미경하에 관찰하였다.
뿌리의 현미경사진은 도 4에 나타낸다 (여기서, 스케일 바는 75 μm이다).
제1 절간의 현미경사진은 도 5에 나타낸다 (여기서, 스케일 바는 200 μm이다).
종 #5의 식물의 지상 부분 및 뿌리 둘 다에서 염색 강도는 야생형 식물과 비교하여 보다 밝은 색이다 (즉, 리그닌 함량은 감소된다). 빈 벡터 형질전환된 종의 식물의 지상 부분 및 뿌리 둘 다에서 염색 강도는 야생형 식물의 염색 강도와 일치한다.
IV. 리그닌 함량의 결정
시험 식물은 종 #5의 T2 세대의 식물, 빈 벡터-형질전환된 종의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다.
각각의 종의 3개의 식물이 사용되었고, 상기 결과를 평균화하였다.
성숙한 시기에 수분 후 7일 째에, 시험 식물의 제3 절간은 일정한 중량으로 80℃에서 건조시키고, 이어서 으깨고 40-메쉬 체를 통해 체질하여 분말을 수거하였다. 약 5 mg의 분말은 10 ml 유리 시험 튜브에서 칭량하고, 리그닌 함량은 제조원 (Suzhou Keming Science and Technology Co., Ltd)으로부터 시판되는 리그닌 함량 검정 키트를 사용하여 측정하였다 (아세틸 브로마이드 방법, 특정 과정에 대한 지침을 참조한다).
리그닌 함량 (mg/g으로, 여기서, mg은 리그닌의 질량 단위이고, g는 건조 기반의 분말의 질량 단위이다) = 0.0735* (ΔA-0.0068)/W*T (여기서, A: 280 nm에서 흡광도; ΔA = 블랭크 튜브의 시험 튜브-A의 A; W: g의 샘플 질량; 및 T: 희석 인자).
상기 결과는 도 6에 나타낸다. 야생형 식물과 비교하여, 종 #5의 식물의 줄기에서 리그닌 함량은 22.93%까지 감소된다. 야생형 식물과 비교하여, 빈 벡터 형질전환된 종의 식물의 줄기에서 리그닌 함량에서 어떠한 유의적 변화도 없다.
실시예 3: 재조합 플라스미드의 작제
pCUB 벡터는 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 환형 플라스미드이다.
I. 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 이중 가닥 DNA 분자를 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입하여 재조합 플라스미드 pCUB-MIR을 수득하였다. 재조합 플라스미드 pCUB-MIR은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA를 과발현하는 플라스미드였다. 서열번호 13에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 이중 가닥 DNA 분자는 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA 분자를 발현한다. 서열번호 14에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA 분자는 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 전구체 RNA였다.
II. 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 이중 가닥 DNA 분자를 pCUB 벡터의 BamHI 절단 부위에 삽입하여 재조합 플라스미드 pCUB-MIM을 수득하였다. 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 위치 218-241로부터의 뉴클레오타이드 서열에 "CTA"이외의 다른 부분은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 RNA에 상응하는 DNA에 역으로 상보적이다. 재조합 플라스미드 pCUB-MIM은 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 발현을 억제하는 플라스미드였다.
실시예 4: 형질전환 식물의 생성 및 표현형 동정
I. 형질전환 식물의 생성
옥수수 변종 Zong 31은 출발 식물로서 사용하였다. 옥수수 변종 Zong 31은 또한 야생형 식물로서 공지되어 있고, 도면에서 WT로서 나타냈다.
재조합 플라스미드 pCUB-MIR은 출발 식물에 형질전환시켜 T0 세대의 형질전환 식물을 수득하였다. T0 세대의 유전자 전이 식물은 교배하여 T1 세대의 식물을 수득하였다. T1 세대의 식물은 추가로 교배하여 T2 세대의 식물을 수득하였다. T2 세대에서 수득된 동형접합성 유전자전이 종은 과발현 종으로서 지정하였다. 과발현 (OE) 종은 무작위로 선택하고, 후속 시험에 사용하였다.
재조합 플라스미드 pCUB-MIM은 출발 식물에 형질전환시켜 T0 세대의 형질전환 식물을 수득하였다. T0 세대의 유전자 전이 식물은 교배하여 T1 세대의 식물을 수득하였다. T1 세대의 식물은 추가로 교배하여 T2 세대의 식물을 수득하였다. T2 세대에서 수득된 동형접합성 유전자전이 종은 발현 억제된 종으로서 지정하였다. 2개의 발현 억제된 종 (TM-3 및 TM-7)은 무작위로 선택하였고, 후속 시험에 사용하였다.
pCUB 벡터는 출발 물질에 형질전환시켜 T0 세대의 형질전환 식물을 수득하였다. T0 세대의 유전자 전이 식물은 교배하여 T1 세대의 식물을 수득하였다. T1 세대의 식물은 추가로 교배하여 T2 세대의 식물을 수득하였다. T2 세대에서 수득된 동형접합성 유전자전이 종은 빈 벡터 형질전환된 종으로서 지정하였다.
II. miRNA 발현 수준의 동정
시험 식물은 종 OE의 T2 세대의 식물, 종 TM-3의 T2 세대의 식물, 종 TM-7의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다. 각각의 종의 5개의 식물이 사용되었고, 상기 결과를 평균화하였다.
총 RNA는 시험 식물의 잎으로부터 추출하였고, 역 전사는 RT 프라이머를 사용하여 수행하였고, 이어서 실시간 정량 PCR은 F1 및 R1로 이루어진 프라이머 쌍을 사용하여 수행하여 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 상대적 발현 수준을 검출하였다. Ubi 유전자는 내부 참조 유전자로서 사용하였다 (여기서, 상기 내부 표준 유전자를 동정하기 위한 프라이머 쌍은 F2 및 R2로 이루어져 있다).
(서열번호 28) RT: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCTC.
(서열번호 29) F1: 5'-GTGGAAGGGGCATGCA-3';
(서열번호 30) R1: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'.
(서열번호 26) F2: 5'-GCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3';
(서열번호 27) R2: 5'-CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3'.
상기 결과는 도 7에 나타낸다. 야생형 식물과 비교하여, 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 발현 수준은 종 OE의 식물에서 유의적으로 증가하였고, 종 TM-3 및 TM-7의 식물에서 유의적으로 감소하였다.
III. 조직화학적 염색
시험 식물은 종 OE의 T2 세대의 식물, 종 TM-3의 T2 세대의 식물, 종 TM-7의 T2 세대의 식물, 공 플라스미드 형질전환된 종의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다.
수경재배 배양 조건하에서 (발아일로부터) 30일 동안 성장한 시험 식물의 제1 절간 및 뿌리의 성숙 영역을 슬라이싱하고 (여기서, 슬라이스의 두께는 50 μm였다), 2분 동안 5% 플로로글루신으로 염색시키고, 1 방울의 염산을 첨가하고 현미경하에 관찰하였다.
뿌리의 현미경사진은 도 8에 나타낸다 (여기서, 스케일 바는 75 μm이다).
제1 절간의 현미경사진은 도 9에 나타낸다 (여기서, 스케일 바는 200 μm이다).
염색 강도는 야생형 식물과 비교하여 지상 부분 및 뿌리 둘 다에서, 종 OE의 식물에서 보다 밝아지고 (즉, 리그닌 함량은 감소한다) 종 TM-3 및 TM-7의 식물에서 보다 어두워진다 (즉, 리그닌 함량은 증가한다). 빈 벡터 형질전환된 종의 식물의 지상 부분 및 뿌리 둘 다에서 염색 강도는 야생형 식물의 염색 강도와 일치한다.
IV. 리그닌 함량의 결정
시험 식물은 종 OE의 T2 세대의 식물, 종 TM-3의 T2 세대의 식물, 종 TM-7의 T2 세대의 식물, 빈 플라스미드 형질전환된 종의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다. 각각의 종의 3개의 식물이 사용되었고, 상기 결과를 평균화하였다.
성숙한 시기에 수분 후 7일 째에, 시험 식물의 제3 절간은 일정한 중량으로 80℃에서 건조시키고, 이어서 으깨고 40-메쉬 체를 통해 체질하여 분말을 수거하였다. 약 5 mg의 분말은 10 ml 유리 시험 튜브에서 칭량하고, 리그닌 함량은 제조원 (Suzhou Keming Science and Technology Co., Ltd)으로부터 시판되는 리그닌 함량 검정 키트를 사용하여 측정하였다 (아세틸 브로마이드 방법, 특정 과정에 대한 지침을 참조한다).
리그닌 함량 (mg/g으로, 여기서, mg은 리그닌의 질량 단위이고, g는 건조 기반의 분말의 질량 단위이다) = 0.0735* (ΔA-0.0068)/W*T (여기서, A: 280 nm에서 흡광도; ΔA = 블랭크 튜브의 시험 튜브-A의 A; W: g의 샘플 질량; 및 T: 희석 인자).
상기 결과는 도 10에 나타낸다. 야생형 식물과 비교하여, 리그닌 함량은 종 OE의 식물의 줄기에서 21.62%까지 감소하고 종 TM-3의 식물의 줄기에서 42.15%까지 및 종 TM-7의 식물의 줄기에서 28.96%까지 증가한다. 야생형 식물과 비교하여, 빈 벡터 형질전환된 종의 식물의 줄기에서 리그닌 함량에서 어떠한 유의적 변화도 없다.
V. 줄기의 천공 강도의 결정
줄기의 천공 강도는 명백하게 콘의 도복 저항성과 상호관련이 있고, 줄기의 강도 및 도복 저항성을 완전하게 반영할 수 있다.
시험 식물은 종 OE의 T2 세대의 식물, 종 TM-3의 T2 세대의 식물, 종 TM-7의 T2 세대의 식물, 공 플라스미드 형질전환된 종의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다. 각각의 종의 20개의 식물이 사용되었고, 상기 결과를 평균화하였다.
제조 시기에 수분 후 7일 째에, 시험 식물은 구체적으로 줄기의 짧은 축 방향을 따라 지상 제3 절간의 중앙 부분으로 1.0 mm2의 단면적을 갖는 시험 헤드를 수직으로 삽입함에 의해 AWOS-SL04 줄기 강도 시험기를 사용하고, 상기 시험 데이터를 판독하고 기록함에 의해 천공 강도에 대해 결정하였다.
상기 결과는 도 11에 나타낸다. 야생형 식물과 비교하여, 줄기의 천공 강도는 종 OE의 식물에 대해 22.15%까지 감소하고 종 TM-3의 식물에 대해 18.97%까지 및 종 TM-7의 식물에 대해 21.45%까지 증가한다. 야생형 식물과 비교하여, 빈 벡터 형질전환된 종의 식물의 줄기의 천공 강도에서 어떠한 유의적 변화도 없다.
VI. 화분 실험
시험 종자는 종 OE의 T3 세대의 종자, 종 TM-3의 T3 세대의 종자, 종 TM-7의 T3 세대의 종자, 공 플라스미드 형질전환된 종의 T3 세대의 종자 및 출발 식물의 종자였다.
플라스틱 플라워 화분 (직경 32.5 cm * 높이 26 cm)을 취득하고 14.0 kg의 토양을 각각의 화분에 채웠다. 이어서, 기본 비료를 적용하고, 발아 후 시험 종자를 화분에 심고 야외에서 배양하였다.
도 12는 태슬링 단계 (tasseling stage)에서 식물의 사진을 보여준다. 바람이 부는 경우, 종 OE의 식물은 굽은 줄기를 보여주고 (이는 줄기의 기계적 강도가 보다 작아짐을 보여준다), 종 TM-3 및 TM-7의 식물, 야생형 식물 및 빈 벡터 형질전환된 종의 식물은 곧게 유지한다 (줄기의 기계적강도가 보다 높음을 지적한다).
실시예 5: 표적 유전자의 측정
I. 5' RACE 시험
8개 유전자는 예비적으로 서열번호 15 또는 9에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 miRNA의 후보물 표적 유전자인 것으로 예측하였고, 이는 GRMZM2G367668, GRMZM2G169033, GRMZM2G148937, GRMZM2G178741, GRMZM2G039381, GRMZM2G062069, GRMZM2G043300, 및 GRMZM2G004106을 포함하고, 각각의 후보물 표적 유전자는 순차적으로 입증되었다.
옥수수 B73의 총 RNA를 추출하였고, 5'RACE 시험은 GeneRacerTM 키트를 사용함에 의해 각각의 후보물 표적 유전자에 대해 수행하였다. 상기 프로세스는 5' RACE 링커의 표적 유전자 mRNA 생성물로의 연결, cDNA로의 역전사, 네스티드 PCR 및 특정 단편의 클로닝 및 서열 분석을 포함하였다. 세부 사항에 대해 사용 지침서를 참조한다.
결과는 miRNA의 절단 부위가 GRMZM2G367668 전사체 및 GRMZM2G169033 전사체 상에 존재함을 보여준다. GRMZM2G367668 전사체의 상응하는 DNA는 서열번호 16에 나타내고, miRNA의 절단 부위는 GRMZM2G367668 전사체의 뉴클레오타이드 222 내지 242에 위치한다. GRMZM2G169033 전사체의 상응하는 DNA는 서열번호 17에 나타내고 miRNA의 절단 부위는 GRMZM2G169033 전사체의 뉴클레오타이드 302 내지 322에 위치한다.
II. 노던 블롯 분석
시험 식물은 종 OE의 T2 세대의 식물, 종 TM-3의 T2 세대의 식물, 종 TM-7의 T2 세대의 식물, 실시예 4에서 생성된 공 플라스미드 형질전환된 종의 T2 세대의 식물 및 출발 식물이었다.
묘목 단계에서 시험 식물의 뿌리를 채취하고, 총 RNA를 추출하고, 노던 블롯 분석에 적용하였다 (여기서, GRMZM2G169033 전사체에 대한 프로브는 서열번호 18에 나타내고, GRMZM2G367668 전사체에 대한 프로브는 서열번호 19에 나타낸다).
상기 결과는 도 13에 나타낸다. 종 OE의 식물에서, GRMZM2G169033 및 GRMZM2G367668 전사체의 수준은 유의적으로 감소한다. GRMZM2G169033 및 GRMZM2G367668 전사체의 수준은 종 TM-3 및 TM-7의 식물에서 유의적으로 증가한다. 상기 결과는 GRMZM2G169033 전사체 및 GRMZM2G367668 전사체가 miRNA의 표적 유전자임을 지적한다.
실시예 6: 마이크로RNA528은 질소-럭셔리 조건하에서 리그닌 생합성을 조절함에 의해 옥수수의 도복 저항성에 영향을 미친다.
I. 옥수수 묘목의 리그닌 조성 및 함량은 N 공급에 의해 영향을 받는다.
앞서 주지한 바와 같이, N-럭셔리 조건하에서 도복은 중국에서 옥수수 수확량을 감소시킨다. 도복은 리그닌과 관련될 수 있고, 상이한 N 조건하에서 옥수수 리그닌 조성 및 함량에 대한 정량적 데이터가 부재이기 때문에, 본원 발명자들은 먼저, 황가산분해 (thioacidolysis)를 사용하여 옥수수 리그닌 조성물에 대한 N의 효과를 결정하였다. N 충분과 비교하여, N 결핍은 실질적으로 옥수수 묘목의 새싹에서 H, G, 및 S 단량체의 생성을 유도하였다 (표　2). N 럭셔리는, 대조적으로, 이들 단량체의 생성을 유의적으로 억제하였다 (표 2). 추가로, 새싹에서 S/G 비율은 N 공급이 제한되는 경우 높았고, N 공급이 과도한 경우 낮았다 (표 2).
[표 2] 상이한 N 조건하에서 옥수수 묘목의 리그닌 조성 및 함량.
Figure pct00002
NL, NS, 및 ND는 각각 N 럭셔리, N 충분, 및 N 결핍을 지적한다. H, G, 및 S는 각각 p-쿠마릴 알코올, 코니페릴 알코올, 및 시나필 알코올이다. DW, 건조 중량. 값은 4개의 생물학적 레플리케이트의 평균 ± SE이다. 동일한 문자를 갖는 평균은 LSD 시험에 따르면 p < 0.01에서 유의적으로 상이하지 않다.
본원 발명자들은 또한 아세틸 브로마이드 (AcBr) 분석 (참조: liyama and Wallis, 1990)을 사용하여 옥수수 묘목의 총 리그닌 함량에 대한 N 공급의 효과를 정량하였다. 황가산분해와 일치되게, AcBr 분석은 옥수수 묘목의 새싹에서 총 리그닌 함량이 N 럭셔리에 의해 감소되었지만 N 결핍에 의해 증진됨을 보여주었다 (표 2). 황가산분해 및 AcBr 결과는 30-일-령 수경재배 성장한 옥수수 줄기 및 잎의 플로로글루시놀 염색에 의해 확인하였다. 이들 결과는 함께 옥수수의 리그닌 조성 및 함량이 N 공급에 의해 영향을 받는 것을 지적한다.
II. ZmmiR528은 N 공급에 의해 조절된다
옥수수에서 ZmmiR528 패밀리의 2개의 구성원 ZmMIR528a　및　ZmMIR528b가 있고, 이들의 성숙한 서열은 동일하다. TGA1/TGA4　및　NAC4　(참조: Vidal et　al., 2013,　Alvarez et　al., 2014)를 포함하는, N-반응성 전사에 의해 인지되는 여러 모티프는 ZmMIR528a　및　ZmMIR528b의 1.5-kb 프로모터 영역에서 발견될 수 있다. 본원 발명의 이전의 서열분석　데이터는 또한 ZmMIR528a　및　ZmMIR528b 둘 다가 N 결핍에 의해 유의적으로 하향조절됨을 보여주었다 (참조: Zhao et　al., 2012). ZmmiR528의 발현이 N 공급에 의해 어떻게 조절되는지를 결정하기 위해, 본원 발명자들은 N 럭셔리 및 N 결핍하에 수경재배로 성장한 옥수수와 함께 시간-과정 실험을 수행하였다. 줄기-루프 qRT-PCR은 새싹에서 ZmmiR528의 발현이 N 럭셔리에 의해 유도되지만 N 결핍에 의해 감소됨을 보여주었고 (도 14a), 이는 N 럭셔리 및 결핍에 응답하여 총 리그닌 함량에서의 변화와는 반대이다 (표　2). 다시 말해, N 럭셔리는 ZmmiR528　발현을 증가시켰고 총 리그닌 함량을 감소시켰고, N 결핍은 ZmmiR528　발현을 감소시켰고 총 리그닌 함량을 증가시켰다.
III. ZmLAC3 및 ZmLAC5 는 ZmmiR528의 표적이다
ZmmiR528의 잠재적 표적은 ZmLAC3,　ZmLAC5, 여러 쿠프레독신 (GRMZM2G043300, GRMZM2G004106, 및 GRMZM2G039381), 및 호메오박스-전사 인자 22　ZmHB22　(GRMZM2G178741) (참조: Zhang et　al., 2009)를 포함한다. 단지 ZmLAC3및 ZmLAC5가　N-럭셔리 및 N-결핍 조건에 응답하여 ZmmiR528의 것들과는 반대의 발현 패턴을 보여주었고 (도 14b 및 c), 이는 쿠프레독신 및 ZmHB22가 ZmmiR528의 표적이 아니거나 이들이 해독 수준에서 ZmmiR528에 의해 조절됨을 지적한다. 따라서, 본원 발명자들은 추가의 분석을 위해 ZmLAC3　및　ZmLAC5를 선택하였다. ZmmiR528이 ZmLAC3　및　ZmLAC5 발현을 조절할 수 있는지를 결정하기 위해, 본원 발명자들은 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana)에서 일시적 동시-발현 검정을 수행하였다. 엔. 벤타미아나 (N.　benthamiana)에서 동시-발현 2일 후, RNA를 추출하였고, ZmLAC3　및　ZmLAC5 전사체는 qRT-PCR로 분석하였다. ZmLAC3　및　ZmLAC5 전사체의 풍부함은 ZmMIR528b와 동시 발현되는 경우 유의적으로 감소하였다 (도 15a). 추가로, ZmLAC3　및　ZmLAC5에서 예측된 표적 부위는 옥수수 묘목으로부터 RNA를 사용한 5' RACE (cDNA 말단의 신속 증폭) 검정을 수행함에 의해 결정하였다 (도 15b). 이를 종합해 보면, 이들 결과는 ZmLAC3　및　ZmLAC5가 옥수수에서 ZmmiR528의 실제 표적임을 보여준다.
IV. ZmmiR528 는 주로 도관 조직에서 발현된다
ZmmiR528의 공간 분포에 대한 정보가 이의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있기 때문에, 본원 발명자들은 qRT-PCR에 의해 상이한 옥수수 조직에서 ZmmiR528의 발현 패턴을 조사하였다. ZmmiR528은 (바닥으로부터) 10번째 잎에서 고도로 발현하고, 절간에서는 중간 정도로 발현하였고, 성숙한 옥수수 식물의 뿌리에 낮은 수준으로 발현하였다. 대조적으로, ZmLAC3　및 ZmLAC5의 발현 패턴은 ZmLAC5가 또한 절간에서 고도로 발현되는 것을 제외하고는 ZmmiR528의 발현 패턴과 상반되었다.
ZmmiR528의 발현 패턴은 동일 반응계　하이브리드화 분석에 의해 추가로 조사하였다.　ZmmiR528은 옥수수 잎 및 줄기의 체관부에서 그리고 곁뿌리의 도관 영역에서 특이적으로 검출되었다 (도 16a). ZmLAC5의 발현 수준은 또한 옥수수 절간에서 높았기 때문에, 옥수수 줄기에서 ZmLAC5의 발현 패턴은 또한 동일 반응계　하이브리드화에 의해 조사하였다. ZmmiR528과 같지 않게,　ZmLAC5　전사체는 옥수수 줄기의 섬유에서 축적되었고 (도 16b), 이는 추가로 ZmmiR528에 의해 ZmLAC의 음성 조절을 지적한다.
V. ZmmiR528는 N-럭셔리 조건하에서 옥수수 도복 저항성에 영향을 미친다
ZmmiR528의 기능을 특징 분석하기 위해, 본원 발명자들은 항상성 유비퀴틴 프로모터의 제어하에 ZmmiR528을 과발현하는 유전자전이 옥수수 종을 생성하였다. 단지 하나의 종 (OE)은 야생형 (WT) 옥수수에서 고수준의 ZmmiR528 발현으로 인해 수득되었다 (참조: Zhao et al., 2012). ZmmiR528 패밀리는 2개의 구성원을 갖기 때문에, CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 ZmmiR528의 기능 상실 돌연변이체를 생성하기 어렵다. 따라서, ZmMIR528a 및 ZmMIR528b를 표적화하는 짧은 탠덤 표적 모사체는 문헌 (참조: Yan et al. (2012))에 의해 기재된 바와 같이 디자인되었고 옥수수에 도입되었다. ZmMIR528a 및 ZmMIR528b 파괴의 효과는 소형 RNA 노던 블롯 분석에 의해 입증되었고, 2개의 독립적 녹다운 종 (TM-3 및 TM-7)은 후속적 분석을 위해 선택되었다 (도 17e). ZmLAC3 및 ZmLAC5의 mRNA 풍부함은 ZmmiR528 과발현에 의해 감소하였지만 ZmmiR528 녹다운에 의해 증가하였고 (도 17g), 이는 추가로 ZmLAC3 및 ZmLAC5가 ZmmiR528에 의해 직접 조절됨을 입증한다.
N 공급에 의한 ZmmiR528의 조절 및 도관 조직에서 이의 특이적 발현은 본 발명자가 리그닌 생합성에서 이의 잠재적 역할을 분석하도록 촉진시켰다. 흥미롭게도, ZmmiR528 풍부함은 수경재배로 성장한 옥수수 묘목에서 리그닌 함량과 음성으로 상호관련되지만 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 함량과는 관련이 없었다 (도 17f). 리그닌 함량은 WT에서 보다 TM 유전자전이 옥수수에서 약 1.5배 높았다 (도 17f). 추가로, 세포수는 WT 또는 TM 유전자전이 옥수수의 체관부에서의 것 보다 낮았고 세포 직경은 높았으며, 이는 체관부 세포가 OE 유전자전이 옥수수에서 보다 느슨하게 정렬됨을 시사한다. 따라서, 본원 발명자들은 N-럭셔리 조건하에서 유전자전이 옥수수 식물의 도복 저항성을 평가하였다. OE 유전자전이 옥수수는 N-럭셔리 조건하에서 WT 또는 TM 유전자전이 옥수수 보다 도복 경향이 있었다 (도 17a). 상기 표현형과 일치하여, 껍질 침입도계 저항성 및 AcBr 리그닌 함량은 WT 또는 TM 유전자전이 옥수수에서의 것 보다 OE 유전자전이 옥수수에서 훨씬 더 낮았다 (도 17b 및 c). TM 및 OE 유전자전이 옥수수에서 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 함량은 WT의 것들과 유사하였다 (도 17d). 이들 결과는 ZmmiR528이 리그닌 함량에 영향을 미침에 의해 N-럭셔리 조건하에서 옥수수에서 도복 저항성에 영향을 미친다.
VI. ZmLAC3 의 과발현은 옥수수에서 리그닌 함량을 증가시킨다
라카아제는 많은 유기체에서 발견되는 구리-함유 당단백질이다. 라카아제는 아라비도프시스에서 도관 발육 동안에 리그닌 중합에서 필요하고 퍼옥시다제와 비-중복적으로 기능한다 (참조: Zhao et al., 2013). 옥수수 리그닌 생합성에서 ZmmiR528의 기능을 추가로 특징 분석하기 위해, 본원 발명자들은 항상성 유비퀴틴 프로모터의 제어하에 ZmmiR528의 표적 중 하나인 ZmLAC3을 과발현하는 유전자전이 옥수수 식물을 생산하였다. 2개의 유전자전이 종 (#3 및 #4)은 이들의 고수준의 ZmLAC3 발현을 기준으로 하는 추가의 분석을 위해 선택되었다 (도 19a). WT 및 ZmLAC30E 유전자전이 옥수수 묘목의 줄기 및 잎의 플로로글루시놀 염색은 ZmLAC3의 과발현이 리그닌 함량을 증가시킴을 보여주었다 (도 18a). 예를 들어, N-럭셔리 및 N-충분한 조건하에 리그닌의 이소성 침적은 ZmLAC3OE 유전자전이 옥수수의 줄기 표피에서 명확하였지만 WT 옥수수의 줄기 표피에서는 명확하지 않았다 (도 18a). AcBr 분석을 기준으로, N-럭셔리 조건하에서 성숙한 줄기에서 리그닌 함량은 WT에서 보다 ZmLAC30E 유전자전이 옥수수에서 11%-20% 높았다 (도 18b). 껍질 침입도계 저항성은 또한 WT 옥수수에서의 것 보다 ZmLAC3OE 유전자전이 옥수수에서 보다 높았다 (도 18c). ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수에서의 관찰과 일치하여, ZmLAC3의 과발현은 N-럭셔리 조건하에서 WT 옥수수와 비교하여 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 함량에 영향을 주지 않았다 (도 18d 및 e).
VII. ZmmiR528 및 N 공급은 ZmPAL 의 발현에 영향을 미친다
ZmmiR528-매개된 신호전달 경로에서 분자 반응들에 대한 통찰력을 얻기 위해, 본원 발명자들은 RNA 서열 분석 (RNA-seq)을 사용하여 WT 및 ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수의 전체-전사체 프로필을 비교하였다. 총 RNA는 15-일-령의 수경재배로 성장한 교배 종 및 충분한 N이 공급된 유전자전이 옥수수의 잎으로부터 추출하였다. 각각의 유전자형에 대해 생물학적 레플리케이트가 있고, 라이브러리는 일루미나 고속 처리 서열분석 기술을 사용하여 서열 분석하였다. 이들 6개의 RNA 라이브러리는 2.8억개 초과의 미가공 판독을 수득하였다. 옥수수 게놈에 맵핑될 수 없는 서열은 버리고 완벽하게 맵핑된 것들은 추가로 분석하였다. 각각의 유전자의 풍부함은 100만 맵핑된 판독 당 킬로베이스 당 단편으로서 표현하였다 (참조: Trapnell et al., 2010). 대략적으로 2328개 유전자는 비-스트레스 조건하에서 WT와 비교하여, ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수에서의 발현에서 통계학적으로 유의적 변화를 보여주었다. 차등적으로 발현된 유전자 (DEG) 중에서, ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수에서 1048개는 하향조절되었고 1281개는 상향조절되었다. UniProt 데이터베이스 (http://www.uniprot.org/blast/)에 대하여 BLAST 검색을 수행함에 의해, 본원 발명자들은 기능적으로 1932개의 DEG에 주석을 달았다. DEG 중에서, UDP-글리코실트랜스퍼라제 72B1 (UGT72B1)은 모노리그놀의 글루코스 접합을 촉매하는 것으로 보고되었고, 아라비도프시스에서 정상 세포 벽 리그닌화를 위해 필수적이다 (참조: Lin et al., 2016). AtABCG29는 리그닌 생합성에 관여하는 p-쿠마릴 알코올 수송체이다 (참조: Alejandro et al., 2012). 옥수수에서 이들 유전자, GRMZM2G156026 및 GRMZM2G366146의 전사체는 ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수에서 유의적으로 상향조절되었다. 유전자 온톨로지 (GO; http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/) 분석은 주석이 달린 DEG가 대부분 GO:0006950 (반응 대 스트레스; p = 1.70E-6), GO:0019748 (2차 대사 과정; p = 6.80E-6), GO:0044271 (세포 질소 화합물 생합성 과정; p = 0.0008), GO:0005618 (세포 벽; p = 2.60E-14), 및 GO:0030054 (세포 접합; p = 5.60E-10)에 관여함을 지적했다.
GRMZM2G170692 및 GRMZM2G334660은 이들이 페닐알라닌 암모니아 리아제 7 (PAL7) 및 PAL8 각각을 암호화하기 때문에 본원 발명자의 주의를 끌었다. PAL은 페닐알라닌으로부터 모노리그놀을 생성하는 일련의 효소 반응에서 제1 단계를 촉매할 뿐만 아니라 페닐프로파노이드-질소 사이클에서 주요 링크이다 (참조: Cantσn et al., 2005, Vanholme et al., 2008). N-충분한 조건하에서, ZmmiR528은 ZmPAL7 및 ZmPAL8 발현에 부정적 영향을 미쳤고, 즉, ZmPAL7 및 ZmPAL8 mRNA 수준은 ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수에서 최고였고, 이어서 WT 및 ZmmiR528 OE 유전자전이 옥수수 순으로 나타났다 (도 20). 이들 결과는 ZmLAC3OE 유전자전이 옥수수에서 추가로 입증되었다 (도 19b). N 결핍은 WT, ZmmiR528 OE, 및 TM 유전자전이 옥수수에서 ZmPAL7 및 ZmPAL8 발현을 유의적으로 유도하였고, 최고 유도는 ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수에서 관찰되었다 (도 20). N-럭셔리 조건하에서, ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수에서 ZmPAL7 및 ZmPAL8 발현 수준은 N-충분한 조건하에서의 것들과 유사하였다. 대조적으로, 발현 수준은 N-럭셔리 조건하에서 WT 및 ZmmiR528 OE 유전자전이 옥수수에서 유의적으로 감소하였다 (도 20). 또 다른 7개 ZmPAL의 발현 수준은 또한 실시간 RT-PCR에 의해 이들 유전자전이 옥수수 종에서 결정되었다. ZmPAL7 및 ZmPAL8과 일치하여, ZmPAL1 및 ZmPAL3의 mRNA 수준은 N 공급, ZmmiR528, 및 ZmLAC3 풍부함에 의해 조절되었다 (도 20 및 19b).
VIII. 논의
옥수수는 식물 발육 및 진화를 연구하기 위해 중요한 모델이지만, 옥수수에 대한 연구는 벼 및 아라비도프시스에 대안 연구를 지체시켰고, 이는 아마도 유전자전이 옥수수에 대해 낮은 형질전환 효율 및 제한된 유전학적 배경 때문이다. 지금까지, 옥수수에서 단지 특징 분석된 miRNA는 ZmmiR156 (참조: Chuck et　al., 2007a), ZmmiR164 (참조: Li et　al., 2012), ZmmiR166 (참조: Juarez et　al., 2004), 및 ZmmiR172 (참조: Lauter et　al., 2005,　Chuck et　al., 2007b)이다. 본 연구에서, 본원 발명자들은 ZmLAC3　및　ZmLAC5　mRNA의 풍부함을 음성으로 조절함에 의해 ZmmiR528이 N-럭셔리 조건하에 옥수수의 리그닌 생합성 및 도복 저항성에 영향을 미침을 밝혔고, 이는 N과 리그닌 생합성 간의 관계에 대한 유의적 통찰력을 제공한다.
N-럭셔리 조건하에서 도복은 중국에서 옥수수 수확량을 제한하는 주요 문제이다. 포플러에서, 물관부의 2차 세포 벽에서 리그닌은 N-럭셔리 조건하에서 감소하였지만 N-제한 조건하에서 꾸준히 침적되었다 (참조: Camargo et　al., 2014). 벼과 사료 작물에서, 리그닌 함량은 N 수정에 의해 증가한다 (참조: Collins et　al., 1990). 여기서, 본원 발명자들은 옥수수에서 리그닌 조성 및 함량에 대한 N 처리의 효과를 정량하였다. N 럭셔리는 옥수수 묘목에서 H, G, 및 S 단량체 및 총 리그닌 함량의 생성을 유의적으로 억제하였다. TGA1/4　및　NAC4　전사 인자는 니트레이트-반응 네트워크의 주요 조절인자이다 (참조: Vidal et　al., 2013,　Alvarez et　al., 2014). 이들 전사 인자들에 상응하는 결합 부위는 ZmMIR528a/b의 1.5-kb 프로모터 영역에서 발견되었고, 이는 ZmMIR528a/b　발현이 N 처리에 의해 조절될 수 있음을 지적하고, 줄기-루프 qRT-PCR은 이러한 가설을 입증하였다.　ZmMIR528a/b는 ZmLAC3　및　ZmLAC5를 직접적으로 절단할 수 있고, 리그닌 함량은 특히 ZmmiR528 녹다운 돌연변이체 및 ZmLAC3-과발현 유전자전이 옥수수에서 증진되었다. 리그닌의 이소성 침적은 이들 종의 줄 표피에서 명확하였다. 모노리그놀 생합성 유전자는 아라비도프시스　lac4lac11lac17　3중 돌연변이체 (참조: Zhao et　al., 2013)에서 거의 영향을 미치지 않지만, ZmmiR528의 녹다운 및 ZmLAC3의 과발현은 현재 연구에서 PAL 발현 수준을 유의적으로 증가시켰다. N-럭셔리 조건하에서,　ZmPAL　발현 수준은 WT 또는 ZmmiR528　OE 유전자전이 옥수수에서의 것 보다 ZmmiR528 TM 유전자전이 옥수수에서 보다 높았다. 이를 종합해 보면, miR528의 증가된 수준 및 ZmLAC 및 ZmPAL의 감소된 풍부함은 N-럭셔리 조건하에 옥수수의 감소된 도복 저항성을 설명할 수 있다 (도 21).
앞서 주지한 바와 같이, miRNA528은 외떡잎-특이적 miRNA이다. miRNA528 (5'-UGG AAG GGG CAU GCA GAG GAG-3')의 성숙한 서열은 벼 및 옥수수에서 동일하지만, 이들 종에서 miRNA528의 기능은 상이하다. 벼에서, OsmiR528은 AO (참조: Wu et　al., 2017)를 하향조절함에 의해 면역 반응에 기여한다. 본원 발명자들은 엔. 벤타미아나에서 동시발현 및 5' RACE를 사용하여 벼와 대조적으로 옥수수에서,　ZmLAC3　및　ZmLAC5가 ZmmiR528의 실제 표적임을 결정한다. ZmLAC3의 과발현은 옥수수의 리그닌 함량을 증가시켰고, 이는 ZmMIR528a/b TM 유전자전이 옥수수의 표현형과 일치한다. 추가로, ZmmiR528는 특이적으로 옥수수 잎 및 줄기의 체관부에서 유의적으로 발현된다. 이를 종합해 보면, 본원 발명의 결과는 ZmLAC3　및　ZmLAC5를 조절함에 의해, ZmmiR528이 옥수수 리그닌 생합성에 영향을 미침을 지적한다.
라카아제의 전사 조절은 아라프도프시스　(참조: Mitsuda et　al., 2007,　Zhou et　al., 2009,　Wang et　al., 2010)에서 2차 벽 형성을 위해 중요하다. 아라비도프시스는 miRNA528이 결핍되어 있지만, 이것은 리그닌 생합성과 관련하여 중요한 기능을 제공하는 다른 miRNA를 갖는다. 예를 들어, 아라비도프시스에서 miRNA408의 과발현은 LAC13　및　ARPN　mRNA 수준을 하향조절하고 영양 성장 (참조: Zhang and Li, 2013)을 증가시키고; miRNA397b는 그리닌 생합성 (참조: Wang et　al., 2014)에 관여하는 라카아제를 조절함에 의해 아라비도프시스에서 리그닌 함량 및 종자 수 둘 다를 조절하고; miRNA857은 LAC7　(참조: Zhao et　al., 2015)의 조절을 통해 아라비도프시스에서 도관 조직의 2차 성장을 조절한다. 따라서, 본원 발명자들은 리그닌 생합성의 전사 후 조절이 외떡잎과　쌍떡잎사이에서 보존되는 것으로 추론한다.
사람에 대한 식품 공급원인 것에 추가로, 옥수수는 또한 바이오연료 생성을 위해 중요한 원료이고 가축을 위해 중요한 사료 작물이다. 바이오연료 생성을 위한 옥수수의 사용은 리그닌의 제거를 필요로 하고, 리그닌은 사료 작물의 소화성에 영향을 미친다 (참조: Zhou et　al., 2009). ZmmiRNA528　OE 유전자전이 옥수수는 리그닌 함량을 감소시키기 때문에, 이것은 바이오연료 생성 또는 사료를 위해 유용할 수 있다. 대부분 중요하게, 현재 연구의 결과는 ZmmiR528 및　ZmLAC　모듈이 변형되어 N-럭셔리 조건하에서 옥수수의 도복을 감소시킬 수 있음을 지적한다.
IX. 방법
식물 재료 및 성장 조건
균일한 크기의 종자는 20분 동안 10% H2O2에서 표면 멸균화시켰다. 이들을 6시간 동안 연속 통기와 함께 포화된 CaSO4　용액 중에 침지시킨 후, 종자는 2개의 잎이 보일때까지 조악한 석영 모래에서 발아시켰다. 묘목은 문헌 (참조: Zhao et　al. (2012))에 기재된 바와 같이 수경재배로 성장시켜 N-충분한 (4　mM NO3 -, 완전 강도 호글랜드 (Hoagland)의 영양 용액에서 농도), N-럭셔리 (8　mM NO3 -), 또는 N-결핍 조건 (0.04　mM NO3 -)에 대한 반응을 평가하였다. 옥수수는 또한 토양에서 성장시켜 N-럭셔리 조건하에서 도복 저항성을 결정하였다. 토양 배양을 위해, 식물은 천연 조건하에서 70일 동안 10 kg의 토양을 함유하는 화분에서 성장시켰다. 심기 전에, 6.2　g의　우레아, 12.1　g의 과인산칼슘, 및 5.5　g의　황산칼륨을 각각의 화분의 토양에 혼합하였다. 우레아 비료의 양은 실제 투입에서의 것 보다 화분 실험에서 약 2배 높았다. 옥수수 V6 단계에서, 추가의 2g의 우레아를 각각의 화분에 적용하였다.
유전자전이 옥수수의 작제 및 생성
3' UTR이 없는 ZmLAC3의 cDNA는 PCR에 의해 증폭시켰다. 폴딩-백 구조를 포함하는 ZmMIR528b　서열 주변의 ∼80-bp 단편은 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. ZmmiR528 녹다운 돌연변이체 ZmmiR528　TM을 생성하기 위해, 본원 발명자들은 문헌 (참조: Yan et　al. (2012))에 의해 기재된 바와 같이 ZmMIR528a　및　ZmMIR528b를 표적화하는 짧은 탠덤 표적 모사체를 디자인하였다. 증폭된 단편은 인-퓨전 반응을 통해 BamHI 제한 부위를 사용하여 벼 유비퀴틴　프로모터의 제어하에 pCUB 벡터에 클로닝하였다.
CaMV 35S　프로모터의 제어하에, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 하이그로스코피쿠스　포스피노트리신아세틸트랜스퍼라제 (bar) 유전자를 함유하는 작제된 플라스미드는 에이. 튜메파시엔스 (A.　tumefaciens) EHA105로 전기천공하였다. 옥수수 교배 종 ZZC01의 미성숙한 배아는 연구소 (Life Science and Technology Center of China National Seed Group)에서 EHA105와 동시 항온처리함에 의해 형질감염시켰다. 형질감염체는 점진적으로 증가하는 농도의 바이알라포스와 함께 선택되었다. 20개 초과의 독립적 유전자전이 반응들을 생성하였고, 단일 카피 또는 낮은 카피수와의 반응들은 자가 수분하거나 옥수수 교배 종 ZZC01과 교배함에 의해 T1　종자를 생성시키기 위해 진전되었다. 실시간 qRT-PCR 분석 후, 확인된 전이유전자 발현을 갖는 T1　식물은 자가수분하여 T2 종자를 생성하였다. T2　동형접합성 종은 모든 실험을 위해 사용하였다.
리그닌, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 함량의 분석
15-일-령 수경재배로 성장한 식물의 상이한 부분 및 V9 성장 단계에서 토양-성장한 옥수수의 바닥으로부터 제3 절간을 샘플링하였다. 샘플은 7일 동안 45℃에서 건조시키고, 이어서 미세 분말로 분쇄하였다. 리그닌 조성은 황가산분해에 의해 결정하였다 (참조: Lapierre et　al., 1995). 상기 AcBr 방법을 사용하여 문헌 (참조: Fukushima and Hatfield (2004))에 의해 기재된 바와 같이 총 리그닌 함량을 결정하였다. 셀룰로스 및　헤미셀룰로스　함량은 변형된 NREL 과정을 사용하여 결정하였다 (참조: Sluiter et　al., 2008).
도관 구조의 조직화학적 분석
본원 발명자들은 15-일-령 수경재배로 성장한 옥수수의 동일한 위치 및 30-일-령 수경재배로 성장한 옥수수의 뿌리 위로 줄기의 첫번째 2 cm에서 잎을 샘플링하였다. 이들 샘플의 도관 구조는 이전에 기재된 바와 같이 비스터 (Wiesner) 염색에 의해 가시화하였다 (참조: Berthet et　al., 2011).
RNA 분석
총 RNA는 TRIzol　시약 (Invitrogen)을 사용하여 교배 종 및 유전자전이 옥수수로부터 추출하였다. ZmmiR528의 정량을 위해, 줄기-루프 qRT-PCR은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (참조: Chen et　al., 2005). 실시간 RT-PCR　및 절단 부위 맵핑은 문헌 (참조: Zhao et　al. (2012))에 기재된 바와 같이 수행하였다.
엔. 벤타미아나에서 일시적 발현
폴딩 백 구조를 포함하는 ZmLAC3,　ZmLAC5, 및　ZmMIR528b의 전장 cDNA 서열은 프라이머로 증폭시켰다. 증폭된 단편은 인-퓨전 반응을 통해 BamHI 제한 부위를 사용하여 pCPB 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드는 에이. 튜메파시엔스　GV3101로 전기천공하고 문헌 (참조: Li et　al. (2008))에 기재된 바와 같이 타바코 표피 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 잎은 침윤 2일 후 수확하고, 상기 기재된 바와 같이 RNA 분석에 적용하였다.
동일 반응계 하이브리드화
ZmmiR528의 동일 반응계 하이브리드화는 문헌 (참조: Trevisan et　al. (2012))에 기재된 바와 같이 수행하였다. ZmLAC5　프로브의 경우, 고특이성을 갖는 385-bp 단편을 증폭시키고 pGEM-T-이지 (easy) 벡터 (Promega)에 클로닝하였다. 상응하는 센스 및 안티센스 프로브는 T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제를 사용한 시험관내 전사에 의해 생성하였다. ZmLAC5의 동일 반응계 하이브리드화는 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (참조: Zhang et　al., 2007).
절단력의 측정
V9 성장 단계에서 토양-성장한 옥수수의 바닥으로부터의 제3 절간은 측정을 위해 사용하였다. 줄기를 절단하기 위해 요구되는 힘은 마이크로시험기 (AWOS-SL04)를 사용하여 기록하였다. 각각의 유전자형의 10개 식물을 측정하였고, 모든 측정은 동일한 조건하에 수행하였다.
세포 수 및 크기
각각의 유전자형에 대한　체관부　세포 수 및 직경의 측정을 위해, 바닥으로부터 두번째 잎의 동일한 부분을 0.1　M 포스페이트 완충액 (pH 7.2) 중의 2.5% 글루타르알데하이드 중에서 4℃에서 밤새 고정화시키고, 1% OsO4 중에서 2시간 동안 후-고정화시켰다. 전자 단층사진은 80 kV에서 작동하는 HT7700 투과 전자현미경 (Hitachi)을 사용하여 수거하였다. 이미지 프로 플러스 6.0을 사용하여 체관부 세포 직경을 측정하였다.
실시예 7: CRISPR/Cas9-매개된 miRNA528 a 및 b 편집.
MIRNA528의 gRNA의 2개의 별도의 쌍을 제조하였다:
528a: TCAGGGTCAGTTTGCTCTGCTGG (서열번호 33),
TGCGCAGTTGCCCTGTGATGAGG (서열번호 36)
528b: TCTCTAGTTCTGGGAGTTCCTGG (서열번호 40) 및
AAAACTCAGAAGCGCAACCGAGG (서열번호 43)
이후, 단편은 인-퓨전 반응을 통해 HindIII 제한 부위를 사용하여 pCPB 벡터에 클로닝하였다. sgRNA 및 hSpCas9의 도식적 다이아그램은 도 22에 제공된다.
실시예 9: 필드-연구
본원 발명자들은 miR528 녹다운 전이유전학적 (암 (female)) 식물을 제조하였고 이들을 도복 경향이 있는 수 (male)와 교배하였다. 이어서, F1 세대는 도복 경향 교배종과 역 교배하였다. 도 23에서의 사진에 나타낸 바와 같이, 수득한 식물은 지연된 개화 시기와 같은 임의의 음성 표현형 없이 도복-경향 식물과 교배된 야생형 (WT x 하이브리드)와 비교하여, 필드에서 증가된 도복 (도복 조건에 노출되는 경우)을 가졌다. 도복 저항성 식물은 새로운 하이브리드를 생성하기 위해 수 (male) 또는 암 (female) 모체로서 사용될 수 있다.
참조문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
서열 목록
서열번호 1 라카아제 3 아미노산
Figure pct00009
서열번호 2 라카아제 3 게놈 핵산
Figure pct00010
Figure pct00011
서열번호 3 라카아제 3 CDS 핵산
Figure pct00012
Figure pct00013
서열번호 4 라카아제 5 아미노산
Figure pct00014
서열번호 5 라카아제 5 게놈 핵산 (GRMZM2G367668)
Figure pct00015
Figure pct00016
서열번호 6 라카아제 5 CDS 핵산
Figure pct00017
Figure pct00018
서열번호 7 STTM 핵산 서열
Figure pct00019
서열번호 8 STTM RNA 서열
Figure pct00020
서열번호 9 miR528 RNA 서열
Figure pct00021
서열번호 10 miR528 핵산 서열
Figure pct00022
서열번호 11: pCUB 벡터 서열
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
서열번호 12 (PCR 증폭 생성물)
Figure pct00032
Figure pct00033
서열번호 13 (miR528의 전구체의 핵산 서열)
Figure pct00034
서열번호 14 (miR528의 전구체 RNA)
Figure pct00035
서열번호 15 (miR528)
Figure pct00036
서열번호 16 (GRMZM2G367668 전사체의 상응하는 DNA)
Figure pct00037
Figure pct00038
서열번호 17 (GRMZM2G169033 전사체의 상응하는 DNA)
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
서열번호 18 (GRMZM2G169033 전사체를 위한 프로브)
Figure pct00042
서열번호 19 (GRMZM2G367668 전사체를 위한 프로브)
Figure pct00043
서열번호 31 (tracrRNA)
Figure pct00044
서열번호 32 (miR528a)
Figure pct00045
서열번호 33 (miR528a 표적 1)
Figure pct00046
서열번호 34 (miR528a 프로토스페이서 1)
Figure pct00047
서열번호 35 (miR528a 완전한 sgRNA 1)
Figure pct00048
서열번호 36 (miR528a 표적 2)
Figure pct00049
서열번호 37 (miR528a 프로토스페이서 2)
Figure pct00050
서열번호 38 (mi528a 완전한 sgRNA 2)
Figure pct00051
서열번호 39 (miR528b)
Figure pct00052
서열번호 40 (miR528b 표적 1)
Figure pct00053
서열번호 41 (miR528b 프로토스페이서 1)
Figure pct00054
서열번호 42 (mi528b 완전한 sgRNA 1)
Figure pct00055
서열번호 43 (miR528b 표적 2)
Figure pct00056
서열번호 44 (miR528b 프로토스페이서 2)
Figure pct00057
서열번호 45 (miR528b 완전한 sgRNA 2)
Figure pct00058
서열번호 46 (프로모터 서열 (ZmUbi) 가이드 Cas9)
Figure pct00059
Figure pct00060
서열번호 47 Cas9
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
서열번호 48 gRNA 서열
Figure pct00064
서열번호 49 miR528a 핵산 서열
Figure pct00065
서열번호 50 miR528b 핵산 서열
Figure pct00066
서열번호 51 Lac3 표적 1
Figure pct00067
서열번호 52 Lac3 프로토스페이서 1
Figure pct00068
서열번호 53 Lac3 완전한 sgRNA 1:
Figure pct00069
서열번호 54 Lac3 표적2
Figure pct00070
서열번호 55 Lac3 프로토스페이서 2
Figure pct00071
서열번호 56 Lac3 완전한 sgRNA 2:
Figure pct00072
서열번호 57 Lac5 표적1
Figure pct00073
서열번호 58 Lac5 프로토스페이서 1
Figure pct00074
서열번호 59 Lac5 완전한 sgRNA 1
Figure pct00075
서열번호 60 Lac5 표적2
Figure pct00076
서열번호 61 Lac5 프로토스페이서 2
Figure pct00077
서열번호 62 Lac5 완전한 sgRNA 2
Figure pct00078
서열번호 63 LbCpf1의 DNA 서열:
Figure pct00079
Figure pct00080
서열번호 64 LbCpf1의 단백질 서열:
Figure pct00081
서열번호 65 LAC3의 대체 서열 (볼드체는 인공 miR528 결합 부위이다):
Figure pct00082
서열번호 66 LAC3의 대체 서열 (볼드체는 인공 miR528 결합 부위이다):
Figure pct00083
서열번호 72 서열번호 35의 RNA 서열 (miR528a 완전한 sgRNA 1)
Figure pct00084
서열번호 73 서열번호 38의 RNA 서열 (mi528a 완전한 sgRNA 2)
Figure pct00085
서열번호 74 서열번호 42의 RNA 서열 (mi528b 완전한 sgRNA 1)
Figure pct00086
서열번호 75 서열번호 45의 RNA 서열 (miR528b 완전한 sgRNA 2)
Figure pct00087
서열번호 76 서열번호 53의 RNA 서열 (Lac3 완전한 sgRNA 1)
Figure pct00088
서열번호 77 서열번호 56의 RNA 서열 (Lac3 완전한 sgRNA 2)
Figure pct00089
서열번호 78 서열번호 59의 RNA 서열 (Lac5 완전한 sgRNA 1)
Figure pct00090
서열번호 79 서열번호 62의 RNA 서열 (Lac5 완전한 sgRNA 2)
Figure pct00091

Claims (108)

  1. 식물에서 내도복성 (resistance to lodging)을 변화시키는 방법으로서, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법이 식물에서 내도복성을 증가시키고, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 라카아제 유전자가 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 상기 핵산이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체 및/또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 라카아제 3을 암호화하는 핵산이 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 상기 라카아제 5를 암호화하는 핵산이 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현함을 포함하는, 방법.
  7. 제4항 또는 제6항에 있어서, 상기 조절 서열이 항상성 또는 강한 프로모터인, 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 miR528의 활성이 적어도 하나의 miR528 억제제를 사용하여 감소되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 miR528 억제제가 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자인, 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 돌연변이를 적어도 하나의 라카아제 유전자에 도입함을 포함하고, 상기 라카아제 폴리펩타이드가 상기 miR528 결합 부위 내 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고/하거나 miR528 및/또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 라카아제 유전자가 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택되고, 여기서, 상기 라카아제 3 유전자가 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 라카아제 5 유전자가 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 서열번호 3의 위치 1 내지 12로부터 선택되는 적어도 하나의 위치 또는 서열번호 2의 위치 191 내지 211로부터 선택되는 적어도 하나의 위치, 또는 서열번호 6의 위치 48 내지 68로부터 선택되는 적어도 하나의 위치로 도입되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 돌연변이가 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 돌연변이가 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입되는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 방법이 식물에서 내도복성을 감소시키고, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 증가시킴을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 라카아제 유전자가 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택되고, 여기서, 상기 라카아제 3 유전자가 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 라카아제 5 유전자가 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자 및/또는 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하고, 여기서, 상기 돌연변이가 야생형 또는 대조군 폴리펩타이드와 비교하여 라카아제 핵산의 발현을 감소시키는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 돌연변이가 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 방법이 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입되는, 방법.
  20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 방법이 RNA 간섭을 사용하여 적어도 하나의 라카아제 핵산, 바람직하게 라카아제 3 및/또는 5 핵산의 발현을 감소시키거나 폐지시킴을 포함하는, 방법.
  21. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 상기 핵산이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 10에 정의된 바와 같은 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는, 방법.
  22. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 방법이 서열번호 9를 포함하는 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 도입함을 포함하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 증가된 리그닌 함량을 갖는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준 및/또는 miR528의 발현 또는 활성이 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 변화되는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 뿌리 도복 저항성 (lodging resistance)이 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 변화되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 옥수수인, 방법.
  27. 수확량, 종자 품질 및 줄기 강도 중 적어도 하나를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  28. 식물에서 리그닌 함량을 변화시키는 방법으로서, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함하는, 방법.
  29. 유전학적으로 변화된 식물, 이의 일부 또는 식물 세포로서, 상기 식물이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 변화된 발현 또는 수준 및/또는 miR528의 변화된 발현 또는 활성을 특징으로 하는, 유전학적으로 변화된 식물, 이의 일부 또는 식물 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 식물이 변화된 리그닌 함량을 특징으로 하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 식물이 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여, 적어도 하나의 라카아제 유전자의 증가된 발현 및/또는 miR528의 감소된 발현 또는 활성을 특징으로 하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 식물이 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 발현하고, 여기서, 상기 핵산이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체 및/또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 라카아제 3을 암호화하는 핵산이 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 상기 라카아제 5를 암호화하는 핵산이 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  34. 제31항에 있어서, 상기 식물이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 작제물을 발현하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  35. 제32항 또는 제34항에 있어서, 상기 조절 서열이 항상성 또는 강한 프로모터인, 유전학적으로 변화된 식물.
  36. 제31항에 있어서, 상기 식물이 적어도 하나의 miR528 억제제를 발현하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 miR528 억제제가 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자인, 유전학적으로 변화된 식물.
  38. 제31항에 있어서, 상기 식물이 라카아제 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 중에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게, 여기서, 상기 라카아제 핵산이 라카아제 3 및 5로부터 선택되고, 상기 돌연변이가 miR528 결합 부위에 있고/있거나 miR528 및/또는 b 유전자 또는 miR528 프로모터 내의 적어도 하나의 돌연변이인, 유전학적으로 변화된 식물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 돌연변이가 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되는, 유전학적으로 변화된 식물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 돌연변이가 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입되는, 유전학적으로 변화된 식물.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이가 서열번호 3의 위치 1 내지 12로부터 선택되는 적어도 하나의 위치, 또는 서열번호 6의 위치 48 내지 68로부터 선택되는 적어도 하나의 위치로 도입되는, 유전학적으로 변화된 식물.
  42. 제31항에 있어서, 상기 식물이 적어도 하나의 miR528 억제제를 발현하고, 여기서, 상기 miR528 억제제가 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자인, 유전학적으로 변화된 식물.
  43. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 식물이 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여, 적어도 하나의 라카아제 유전자의 감소된 발현 및/또는 miR528의 증가된 발현 또는 활성을 특징으로 하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 식물이 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 발현하고, 여기서, 상기 핵산이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 10에 정의된 바와 같은 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하거나, 상기 식물이 서열번호 9를 포함하는 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 발현하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 식물이 라카아제 핵산을 암호화하는 적어도 하나의 핵산에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게, 여기서, 상기 라카아제 핵산이 라카아제 3 및 5로부터 선택되고, 상기 돌연변이가 야생형 또는 대조군 폴리펩타이드와 비교하여 라카아제 핵산의 발현을 감소시키는, 유전학적으로 변화된 식물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하고/하거나 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 돌연변이가 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되거나, 상기 돌연변이가 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입되는, 유전학적으로 변화된 식물.
  48. 제43항에 있어서, 상기 식물이 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 적어도 하나의 라카아제 3 및/또는 5 핵산의 발현을 감소시키는 RNAi 분자를 발현하는, 유전학적으로 변화된 식물.
  49. 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 옥수수인, 유전학적으로 변화된 식물.
  50. 식물에서 내도복성이 변화된 식물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현 또는 수준을 변화시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 변화시킴을 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 식물이 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 변화된 리그닌 함량을 갖는, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 식물이 식물에서 증가된 내도복성을 갖고, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 증가시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 상기 핵산이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 1에 정의된 바와 같은 라카아제 3 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체 및/또는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 라카아제 5 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 암호화하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 라카아제 3을 암호화하는 핵산이 서열번호 2 또는 3에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하고, 상기 라카아제 5를 암호화하는 핵산이 서열번호 5 또는 6에 정의된 바와 같은 서열 또는 이의 기능적 변이체 또는 동족체를 포함하는, 방법.
  55. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현함을 포함하는, 방법.
  56. 제53항 또는 제55항에 있어서, 상기 조절 서열이 항상성 또는 강한 프로모터인, 방법.
  57. 제52항에 있어서, 상기 miR528의 활성이 적어도 하나의 miR528 억제제를 사용하여 감소되는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 miR528 억제제가 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는 RNA 분자인, 방법.
  59. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하고, 여기서, 상기 라카아제 폴리펩타이드는 miR528 결합 부위에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 바람직하게 상기 라카아제 유전자는 라카아제 3 및 라카아제 5로부터 선택되고, 여기서, 상기 라카아제 3 유전자는 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 라카아제 5 유전자는 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 서열번호 3의 위치 1 내지 12로부터 선택되는 적어도 하나의 위치, 또는 서열번호 6의 위치 48 내지 68로부터 선택되는 적어도 하나의 위치로 도입되는, 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 돌연변이가 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되거나, 상기 돌연변이가 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입되는, 방법.
  62. 제50항에 있어서, 상기 식물이 감소된 내도복성을 갖고, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나 miR528의 발현 또는 활성을 증가시킴을 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 라카아제 유전자가 라카아제 3 및/또는 라카아제 5로부터 선택되고, 여기서, 상기 라카아제 3 유전자가 서열번호 1에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하고, 상기 라카아제 5 유전자가 서열번호 4에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는, 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 라카아제 유전자 및/또는 프로모터에 적어도 하나의 돌연변이를 도입함을 포함하고, 여기서, 상기 돌연변이가 야생형 또는 대조군 폴리펩타이드와 비교하여 라카아제 핵산의 발현을 감소시키는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 돌연변이가 표적화된 게놈 변형, 바람직하게 ZFN, TALEN 또는 CRISPR/Cas9를 사용하여 도입되거나, 상기 방법이 돌연변이유발, 바람직하게 TILLING 또는 T-DNA 삽입을 사용하여 도입되는, 방법.
  66. 제62항에 있어서, 상기 방법이 RNA 간섭을 사용하여 적어도 하나의 라카아제 핵산, 바람직하게 라카아제 3 및/또는 5 핵산의 발현을 감소시키거나 폐지시킴을 포함하는, 방법.
  67. 제62항에 있어서, 상기 방법이 적어도 하나의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 상기 핵산이 조절 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 10에 정의된 바와 같은 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 방법이 서열번호 9를 포함하는 miR528 또는 이의 기능적 변이체를 도입함을 포함하는, 방법.
  69. 제50항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 바람직하게 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여 도복에서의 변화를 측정함을 추가로 포함하는, 방법.
  70. 제50항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 식물을 재생하고 도복에서의 변화를 스크리닝함을 추가로 포함하는, 방법.
  71. 제50항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 옥수수인, 방법.
  72. 제50항 내지 제71항 중 어느 한 항에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 식물.
  73. 서열번호 7 또는 16에 정의된 바와 같은 miR528 억제제 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  74. 제73항의 핵산 작제물을 포함하는 벡터.
  75. 서열번호 8에 정의된 바와 같은 RNA 서열 또는 이의 기능적 변이체를 갖는 RNA 분자를 포함하는 miR528 억제제.
  76. 제73항의 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포, 제74항의 벡터 또는 제75항의 miR528 억제제.
  77. 제76항에 있어서, 상기 숙주 세포가 세균 또는 식물 세포인, 숙주 세포.
  78. 제73항의 핵산 작제물을 발현하는 형질전환 식물, 제74항의 벡터 또는 제75항의 miR528 억제제.
  79. 제78항에 있어서, 상기 식물이 옥수수인, 형질전환 식물.
  80. 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여, 식물에서 내도복성을 증가시키기 위한 제73항의 핵산 작제물, 제74항의 벡터 또는 제75항의 miR528 억제제의 용도.
  81. 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여, 식물에서 리그닌 합성을 조절하고, 리그닌 함량 및/또는 프로모터 리그닌 합성을 조절하기 위한 제73항의 핵산 작제물, 제74항의 벡터 또는 제75항의 miR528 억제제의 용도.
  82. 제81항에 있어서, 제73항의 핵산 작제물, 제74항의 벡터 또는 제75항의 miR528 억제제가 대조군 또는 야생형 식물과 비교하여, 식물에서 리그닌 합성을 증가시키고/시키거나 리그닌 함량을 증가시키는, 용도.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 리그닌 합성 및/또는 리그닌 함량이 식물 줄기 및/또는 뿌리에서 증가되는, 용도.
  84. 적어도 하나의 miR528 유전자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 DNA-결합 도메인 또는 적어도 하나의 라카아제 3 유전자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 DNA-결합 도메인 또는 적어도 하나의 라카아제 5 유전자에 결합할 수 있는 적어도 하나의 DNA-결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물.
  85. 제84항에 있어서, 상기 핵산 서열이 적어도 하나의 프로토스페이서 요소를 암호화하고, 상기 프로토스페이서 요소의 서열이 서열번호 34, 37, 41, 44 또는 52, 55, 58 또는 61 또는 서열번호 34, 37, 41, 44, 52, 55, 58 또는 61과 적어도 90% 동일한 서열로부터 선택되는, 핵산 작제물.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 작제물이 CRISPR RNA (crRNA) 서열을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서, 상기 crRNA 서열이 프로토스페이서 요소 서열 및 추가의 뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산 작제물.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 트랜스활성화 RNA (tracrRNA)를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하고, 여기서, 바람직하게 상기 tracrRNA가 서열번호 31로 정의되거나 또는 이의 기능적 변이체인, 핵산 작제물.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 적어도 하나의 단일-가이드 RNA (sgRNA)를 암호화하고, 상기 sgRNA가 tracrRNA 서열 및 crRNA 서열을 포함하고, 상기 sgRNA가 서열번호 35, 38, 42, 45 또는 53, 56, 58 또는 62로부터 선택되는 서열 또는 이의 기능적 변이체를 포함하거나 이들로 이루어진, 핵산 작제물.
  89. 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 프로모터에 의해 작동적으로 연결된, 핵산 작제물.
  90. 제89항에 있어서, 상기 프로모터가 항상성 프로모터인, 핵산 작제물.
  91. 제84항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 작제물이 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 핵산 작제물.
  92. 제91항에 있어서, 상기 CRISPR 효소가 Cas 또는 Cpf1 단백질인, 핵산 작제물.
  93. 제92항에 있어서, 상기 Cas 단백질이 Cas9 또는 이의 기능적 변이체인, 핵산 작제물.
  94. 제84항에 있어서, 상기 핵산 작제물이 TAL 이펙터를 암호화하는, 핵산 작제물.
  95. 제84항 또는 제94항에 있어서, 상기 핵산 작제물이 엔도뉴클레아제 또는 이의 DNA-절단 도메인을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 핵산 작제물.
  96. 제95항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제가 FokI인, 핵산 작제물.
  97. 단일 가이드 (sg) RNA 분자로서, 상기 sgRNA가 crRNA 서열 및 tracrRNA 서열을 포함하고, 상기 crRNA 서열이 서열번호 33, 36, 40, 43으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열 또는 서열번호 51, 54, 57 또는 60으로부터 선택되는 적어도 하나의 서열 또는 이의 변이체에 결합할 수 있는, 단일 가이드 (sg) RNA 분자.
  98. 제84항 내지 제96항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 핵산 작제물 또는 제97항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 sgRNA로 형질감염된 단리된 식물 세포.
  99. 제84항 내지 제90항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 핵산 작제물, 및 Cas 단백질, 바람직하게는 Cas9 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 핵산 작제물로 형질감염된 단리된 식물 세포.
  100. 제99항에 있어서, 상기 제2 핵산 작제물이 제84항 내지 제90항 중 어느 한 항의 핵산 작제물 전, 이후에 또는 이와 동시에 형질감염되는, 단리된 식물 세포.
  101. 유전학적으로 변형된 식물로서, 상기 식물이 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 형질감염된 세포를 포함하는, 유전학적으로 변형된 식물.
  102. 제101항에 있어서, sgRNA를 암호화하는 핵산 및/또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산이 안정한 형태로 통합되어 있는, 유전학적으로 변형된 식물.
  103. 식물에서 내도복성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 식물에서 제84항 내지 제96항 중 어느 한 항의 핵산 작제물 또는 제97항의 sgRNA를 도입하고 발현시킴을 포함하고, 여기서, 바람직하게 상기 증가가 대조군 또는 야생형 식물에 상대적인, 방법.
  104. 제103항의 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 식물.
  105. 식물에서 내도복성을 증가시키기 위한 제84항 내지 제96항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 작제물 또는 제97항의 sgRNA의 용도.
  106. 제105항에 있어서, 상기 핵산 작제물 또는 sgRNA가 식물에서 miRNA528의 발현 및/또는 활성을 감소시키는, 용도.
  107. 제31항에 정의된 바와 같은 유전학적으로 변형된 식물을 수득하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 하기의 단계를 포함하는, 방법:
    a) 식물의 일부를 선택하는 단계;
    b) 제84항 내지 제96항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 작제물 또는 제97항의 sgRNA 분자로 문단 (a)의 식물의 일부의 적어도 하나의 세포를 형질감염시키는 단계;
    c) 상기 형질감염된 세포 또는 세포들로부터 유래된 적어도 하나의 식물을 재생하는 단계;
    d) 상기 식물에서 적어도 하나의 miRNA528 핵산의 감소된 발현을 보여주는 문단 (c)에 따라 수득된 하나 이상의 식물을 선택하는 단계.
  108. 바람직하게 야생형 또는 대조군 식물과 비교하여 증가된 내도복성을 가질 식물을 동정하고/하거나 선택하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 식물 또는 식물 생식질에서 라카아제 3 유전자 및/또는 프로모터, 라카아제 5 유전자 및/또는 프로모터 또는 miR528a 및/또는 b 유전자 및/또는 프로모터에서 적어도 하나의 다형태 또는 돌연변이를 검출하는 단계로서, 상기 다형태 또는 돌연변이가 상기 돌연변이가 없는 식물과 비교하여 라카아제 3 및/또는 5의 증가된 발현 및/또는 miR528의 감소된 발현/활성을 유도하는, 단계; 및 상기 식물 또는 이의 후손을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
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