CN111630171A - 植物抗倒伏性 - Google Patents

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Abstract

提供改变玉米中抗倒伏性的方法，包括改变至少一种漆酶的表达或水平和/或改变miRNA528的表达或活性。还提供抗倒伏性改变的转基因植物及其制备方法。

Description

植物抗倒伏性
发明领域
本发明涉及改变在玉米中对倒伏的抗性的方法，具有改变的对倒伏的抗性的转基因植物以及制备这种植物的方法。
背景技术
玉米是世界上最重要的食粮之一，现今全世界约有三分之一人口以玉米作为主要食物。玉米的蛋白质含量高于大米，脂肪含量高于面粉、大米和小米，热量含量高于面粉、大米和高粱。因此，在许多发达地区，玉米是必不可少的食物。随着玉米加工业的发展，玉米的食用品质不断改善，新的玉米食品如玉米片、玉米面、玉米碴、特制玉米粉，速食玉米等，随之生产，其可进一步加工成面条、面包、饼干等。玉米也可以加工成玉米蛋白、玉米油、味精、酱油和白酒等。玉米也是饲料之王。据报道，100千克玉米的饲料价值相当于135千克燕麦，120千克高粱或150千克籼米。玉米的副产品秸秆或甚至整个植物(穗/穗轴加秸秆)也可制成青贮饲料。世界上约有65-70％的玉米都用作饲料，发达国家高达80％，是畜牧业赖以发展的重要基础。
为了获得高产，农民经常使用过量的化学氮肥。例如，在中国，合成氮肥的施用量从1977年的707万吨增加到2005年的2621万吨(Ju等，2009)。这些大量的外部氮输入加上氮利用效率的下降会导致环境问题(Ju等，2009；Guo等，2010；Liu等，2013)，并且还会因在“氮奢华(N-luxury)”条件下的倒伏导致产量损失(Zhang等，2016；Shah等，2017；Khan等，2018)。过量的N肥施用通过增加作物重心高度和通过降低茎杆直径和基部节间的细胞壁厚度而加剧差的抗倒伏性(Wang等，2012；Zhang等，2014)。然而，调控倒伏的分子机制仍有待探索。
谷物植物倒伏包括根倒伏和茎杆倒伏(Zhang等，2016)。茎杆强度在茎杆抗倒伏性中起重要作用(Zuber等，1999)。作为继纤维素之后第二丰富的生物聚合物，木质素对于茎杆硬度和强度以及抵抗害虫和病原体是重要的(Boerjan等，2003；Bhuiyan等，2009；Zhang等，2014；Barros等，2015)。木质素是通过以下三种木质素单体(monolignol)前体在植物细胞壁中的氧化聚合产生的类苯丙烷衍生聚合物：对-香豆基醇(p-coumaryl alcohol)(H单元)、松柏基醇(G单元)和芥子基醇(S单元)(Vanholme等，2008)。除过氧化物酶外，漆酶对于木质素通过木质素单体氧化聚合的木质素聚合作用也是必需的(Berthet等，2011；Zhao等，2013；Bryan等，2016)。
许多研究已经报道，木质素的生物合成可以通过修饰激活下游靶基因的转录因子的表达来改变。这些转录因子包括NAC、WRKY和MYB(Mitsuda等，2007；Zhou等，2009；Wang等，2010)。已知通过转录后基因沉默，翻译抑制或异染色质修饰，MicroRNA(miRNA)和其他小RNA对于基因调控是重要的(Vaucheret等，2006)。最近的研究发现，miR397和miR857分别在杨树和拟南芥中在木质素的生物合成和血管组织的继发生长中起重要作用(Lu等，2013；Wang等，2014；Zhao等，2015)。
miR528是单子叶植物特异性的miRNA。在水稻中，miR528靶向L-抗坏血酸氧化酶(AO)、类质体蓝蛋白、RING-H2指E3泛素连接酶VirE2相互作用蛋白2、F-box结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白DWARF3(Wu等，2017)。当水稻被病毒感染时，miR528优先与AGO18结合，导致增强的AO活性，更高的基础活性氧种类积累和增强的抗病毒防御能力(Wu等，2017)。水稻miR528的组成型表达通过抑制AAO(抗坏血酸氧化酶)和CBP1(铜离子结合蛋白1)的转录来增强匍匐翦股颖中对盐分胁迫和氮饥饿的耐受性(Yuan等，2015)。但是，miR528在玉米中的功能意义尚不清楚，因为ZmmiR528的预测潜在靶标与水稻中的不同。
因此，需要调节有价值的农作物如玉米的倒伏。本发明解决了这一需求。
发明内容
在本申请中，我们描述了改善植物抗倒伏性的方法。倒伏通常发生在生长季节的后期，此时植物大到足以被吹倒(并且已经花费大量资源来种植农作物)，并且可能使农作物完全无法通过机械手段收割。因此，防止倒伏具有巨大的经济意义。此外，除非倒伏情况发生在生长季节，否则培育者、农民、农作物测试者等难以确定品种是否抗倒伏。因此，如果出现倒伏情况，则能够确定单个植物或品种是否会抵抗倒伏，也很有价值。
我们发现，玉米中木质素的组成和含量受氮供应的显著影响，并且ZmLACCASE3(ZmLAC3)和ZmLACCASE5(ZmLAC5)是ZmmiR528的真正靶标。我们表明漆酶，特别是LAC3(ZmMZS)和LAC5参与木质素聚合的调控，导致木质素含量的变化，从而导致植物的机械强度发生变化。我们表明，这些漆酶的过表达促进植物中木质素含量的增加，从而提高抗倒伏性。相反，抑制漆酶的表达可以降低植物中木质素的含量，其增加植物作为生产生物能源的原料和家畜饲料的用途。我们还证明ZmmiR528通过负调控ZmLAC3和ZmLAC5 mRNA的丰度，影响玉米木质素的生物合成和抗倒伏性。
在本发明的一个方面，提供了改变对植物倒伏的抗性的方法，该方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平和/或改变miR528的表达或活性。
在一个优选的实施方案中，该方法通过增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性来提高对植物倒伏的抗性。更优选地，所述漆酶基因选自漆酶3和漆酶5。
在一个实施方案中，该方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO：1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物，和/或如SEQ ID NO：4中定义的漆酶5多肽或其功能性变体或同源物。
在一个优选的实施方案中，编码漆酶3的核酸包含如SEQ ID NO：2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，其中编码漆酶5的核酸包含如SEQ ID NO：5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
在另一个实施方案中，所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至调控序列的如SEQ ID NO：7或16中定义的核酸序列或其功能变体。
在优选的实施方案中，所述调控序列是组成型启动子或强启动子。
在一个实施方案中，miR528的活性是使用至少一个miR528抑制剂降低的。优选地，所述miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO：8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
在一个备选的实施方案中，该方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因中，其中所述漆酶多肽在miR528结合位点中包含至少一个突变。优选地，所述漆酶基因选自漆酶3和漆酶5。更优选地，所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO：1定义的多肽，和所述漆酶5基因编码如SEQ ID NO：4中定义的多肽。甚至更优选地，所述编码漆酶3的核酸包含如SEQ IDNO：2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，其中编码漆酶5的核酸包含如SEQ ID NO：5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
在一个实施方案中，将至少一个突变引入选自SEQ ID NO：3的位置1至12的至少一个位置处，或选自SEQ ID NO：2的位置191至211的至少一个位置处，或选自SEQ ID NO：6的位置48至68的至少一个位置处。更优选地，所述突变使用靶向基因组修饰(优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9)引入。备选地，所述突变使用诱变(优选TILLING或T-DNA插入)引入。
在备选的实施方案中，所述方法通过降低至少一个漆酶基因的表达和/或增加miR528的表达或活性来降低对植物倒伏的抗性。
在一个实施方案中，所述漆酶基因选自漆酶3和漆酶5。更优选地，所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO：1定义的多肽，和所述漆酶5基因编码如SEQ ID NO：4中定义的多肽。甚至更优选地，所述编码漆酶3的核酸包含如SEQ ID NO：2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，其中编码漆酶5的核酸包含如SEQ ID NO：5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
在一个实施方案中，该方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因和/或启动子中，其中与野生型或对照多肽相比，所述突变降低了所述漆酶核酸的表达。在另一个实施方案中，该方法包括将至少一个突变引入miR528和/或b基因或miR528启动子中，优选使得miR528的表达(前体序列或成熟序列减少或消除)。
优选地，所述突变是使用靶向基因组修饰(优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9)引入的。备选地，所述突变是使用诱变(优选TILLING或T-DNA插入）引入的。
在一个备选的实施方案中，所述方法包括使用RNA干扰来减少或消除至少一个漆酶核酸(优选漆酶3和/或5核酸)的表达。
在一个实施方案中，所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO：10中定义的miR528或其功能变体。备选地，所述方法包括引入包含SEQ ID NO：9(或15)的miR528或其功能变体。
优选地，与对照或野生型植物相比，所述植物的特征在于增加的木质素含量。
在一个实施方案中，与野生型或对照植物相比，至少一个漆酶基因的表达或水平和/或miR528的表达或活性改变。在另一个实施方案中，与对照或野生型植物相比，根抗倒伏性改变。
在本发明的另一方面，提供了增加产量、种子品质和茎杆强度中的至少一种的方法，所述方法包括增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性。
在本发明的另一方面，提供了改变植物中木质素含量的方法，所述方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平和/或改变miR528的表达或活性。
在本发明的另一方面，提供了基因改变的植物、其一部分或植物细胞，其中所述植物的特征在于至少一个漆酶基因的表达或水平的改变和/或miR528的表达或活性的改变。在一个备选的实施方案中，所述植物的特征在于木质素含量改变。
在一个实施方案中，所述植物的特征在于与野生型或对照植物相比，至少一个漆酶基因的表达增加和/或miR528的表达或活性降低。
优选地，所述植物表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO：1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物，和/或编码如SEQ ID NO：4中定义的漆酶5多肽或其功能性变体或同源物的核酸。
更优选地，编码漆酶3的核酸包含如SEQ ID NO：2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，其中编码漆酶5的核酸包含如SEQ ID NO：5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
在另一个实施方案中，所述植物表达至少一种miR528抑制剂。在一个实施方案中，所述植物表达核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至调控序列的如SEQ ID NO：7或16中定义的核酸序列或其功能变体。在另一个实施方案中，所述植物表达至少一种miR528抑制剂，其中所述miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO：8所定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
在另一个实施方案中，所述植物在至少一个编码漆酶核酸的核酸中包含至少一个突变，优选其中所述漆酶核酸选自漆酶3和5，并且其中所述突变在miR528结合位点中。优选地，所述突变使用靶向基因组修饰(优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9)引入。备选地，所述突变使用诱变(优选TILLING或T-DNA插入)引入。
在一个实施方案中，所述突变在选自SEQ ID NO：3的位置1至12的至少一个位置处或选自SEQ ID NO：6的位置48至68的至少一个位置处引入。
在一个实施方案中，所述植物的特征在于，与野生型或对照植物相比，至少一个漆酶基因的表达降低和/或miR528的表达或活性增加。
在一个实施方案中，所述植物表达核酸构建体，所述核酸构建体包含编码至少一个miR528的核酸序列。优选地，所述miR528是可操作地连接至调控序列的如SEQ ID NO：10中所定义的或其功能性变体，或者其中所述植物表达包含SEQ ID NO：9的miR528或其功能变体。
优选地，所述植物在至少一个编码漆酶核酸的核酸中包含至少一个突变，优选地，其中所述漆酶核酸选自漆酶3和5，并且其中与野生型或对照多肽相比，所述突变降低所述漆酶核酸的表达。更优选地，所述核酸编码如SEQ ID NO：1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物，和/或编码如SEQ ID NO：4中定义的漆酶5多肽或功能变体或其同源物的核酸。
在另一个实施方案中，植物包括在miR528和/或b基因或miR528启动子中的至少一个突变，优选使得miR528的表达(前体序列或成熟序列减少或消除)。
在一个实施方案中，所述突变是使用靶向基因组修饰(优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9)引入的，或者其中所述突变是使用诱变(优选TILLING或T-DNA插入)引入的。
在另一个实施方案中，与野生型或对照植物相比，所述植物表达降低至少一个漆酶3和/或5核酸的表达的RNAi分子。
在一个优选的实施方案中，所述植物是玉米。
在本发明的另一方面，提供了产生具有改变的对植物倒伏的抗性的植物的方法，所述方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平和/或改变miR528的表达或活性。在一个实施方案中，与野生型或对照植物相比，所述植物具有改变的木质素含量。更优选地，所述植物具有增加的对植物倒伏的抗性，并且所述方法包括增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性。
在一个实施方案中，该方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO：1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物和/或如SEQ ID NO：4中定义的漆酶5多肽或其功能性变体或同源物。优选地，编码漆酶3的核酸包含如SEQ ID NO：2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，并且其中编码漆酶5的核酸包含如SEQ ID NO：5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
在一个实施方案中，所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至调控序列的如SEQ ID NO：7或16中定义的核酸序列或其功能变体。优选地，所述调控序列是组成型启动子或强启动子。
在一个备选的实施方案中，使用至少一种miR528抑制剂，降低miR528的活性。优选地，所述miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO：8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
在另一个备选的实施方案中，所述方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因中，其中所述漆酶多肽在miR528结合位点中包含至少一个突变，其中优选地所述漆酶基因选自漆酶3和漆酶5，并且其中所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO：1定义的多肽，其中所述漆酶5基因编码如SEQ ID NO：4中定义的多肽。在一个优选的实施方案中，至少一个突变在选自SEQ ID NO：3的位置1至12的至少一个位置处或选自SEQ ID NO：6的位置48至68的至少一个位置处引入。
在一个实施方案中，所述突变是使用靶向基因组修饰(优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9)引入的，或者其中所述突变是使用诱变(优选TILLING或T-DNA插入)引入的。
在另一个实施方案中，所述植物具有降低的对倒伏的抗性，并且其中所述方法包括降低至少一个漆酶基因的表达和/或提高miR528的表达或活性。优选地，所述漆酶基因选自漆酶3和/或漆酶5，且其中所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO：1定义的多肽，并且其中漆酶5基因编码如SEQ ID NO：4中定义的多肽。
在一个实施方案中，该方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因和/或启动子中，其中与野生型或对照多肽相比，所述突变降低了所述漆酶核酸的表达。
优选地，所述突变是使用靶向基因组修饰(优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9)引入的，或者其中所述方法是使用诱变(优选TILLING或T-DNA插入)引入的。在一个备选的实施方案中，所述方法包括使用RNA干扰来减少或消除至少一个漆酶核酸(优选漆酶3和/或5核酸)的表达。
在另一个实施方案中，所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO：10中定义的miR528或其功能变体。备选地，所述方法包括引入包含SEQ ID NO：9或15的miR528或其功能变体。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括测量倒伏的变化，优选与对照或野生型植物相比。更优选地，所述方法进一步包括使植物再生并筛选倒伏的改变。
在一个优选的实施方案中，所述植物是玉米。
在本发明的另一方面，提供了通过上述任何方法获得或可获得的植物。
在另一方面，提供了核酸构建体，其包含编码如SEQ ID NO：7或16中定义的miR528抑制剂或其功能变体的核酸序列。还提供了包含本文描述的核酸构建体的载体。
在另一方面，提供了miR528抑制剂，其包含具有如SEQ ID NO：8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
在本发明的另一方面，提供了宿主细胞，其包含如本文所述的核酸构建体，如本文所述的载体或如本文所述的miR528抑制剂。优选地，所述宿主细胞是细菌或植物细胞。
在另一方面，提供了表达如本文所述的核酸构建体、载体或miR528抑制剂的转基因植物。最优选地，所述植物是玉米。
在另一方面，提供如本文所述的核酸构建体、载体或miR528抑制剂，与对照或野生型植物相比，提高植物抗倒伏性的用途。还提供了如本文所述的核酸构建体、载体或miR528抑制剂，与对照或野生型植物相比，在植物中调节木质素合成、调节木质素含量和/或促进木质素合成中的用途。优选地，与对照或野生型植物相比，所述核酸构建体、载体或miR528抑制剂增加植物中木质素的合成和/或增加木质素的含量。更优选地，植物茎杆和/或根中木质素合成和/或木质素含量增加。最优选地，所述植物是玉米。
在本发明的另一方面，提供了核酸构建体，其包含编码能够结合至少一个miR528基因的至少一个DNA结合结构域的核酸序列。备选地，提供了核酸构建体，其包含编码至少一个DNA结合结构域的核酸序列，所述DNA结合结构域能够与LAC3或LAC5基因结合并抑制或阻止miR528在miR528结合位点的结合。更优选地，漆酶活性不受影响。
在一个实施方案中，所述核酸序列编码至少一个原间隔子元件，其中所述原间隔子元件的序列选自SEQ ID NO：34、37、41、44或其变体。在另一个实施方案中，所述核酸序列编码至少一个原间隔子元件，其中所述原间隔子元件的序列选自SEQ ID NO：52、55、58、61或其变体。
在另一个优选的实施方案中，所述构建体还包含编码CRISPR RNA(crRNA)序列的核酸序列，其中所述crRNA序列包含原间隔子元件序列和额外的核苷酸。
更优选地，所述构建体进一步包含编码反式激活RNA(tracrRNA)的核酸序列，其中优选地所述tracrRNA是SEQ ID NO：31中定义的或其功能变体。
在另一个实施方案中，所述构建体编码至少一个单向导RNA(sgRNA)，其中所述sgRNA包含所述tracrRNA序列和所述crRNA序列。在一个实施方案中，所述sgRNA包含选自SEQ ID NO：35、38、42、45的序列或其功能变体或由其组成。在另一个实施方案中，所述sgRNA包含选自SEQ ID NO：53、56、59或62的序列或其功能变体或由其组成。
在一个实施方案中，原间隔子元件或sgRNA可操作地连接至调控序列，其中优选地所述调控序列是启动子，更优选地是组成型启动子。
在另一个实施方案中，所述核酸构建体进一步包含编码CRISPR酶的核酸序列。优选地，所述CRISPR酶是Cas或Cpf1蛋白。更优选地，所述Cas蛋白是Cas9或其功能变体。
在一个备选的实施方案中，所述核酸构建体编码TAL效应子。优选地，所述核酸构建体进一步包含编码核酸内切酶或其DNA切割结构域的序列。更优选地，所述核酸内切酶是FokI。
在本发明的另一方面，提供了单向导(sg)RNA分子，其中所述sgRNA包含crRNA序列和tracrRNA序列。在一个实施方案中，所述crRNA序列能够结合选自SEQ ID NO：33、36、40、43的至少一个序列或其变体。在另一个实施方案中，所述crRNA序列能够结合选自SEQ IDNO：51、54、57或60的至少一个序列或其变体。
在另一方面，提供了用至少一个本文所述的核酸构建体或至少一个本文所述的sgRNA转染的分离的植物细胞。在一个实施方案中，所述分离的植物细胞用至少一个包含本文所述的原间隔子元件或sgRNA的核酸构建体和第二核酸构建体转染，其中所述第二核酸构建体包含编码Cas蛋白(优选Cas9蛋白或其功能变体)的核酸序列。在该实施方案中，所述第二核酸构建体在sgRNA构建体之前、之后或同时转染。
在本发明的另一方面，提供了基因修饰的植物，其中所述植物包含本文所述的经转染的细胞。在一个实施方案中，编码所述sgRNA的核酸和/或编码Cas蛋白的核酸以稳定形式整合。
在本发明的另一方面，提供了提高对植物倒伏的抗性的方法，所述方法包括在植物中引入并表达本文所述的核酸构建体或本文所述的sgRNA，其中优选地所述提高是相对于对照或野生型植物的。
在另一方面，提供了通过本文描述的任何方法获得或可获得的植物。
在另一方面，提供了本文所述的核酸构建体或本文所述的sgRNA在提高对植物倒伏的抗性中的用途。优选地，所述核酸构建体或sgRNA降低植物中miRNA528的表达和/或活性。
在本发明的另一方面，提供了用于获得本文所述的基因修饰的植物的方法，所述方法包括：
a)选择植物部分；
b)用本文所述的核酸构建体或本文所述的sgRNA分子转染段落(a)的所述植物部分的至少一个细胞；
c)使至少一个源自经转染的细胞的植物再生；
d)选择根据段落(c)获得的一个或更多个植物，所述植物在所述植物中显示至少一种miRNA528核酸的表达降低。
在另一方面，提供了用于鉴定和/或选择具有，优选地与野生型或对照植物相比，提高的抗倒伏性的植物的方法，所述方法包括在植物或植物种质中检测漆酶3基因和/或启动子、漆酶5基因和/或启动子或miR528a和/或b基因和/或启动子中的至少一个多态性或突变，其中与没有所述突变的植物相比，所述多态性或突变导致漆酶3和/或5的表达增加和/或miR528的表达/活性降低；并选择所述植物或其后代。
在本发明的另一方面，提供了蛋白质，其是
(a)蛋白质，其包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或
(b)植物木质素合成相关蛋白，其具有通过以下方式源自SEQ ID NO：1的氨基酸序列：在、从或向如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中置换和/或缺失和/或添加一个或更多个氨基酸残基。
还提供上述蛋白质的编码基因，其中优选地所述编码基因是选自以下任一个的DNA分子：
(1)具有如SEQ ID NO：3所示的编码区的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)的DNA序列杂交并编码植物木质素合成相关蛋白的DNA分子；和
(3)与(1)的DNA序列至少90％同源的且编码植物木质素合成相关蛋白的DNA分子。
还提供了包含上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌株。
在本发明的另一方面，提供了本文所述的蛋白质在以下至少一个中的用途：
(d1)植物中木质素合成的调节；
(d2)植物茎杆中木质素合成的调节；
(d3)植物中木质素含量的调节；
(d4)植物茎杆中木质素含量的调节；
(d5)植物中木质素合成的促进；
(d6)植物茎杆中木质素合成的促进；
(d7)植物中木质素含量增加的促进；和
(d8)植物茎杆中木质素含量增加的促进。
还提供了生产转基因植物的方法，其包括以下步骤：将上述基因导入出发植物中，以获得转基因植物，其中与出发植物相比，所述转基因植物在具有(f1)和(f2)的表型，其中(f1)为增加的木质素含量；或(f2)增加的茎杆中木质素含量。
还提供了生产转基因植物的方法，其包括以下步骤：在出发植物中抑制上述基因的表达以获得转基因植物，其中与出发植物相比，所述转基因植物至少具有(f1)和(f2)的表型，其中(f1)为降低的木质素含量；或(f2)降低的茎杆中木质素含量。
还提供了通过增加靶植物中本文所述蛋白质的含量和/或活性，从而增加靶植物中木质素含量或增加靶植物的茎杆中木质素含量的植物培育方法。
还提供了通过降低靶植物中本文所述蛋白质的含量和/或活性，从而降低靶植物中木质素含量或降低靶植物的茎杆中木质素含量的植物培育方法。
还提供上述蛋白质、基因、重组表达载体或上述方法在植物培育中的用途。
在本发明的另一方面，提供了用于培育具有不同木质素含量的转基因植物的方法。在一个实施方案中，提供用于培育具有降低的木质素含量的植物的方法，所述方法包括以下步骤：将特异DNA分子I引入出发植物中，以获得具有低于出发植物的木质素含量的转基因植物，其中特异DNA分子I是DNA分子A或DNA分子B，其中所述DNA分子A编码具有如SEQID NO：15或9所示的序列的miRNA，并且DNA分子B编码具有SEQ ID NO：15或9所示序列的miRNA的前体RNA。
还提供上述方法，其中“具有SEQ ID NO：15或9所示序列的miRNA的前体RNA”是具有SEQ ID NO：14所示序列的RNA。
一方面，所述特异DNA分子I具体地可以是具有SEQ ID NO：13所示序列的DNA分子。
在另一个实施方案中，所述特异DNA分子具体地可以通过重组质粒I引入出发植物。重组质粒I可以具体地是通过将所述特异DNA分子I插入到pCUB载体的Bam HI切割位点而获得的重组质粒。
在另一个实施方案中，从上述方法获得的转基因植物具有降低的木质素含量和降低的茎秆穿刺强度，并且可用作生产生物能源的原料。
还提供了一种用于培育具有增加的木质素含量的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：将特异DNA分子II引入出发植物中以获得具有高于所述出发植物的木质素含量的转基因植物，其中所述特异DNA分子II是抑制具有SEQ ID NO：15或9所示序列的miRNA的表达的DNA分子。在一个实施方案中，所述特异DNA分子II具体地可以是具有SEQ ID NO：7所示序列的DNA分子。
在另一个实施方案中，特异DNA分子II具体地可以通过重组质粒II引入所述出发植物中。所述重组质粒II可以具体地是通过将特异DNA分子II插入pCUB载体的Bam HI切割位点而获得的重组质粒。
在另一个实施方案中，从上述方法获得的转基因植物具有增加的木质素含量、增加的茎秆穿刺强度和改善的抗倒伏性。
在一个实施方案中，上述植物中的任何出发植物可以是单子叶植物。所述单子叶植物可以是禾本科植物，尤其是玉米，例如玉米品种31。
在本发明的另一方面，提供了具有如SEQ ID NO：15或9所示的序列的miRNA。还提供了具有如SEQ ID NO：15或9所示的序列的miRNA的前体RNA。优选地，所述前体RNA具体是具有SEQ ID NO：14所示序列的RNA。
还提供了具有如SEQ ID NO：14所示的序列的RNA。
还提供了编码具有SEQ ID NO：15或9所示序列的miRNA的基因或具有SEQ ID NO：14所示序列的RNA的基因。.优选地，所述基因具体是具有SEQ ID NO：13所示序列的DNA分子。
还提供了包含上述基因的重组载体。
还提供了上述miRNA、RNA或基因在木质素含量降低的植物培育中的用途。
在本发明的另一方面，提供对上述miRNA或RNA的表达具有抑制的物质在具有增加的木质素含量的植物的培育中的用途。
还提供了包含本发明基因的重组载体。所述重组载体具体是通过将基因插入pCUB载体的Bam HI切割位点而获得的重组质粒。还提供包含具有SEQ ID NO：5所示序列的DNA分子的重组质粒。
在另一方面，提供了对具有SEQ ID NO：15或9所示序列的miRNA或具有SEQ ID NO：14所示序列的RNA的表达具有抑制的化合物在培育具有增加的木质素含量的植物中的用途。对具有SEQ ID NO：15或9所示序列的miRNA或具有SEQ ID NO：14所示序列的RNA的表达具有抑制的化合物具体是干扰载体。所述干扰载体是含有具有SEQ ID NO：7所示序列的DNA分子的重组质粒。所述干扰载体具体是重组质粒，其通过将具有SEQ ID NO：7所示序列的DNA分子插入pCUB载体的Bam HI切割位点而获得。
还提供了重组质粒(干扰载体)，其是含有具有SEQ ID NO：7所示序列的DNA分子的重组质粒。所述干扰载体具体是重组质粒，其通过将具有SEQ ID NO：7所示序列的DNA分子插入pCUB载体的Bam HI切割位点而获得。
上述任何植物可以是单子叶植物。所述单子叶植物可以是禾本科植物，尤其是玉米，例如玉米品种31。
附图说明
在以下非限制性附图中进一步描述了本发明：
图1显示实施例1中ZmMZS基因的相对表达水平。
图2显示实施例1中组织学染色后的显微照片。
图3显示实施例1中确定的木质素含量。
图4显示实施例2中的根的组织学染色后的显微照片。
图5显示实施例2中第一节间的组织学染色后的显微照片。
图6显示实施例2中确定的木质素含量。
图7显示鉴定的miRNA表达水平。
图8显示中根部分的组织学染色后的显微照片。
图9显示第一个节间的组织学染色后的显微照片。
图10显示确定的木质素含量。
图11显示确定的茎秆的穿刺强度。
图12显示盆栽试验中抽雄期的植物照片。
图13显示Northern Blot分析的结果。
图14显示氮供应对ZmmiR528和ZmLACs表达的调节。通过氮供应来调节(A)ZmmiR528和(B和C)靶标。将植物在含有0.02、2或4mM Ca(NO3)2的营养液中水培生长指定的时间，然后从叶和根中分离出RNA。ZmmiR528及其靶标的表达水平被标准化至ZmUBQ1。NL、NS和ND分别表示氮奢华、氮充足和氮不足。值是四次生物学重复的平均值±SE。根据最小显著差异(LSD)测试，具有相同字母的平均值在p＜0.01时无显著差异。
图15显示ZmLAC3和ZmLAC5受ZmmiR528调节。(A)在本氏烟草(N.benthamiana)叶中，含有ZmMIR528b和ZmLAC3或ZmLAC5的构建体的共表达。通过实时RT-PCR确定的表达水平被标准化至烟草18S rRNA的表达水平。值是三次生物学重复的平均值±SE。根据LSD测试，具有相同字母的均值在p＜0.01时无显著差异。(B)通过5′RACE确定的ZmLAC3和ZmLAC5mRNA切割位点。数字表示每个位点的切割频率。
图16显示了通过原位杂交分析确定的ZmmiR528和ZmLAC5的表达模式。水培玉米的根、茎秆和枝条中(A)ZmmiR528和(B)ZmLAC5转录本的积累。相应的有义探针用作阴性对照。拍摄代表性植物。(A)和(B)中的比例尺分别代表100μm和50μm。
图17显示玉米抗倒伏性受ZmmiR528丰度的影响。(A)土壤生长的ZmmiR528过表达的转基因玉米比野生型或转基因ZmmiR528敲除系对N-奢华条件下的倒伏更为敏感。拍摄代表性植物。WT，野生型。(B)ZmmiR528丰度对土壤生长的玉米茎秆的耐皮透度计抗性(rindpenetrometer resistance)的影响。测量了每种基因型的十株植物。(C和D)ZmmiR528丰度对土壤生长的玉米的茎秆中AcBr木质素(C)、纤维素和半纤维素(D)含量的影响。DW代表干重。值是四次生物学重复的平均值±SE。根据LSD测试，具有相同字母的平均值在p＜0.01时无显著差异。(E)WT、TM和OE转基因玉米中的ZmmiR528水平，如小RNA northern印迹所示。在每个泳道上样来自每个样品的5微克小RNA。U6显示为上样对照。每个泳道下方的数字表示相对表达率。(F)ZmmiR528丰度对AcBr木质素含量的影响，值是四次生物学重复的平均值±标准误差。DW代表干重。根据LSD测试，具有相同字母的均值在P＜0.01时无显著差异。(G)如实时RT-PCR所示，WT、TM和OE转基因玉米中相应的ZmLAC3和ZmLAC5基因转录本的检测。将定量标准化至ZmUBQ1的表达。值是三次生物学重复的平均值±标准误差。根据LSD测试，具有相同字母的均值在P＜0.01时无显著差异。
图18显示ZmLAC3过表达增加土壤生长的玉米中木质素的含量。(A)ZmLAC3过表达的转基因玉米的茎秆的间苯三酚染色。拍摄代表性植物。比例尺代表75μm。(B-E)ZmLAC3过表达的转基因玉米的AcBr木质素含量(B)、耐皮透度计抗性(C)、纤维素含量(D)和半纤维素含量(E)。DW代表干重。值是四次生物学重复的平均值±SE。根据LSD测试，具有相同字母的平均值在p＜0.01时无显著差异。
图19显示(A)ZmLAC3OE转基因玉米中ZmLAC3的mRNA水平。将实时RT-PCR定量标准化至ZmUBQ1的表达。值是四次生物学重复的平均值±标准误差。根据LSD测试，具有相同字母的均值在P＜0.01时无显著差异。还显示(B)ZmLAC3OE转基因玉米中的ZmPALs转录本。将表达水平标准化至ZmUBQ1的表达水平。值是三次生物学重复的平均值±标准误差。根据LSD测试，具有相同字母的平均值在P＜0.01时无显著差异。
图20显示了氮供应对WT、TM和OE转基因玉米中ZmPAL转录水平的影响。ZmmiR528丰度和氮供应对ZmPAL转录水平的影响。将表达水平标准化至ZmUBQ1的表达水平。值是三次生物学重复的平均值±SE。根据LSD测试，具有相同字母的均值在p＜0.01时无显著差异。NL、NS和ND分别表示氮奢华、氮充足和氮不足。
图21显示用于ZmmiR528在氮奢华条件下在玉米抗倒伏性中作用的建议的模型。miR528水平的提高以及ZmLACs和ZmPALs丰度的降低可能解释玉米在氮奢华条件下的抗倒伏性降低。箭头表示正调节，而平头的条表示抑制。
图22显示了实施例7中使用的sgRNA和hSpCas9的示意图。
图23显示了miR527敲低的转基因植物与易倒伏植物杂交对抗倒伏性的影响。
发明详述
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，将更详细地限定本发明的不同方面。如此限定的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合，除非明确地相反地指出。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他一个或更多个特征组合。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术、生物信息学的在本领域技术范围内的常规技术。文献中对这些技术进行了充分的解释。
如本文所用，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，以及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物。其可以是单链或双链的。此类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列，反义序列和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列。这些术语也包括基因。术语“基因”或“基因序列”广泛地用于指代与生物学功能相关的DNA核酸。因此，基因可以如基因组序列中那样包含内含子和外显子，或者可以如cDNA中那样仅包含编码序列，和/或可以包括与调控序列组合的cDNA。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键连接在一起的任何长度的聚合形式的氨基酸。
术语“miR528”是指micro(mi)RNA分子。成熟miR528的RNA序列如SEQ ID NO：9和15中所示。编码成熟miR528的DNA序列如SEQ ID NO：10中所示。在一个实例中，miR528是玉米miR528，在本文中也称为“ZmmiR528”。玉米中有两个miR528成员-miR528a和miR528b，每个成员由不同的基因座编码。每个基因座产生具有不同前体序列的miR528(分别对应于miR528a和b显示为SEQ ID NO：32和39)，尽管产生的成熟序列是相同的。术语“前体”是指前体RNA或前体miRNA，其在宿主细胞内加工以产生短的、部分双链的RNA，其中一条链是成熟的miRNA。
本发明的方面涉及重组DNA技术，并且排除了仅基于通过传统培育方法产生植物的实施方案。
在本发明的一个方面，提供了改变对植物倒伏的抗性的方法，该方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平和/或改变miR528的表达或活性。
在一个实施方案中，“改变”可意味着提高对倒伏的抗性。在一个备选的实施方案中，“改变”可以意味着降低对倒伏的抗性。在一个实施例中，提高或降低可以，与对照植物相比，高达或至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90或95％或更多。在一个实例中，提高的水平可以在12％与20％之间。
在一个实施方案中，对倒伏的抗性在高氮或富氮条件下改变。在一个实例中，高氮可以认为是高于300kg尿素/公顷。在一个备选的实施方案中，对倒伏的抗性在正常(例如240-300kg尿素/公顷)或低氮条件(180kg尿素/公顷或更低，优选在180和120之间kg尿素/公顷)下改变。
如本文所用，术语“对倒伏的抗性”或“抗倒伏性”也可被称为“可收获性”，并且可指植物茎秆的弯曲或折断或植物的倾斜。备选地，对倒伏的抗性的提高可以被认为等同于倒伏的减少，并且对倒伏的抗性的降低可以被认为等同于倒伏的增加。
在一个实施方案中，在植物的茎秆和/或植物的根中倒伏增加或减少。
在一个实例中，倒伏的严重性可以通过图可视化评分，在该图中，茎(stalk)倒伏通过在穗处或穗下方的茎的断裂可以看到，并且根倒伏通过以超过30℃的角度倾斜的玉米茎秆可以看到。
在另一个实例中，可以从茎强度的度量确定抗倒伏性。茎强度的一种度量是皮穿透力或耐皮透度计抗性或RPR(这是用长钉或针刺穿茎皮所需的力的度量)。大量研究表明，皮穿透抗性与田间茎倒伏呈负相关。在一个实施方案中，RPR可以提高或降低，与对照植物相比，高达或至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90或95％或更多。在一个实例中，提高的水平可以在12％与20％之间。
在另一个实例中，抗倒伏性可以通过植物中，优选植物的茎秆和/或根中木质素含量的增加来确定。作为继纤维素之后第二丰富的生物聚合物，木质素对于茎杆硬度和强度以及抵抗害虫和病原体是重要的(Boerjan等，2003；Bhuiyan等，2009；Zhang等，2014；Barros等，2015)。木质素是通过以下三种木质素单体(monolignol)前体在植物细胞壁中的氧化聚合产生的类苯丙烷衍生聚合物：对-香豆基醇(p-coumaryl alcohol)(H单元)、松柏基醇(G单元)和芥子基醇(S单元)(Vanholme等，2008)。在一个实例中，为了确定总的木质素聚合物含量，将植物材料通过乙酰溴(AcBr)进行水解，并分析木质素的含量。这被称为AcBr方法，Fukushima和Hatfield(2004)对此进行了描述。在一个实施方案中，木质素含量可以提高或降低，与对照植物相比，高达或至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90或95％或更多。在一个实例中，提高的水平可以在12％与20％之间。
在另一个实例中，抗倒伏性可以通过植物，优选植物的茎秆和/或根中纤维素和/或半纤维素含量的增加来确定。在一实例中，纤维素和/或半纤维素含量可使用改良的NREL程序(如Sluuiter等，2008中所述)来确定。在一个实施方案中，纤维素和/或半纤维素的含量可以提高或降低，与对照植物相比，高达或至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90或95％或更多。在一个实例中，提高的水平可以在12％与20％之间。
因此，在一个实例中，抗倒伏性可以通过以下任一项或组合的测量来确定：倒伏严重度的视觉评分、耐皮透度计抗性、木质素含量和/或纤维素/半纤维素含量。测量抗倒伏性的其他参数是技术人员已知的。
在一个实施方案中，该方法通过增加至少一个漆酶基因的水平或表达来增加对植物倒伏的抗性。
在本发明的另一方面，提供了增加产量和/或茎秆强度的方法，特别是在倒伏条件下或当植物已经暴露于会在野生型或对照植物中导致倒伏的条件下时，所述方法包括增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性。在一个实例中，倒伏条件是会在野生型或对照植物中导致倒伏的任何环境条件，例如大风、降雨、人口过多、风暴破坏等。
术语“产量”通常是指通常与特定作物、地区和一段时间有关的可测量的经济价值产品。各个植物部分根据其数量、大小和/或重量直接贡献产量。实际产量是每年农作物的每平方米产量，由每年的总产量(包括收获和评估的产量)除以种植的平方米来确定。
相对于对照或野生型植物，产量增加。例如，与对照或野生型植物相比，产量增加2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
在本发明的另一方面，提供改变植物中木质素含量的方法，所述方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平和/或改变miR528的表达或活性。在一个优选的实施方案中，该方法包括增加植物中，优选植物的茎秆或根中木质素的含量，该方法包括增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性。在一个实施方案中，与对照植物相比，木质素含量可以增加或降低高达或至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90或95％或更多。
如本文所用，“增加表达”是指核苷酸水平的增加，而如本文所用“增加水平”是指至少一个漆酶的蛋白质水平的增加。在一个实施方案中，与野生型或对照植物中的水平相比，至少一种漆酶的表达或水平或活性增加高达或大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。确定漆酶核苷酸表达或蛋白质水平的方法是技术人员众所周知的。特别地，增加可以通过技术人员已知的任何标准技术来测量。例如，漆酶的表达和/或蛋白质水平的增加可包括蛋白质和/或核酸水平的测量，并且可以通过技术人员已知的任何技术来测量，例如但不限于凝胶电泳或色谱法(例如HPLC)的任何形式。
漆酶是含铜的氧化酶。如本文所用，漆酶也可以是指植物木质素合成相关蛋白。在一个优选的实施方案中，所述漆酶选自漆酶3(或LAC3)和漆酶5(或LAC5)。在一个实施方案中，植物是玉米，且漆酶可以是指ZmLACCASE 3(ZmLAC3)或ZmLACCASE 5(ZmLAC5)。备选地，ZmLAC3在本文中可以是指ZmMNS或ZmMZS。
在本发明的一个方面，提供了漆酶蛋白，其中该蛋白是
(a)蛋白质，其包含如SEQ ID NO：1或4所示的氨基酸序列；或
(b)植物木质素合成相关蛋白，其具有通过以下方式源自SEQ ID NO：1的氨基酸序列：在、从或向如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中置换和/或缺失和/或添加一个或更多个氨基酸残基。
为了便于纯化和检测(b)中的蛋白质，可以将包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的N或C末端与表1所示的标签附接。
表1标签序列：
Figure BDA0002515773860000211
Figure BDA0002515773860000221
(b)中的蛋白质可以是人工合成的，或者通过合成其编码基因然后进行生物学表达而获得。(b)中蛋白质的编码基因可以通过缺失如SEQ ID NO：3所示的DNA序列中一个或更多个氨基酸残基的密码子和/或经历如SEQ ID NO：3所示的DNA序列中一个或多个碱基对的错义突变，和/或将如上表1所示的标签附到其编码序列的5′和/或3′末端而获得。
在本发明的另一方面，还提供了分离的漆酶核酸或DNA分子。在一个实施方案中，所述DNA分子选自以下任一项：
(1)具有如SEQ ID NO：3或6所示的编码区的DNA分子；
(2)具有SEQ ID NO：2或5所示的基因组序列的DNA分子。
(3)在严格条件下与(1)或(2)的DNA序列杂交并编码植物木质素合成相关或漆酶蛋白的DNA分子；和
(4)DNA分子，其与(1)、(2)或(3)的DNA序列具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同源性(或“同一性”)，并编码植物木质素合成相关蛋白或漆酶。
优选地，严格条件可包括在65℃的DNA或RNA杂交实验中在0.1x SSPE(或0.1xSSC)和0.1％SDS溶液中杂交并洗涤。
在本发明的另一方面，提供了包含本文所述的蛋白质、核酸或DNA分子，优选ZmMZS，的重组表达载体(本文也称为“核酸构建体”)、表达盒、转基因细胞系或重组菌株。
可以通过使用现有的表达载体来构建包含如本文所述的漆酶核酸(优选LAC3(优选ZmMZS)或LAC5)的重组表达载体。表达载体包括二元根癌农杆菌载体或用于微粒轰击的载体。当用漆酶基因构建重组表达载体时，任何增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子均可以在转录起始核苷酸之前连接，其可以单独使用或与其他植物启动子结合使用。此外，当用漆酶基因构建重组表达载体时，可以包括增强子，包括翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域的起始密码子，但是它们需要与编码序列阅读框相同，以确保整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子是广泛可用的，并且可以是天然的或合成的。翻译起始区可以来自转录起始区或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如添加在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。考虑到转基因的安全性，可不加选择性标记基因，直接通过表型选择转化植物或微生物。
具体地，重组表达载体可以是重组质粒pCUB-ZmMZS，其通过将如SEQ ID NO：2、3、5或6所示的DNA分子插入pCUB载体的Bam HI切割位点而获得。
在一个实施方案中，该方法包括引入和表达包含至少一个核酸的核酸构建体，其中所述核酸编码可操作地连接至调控序列的如上所述的漆酶3和/或漆酶5多肽。上述核酸构建体的使用导致在引入核酸的植物中表达，优选过表达漆酶3和/或漆酶5。
优选地，漆酶3多肽如SEQ ID NO：1中定义的或其功能变体或同源物。因此，在一个实施方案中，漆酶3核酸编码如SEQ ID NO：1中定义的多肽或其变体。更优选地，漆酶3核酸包含SEQ ID NO：2或3或其功能变体，或由其组成。
优选地，漆酶5多肽如SEQ ID NO：4中定义的或其功能变体或同源物。因此，在一个实施方案中，漆酶5核酸编码如SEQ ID NO：4中定义的多肽或其变体。更优选地，漆酶5核酸包含SEQ ID NO：5或6或其功能变体或同源物，或由其组成。
关于SEQ ID NO：1至47中的任一个，如本文所使用的，术语“变体”或“功能变体”是指保留完整的非变体序列的生物学功能的变体基因序列或基因序列的一部分。功能变体还包括目的基因的变体，其具有不影响功能的序列改变，例如在非保守残基中。还涵盖了基本上相同的变体，即仅具有一些序列变化，例如在非保守残基中，与本文所示的野生型序列相比，并且具有生物活性。导致在给定位点产生不影响编码的多肽的功能特性的不同氨基酸的核酸序列的改变是本领域众所周知的。例如，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较小的残基(例如甘氨酸)或疏水性更大的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子置换。类似地，导致将一个带负电荷的残基置换为另一个的带负电荷的残基(例如将天冬氨酸置换为谷氨酸)或者将一个带正电荷的残基替换为另一个的带正电荷的残基(例如将赖氨酸置换为精氨酸)的变化也可以预期产生功能上等效的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分的改变的核苷酸变化也不会被期望改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一个均在本领域的常规技术范围内，如编码产物的生物学活性的保留所确定的。
如本文所述的本发明的任何方面中所使用的，“变体”或“功能变体”具有与非变体核酸或氨基酸序列至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％总序列同一性。
如果两个核酸序列或多肽中核苷酸或氨基酸残基序列按如下所述进行最大对应性的比对时分别是相同的，则这两个核苷酸序列或多肽被称为“相同”。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分数是指两个或更多个相同或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的序列或亚序列，在比较窗口中进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的。当关于蛋白质或肽使用序列同一性的百分比时，应认识到不相同的残基位置通常因保守的氨基酸置换而有所不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能特性。如果序列在保守置换中不同，则可以向上调整序列同一性百分比以校正置换的保守性质。进行这种调整的手段是本领域技术人员众所周知的。为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定备选的参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的非限制性实例是BLAST和BLAST 2.0算法。
在另一个实施方案中，本文使用的变体可以包含编码本文定义的漆酶多肽的核酸序列，该核酸序列能够在本文定义的严格条件下与SEQ ID NO：2、3、5或6中的任一个杂交。
这些序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样的条件，在该条件下探针将与其靶序列可检测的杂交程度比与其他序列大(例如，比背景高至少2倍)。严格条件取决于序列，并且在不同情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，从而检测到更低程度的相似度(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，优选地小于500个核苷酸。
典型地，严格条件将是其中盐浓度小于约1.5M Na离子，通常在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度至少约30℃的条件，对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度至少约60℃。杂交的持续时间通常小于约24小时，通常为约4至12小时。严格的条件也可通过添加去稳定剂如甲酰胺达到。在一个实例中，严格条件可包括在65℃的DNA或RNA杂交实验中在0.1x SPPE(或0.1xSSC)和0.1％SDS溶液中杂交并洗涤。
根据本发明的所有方面，包括以上方法以及包括如下所述的植物、方法和用途，术语“调控序列”在本文中与“启动子”可互换使用，并且所有术语在广义上是指能够影响其连接序列表达的调控核酸序列。术语“调控序列”还涵盖赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成融合分子或衍生物。
在一个实施方案中，所述启动子可以是组成型启动子或强启动子。
“组成型启动子”是指在至少一个细胞、组织或器官中，在大多数但不一定是所有阶段的生长和发育中以及在大多数环境条件下具有转录活性的启动子。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S或19S)、水稻肌动蛋白启动子、玉米泛素启动子、二磷酸核酮糖氧合酶(rubisco)小亚基、玉米或苜蓿H3组蛋白、OCS、SAD1或2、GOS2或任何使表达增强的启动子。
“强启动子”是指导致基因增加或过表达的启动子。强启动子的实例包括但不限于CaMV-35S、CaMV-35Somega、拟南芥泛素UBQ1、水稻泛素、肌动蛋白或玉米醇脱氢酶1启动子(Adh-1)。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动目的基因的转录。
在一个实施方案中，后代植物用本文所述的核酸构建体稳定转化，并包含可遗传地保留在植物细胞中的外源多核苷酸。该方法可以包括验证该构建体被稳定整合的步骤。该方法还可包括从选定的后代植物中收集种子的额外步骤。
在另一个实施方案中，该方法通过降低miR528的表达或活性来增加对植物倒伏的抗性。
miR528是单子叶植物特异性的miRNA。在水稻中，miR528靶向L-抗坏血酸氧化酶(AO)、类质体蓝蛋白、RING-H2指E3泛素连接酶VirE2相互作用蛋白2、F-box结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白DWARF3(Wu等，2017)。当水稻被病毒感染时，miR528优先与AGO18结合，导致增强的AO活性，更高的基础活性氧种类积累和增强的抗病毒防御能力(Wu等，2017)。水稻miR528的组成型表达通过抑制AAO(抗坏血酸氧化酶)和CBP1(铜离子结合蛋白1)的转录来增强匍匐翦股颖中对盐分胁迫和氮饥饿的耐受性(Yuan等，2015)。但是，miR528在玉米中的功能意义尚不清楚，因为ZmmiR528的预测潜在靶标与水稻中的靶标不同。此外，玉米中有两个miR528成员-miR528a和miR528b，每个成员由不同的基因座编码。尽管产生的成熟序列是相同的(成熟miR528的RNA和DNA序列分别显示在SEQ ID NO：9和10中)，每个基因座均产生具有不同前体序列(本文为SEQ ID NO：32和39)的miR528。在这里，我们表明玉米中木质素的组成和含量受氮供应的显著影响，且ZmLACCASE3(ZmLAC3)和ZmLACCASE5(ZmLAC5)是ZmmiR528的真正靶标。我们还证明了，通过负调控ZmLAC3和ZmLAC5 mRNA的丰度，ZmmiR528影响玉米木质素的生物合成和抗倒伏性。
miR528的“降低表达”是指与对照植物相比，miR528的核苷酸(DNA或RNA)水平降低。在一实例中，miR528的活性可以通过测量漆酶3和/5蛋白或RNA水平来评估。在一个实施方案中，与野生型或对照植物中的水平相比，至少一种miR528的表达或活性降低高达或大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。“消除”表示没有miR528被表达或可检测地表达。确定miR528核苷酸表达的方法是技术人员众所周知的。特别地，可以通过技术人员已知的任何标准技术来测量降低。例如，表达水平的降低可以包括核酸水平的测量，并且可以通过技术人员已知的任何技术来测量，例如但不限于凝胶电泳或色谱法(例如HPLC)的任何形式。
在一个实施方案中，该方法可包括将至少一个突变引入至少一种miR528基因(例如本文所述的至少一种前体序列或成熟miR528序列，例如SEQ ID NO：32、39、49或50)和/或启动子序列，使得miR528不被表达(即表达被消除)或表达被降低，如本文所定义的。备选地，可以将至少一个突变引入miR528，使得经改变的基因不表达功能性产物，即它不能结合至LAC3和/或LAC5。以这种方式，可以认为miR528的活性被降低或消除。优选地，miR528的表达被消除。以这种方式，该突变是敲除突变。
在一个备选的实施方案中，降低miR528的活性可能涉及使miR528与其靶标-LAC3和LAC5结合的位点突变，从而使miR528无法结合和降解LAC3和/或LAC5 mRNA。反过来，这将导致LAC3和LAC5的蛋白质水平增加。
因此，在一个实施方案中，该方法包括将至少一个突变引入至少一种漆酶基因的miR528结合位点。最优选地，该方法包括将至少一个突变引入LAC3和/或LAC5的miR528结合位点。在一个实施方案中，将突变引入LAC3和LAC5 miR528结合位点。
LAC3中的miR528结合位点如下：
CUCUGCUGCAUGCCCCUUCGA(SEQ ID NO：20)
LAC5中的miR528结合位点如下：
CUUCUCCGCAUGUCCCUUCCU(SEQ ID NO：21)
优选地，该突变是阻止miR528结合至LAC3和/或LAC5的任何突变。在一实例中，所述突变可选自上述SEQ ID NO：20和/或21中一个或多个核苷酸的缺失、插入和置换。在一个实例中，缺失或插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一个实施方案中，该突变是沉默突变。更优选地，该突变也不影响蛋白质的漆酶(例如氧化酶)活性。
在一个实施方案中，突变使用诱变或靶向基因组编辑来引入。也就是说，在一个实施方案中，本发明涉及一种方法和通过如上所述的基因工程方法产生的植物，并且不包括天然存在的品种。
靶向基因组修饰或靶向基因组编辑是使用靶向DNA双链断裂(DSB)通过同源重组(HR)介导的重组事件来刺激基因组编辑的基因组工程技术。为了通过引入位点特异性DNADSB实现有效的基因组编辑，可以使用四类主要的可定制DNA结合蛋白：源自微生物移动遗传元件的大范围核酸酶，基于真核转录因子的ZF核酸酶，来自黄杆菌属(Xanthomonas)细菌的转录激活因子样效应物(TALE)，以及来自II型细菌适应性免疫系统CRISPR(聚簇的规则间隔的短回文重复序列)的RNA引导的DNA核酸内切酶Cas9。大范围核酸酶、ZF和TALE蛋白都通过蛋白质-DNA相互作用识别特异性DNA序列。尽管大范围核酸酶整合核酸酶和DNA结合结构域，但ZF和TALE蛋白由分别靶向DNA的3个或1个核苷酸(nt)的单个模块组成。ZF和TALE可以以所需的组合进行组装，并连接至FokI的核酸酶结构域，以将溶核活性导向特异性基因组位点。
通过细菌III型分泌系统递送到宿主细胞后，TAL效应子进入细胞核，与宿主基因启动子中的效应子特异性序列结合并激活转录。它们的靶向特异性由串联的中央结构域(33-35个氨基酸重复序列)决定。随后是20个氨基酸的单独截短重复序列。检查的大多数天然存在的TAL效应子具有12至27个完整重复序列。
这些重复的彼此之间的区别仅在于两个相邻的氨基酸，即它们的重复可变双残基(RVD)。RVD，其决定TAL效应子将识别是哪个单核苷酸：一个RVD对应一个核苷酸，四个最常见的RVD每个优先与四个碱基之一关联。天然存在的识别位点统一在TAL效应子活性所需的T之前。可以将TAL效应子融合到FokI核酸酶的催化结构域上，以创建TAL效应子核酸酶(TALEN)，其使靶向DNA双链断裂(DSB)在体内用于基因组编辑。该技术在基因组编辑中的使用在本领域中有很好的描述，例如在US 8,440,431，US 8,440,432和US 8,450,471中。Cermak T等描述了一组定制质粒，其可与金门克隆方法一起使用以组装多个DNA片段。如其中所述，金门方法使用IIS型限制性核酸内切酶，该酶在其识别位点外切割，以产生独特的4bp突出端。通过在同一反应混合物中消化和连接，可以加快克隆速度，因为正确的组装可以消除酶识别位点。定制TALEN或TAL效应子构建体的组装涉及两个步骤：(i)将重复模块组装成1-10个重复的中间阵列，以及(ii)将中间阵列连接到骨架中，以形成最终构建体。因此，使用本领域已知的技术，可以设计靶向如本文所述的miR528基因或启动子或LAC3和/或LAC5中的miR528结合序列的TAL效应子。
可以根据本发明的各个方面使用的另一种基因组编辑方法是CRISPR。该技术在基因组编辑中的使用在本领域中有很好的描述，例如在US 8,697,359和本文引用的参考文献中。简而言之，CRISPR是一种参与防御入侵的噬菌体和质粒的微生物核酸酶系统。微生物宿主中的CRISPR基因座包含CRISPR相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR介导的核酸切割(sgRNA)特异性的非编码RNA元件的组合。三种类型的(I-III)CRISPR系统已经在广泛的细菌宿主中鉴定出。每个CRISPR基因座的一个关键特征是存在一系列重复序列(直接重复)，这些重复序列由短段的非重复序列(间隔子)隔开。非编码CRISPR阵列被转录并在直接重复序列中切割成短crRNA，该短crRNA包含独立的间隔子序列，将Cas核酸酶引导至靶位点(原间隔子)。II型CRISPR是表征得最好的系统之一，可按四个连续步骤进行靶向DNA双链断裂。首先，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA，即pre-crRNA阵列和tracrRNA。第二，tracrRNA与pre-crRNA的重复区域杂交，并介导pre-crRNA的加工为成熟的含有单个间隔子序列的crRNA。第三，成熟的crRNA：tracrRNA复合体通过crRNA上的间隔子和与原间隔子相邻基序(PAM)相邻的靶DNA上的原间隔子之间的Watson-Crick碱基配对，将Cas9引导至靶标DNA，这是对靶标识别的附加要求。最终，Cas9介导了靶DNA的分离以在原间隔子内产生了一条双链断裂。
与传统的基因靶向和其他可编程核酸内切酶相比，CRISPR-Cas9系统的一个主要优势是易于多路复用，其中多个基因可以简单地通过使用分别靶向不同基因的多个sgRNA进行同时突变。另外，在基因组区域侧翼使用两个sgRNA的情况下，中间部分可以删除或倒置(Wiles等，2015)。
因此，Cas9是II型CRISPR-Cas系统的标志性蛋白，是一种大型单体DNA核酸酶，通过两个非编码RNA：CRISPR RNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)的复合体引导至与PAM(原间隔子相邻基序)序列基序相邻的DNA靶序列。Cas9蛋白包含两个与RuvC和HNH核酸酶同源的核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补的DNA链，而RuvC样结构域切割非互补的链，结果，平切(blunt cut)被引入到靶DNA中。Cas9的异源表达与sgRNA一起可以将位点特异性双链断裂(DSB)引入来自各种生物的活细胞的基因组DNA中。对于在真核生物中的应用，已经使用了最初来自细菌化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9的密码子优化版本。
单向导RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas系统的第二个组分，其与Cas9核酸酶形成复合体。sgRNA是通过将crRNA与tracrRNA融合而产生的合成RNA嵌合体。位于其5′端的sgRNA引导序列赋予DNA靶标特异性。因此，通过修饰向导序列，可能创建具有不同靶标特异性的sgRNA。向导序列的标准长度是20bp。在植物中，sgRNA已经使用植物RNA聚合酶III启动子(例如U6和U3)而被表达。因此，使用本领域已知的技术，可能设计靶向miR528a和/或b或LAC3和/或LAC5基因中的miR528结合位点的sgRNA分子。可以根据本文描述的方法使用的此类合适的CRISPR构建体的实例在下文描述。
在一个实施方案中，该方法使用下文详细定义的sgRNA(和模板或供体DNA)构建体，以便将靶向的SNP或突变引入miR528基因。优选地，该突变减少或消除miR528的表达。备选地，由于突变，miR528不再能够与LAC 3和/或5结合。如下所述，在双链DNA中sgRNA介导的剪接之后，模板DNA链的引入可用于使用同源性指导的修复在基因中产生特异性的靶向突变(即SNP)。
在另一个实例中，sgRNA(例如，如本文所述)可与修饰的Cas9蛋白一起使用，修饰的Cas9蛋白为诸如融合到“碱基编辑器”的切口酶Cas9或nCas9或“死”Cas9(dCas9)，“碱基编辑器”为诸如酶，例如脱氨酶，诸如胞苷脱氨酶或TadA(tRNA腺苷脱氨酶)或ADAR或APOBEC。这些酶能够用一个碱基替代另一个。结果DNA没有缺失，但进行了单个置换(Kim等人，2017；Gaudelli等2017)。
在一个实例中，使用如本文所述的以下sgRNA序列将突变引入miRNA528a和/或miRNA528b中，所述sgRNA序列如SEQ ID NO：35、38、42和/或45所示。
在另一个实施方案中，该方法使用如本文所述的sgRNA构建体，以将至少一个突变引入LAC3和/或LAC5基因中的miRNA528结合位点。备选地，可以使用CRISPR系统用人工序列或供体序列替换LAC3或LAC5中的miRNA528结合位点。优选地，人工序列在miRNA结合位点中包含至少一个突变，该突变是同义突变(即，改变核酸序列但不改变氨基酸序列)。因此，miRNA528不能结合或以较低的效率结合，但是漆酶的蛋白质功能不受影响。如本文所述，以这种方式，miRNA528的活性可以认为是降低的。使用CRISPR引入靶向DNA替换或供体序列的方法是本领域已知的(参见例如Zhao等2016和Zhang等2018)。然而，在一个实例中，提供了sgRNA构建体，其中该sgRNA构建体包含靶向(能够结合)选自SEQ ID NO：51(LAC3)，54(LAC3)，57(LAC5)或和60(LAC5)或其变体(如上定义)的至少一个序列的至少一个核酸序列。sgRNA构建体更优选包含至少一个原间隔子序列，其中所述原间隔子序列选自SEQ IDNO：52(LAC3)、55(LAC3)、58(LAC5)和61(LAC5)。甚至更优选地，sgRNA构建体包含编码选自SEQ ID NO：53(LAC3)，56(LAC3)，59(LAC5)和62(LAC5)之一或其变体的sgRNA的核酸序列。所述核酸序列优选可操作地连接至调控序列，例如启动子，其实例在本文中描述。sgRNA构建体还可包含本文所述的CRISPR酶，例如Cas，优选Cas 9或Cpf1。在该实例中，其中靶序列选自SEQ ID NO：51(LAC3)或57(LAC5)，或原间隔子序列选自SEQ ID NO：52(LAC3)或SEQ IDNO：58(LAC5)，或sgRNA核酸序列选自SEQ ID NO：53(LAC3)或SEQ ID NO：59(LAC5)，CRISPR酶是Cas蛋白，优选Cas9。备选地，其中靶序列选自SEQ ID NO：54(LAC3)或60(LAC5)，或原间隔子序列选自SEQ ID NO：55(LAC3)或SEQ ID NO：61(LAC5)，或sgRNA核酸序列选自SEQ IDNO：56(LAC3)或SEQ ID NO：562(LAC5)，CRISPR酶是Cpf1。
此外，还提供了包含供体序列的供体序列构建体，以替换LAC3或LAC5基因中的miRNA528结合位点。在一个实例中，供体序列包含SEQ ID NO：65，优选其中靶标是LAC3。在另一个实例中，供体序列包含SEQ ID NO：66，优选其中靶序列是LAC5。在一个优选的实例中，所述供体序列可操作地连接至调控序列，例如本文所述的任何启动子。然而，在一个备选的实施方案中，所述供体序列可以存在于与sgRNA序列相同的构建体上，并且在相同或分开的调控序列的控制下。
“crRNA”或CRISPR RNA是指包含原间隔子元件和与tracrRNA互补的额外核苷酸的RNA序列。
“tracrRNA”(反式激活RNA)是指与crRNA杂交并结合CRISPR酶(如Cas9)从而激活核酸酶复合体以在至少一个miRNA528核酸或启动子序列的基因组序列内的特定位点处引入双链断裂的RNA的序列。
“原间隔子元件”是指与基因组DNA靶序列互补的crRNA(或sgRNA)部分，通常长度约为20个核苷酸。这也可以称为间隔子或靶向序列。
“sgRNA”(单向导RNA)是指tracrRNA和crRNA在单个RNA分子中的组合，优选还包括连接环(将tracrRNA和crRNA连接成单个分子)。“sgRNA”也可以称为“gRNA”，且在本文中，这些术语是可互换的。sgRNA或gRNA为Cas或Cpf1核酸酶提供靶向特异性和支架/结合能力。gRNA可以指包含crRNA分子和tracrRNA分子的双重RNA分子。
“供体序列”是指这样的核酸序列，其包含所有必需元件，以将特定的置换或序列引入靶序列，优选使用同源性指导的修复或HDR。在一个实施方案中，供体序列的侧翼为至少一个，优选地分别与靶序列相同的左臂和右臂。所述一个或更多个臂的进一步的侧翼可以是两个包含PAM基序的gRNA靶序列，使得供体序列可以被Cas9/gRNA释放。
“TAL效应子”(转录激活因子样(TAL)效应子)或TALE是指能够结合基因组DNA靶序列(例如，miRNA528基因或启动子内的序列或LAC3或LAC5中的miR528结合位点)并且能够被融合至核酸内切酶(例如FokI)的切割结构域以创建TAL效应子核酸酶，或被融合至TALENS或大范围核酸酶的切割结构域以创建megaTAL，的蛋白质序列。TALE蛋白由负责DNA结合的中央结构域、核定位信号和激活靶基因转录的结构域组成。DNA结合结构域由单体组成，每个单体可以结合靶核苷酸序列中的一个核苷酸。单体是33-35个氨基酸的串联重复序列，其中位于12和13位的两个氨基酸高度可变(重复可变双残基，RVD)。RVD负责识别单个特定核苷酸。HD靶向胞嘧啶；NI靶向腺嘌呤，NG靶向胸腺嘧啶，而NN靶向鸟嘌呤(尽管NN也可以以较低的特异性结合腺嘌呤)。
在本发明的另一方面，提供了核酸构建体，其中所述核酸构建体编码至少一个DNA结合结构域，其中所述DNA结合结构域可以结合miRNA528基因中的序列，其中所述序列选自SEQ ID NO：33、36、40或43。在本发明的另一方面，提供了编码至少一个DNA结合结构域的核酸构建体，其中所述DNA结合结构域能够结合LAC3或LAC5基因中的序列，其中优选地，所述序列选自SEQ ID NO：51(LAC3)、54(LAC3)、57(LAC5)和60(LAC5)。
在一个实施方案中，所述构建体进一步包含编码(SSN)序列特异性核酸酶(例如FokI或CRISPR酶，例如Cas或Cpf1蛋白)的核酸。
在一个实施方案中，该核酸构建体编码至少一个原间隔子元件，其中该原间隔子元件的序列选自SEQ ID NO 34、37、41、44或其变体。备选地，至少一个原间隔子元件选自SEQ ID NO：52、55、58和61或其变体。
在另一个实施方案中，核酸构建体包含crRNA编码序列。如上文所定义，crRNA序列可包含如上文所定义的原间隔子元件，并且优选地包含与tracrRNA互补的额外核苷酸。额外核苷酸的合适序列是技术人员已知的，因为这些是通过Cas或Cpf1蛋白的选择来限定的。然而，在一个实例中，crRNA的序列或额外核苷酸序列包含SEQ ID NO：48或其变体。
在另一个实施方案中，核酸构建体进一步包含tracrRNA序列。再次，合适的tracrRNA序列对于技术人员会是已知的，因为该序列是通过Cas蛋白的选择来限定的。然而，在一个实例中，所述序列包含SEQ ID NO：31所定义的序列或其变体，或由其组成。
在另一个实施方案中，核酸构建体包含至少一个编码sgRNA(或gRNA)的核酸序列。再次，如已经讨论的，sgRNA通常包含crRNA序列、tracrRNA序列，且优选包含接头环的序列。在一个实例中，sgRNA序列包含SEQ ID NO：48或其变体，并且优选地原间隔子序列，例如本文中所定义的任何序列。在一个优选的实施方案中，核酸构建体包含至少一个核酸序列，所述核酸序列编码如SEQ ID NO：35、38、42、45中的任一个所定义的sgRNA序列或其变体。在另一个实施方案中，核酸构建体包含至少一个核酸序列，所述核酸序列编码如SEQ ID NO：53、56、59和62中的任一个所定义的sgRNA序列或其变体。
在另一个实施方案中，核酸构建体可以进一步包含至少一个编码核糖核酸内切酶切割位点的核酸序列。优选地，核糖核酸内切酶是Csy4(也称为Cas6f)。当核酸构建体包含多个sgRNA核酸序列时，构建体可以包含相同数目的核糖核酸内切酶切割位点。在另一个实施方案中，切割位点是sgRNA核酸序列的5′。因此，每个sgRNA核酸序列的侧翼是核糖核酸内切酶切割位点。
全文使用的术语“变体”是指核苷酸序列，其中所述核苷酸与上述序列之一基本相同。该变体可以通过修饰，例如一个或更多个核苷酸的插入、置换或缺失来实现。在优选的实施方案中，所述变体与上述序列的任一个具有至少50％，至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。在一实施方案中，序列同一性是至少90％。在另一个实施方案中，序列同一性是100％。序列同一性可以通过本领域中任一种已知的序列比对程序来确定。
本发明还涉及核酸构建体，其包含可操作地连接至合适的植物启动子的这些核酸序列之一。合适的植物启动子可以是组成型启动子或强启动子，或者可以是组织特异性启动子。在一个实施方案中，合适的植物启动子选自但不限于夜香树黄叶卷曲病毒(CmYLCV)启动子或柳枝稷泛素1启动子(PvUbi1)小麦U6 RNA聚合酶III(TaU6)CaMV35S、小麦U6或玉米泛素(例如Ubi1)启动子。在一个实施方案中，启动子是ZmUbi(SEQ ID NO：46)。
本发明的核酸构建体还可以进一步包含编码CRISPR酶的核酸序列。“CRISPR酶”是指能够与CRISPR系统相关联的RNA导向的DNA核酸内切酶。具体地说，这种酶与tracrRNA序列结合。在一个实施方案中，CRIPSR酶是Cas蛋白(“CRISPR相关蛋白”)，优选Cas 9或Cpf1，更优选Cas9。在一个具体的实施方案中，Cas9是密码子优化的Cas9，并且更优选，具有SEQID NO：47中所述的序列或其功能变体或同源物。在一个备选实施方案中，CRISPR酶是Cpf1，并且包含编码如SEQ ID NO：64中定义的Cpf1蛋白或其功能变体或同源物的核酸序列。更优选地，Cpf1序列包含SEQ ID NO：63或其功能变体或同源物，或由其组成。在另一个实施方案中，CRISPR酶是来自2类候选蛋白家族的蛋白，例如C2c1、C2C2和/或C2c3。在一个实施方案中，Cas蛋白来自化脓性链球菌。在一个备选的实施方案中，Cas蛋白可以来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitide)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)或密螺旋体(Treponema denticola)中的任一种。
如本文中关于Cas9或Cpf1所用的术语“功能变体”是指保留完整非变体序列的生物学功能(例如充当DNA核酸内切酶，或识别或/和与DNA结合)的变体Cas9或Cpf1基因序列或其基因序列的一部分。功能变体还包括目的基因的变体，其具有不影响功能的序列改变，例如非保守残基。还涵盖了基本上相同的变体，即仅具有一些序列变化，例如在非保守残基中，与本文所示的野生型序列相比，并且具有生物活性。在一个实施方案中，SEQ ID NO.47或63的功能变体与SEQ ID NO：47或63表示的氨基酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的整体序列同一性。在另一个实施方案中，Cas9蛋白已经被修饰以提高活性。
合适的同源物或直系同源物可以通过序列比较和保守域的鉴定来鉴定。同源物或直系同源物的功能可以如本文所述进行鉴定，因此技术人员将能够在植物中表达时确认其功能。
在另一个实施方案中，Cas9蛋白已经被修饰以提高活性。例如，在一个实施方案中，Cas9蛋白可包含D10A氨基酸置换，该切口酶仅切割与gRNA互补并被gRNA识别的DNA链。在一个备选的实施方案中，Cas9蛋白可以备选地或额外地包含H840A氨基酸置换，该切口酶仅切割不与sRNA相互作用的DNA链。在此实施方案中，Cas9可以与一对(即两个)sgRNA分子(或表达该对的构建体)一起使用，因此可以切割相反DNA链上的靶区域，并有可能将特异性提高100-1500倍。在另一个实施方案中，Cas9蛋白可以包含D1135E置换。Cas9蛋白也可以是VQR变体。备选地，Cas蛋白可以在核酸酶结构域HNH和RuvC样二者中都包含突变，因此是催化失活的。该催化失活的Cas蛋白可用于防止转录延伸过程，而非切割靶链，从而导致与sgRNA分子共表达时不完全翻译的蛋白质的功能丧失。催化失活蛋白的一个例子是由在RuvC和/或HNH核酸酶结构域中的点突变引起的死Cas9(dCas9)(Komor等人，2016和Nishida等，2016)。
在另一个实施方案中，如上所述，可以将Cas蛋白(例如Cas9)与抑制效应子(例如组蛋白修饰/DNA甲基化酶)或碱基编辑器(例如胞苷脱氨酶(Komor等2016))进一步融合，以影响定点诱变。在后者中，胞苷脱氨酶不诱导dsDNA断裂，但介导胞苷向尿苷的转化，从而实现C至T(或G至A)的置换。
在另一个实施方案中，核酸构建体包含核糖核酸内切酶。优选地，核糖核酸内切酶是Csy4(也称为Cas6f)，并且更优选地，密码子优化的csy4。在一个实施方案中，当核酸构建体包含cas蛋白时，核酸构建体可以包含用于表达核糖核酸内切酶的序列，例如表达为针对cas蛋白(例如Cas9)的5′末端P2A融合体(用作自切割肽)的Csy4。
在一个实施方案中，可以将cas蛋白，核糖核酸内切酶和/或核糖核酸内切酶-cas融合序列可操作地连接至合适的植物启动子。合适的植物启动子已经在上面描述，但是在一个实施方案中，可以是Zea Mays泛素1启动子。
用于产生CRISPR核酸和载体系统的合适方法是已知的，并且例如公开在Molecular Plant(Ma等，2015，Molecular Plant，DOI：10.1016/j.molp.2015.04.007)中，其通过引用并入本文。
在本发明的一个备选的方面，核酸构建体包含至少一个编码TAL效应子的核酸序列，其中所述效应子靶向选自SEQ ID NO：33、36、40或43的miRNA528序列，或LAC3中的选自SEQ ID NO：51和54的miRNA528结合位点，或LAC5中的选自SEQ ID NO：57和60的miRNA528结合位点。给定靶序列，设计TAL效应子的方法对于技术人员是众所周知的。合适的方法的实例在Sanjana等和Cermak T等中给出，二者均通过引用并入本文。优选地，所述核酸构建体包含两个编码TAL效应子的核酸序列，以产生TALEN对。在另一个实施方案中，核酸构建体进一步包含序列特异性核酸酶(SSN)。优选地，这样的SSN是核酸内切酶，例如FokI。在另一个实施方案中，TALEN通过金门克隆方法在单个质粒或核酸构建体中组装。
在本发明的另一方面，提供了sgRNA分子，其中所述sgRNA分子包含crRNA序列和tracrRNA序列，并且其中所述crRNA序列能够结合选自SEQ ID NO：33、36、40或43或其变体的至少一个靶序列。优选地，sgRNA分子具有包含SEQ ID NO：35、38、42和45的核酸序列和选自SEQ ID NO：72至75的RNA序列。
备选地，提供了sgRNA分子，其中所述sgRNA分子能够与选自SEQ ID NO：51、54、57和60的至少一个靶序列结合。优选地，sgRNA分子具有包含SEQ ID NO：53、56、59和62的核酸序列和选自SEQ ID NO：76至79的RNA序列。
“变体”如本文所定义。在一个实施方案中，sgRNA分子可包含至少一个化学修饰，例如增强其稳定性和/或对靶序列或crRNA序列对tracrRNA序列的结合亲和力。这样的修饰对于本领域技术人员将是众所周知的，并且包括例如但不限于Rahdar等，2015中描述的修饰，该文献通过引用并入本文。在该实例中，crRNA可以包含硫代磷酸酯骨架修饰，例如2′-氟(2′-F)，2-O-甲基(2′-O-Me)和S-约束的乙基(cET)置换。
在本发明的另一方面，提供了编码原间隔子元件(如SEQ ID NO：34、37、41、44或其变体中定义)的分离的核酸序列。
在本发明的另一方面，提供用本文所述的至少一个核酸构建体转染的植物或其部分或至少一个分离的植物细胞。可以将Cas9和sgRNA组合或在单独的表达载体中(或核酸构建体，此类术语可互换使用)。换句话说，在一个实施方案中，分离的植物细胞用包含sgRNA和Cas9的单个核酸构建体转染，如上文所详细描述的。在一个备选的实施方案中，用两个核酸构建体转染分离的植物细胞，第一核酸构建体包含至少一个如上定义的sgRNA，第二核酸构建体包含Cas9或其功能变体或同源物。第二核酸构建体可以在第一核酸构建体下方、之后或同时转染。包含cas蛋白的单独的第二构建体的优势在于，编码至少一个sgRNA的核酸构建体能够与任何类型的cas蛋白配对，如本文所述，因此不限于单个cas功能(如当cas和sgRNA都在同一核酸构建体上编码时)。
在本发明的另一方面，提供了用单个核酸构建体转染的植物或其部分或至少一个分离的植物细胞，所述单个核酸构建体包含sgRNA和Cas9二者或sgRNA，Cas9和供体DNA序列，如上所详述。在一个备选的实施方案中，用两个或三个核酸构建体转染分离的植物细胞，第一核酸构建体包含至少一个如上定义的sgRNA，第二核酸构建体包含Cas9或其功能变体或同源物，且第三核酸构建体包含如上定义的供体DNA序列。同样，第二和/或第三核酸构建体可以在第一和/或第二核酸构建体之前、之后或同时转染。
在一个实施方案中，包含CRSIPR酶的核酸构建体首先被转染，并稳定地并入到基因组中，然后用包含至少一个sgRNA核酸的核酸构建体二次转染。在一个备选的实施方案中，用编码Cas蛋白的mRNA转染植物或其部分或至少一个分离的植物细胞，并用本文定义的至少一个核酸构建体共转染。
可如本领域中所述，构建用于本发明的Cas9表达载体。在一实例中，表达载体包含如SEQ ID NO：47中定义的核酸序列或其功能变体，其中所述核酸序列可操作地连接至合适的启动子。合适的启动子的实例包括肌动蛋白、CaMV35S、小麦U6或玉米泛素(例如Ubi1)启动子。
本发明的范围还包括上述核酸构建体(CRISPR构建体)或sgRNA分子在任何上述方法中的用途。例如，提供了上述CRISPR构建体或sgRNA分子在减少miRNA528表达或活性中的用途，如本文所述。
因此，在本发明的另一方面，提供了降低miRNA528表达和/或活性的方法，该方法包括将上述构建体中的任一个引入并表达或将如上所述的sgRNA分子引入植物中。换句话说，如本文所述，还提供了降低miRNA528表达和/或活性的方法，其中所述方法包括使用CRISPR/Cas9，特别是本文所述的CRISPR(核酸)构建体，将至少一个突变引入内源性miRNA528基因和/或启动子中或引入LAC3和/或LAC5基因中的miRNA528结合位点。
在本发明的一个备选的方面，提供了用至少一个如本文所述的sgRNA分子转染的分离的植物细胞。
在本发明的另一方面，提供了包含本文所述的转染细胞的基因修饰或编辑的植物。在一实施方案中，可以以稳定形式整合一个或更多个所述核酸构建体。在备选的实施方案中，一个或更多个核酸构建体不整合(即被瞬时表达)。因此，在优选的实施方案中，基因修饰的植物不含任何sgRNA和/或Cas/Cpf1蛋白核酸。换句话说，植物是无转基因的。
如本文所指，术语“引入”，“转染”或“转化”涵盖外源多核苷酸向宿主细胞的转移，而与用于转移的方法无关。可以用本发明的遗传构建体转化能够随后通过器官发生或胚胎发生进行克隆繁殖的植物组织，并从中再生出整株植物。选择的特定组织将取决于可用于且最适合于正被转化的特定物种的克隆繁殖系统。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、巨型配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。然后可以以本领域技术人员已知的方式将所得的转化植物细胞用于再生转化植物。外来基因向植物基因组的转移称为转化。现在，植物的转化在许多物种中是常规技术。技术人员已知的几种转化方法中的任何一种都可用于将目的核酸构建体或sgRNA分子引入合适的祖细胞中。所描述的用于从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法可以用于瞬时或稳定转化。
转化方法包括使用脂质体，电穿孔，增加游离DNA摄取的化学物质，将DNA直接注入植物中(显微注射)，如实施例中所描述的基因枪(或生物弹颗粒递送系统(biolistics))，脂质体转染，使用病毒或花粉和微喷射的转化。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法，超声介导的基因转染，光学或激光转染，使用碳化硅纤维的转染，原生质体的电穿孔，向植物材料中的显微注射，DNA或RNA包被的颗粒轰击，用(非整合)病毒感染等。转基因植物也可以通过根癌农杆菌介导的转化产生，包括但不限于使用如Clough&Bent(1998)中所述的浸花/农杆菌真空浸润方法，该文献以引用的方式并入本文。
因此，在一个实施方案中，可以使用任何上述方法将至少一个本文所述的核酸构建体或sgRNA分子引入至少一个植物细胞。在一个备选实施方案中，可以首先转录本文所述的任何核酸构建体，以形成预组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白，然后使用上述方法中的任一种，例如脂质转染、电穿孔或显微注射，将其递送至至少一个植物细胞。
任选地，为了选择转化植物，通常将转化中获得的植物材料置于选择条件下，以便可以将转化植物与未转化植物区分开。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并且在初始生长期之后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性是，如果合适的话，在灭菌后，使用合适的选择剂使种子在琼脂平板上进行生长，以便只有转化的种子才能生长成植物。如实施例中所述，合适的标记物可以是棒膦丝菌素(bar-phosphinothricin)或PPT。备选地，筛选转化植物中是否存在选择标记，例如但不限于GFP、GUS(β-葡萄糖醛酸苷酶)。其他示例对于技术人员将是容易知道的。备选地，不进行选择，并且种植和生长以上述方式获得的种子，并使用本领域的标准技术在适当的时间测量miRNA528的表达、蛋白质水平或与LAC3或LAC5的结合。该备选方案，其避免引入转基因，对于产生无转基因的植物是优选的。
DNA转移和再生后，还可以评价推定转化的植物，例如使用PCR来检测目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组织。备选地或额外地，可以使用Southern，Northern和/或Western分析来监测新引入的DNA的整合和表达水平，这些技术对于本领域普通技术人员而言都是众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种手段繁殖，例如通过克隆繁殖或经典培育技术。例如，可以使第一代(或T1)转化植物自交并选择纯合的第二代(或T2)转化子，然后可以通过经典培育技术进一步繁殖T2植物。
使用上述CRISPR构建体的具体方案是技术人员众所周知的。作为一个实例，合适的方案描述于Ma&Liu(“CRISPR/Cas-based multiplex genome editing in monocot anddicot plants”)中，其通过引用并入本文。
在本发明的另一个相关方面，还提供了获得本文所述的基因修饰的植物的方法，该方法包括
a.选择植物部分；
b.使用如上所述的转染或转化技术，用至少一个如本文所述的核酸构建体或至少一种如本文所述的sgRNA分子转染段落(a)的所述植物部分的至少一个细胞。
c.使至少一个源自转染细胞的植物再生；
d.选择根据段落(c)获得的一个或更多个植物，其显示miRNA528的表达或功能降低，或显示降低的miR528结合的漆酶3或5。
在另一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：针对miRNA528基因或启动子序列或LAC3或LAC5的miR528结合位点中的SSN(优选CRISPR)诱导的突变，筛选基因修饰的植物。在一个实施方案中，该方法包括从转化植物中获得DNA样品，并进行DNA扩增以检测至少一种miRNA528基因或启动子序列中的突变。
在进一步的实施方案中，所述方法包括产生稳定的T2植物，所述植物优选为突变纯合的(即在至少一个miRNA528基因或启动子序列中或在LAC3或LAC5的miR528结合位点中的突变)。
在至少一个miRNA528基因序列中或LAC3或LAC5的miR528结合位点中具有突变的植物，也可以与在至少一个miRNA528基因或LAC3或LAC5序列的miR528结合位点中也含有至少一个不同突变的另一株植物杂交，以获得在miRNA528基因序列中具有额外突变的植物。组合对于技术人员将是显而易见的。因此，当与如上所述转化的单个T1植物中的同源突变的数目相比时，该方法可用于产生在全部或增加的同源数目上具有突变的T2植物。
通过上述方法获得或可获得的植物也在本发明的范围内。
本发明的基因改变的植物也可通过转移本发明的任何序列而获得，通过杂交，例如，使用本文所述的基因改变的植物的花粉对野生型或对照植物进行授粉，或用在miRNA528基因或启动子序列或在LAC3或LAC5的miR528结合位点中的至少一个中不包含突变的其他花粉对本文所述的植物的雌蕊进行授粉。获得本发明植物的方法不仅仅限于本段中描述的那些；例如，可以如前所述进行来自小麦穗的生殖细胞的遗传转化，但此后不必再生植物。
或者，可以使用更常规的诱变方法将至少一个突变引入miR528基因和/或启动子或LAC3和/或LAC5 miR528结合序列。这些方法包括物理和化学诱变。技术人员会知道，可以使用进一步的方法来产生这样的突变体，并且用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；U.S.Patent No.4,873,192；Walker和Gaastra编(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，纽约)和其中引用的参考文献。
在一个实施方案中，使用插入诱变，例如使用T-DNA诱变(其将来自根癌农杆菌T-质粒的T-DNA片段插入DNA中，导致基因功能丧失或基因功能突变的获得)，定点核酸酶(SDN)或转座子作为诱变剂。插入诱变是破坏基因功能的备选的方法，其基于将外源DNA插入目的基因中(参见Krysan等，The Plant Cell，第11卷，第2283-2290页，1999年12月)。因此，在一个实施方案中，T-DNA用作插入诱变剂以破坏miR528a或b基因或miR528启动子或LAC3和/或LAC5 miR528结合序列，使得miR528不能结合。Downes等2003描述了使用T-DNA诱变破坏拟南芥(Arabidopsis)ARE1基因的例子。T-DNA不仅破坏了其插入基因的表达，而且还充当了随后突变鉴定的标记。由于插入元件的序列是已知的，因此可以使用各种克隆或基于PCR的策略重新获得发生插入的基因。长度约为5至25kb的T-DNA的插入通常产生基因功能的破坏。如果产生足够大群体的T-DNA转化系，则有相当好的机会找到在任何目的基因内携带T-DNA插入序列的转基因植物。通过农杆菌介导的方法可以实现用T-DNA转化孢子，该方法包括将植物细胞和组织暴露于农杆菌细胞的悬浮液中。
该方法的细节是技术人员众所周知的。简而言之，通过农杆菌进行的植物转化导致将称为T-DNA的序列整合到核基因组中，该序列携带在细菌质粒上。T-DNA转化的使用导致稳定的单次插入。对所得转化株系的进一步突变分析是简单的，并且每个单独的插入株系可以通过直接测序和分析插入序列侧翼的DNA而快速表征。
在另一个实施方案中，诱变是物理诱变，例如应用紫外线辐照、X射线、γ射线、快中子或热中子或质子。然后可以筛选靶向的群体以鉴定在miR528结合位点中具有突变的植物。
在本发明各个方面的另一个实施方案中，该方法包括用诱变剂诱变植物群体。诱变剂可以是快速中子辐照或化学诱变剂，例如选自以下非限制性列表：乙基甲磺酸(EMS)，甲基甲磺酸(MMS)，N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)，三乙基三聚氰胺(1′EM)，N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)，丙卡巴肼，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，硫酸二乙酯，丙烯酰胺单体，美法仑，氮芥，长春新碱，二甲基亚硝胺(dimethylnitosamine)，N-甲基-N′-硝基-亚硝基胍(MNNG)，亚硝基胍，2-氨基嘌呤，7，12二甲基-苯并蒽(DMBA)，环氧乙烷，六甲基磷酰胺，亚砜(bisulfan)，二环氧烷烃(二环氧辛烷(DEO)，二环氧丁烷(BEB)等)，2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯乙基)氨基丙基氨基]吖啶二盐酸盐(ICR-170)或甲醛。再次，然后可以筛选靶向的群体，以鉴定在LAC3或LAC5中miR528结合位点的miR528 a或b基因或miR528启动子中具有突变的植物。
在另一个实施方案中，用于产生和分析突变的方法是定向诱导基因组局部突变(TILLING)，在Henikoff等，2004中综述。在该方法中，用化学诱变剂，例如EMS诱变种子。所得的M1植物是自体受精的，并且使用M2代个体制备用于突变筛选的DNA样品。将DNA样品收集和排列在微量滴定板上并进行基因特异性PCR。可以使用鉴定野生型和突变基因之间的异源双链体的任何方法，针对miR528a或b基因或miR528启动子或miR528结合位点中的突变，筛选PCR扩增产物。例如但不限于变性高压液相色谱(dHPLC)、恒定变性毛细管电泳(CDCE)、温度梯度毛细管电泳(TGCE)，或通过使用化学切割的断裂。优选地，PCR扩增产物与优先切割野生型和突变序列之间异源双链体中错配的核酸内切酶一起温育。使用自动测序凝胶设备使切割产物电泳，并借助于标准商业的图像处理程序分析凝胶图像。可利用对miR528或LAC3/LAC5特异的任何引物来扩增收集的DNA样品中的miR528或LAC3/LAC5核酸序列。为了促进凝胶上PCR产物的检测，可以使用任何常规的标记方法标记PCR引物。在一个备选的实施方案中，用于产生和分析突变的方法是EcoTILLING。EcoTILLING是类似于TILLING的分子技术，除了其目的是揭示给定群体中的天然变异而不是诱导的突变。EcoTILLING方法的首次公开描述于Comai等2004。
因此，快速高通量筛选方法允许分析扩增产物，以鉴定赋予与相应的未诱变的野生型植物相比对miR528结合或减少的miR528表达的抗性的突变。一旦在目的基因中鉴定到突变，使携带该突变的M2植物的种子生长为成年M3植物并筛选。
通过这种方法获得的或可获得的的植物也在本发明的范围内，其中所述植物在miR528a或b基因或miR528启动子或LAC3和/或LAC5的miR528结合位点中携带突变。
在另一个实施方案中，所述方法可包括使用miR528抑制剂降低miR528的表达或活性。miR528抑制剂是能够降低miR528的表达或降低其活性的任何分子。在一个实施方案中，miR528抑制剂是抑制miRNA功能的基于核酸的分子。合成的miRNA抑制剂可包括这样的RNA分子：其具有成熟miRNA的反向互补序列，并且此外，其被化学修饰以防止RISC诱导的切割，增强结合亲和力并提供对溶核降解的抗性。当合成的miRNA抑制剂结合miRNA528时，其结合是不可逆的，因此该抑制剂实际上螯合了内源miRNA，使其不能用于正常功能(Robertson等2010)。因此，在一个实施方案中，miR528抑制剂通过结合和螯合miR528而降低了的miRNA528的活性。在另一个实施方案中，如本文所述，miRNA表达可以通过基因编辑降低，其中通过基因编辑产生miR528单敲除植物，然后杂交以产生miR528双敲除植物。
在一个实施方案中，miR528抑制剂是短串联靶模拟物，并且包含如SEQ ID NO：8中定义的RNA序列或其功能变体(如本文所定义)和如SEQ ID NO：7中定义的DNA序列或其功能变体(同样如本文所定义)。
因此，在一个实施方案中，所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至调控序列的如SEQ ID NO：7或16中定义的核酸序列或其功能变体。在另一个实施方案中，该方法包括引入如SEQ ID NO：8中定义的RNA分子或其功能变体。
在本发明的另一方面，提供了编码miR528抑制剂的分离的核酸，其中miR528抑制剂包含如SEQ ID NO：7或16中定义的核酸序列或其功能变体，如本文定义的。
在另一方面，提供了miR528抑制剂，其包含RNA分子，其中所述RNA分子包含如SEQID NO：8中定义的RNA序列或其功能变体。
在另一方面，提供了核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至调控序列的编码如上所述的miR528抑制剂的核酸序列。
还提供了分离的细胞，优选植物细胞或根癌农杆菌(Agrobacterium tume向ciens)细胞，其表达核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至调控序列的编码miR528抑制剂的核酸序列或其功能变体。此外，本发明还涉及包含表达本发明的核酸构建体或miR528抑制剂的分离的植物细胞或根癌农杆菌细胞的培养基。
还提供了上述分离的核酸、miR528抑制剂、核酸构建体或载体在与对照或野生型植物相比增加植物中的抗倒伏性、木质素含量和/或合成中的至少一种的用途。木质素的含量和/或合成可以在植物的茎秆和/或根中增加。
在一个备选的实施方案中，该方法降低了对植物倒伏的抗性，即增加了倒伏。优选地，该方法包括降低至少一个漆酶基因的表达和/或提高miR528的表达或活性。如上所述，在植物要用作生物能源用途的原料来源或植物要用作牲畜的饲料的地方，降低倒伏可能是有用的。优选地，此类植物的特征在于木质素含量降低，因为将植物用于生物燃料生产需要去除木质素，并且对于饲料而言，木质素影响饲料作物的消化率。在一个实施方案中，所述植物是玉米。
在另一个实施方案中，漆酶基因选自漆酶3和漆酶5，其中所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO：1中定义的多肽或其功能变体，并且其中漆酶基因5编码如在SEQ ID NO：4中定义的多肽或其功能变体。更优选地，所述漆酶3基因包含如SEQ ID NO：2或3中定义的核酸序列或其功能变体。类似地，在优选的实施方案中，所述漆酶5基因包含如SEQ ID NO：5或6中定义的核酸序列或其功能变体。
在一个实施方案中，该方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因和/或启动子中，其中与野生型对照相比，该突变降低或消除漆酶核酸的表达或活性。在一个实施方案中，与野生型或对照植物中的水平相比，表达或活性降低高达或大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。“消除”表示没有LAC3和/或LAC5被表达或可以被可检测地表达。在优选的实施方案中，这种突变使用如上所述的靶向基因组修饰(优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9)引入。在一个备选的实施方案中，这种突变还使用如上所述的诱变(优选TILLING或T-DNA插入)引入。在这样的实施方式中，本发明涉及一种方法和通过如上所述的基因工程方法产生的植物，并且不涵盖天然存在的品种。
在一个备选的实施方案中，该方法包括使用RNA干扰来减少或消除至少一种漆酶核酸，优选LAC3和/或5核酸的表达。例如，可以使用技术人员已知的多种基因沉默方法，使本文定义的漆酶核酸的表达被减少或沉默，例如但不限于，使用针对LAC3和/或5的小干扰核酸(siNA)。“基因沉默”是通常用于指通过RNA分子介导的序列特异性相互作用抑制基因表达的术语。降低的程度可以是为了完全消除编码基因产物的产生，但是更通常地，部分消除表达，而保留一定程度的表达。因此，该术语不应被认为要求表达的完全“沉默”。
在一个实施方案中，所述siNA可包括能够介导RNA干扰的短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、拮抗剂(antagomirs)和短发夹RNA(shRNA)。
表达和/或活性的抑制可通过使用技术人员熟知的技术(例如Northern印迹，RT-PCR等)确定漆酶3和/或5转录本的存在和/或量来测量。
转基因可用于抑制内源植物基因。这最初是在矮牵牛中的查耳酮合酶转基因引起内源性查耳酮合酶基因的抑制时发现的，并且通过容易可见的色素沉着变化而被指示。随后描述了转基因可以沉默多少个植物基因(如果不是全部的话)。基因沉默需要转基因和被沉默的基因之间的序列相似性。该序列同源性可涉及沉默的靶基因的启动子区或编码区。当涉及编码区时，可能已经用启动子构建了能够引起基因沉默的转基因，该启动子将转录编码序列RNA的有义或反义方向。基因沉默的各种例子可能涉及尚未充分理解的不同机制。在不同的例子中，可能存在转录或转录后基因沉默，并且两者均可根据本发明的方法使用。
文献中广泛地描述了基因沉默的机制及其在基因工程中的应用，这种机制最初是在1990年代初期在植物中发现的，然后在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中显示。
根据本发明方法的RNA介导的基因抑制或RNA沉默包括共抑制，其中靶标有义RNA或mRNA，即漆酶3和/或5有义RNA或mRNA的过表达导致相关基因表达水平的降低。协调地抑制了转基因和同源内源基因的RNA。本发明方法中使用的其他技术包括反义RNA，以减少植物中内源靶基因的转录水平。在这种方法中，RNA沉默不会影响基因座的转录，而只会引起靶标mRNA的序列特异性降解。″反义″核酸序列包括与编码漆酶蛋白或该蛋白的一部分的″有义″核酸序列互补的核苷酸序列，即与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA转录序列互补。反义核酸序列优选与待沉默的内源漆酶基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或“非编码区”。术语“编码区”是指核苷酸序列的包含被翻译成氨基酸残基的密码子的区域。术语“非编码区”是指在编码区侧翼的5′和3′序列，其被转录但未翻译成氨基酸(也称为5′和3′非翻译区)。
反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对的规则来设计。反义核酸序列可以与本文所定义的完整漆酶3或5核酸序列互补，但也可以是仅与核酸序列(包括mRNA 5′和3′UTR)的一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与编码多肽的mRNA转录本的翻译起始位点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的，并且可以从约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸长度或更短开始。可以使用化学合成和酶促连接反应，使用本领域已知的方法构建根据本发明的反义核酸序列。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子的生物稳定性或增加反义和有义核酸序列之间形成的双链体的物理稳定性的各种经修饰的核苷酸而被化学合成，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸序列的经修饰的核苷酸的实例是本领域公知的。反义核酸序列可以使用表达载体生物学产生，其中核酸序列已经以反义方向亚克隆到所述表达载体中(即，从插入的核酸转录的RNA将具有与目的靶核酸反义的方向)。优选地，通过稳定整合的核酸构建体在植物中产生反义核酸序列，所述核酸构建体包含启动子、可操作连接的反义寡核苷酸和终止子。
在本发明方法中用于沉默的核酸分子与编码多肽的mRNA转录本杂交或结合和/或插入编码多肽的基因组DNA，从而抑制蛋白质的表达，例如通过抑制转录和/或翻译。杂交可以通过常规核苷酸互补性形成稳定的双链体，或者例如在结合DNA双链体的反义核酸序列的情况下，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用。反义核酸序列可以通过转化或直接注射在特定组织位点而被引入植物中。备选地，可以修饰反义核酸序列，以靶向选定细胞，然后全身施用。例如，对于全身施用，可以修饰反义核酸序列，使其特异性结合至在选定细胞表面上表达的受体或抗原，例如，通过将反义核酸序列与结合至细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接。反义核酸序列也可以使用载体递送至细胞。
RNA干扰(RNAi)是另一种转录后基因沉默现象，其可以根据本发明的方法使用。这是由双链RNA诱导的，其中与dsRNA同源的mRNA被特异降解。它是指由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。当酶DICER遇到dsRNA并将其切成称为小干扰RNA(siRNA)的片段时，RNAi的过程开始。该酶属于RNase III核酸酶家族。蛋白质复合物聚集这些RNA残余物，并使用它们的编码作为指导，以搜索和破坏细胞中具有匹配序列的任何RNA，例如靶mRNA。
人工和/或天然的微小RNA(miRNA)可以用于敲除基因表达和/或mRNA翻译。MicroRNA(miRNA)miRNA通常是单链小RNA，通常长19-24个核苷酸。大多数植物miRNA与它们的靶序列具有完美或接近完美的互补性。然而，存在具有多达五个错配的天然靶标。它们是从具有特征性折回结构的较长的非编码RNA通过Dicer家族的双链特异性RNA酶加工而来的。在加工后，它们通过结合至其主要成分Argonaute蛋白而被掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。miRNA充当RISC的特异性组分，因为它们与细胞质中的靶核酸，主要是mRNA，碱基配对。随后的调节事件包括靶mRNA的切割和破坏和/或翻译抑制。因此，miRNA过表达的影响通常反映在靶基因的mRNA水平降低。人工microRNA(amiRNA)技术已经应用于拟南芥和其它植物中，以有效地沉默目的靶基因。amiRNA的设计原理已被概括并集成到基于Web的工具(http://wmd.weigelworld.org)中。
因此，根据本发明的各个方面，可以转化植物以导入RNAi、shRNA、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、amiRNA或共抑制分子，所述分子被设计为靶向漆酶核酸序列的表达并选择性地降低或抑制该基因的表达或其转录本的稳定性。优选地，根据本发明的各个方面使用的RNAi、snRNA、dsRNA、shRNA、siRNA、miRNA、amiRNA、ta-siRNA或共抑制分子包含至少17nt，优选22至26nt的片段，并且可以基于SEQ ID NO.2、3、5或6中任一个所示的信息进行设计。用于设计有效siRNA的指南是技术人员已知的。简言之，选择靶基因序列的短片段(例如，19-40个核苷酸长)作为本发明siRNA的靶序列。靶基因序列的短片段是靶基因mRNA的片段。在优选实施方案中，从靶基因mRNA中选择序列片段作为候选siRNA分子的标准包括1)来自靶基因mRNA的序列，其是自天然mRNA分子的5′或3′端的至少50-100个核苷酸，2)来自靶基因mRNA的序列，其G/C含量为30％-70％，最优选约50％，3)来自靶基因mRNA的序列，其不包含重复序列(例如AAA、CCC、GGG、TTT、AAAA、CCCC、GGGG、TTTT)，4)来自靶基因mRNA的序列，其在靶基因mRNA中是可接近的，5)来自靶基因mRNA的序列，其是靶基因特有的，6)避开起始密码子75个碱基内的区域。来自靶基因mRNA的序列片段可以满足一个或更多个上述标准。选定的基因作为核苷酸序列引入预测程序，该程序考虑了上述用于设计最佳寡核苷酸的所有变量。该程序扫描任何mRNA核苷酸序列以寻找易于被siRNA靶向的区域。该分析的输出是可能的siRNA寡核苷酸的评分。最高的分数用于设计通常通过化学合成制备的双链RNA寡核苷酸。除了与mRNA靶区域互补的siRNA之外，简并siRNA序列可用于靶向同源区域。根据本发明的siRNA可以通过本领域已知的任何方法合成。优选使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学来合成RNA。另外，siRNA可以从商业RNA寡核苷酸合成供应商获得。
根据本发明方面的siRNA分子可以是双链的。在一个实施方案中，双链siRNA分子包含平末端。在另一个实施方案中，双链siRNA分子包含突出端核苷酸(例如1-5个核苷酸的突出端，优选2个核苷酸的突出端)。在一些实施方案中，siRNA是短发夹RNA(shRNA)；siRNA分子的两条链可以通过接头区域(例如核苷酸接头或非核苷酸接头)连接。本发明的siRNA可以包含一个或更多个经修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯键。本领域众所周知的化学修饰能够增加siRNA的稳定性、可用性和/或细胞摄取。技术人员会意识到可以掺入RNA分子中的其他类型的化学修饰。
在另一个备选的实施方案中，所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO：10中定义的miRNA或其功能变体。优选地，该核酸构建体包含至少一个核酸序列，其中该核酸序列选自SEQ ID NO：9、32或39。在另一个实施方案中，所述核酸构建体包含选自SEQ ID NO：32和39的两个核酸序列。优选地，所述核酸序列或每个核酸序列可操作地连接至调控序列，例如启动子。合适的启动子序列的实例是技术人员已知的，但也在上文中进行了描述。
在另一个备选的实施方案中，该方法包括引入包含SEQ ID NO：9的miR528或其功能变体。
在本发明的另一方面，提供了基因改变的植物、其一部分或植物细胞，其中所述植物的特征在于至少一个漆酶基因的表达或水平的改变和/或miR528的表达或活性的改变。优选地，该植物还可以以改变的木质素含量为特征。再次，如上所述，“改变”可以被认为是增加或减少。
在一个实施方案中，所述植物的特征在于与野生型或对照植物相比，至少一个漆酶基因的表达增加和/或miR528的表达或活性降低，如上所述。
在一个实施方案中，植物表达对于个体植物是“外源的”或“内源的”多核苷酸，其是通过除有性杂交以外的任何方式引入植物中的多核苷酸。下文描述了可以实现此目的的手段的示例。在一个实施方案中，外源核酸在植物中表达，其是包含核酸的核酸构建体，其中所述核酸编码如SEQ ID NO：1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物，和/或编码如SEQ ID NO：4中定义的漆酶5多肽或其功能变体或同源物的核酸，其中两个漆酶序列均可操作地连接至调控序列。
优选地，编码漆酶3的核酸包含如SEQ ID NO：2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，优选地编码漆酶5的核酸包含如SEQ ID NO：5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
在另一个实施方案中，所述植物表达miR528抑制剂。具体地，在一个实例中，所述植物可表达核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至调控序列的如SEQ ID NO：7或16中定义的核酸序列或其功能变体。调控序列如上所述。在另一个实例中，所述miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO：8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
在一个备选的实施方案中，所述植物在至少一个编码漆酶核酸的核酸中包含至少一个突变，优选其中所述漆酶核酸选自漆酶3和5，并且其中所述突变在miR528结合位点中。在一个实施方案中，将突变引入LAC3和LAC5 miR528结合位点。可以使用上述任何诱变方法引入突变。
LAC3中的miR528结合位点如下：
CUCUGCUGCAUGCCCCUUCGA(SEQ ID NO：20)
LAC5中的miR528结合位点如下：
CUUCUCCGCAUGUCCCUUCCU(SEQ ID NO：21)
优选地，该突变是阻止miR528结合至LAC3和/或LAC5的任何突变。在一实例中，所述突变可选自上述SEQ ID NO：20和/或21中一个或多个核苷酸的缺失、插入和置换。在一个实例中，缺失或插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。
在另一个备选的实施方案中，所述植物在miR528a和/或b基因中或miR528启动子中包含至少一个突变，使得miR528的表达降低或消除。同样，可以使用上述任何诱变方法引入突变。
在本发明的另一方面，提供了基因改变的植物，其中与野生型或对照植物相比，所述植物的特征在于至少一个漆酶基因的表达降低和/或miR528的表达或活性提高。
在本发明的另一方面，提供了产生具有改变的对植物倒伏抗性的植物的方法，所述方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平，和/或改变miR528的表达或活性。优选地，与野生型或对照植物相比，所述植物还具有改变的木质素含量。
在一个优选的实施方案中，所述植物具有增加的对植物倒伏的抗性，并且所述方法包括增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性。优选地，增加至少一个漆酶基因的表达包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO：1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物，和/或如SEQ ID NO：4中定义的漆酶5多肽或其功能变体或同源物。
在一个备选的实施方案中，降低miR528的活性包括在植物中引入和表达包含miR528抑制剂或表达miR528抑制剂的核酸构建体。在一个优选的实施方案中，所述核酸构建体包含编码miR528抑制剂的核酸序列，其中所述miR528抑制剂的序列是可操作地连接至调控序列的在SEQ ID NO：7或16中定义的，或其功能变体。调控序列如上所述。在另一个优选的实施方案中，miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO：8中所定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
用于产生本发明的转基因植物的转化方法是本领域已知的。因此，根据本发明的各个方面，将本文所述的任何核酸构建体引入植物中并表达为转基因。通过称为转化的过程将核酸构建体引入所述植物中。如本文所指，术语“引入”或“转化”涵盖外源多核苷酸向宿主细胞的转移，而与用于转移的方法无关。无论是通过器官发生还是胚胎发生，能够随后克隆繁殖的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化，并从其再生整株植物。选择的特定组织将取决于可用于且最适合于正被转化的特定物种的克隆繁殖系统。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、巨型配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以将多核苷酸瞬时或稳定地引入宿主细胞，并且可以保持非整合状态，例如作为质粒。或者，可以将其整合到宿主基因组中。然后可以以本领域技术人员已知的方式将所得的转化植物细胞用于再生转化植物。
现在，植物的转化在许多物种中是常规技术。有利地，可以使用几种转化方法中的任何一种将目的基因引入合适的祖细胞中。所描述的用于从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法可以用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、将DNA直接注入植物中、粒子枪轰击以及使用病毒或花粉和显微注射进行的转化。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法，原生质体的电穿孔，向植物材料中的显微注射，DNA或RNA包被的颗粒轰击，用(非整合)病毒感染等。转基因植物，包括转基因农作物，优选通过根癌农杆菌介导的转化而产生。
为了选择转化植物，将转化中获得的植物材料置于选择条件下，以便可以将转化植物与未转化植物区分开。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并且在初始生长期之后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性是，如果合适的话，在灭菌后，使用合适的选择剂，使种子在琼脂平板上生长，以便只有转化的种子才能生长成植物。或者，筛选转化的植物中是否存在选择标记。DNA转移和再生后，还可以针对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组织，评价推定转化的植物，例如使用Southern印迹分析。备选地或额外地，可以使用Northern和/或Western印迹分析来监测新引入的DNA的表达水平，这两个技术对于本领域普通技术人员而言都是众所周知的。
产生的转化植物可以通过多种手段繁殖，例如通过克隆繁殖或经典培育技术。例如，可以使第一代(或T1)转化植物自交并选择纯合的第二代(或T2)转化子，然后可以通过经典培育技术进一步繁殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆转化子(例如，所有细胞被转化为包含表达盒)；转化和未转化的组织的嫁接(例如在植物中，将转化的砧木嫁接到未转化的接穗上)。
该方法可以进一步包括从植物或植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含选自SEQ ID NO：2、3、5、6和7的核酸序列或编码如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：4中定义的漆酶蛋白的核酸，并获得衍生自转基因植物的后代植物，其中所述后代在抗倒伏性、木质素含量和产量的至少一种中显示出增加。
在本发明的另一方面，提供了用于生产本文所述的基因改变的植物的方法。在一个实施方案中，该方法包括使用本文所述的任何诱变技术将至少一个突变引入优选地至少一个植物细胞的如上所述的至少一个LAC3和/或LAC5核酸的miR528结合位点。优选地，所述方法进一步包括从突变的植物细胞使植物再生。
因此，在一个实施方案中，该方法包括
a.选择植物的部分；
b.用本文所述的至少一个核酸构建体或miR528抑制剂转染段落(a)所述植物的部分的至少一个细胞或
c.使至少一个源自转染细胞的植物再生；
d.选择根据段落(c)获得的显示LAC3和/或LAC5表达增加或miR528活性降低的一个或更多个植物。
该方法可以进一步包括选择一个或更多个突变的植物细胞或植物，优选地用于进一步繁殖。优选地，所述选择的植物在至少一个LAC3和/或LAC5核酸的miR528结合位点中包含至少一个突变。在一个实施方案中，所述植物的特征在于，优选在茎秆和/或根中的抗倒伏性水平增加(或倒伏减少)或木质素含量水平增加。
选择的植物可以通过多种手段繁殖，例如通过克隆繁殖或经典培育技术。例如，可以使第一代(或T1)转化植物自交并选择纯合的第二代(或T2)转化子，然后可以通过经典培育技术进一步繁殖T2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；克隆转化子(例如，所有细胞被转化为包含表达盒)；转化和未转化的组织的嫁接(例如在植物中，将转化的砧木嫁接到未转化的接穗上)。
在本文描述的任何方法的另一个实施方案中，该方法可以进一步包括以下至少一个或更多个步骤：评估转基因或基因改变的植物的表型，测量倒伏抗性、木质素含量、耐皮透度计抗性和纤维素/半纤维素含量的增加中的至少一种，如上所述。换句话说，该方法可以包括针对所需表型筛选植物的步骤。
在本发明的另一方面，提供通过上述方法获得或可获得的植物。
在本发明的另一个最终方面，提供筛选植物种群并鉴定和/或选择具有增加的漆酶3和/或5的表达和/或降低的miR528的表达/活性和/或漆酶3和/或5的miR528结合位点中的突变的植物的方法。与野生型或对照植物相比，此类植物会具有增加的木质素含量，因此对倒伏的抗性水平增加。如上所讨论的，这样的筛选方法具有特别的价值，因为除非倒伏情况发生在生长季节，否则培育者、农民、农作物测试者等难以确定品种是否抗倒伏。这样，在种植前能够确定单个植物或品种是否抗倒伏具有显著经济效益的潜力。
特别地，该方法可以包括检测漆酶3和/或5基因和/或启动子中的至少一个多态性或突变，其中这种突变导致漆酶3和/或5表达水平升高，或者其中这种突变处于miR528结合位点中，因此可防止miR528与漆酶3和/或5的结合。表达的增加或miR528结合的减少可相对于不携带该突变的植物中的增加或减少。这样的植物可以用于确定阈值，水平可以与要筛选的植物中的水平进行比较。或者，该方法可能包括检测miR528a和/或b基因和/或其启动子中的至少一个多态性或突变，以使miR528的表达减少或消除或miR528不能结合其靶标漆酶3和/或漆酶5。同样，表达或活性水平可以相对于不携带突变的植物。所述突变可以是至少一个添加、置换或缺失。
用于评估多态性或突变的存在的合适测试是技术人员众所周知的，并且包括但不限于同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增的多态性DNA(RAPD)、随机引物的聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹图谱(DAF)、序列特征性扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR-也称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)。在一个实施方案中，使用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)基因分型。
在一个实施方案中，该方法包括
a)从植物获得核酸样品，并
b)使用一个或更多个引物，对一个或多个漆酶3基因和/或启动子，漆酶5基因和/或启动子或miR528a和/或b基因和/或启动子等位基因进行核酸扩增。
在另一个实施方案中，该方法可进一步包括将包含所述高漆酶3或漆酶5或低miR528表达/活性多态性中至少一个的染色体区域渗入第二植物或植物种质中，以产生渗入的植物或植物种质。优选地，漆酶3或漆酶5的表达或活性将增加，或在所述第二植物中miR528的表达或活性将被降低或消除(与对照或野生型植物相比)，更优选地，所述第二植物将展示如上所述的抗倒伏性的改变。
在本发明的另一方面，提供了改变优选增加植物中抗倒伏性的方法，该方法包括
a.在植物群体中筛选至少一个具有至少一个上述多态性或突变的植物；
b.通过本文所述的任何方法进一步增加漆酶3和/或5的表达，或通过本文所述的任何方法进一步降低或消除至少一个miR528核酸的表达或活性。
“进一步增加”或“进一步降低”是指将表达或活性水平分别增加或降低到高于或低于具有上述至少一种多态性的植物中的水平。与对照植物中的水平相比，这种表达和/或活性的增加或降低可以高达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
本文所述的根据本发明所有方面的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述植物是农作物或禾本科植物。农作物是指以商业规模生长以供人类或动物消费或使用的任何植物。在一个优选的实施方案中，所述植物是谷物。
在一个优选的实施方案中，所述植物是玉米。在一个实例中，所述玉米可以是“玉米品种综31”或“玉米B73”。对于“玉米品种综31”，可参考杨会，王国英，戴景瑞，玉米优良自交系综3、综31的转化研究，农业生物技术学报，2001年，第04期。对于“玉米B73”，参考龚付全，李平华，玉米自交系B73丙酮酸磷酸双激酶基因的克隆以及低氮对PPDK表达的影响，热带生物学报，2014年第4期。
本文所用的术语“植物”涵盖整个植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、果实、枝条、茎秆、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，其中每个前述包含如本文所述的核酸构建体或携带本文所述的突变。术语“植物”还涵盖植物细胞，悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每个上述的都包含本文所述的核酸构建体或突变。在一个实例中，仅植物细胞是不能光合作用的细胞。例如，植物细胞可能缺乏叶绿体。所述细胞也可来自于以下组织类型之一：叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、巨型配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。
本发明还扩展到本文所述的本发明植物的可收获部分，但不限于种子、叶子、果实、花，茎秆、根、根茎、块茎和鳞茎。本发明的方面还扩展到来源于，优选直接来源于这种植物的可收获部分的产品，例如干颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。可以源自本发明植物的可收获部分的另一种产品是生物柴油。本发明还涉及包含本发明的植物或其部分的食品和食品补充剂。在一个实施方案中，食品产品可以是动物饲料。在本发明的另一方面，提供了源自本文所述植物或其一部分的产品。
在最优选的实施方案中，植物部分或可收获产品是种子或籽粒(grain)。因此，在本发明的另一方面，提供了由如本文所述的基因改变的植物产生的种子。
在一个备选的实施方案中，植物部分是本文所述的基因改变的植物的花粉、繁殖体或后代。因此，在本发明的另一方面，提供了由本文所述的基因改变的植物产生的花粉、繁殖体或后代。
根据本发明所有方面的本文所用的对照植物是尚未根据本发明的方法修饰的植物。因此，在一个实施方案中，对照植物没有如上所述改变至少一种漆酶基因的表达或水平和/或没有如上所述改变miR528的表达或活性。在一个备选的实施方案中，如上所述，该植物尚未被基因修饰。在一个实施方案中，对照植物是野生型植物。对照植物通常具有相同的植物种类，优选具有与修饰的植物相同的遗传背景。
虽然前述公开内容提供了包括本发明的范围内的主题的一般描述，包括制备和使用本发明的方法及其最佳模式，提供了以下实施例以进一步使得本领域技术人员实施本发明并提供了其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，其范围应该从本公开所附的权利要求书及其等同物中理解。鉴于本公开，本发明的各个其他方面和实施例对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
本文中使用的术语“和/或”被认为是两个指定特征或部件在具有或不具有另一的情况下每一个的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的各自的具体公开，就像它们在本文中分别列出一样。
除非上下文另有规定，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
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现在在以下非限制性实施例中描述本发明。
实施例1：过表达植物的制备和鉴定
I.构建重组质粒
1.从玉米B73提取总RNA，进行反转录以获得cDNA
2.以步骤1得到的cDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物被测序以具有如SEQ ID NO：12所示的序列。
F1(SEQ ID NO：22)：
5′-GACTCTAGAGGATCCATGCCCCTTCGACAACGTC-3′；和
R1(SEQ ID NO：23)：
5′-GGTACCCGGGGATCCTCAGCACTTGGGCATGTTAGG-3′。
3.用限制性核酸内切酶Bam HI酶切pCUB载体，得到线性化的载体。
4.步骤3得到的线性化载体与步骤2得到的PCR扩增产物进行基于In-fusion的同源重组，得到重组质粒pCUB-ZmMZS。测序后，发现重组质粒pCUB-ZmMZS具有这样的结构，其中在pCUB载体的Bam HI切割位点内插入具有如SEQ ID NO：3所示序列的DNA分子。
II.制备转基因植物
以玉米品种综31为出发植物。玉米品种Zong 31也被称为野生型植物，在图中由WT表示。
在出发植物中导入重组质粒pCUB-ZmMZS，得到T0代转基因植物。将T0代的转基因植物近交，以获得T1代的植物。将T1代植物进一步近交以获得T2代植物。将在T2代获得的纯合转基因系命名为ZmMZS基因过表达株系。随机选取两个过表达ZmMZS基因的株系(#3株系和#4株系)，进行后续实验。
将pCUB载体转化到出发植物中，以获得T0代的转基因植物。将T0代的转基因植物近交以获得T1代的植物。将T1代植物进一步近交以获得T2代植物。将在T2代获得的纯合的转基因株系，命名为转空载体株系。
III.实时荧光定量PCR检测
试验植物为#3株系的T2代植物、#4株系的T2代植株和出发植物。
每个株系3株，结果取平均值。
取水培条件下生长7天(从催芽开始计天数)的试验植株的叶片，提取总RNA，采用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，鉴定ZmMZS基因的相对表达水平。采用Ubi基因为内参基因(用于鉴定内参基因的引物对由F3和R3组成)。
F2(SEQ ID NO：24)：5′-GCGTGTTGTTGTTAGCATTTGG-3′；
R2(SEQ ID NO：25)：5′-GGGTGATGTTCTTGTAGCCCTG-3′。
F3(SEQ ID NO：26)：5′-GCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3′；
R3(SEQ ID NO：27)：
5′-CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3′。
结果如图1所示。与野生型植株相比，#3株系植株和#4株系植株中ZmMZS基因的相对表达水平显著的升高。
IV.组织化学染色
试验植物为：#3株系的T2代植物、#4株系的T2代植物、转空载体株系的T2代植物和出发植物。
取水培条件下生长30天(从催芽开始计天数)的试验植物的第一节间、叶片以及根部成熟区，切片(切片厚度为50μm)，用5％间苯三酚染色2min，然后滴加1滴盐酸，在显微镜下进行观察。
根部的显微照片如图2A所示(其中比例尺为75μm)。
叶片的显微照片如图2B所示(其中比例尺为75μm)。
第一节间的显微照片如图2C所示(其中比例尺为75μm)。
与野生型植株相比，#3株系植株和#4株系植株的地上部分和根部的染色强度变深(即，木质素含量增加)。转空载体株系的植物的地上部分和根部的染色强度与野生型植物一致。
V.木质素含量的测定
试验植株为：#3株系的T2代植株、#4株系的T2代植株、转空载体株系的T2代植株和出发植物。每个株系3株，结果取平均值。
在成熟期授粉后的第7天，将试验植株的第三个节间在80℃下干燥至恒重，然后粉碎并过40目筛，收集粉末。称取约5mg的粉末于10ml玻璃试管中，采用购自苏州科铭生物技术有限公司的木质素含量测定试剂盒(乙酰溴法，具体步骤见说明书)测量木质素含量。
木质素含量(以mg/g计，其中mg为木质素的质量单位，g为粉末干重的质量单位)＝0.0735*(ΔA-0.0068)/W*T，其中A：在280nm处的吸光度；ΔA＝A测定管-A空白管；W：样本质量，单位为g；T：稀释倍数。
结果示于图3。与野生型植物相比，#3株系植物的茎秆中木质素含量增加了21.62％，而#4株系植株的茎秆中木质素含量增加了40.10％。与野生型植物相比，转空载体株系植物的茎秆中木质素含量无显著变化。
实施例2：抑制表达植株的制备和鉴定
I.构建重组质粒
将具有如SEQ ID NO：13所示序列的双链DNA分子插入pCUB载体的Bam HI切割位点，得到重组质粒pCUB-ZmMZS-Ri。具有SEQ ID NO：13所示序列的双链DNA分子表达具有SEQID NO：14所示序列的RNA分子。具有SEQ ID NO：14所示序列的RNA分子是具有SEQ ID NO：15所示序列的RNA的前体RNA。具有如SEQ ID NO：15所示的序列的RNA是靶向ZmMZS基因的miRNA。
II.制备转基因植物
以玉米品种综31为出发植物。玉米品种Zong 31也被称为野生型植物，在图中由WT表示。
在出发植物中导入重组质粒pCUB-ZmMZS-Ri，得到T0代转基因植株。将T0代的转基因植物近交以获得T1代的植物。将T1代植物进一步近交以获得T2代植物。将在T2代获得的纯合转基因株系命名为ZmMZS基因抑制表达株系。随机选择一个ZmMZS基因抑制表达株系(#5株系)进行后续试验。
将pCUB载体转化到出发植物中，以获得T0代的转基因植物。将T0代的转基因植物近交以获得T1代的植物。将T1代植物进一步近交以获得T2代植物。将在T2代获得的纯合的转基因株系，命名为转空载体株系。
III.组织化学染色
试验植株为#5株系的T2代植株、转空载体株系的T2代植株、出发植物。
取水培条件下生长30天(从催芽开始计天数)的试验植株的第一节间以及根部成熟区，切片(切片厚度为50μm)，用5％间苯三酚染色2min，然后滴加1滴盐酸，在显微镜下进行观察。
根部的显微照片如图4所示(其中比例尺为75μm)。
第一节间的显微照片如图5所示(其中比例尺为200μm)。
与野生型植株相比，#5株系植株的地上部分和根部的染色强度变浅(即，木质素含量降低)。转空载体株系的植物的地上部分和根部的染色强度与野生型植物一致。
IV.木质素含量的测定
试验植株为#5株系的T2代植株、转空载体株系的T2代植株、出发植物。
每个株系3株，结果取平均值。
在成熟期授粉后的第7天，将试验植株的第三节间在80℃下干燥至恒重，然后粉碎并过40目筛，收集粉末。称取约5mg的粉末于10ml玻璃试管中，采用购自苏州科铭生物技术有限公司的木质素含量测定试剂盒(乙酰溴法，具体步骤见说明书)测量木质素含量。
木质素含量(以mg/g计，其中mg为木质素的质量单位，g为粉末干重的质量单位)＝0.0735*(ΔA-0.0068)/W*T，其中A：在280nm处的吸光度；ΔA＝A测定管-A空白管；W：样本质量，单位为g；T：稀释倍数。
结果如图6所示。与野生型植物相比，#5株系植株的茎秆中木质素含量降低22.93％。与野生型植物相比，转空载体株系植物的茎秆中木质素含量无显著变化。
实施例3：构建重组质粒
pCUB载体是一种具有如SEQ ID NO：11所示的序列的环状质粒。
I.将具有如SEQ ID NO：13所示序列的双链DNA分子插入pCUB载体的Bam HI切割位点，以获得重组质粒pCUB-MIR。重组质粒pCUB-MIR是过量表达具有SEQ ID NO：15所示序列的miRNA的质粒。具有SEQ ID NO：13所示序列的双链DNA分子表达具有SEQ ID NO：14所示序列的RNA分子。具有SEQ ID NO：14所示序列的RNA分子是具有SEQ ID NO：15所示序列的miRNA的前体RNA。
II.将具有如SEQ ID NO：7所示序列的双链DNA分子插入pCUB载体的Bam HI切割位点，以获得重组质粒pCUB-MIM。SEQ ID NO：7中所示的位置218-241的核苷酸序列中“CTA”以外的部分与DNA反向互补，所述DNA对应于具有SEQ ID NO：15中所示的序列的RNA。重组质粒pCUB-MIM为抑制具有SEQ ID NO：15所示序列的miRNA表达的质粒。
实施例4：转基因植株的产生和表型鉴定
I.制备转基因植物
以玉米品种综31为出发植物。玉米品种Zong 31也被称为野生型植物，在图中由WT表示。
在出发植物中导入重组质粒pCUB-MIR，得到T0代转基因植株。将T0代的转基因植物近交以获得T1代的植物。将T1代植物进一步近交以获得T2代植物。将在T2代获得的纯合的转基因株系，命名为过表达株系。随机取一个过表达株系(OE)进行后续试验。
在出发植物中导入重组质粒pCUB-MIM，得到T0代转基因植株。将T0代的转基因植物近交以获得T1代的植物。将T1代植物进一步近交以获得T2代植物。将在T2代获得的纯合的转基因株系，命名为抑制表达株系。随机选择两个抑制表达株系(TM-3和TM-7)进行后续试验。
将pCUB载体转化到出发植物中，以获得T0代的转基因植物。将T0代的转基因植物近交以获得T1代的植物。将T1代植物进一步近交以获得T2代植物。将在T2代获得的纯合的转基因株系，命名为转空载体株系。
II.鉴定miRNA表达水平
试验植株为：OE株系的T2代植株、TM-3株系的T2代植株、TM-7株系的T2代株系、出发植物。每个株系5株，结果取平均值。
取试验植株的叶片，提取总RNA，采用RT引物进行反转录，然后采用F1和R1组成的引物对进行实时定量PCR，检测具有SEQ ID NO：15或9所示序列的miRNA的相对表达水平。采用Ubi基因为内参基因(用于鉴定内参基因的引物对由F2和R2组成)。
(SEQ ID NO：28)RT：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCTC.
(SEQ ID NO：29)F1：5′-GTGGAAGGGGCATGCA-3′；
(SEQ ID NO：30)R1：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。
(SEQ ID NO：26)F2：5′-GCTGCCGATGTGCCTGCGTCG-3′；
(SEQ ID NO：27)R2：
5′-CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG-3′。
结果如图7所示。与野生型植株相比，在OE株系植株中，具有如SEQ ID NO：15所示序列的miRNA的表达水平显著增加，在TM-3株系植株和TM-7株系植株中所述表达水平显著降低。
III.组织化学染色
试验植株为：OE株系的T2代植株、TM-3株系的T2代植株、TM-7株系的T2代植株、转空载体株系的T2代植株、出发植物。
取水培条件下生长30天(从催芽开始计天数)的试验植株的第一节间以及根部成熟区，切片(切片厚度为50μm)，用5％间苯三酚染色2min，然后滴加1滴盐酸，在显微镜下进行观察。
根部的显微照片如图8所示(其中比例尺为75μm)。
第一节间的显微照片如图9所示(其中比例尺为200μm)。
不论在地上部份还是根部，与野生型植株相比，OE株系植株中染色强度变浅(即木质素含量降低)，TM-3株系植株和TM-7株系植株中染色强度变深(即木质素含量增加)。转空载体株系的植物的地上部分和根部的染色强度与野生型植物一致。
IV.木质素含量的测定
试验植株为：OE株系的T2代植株、TM-3株系的T2代植株、TM-7株系的T2代植株、转空载体株系的T2代植株、出发植物。每个株系3株，结果取平均值。
在成熟期授粉后的第7天，将试验植株的第三节间在80℃下干燥至恒重，然后粉碎并过40目筛，收集粉末。称取约5mg的粉末于10ml玻璃试管中，采用购自苏州科铭生物技术有限公司的木质素含量测定试剂盒(乙酰溴法，具体步骤见说明书)测量木质素含量。
木质素含量(以mg/g计，其中mg为木质素的质量单位，g为粉末干重的质量单位)＝0.0735*(ΔA-0.0068)/W*T，其中A：在280nm处的吸光度；ΔA＝A测定管-A空白管；W：样本质量，单位为g；T：稀释倍数。
结果如图10所示。与野生型植株相比，OE株系植株的茎杆中的木质素含量降低了21.62％，TM-3株系植株的茎杆中的木质素含量升高了42.15％，TM-7株系植株的茎杆中的木质素含量升高了28.96％。与野生型植物相比，转空载体株系植物的茎秆中木质素含量无显著变化。
V.茎秆穿刺强度的测定
茎秆的穿刺强度与玉米的抗倒伏性明显相关，能够综合反映茎秆的强度和抗倒伏性。
试验植株为：OE株系的T2代植株、TM-3株系的T2代植株、TM-7株系的T2代植株、转空载体株系的T2代植株、出发植物。每个株系20株，结果取平均值。
成熟期授粉后第7天，将试验植株进行穿刺强度测定，具体地：使用AWOS-SL04型茎秆强度测定仪，将横截面积为1.0mm2的测头以茎秆的短轴方向垂直刺入地上第三节间中部，读取并记录试验数据。
结果如图11所示。与野生型植株相比，OE株系植株的茎杆的穿刺强度降低了22.15％，TM-3株系植株的茎杆的穿刺强度升高了18.97％，TM-7株系植株的茎杆的穿刺强度升高了21.45％。与野生型植株相比，转空载体株系植株的茎杆的穿刺强度无显著变化。
VI.盆栽实验
试验种子为：OE株系的T3代种子、TM-3株系的T3代种子、TM-7株系的T3代种子、转空载体株系的T3代种子、出发植物的种子。
取塑料花盆(32.5cm直径*26cm高)，每盆装土14.0kg。然后施用基肥，将催芽后的试验种子种植于花盆中，在露天条件下进行培养。
抽雄期植株的照片见图12。风吹之后，OE株系植株出现茎杆弯曲(说明茎杆机械强度变小)，TM-3株系植株、TM-7株系植株、野生型植株和转空载体株系植株仍保持直立(说明茎杆机械强度较高)。
实施例5：靶基因的确认
I.5′RACE试验
初步预测8个基因是具有SEQ ID NO：15或9所示序列的miRNA的候选靶基因，包括GRMZM2G367668、GRMZM2G169033、GRMZM2G148937、GRMZM2G178741、GRMZM2G039381、GRMZM2G062069、GRMZM2G043300和GRMZM2G004106，依次对各个候选靶基因进行验证。
提取玉米B73的总RNA，采用GeneRacerTM试剂盒对各个候选靶基因进行5′RACE试验。该过程包括靶基因mRNA产物连接5′RACE接头，反转录成cDNA、巢式PCR和特异片段的克隆及测序。具体见说明书。
结果表明，GRMZM2G367668转录本和GRMZM2G169033转录本上存在所述miRNA的切割位点。GRMZM2G367668转录本对应的DNA如SEQ ID NO：16所示，所述miRNA的切割位点位于GRMZM2G367668转录本的第222-242位核苷酸之间。GRMZM2G169033转录本对应的DNA如SEQID NO：17所示，所述miRNA的切割位点位于GRMZM2G169033转录本的第302-322位核苷酸之间。
II.Northern印迹分析
试验植株为：实施例4中制备的OE株系的T2代植株、TM-3株系的T2代植株、TM-7株系的T2代植株、转空载体株系的T2代植株和出发植物。
取幼苗期的试验植株的根，提取总RNA，进行Northern印迹分析试验(针对GRMZM2G169033转录本的探针如SEQ ID NO：18所示，针对GRMZM2G367668转录本的探针如SEQ ID NO：19所示。
结果如图13所示。OE株系植株中，GRMZM2G169033转录本和GRMZM2G367668转录本的水平明显下降。TM-3株系植株和TM-7株系植株中，GRMZM2G169033转录本和GRMZM2G367668转录本水平明显升高。结果表明，GRMZM2G169033转录本和GRMZM2G367668转录本为所述miRNA的靶基因。
实施例6：MicroRNA528在氮奢华条件下通过调节木质素的生物合成影响玉米的抗倒伏性。
I.玉米幼苗木质素的组成和含量受氮供应的影响。
如前所述，在氮奢华条件下倒伏会降低中国的玉米产量。由于倒伏可能与木质素有关，并且由于缺乏在不同氮条件下玉米木质素组成和含量的定量数据，我们使用硫代酸解法(thioacidolysis)首次确定了氮对玉米木质素组成的影响。与氮的充足相比，氮的不足实质上诱导了玉米幼苗的枝条中H、G和S单体的生成(表2)。相反，氮奢华显著抑制了这些单体的生成(表2)。此外，当氮供应有限时，枝条中的S/G比高，而当氮供应过多时，S/G比低(表2)。
表2不同氮条件下玉米幼苗的木质素组成和含量。
Figure BDA0002515773860000661
Figure BDA0002515773860000671
NL、NS和ND分别表示氮奢华、氮充足和氮不足。H，G和S分别是p-香豆基醇、松柏基醇和芥子基醇。DW，干重。值是四次生物学重复的平均值±SE。根据LSD测试，具有相同字母的均值在P＜0.01时无显著差异。
我们还使用了乙酰溴(AcBr)分析(Iiyama和Wallis，1990)来量化氮供应对玉米幼苗总木质素含量的影响。与硫代酸解法一致，AcBr分析表明，玉米幼苗的枝条中总木质素的含量通过氮奢华而降低，却通过氮不足而提高(表2)。30天龄水培生长的玉米茎秆和叶的间苯三酚染色证实了硫代酸解和AcBr结果。总之，这些结果表明玉米的木质素组成和含量受氮供应的影响。
II.ZmmiR528受氮供应调节
玉米中ZmmiR528家族有两个成员，ZmMIR528a和ZmMIR528b，它们的成熟序列相同。在ZmMIR528a和ZmMIR528b的1.5-kb启动子区域中可以找到被N反应性转录因子识别的几个基序，包括TGA1/TGA4和NAC4(Vidal等，2013，Alvarez等，2014)。我们之前的测序数据也显示，氮不足显著下调了ZmMIR528a和ZmMIR528b(Zhao等，2012)。为了确定氮供应如何调节ZmmiR528的表达，我们在氮奢华和氮不足条件下用水培生长的玉米进行了时程实验。茎秆-环qRT-PCR表明，ZmmiR528在枝条中的表达通过氮奢华而诱导，但通过氮不足而减少(图14A)，这与响应于氮奢华和不足的总木质素含量的变化相反(表2)。换句话说，氮奢华增加ZmmiR528的表达并降低总木质素含量，而氮不足降低ZmmiR528的表达并增加总木质素含量。
III.ZmLAC3和ZmLAC5是ZmmiR528的靶标
ZmmiR528的潜在靶标包括ZmLAC3，ZmLAC5，几种铜氧还蛋白(GRMZM2G043300、GRMZM2G004106和GRMZM2G039381)和同源盒转录因子22ZmHB22(GRMZM2G178741)(Zhang等，2009)。只有ZmLAC3和ZmLAC5显示出对响应氮奢华和氮不足的与ZmmiR528相反的表达模式(图14B和C)，表明铜氧还蛋白(cupredoxins)和ZmHB22不是ZmmiR528的靶标，或者它们在翻译水平上受ZmmiR528的调控。因此，我们选择了ZmLAC3和ZmLAC5用于进一步分析。为了确定ZmmiR528是否能够调节ZmLAC3和ZmLAC5的表达，我们在本氏烟草(Nicotianabenthamiana)中进行了瞬时共表达测定。在本氏烟草中共表达2天后，提取RNA，并通过qRT-PCR分析ZmLAC3和ZmLAC5转录本。当与ZmMIR528b共表达时，ZmLAC3和ZmLAC5转录本的丰度显著降低(图15A)。此外，通过使用来自玉米幼苗的RNA进行5′RACE(cDNA末端的快速扩增)测定来确定ZmLAC3和ZmLAC5中的预测靶位点(图15B)。综上所述，这些结果显示ZmLAC3和ZmLAC5是ZmmiR528在玉米中的真正靶标。
IV.ZmmiR528主要在维管组织中表达
因为有关ZmmiR528的空间分布的信息可以提供对其功能的深入了解，所以我们通过qRT-PCR研究了ZmmiR528在不同玉米组织中的表达模式。ZmmiR528在第十叶片(自下至上)中高表达，在节间适度表达，在成年玉米植株的根中低表达。相反，ZmLAC3和ZmLAC5的表达模式与ZmmiR528相反，除了ZmLAC5在节间也高度表达。
通过原位杂交分析进一步检查了ZmmiR528的表达模式。在玉米叶和茎秆的韧皮部以及侧根的维管区域中特异性检测到了ZmmiR528(图16A)。由于ZmLAC5在玉米节间中的表达水平也很高，因此也通过原位杂交检查了ZmLAC5在玉米茎秆中的表达模式。与ZmmiR528不同，ZmLAC5转录本在玉米茎秆纤维中积累(图16B)，进一步表明ZmmiR528对ZmLAC的负调控。
V.ZmmiR528影响氮奢华条件下玉米的抗倒伏性
为了表征ZmmiR528的功能，我们在组成型泛素启动子的控制下生成了过表达ZmmiR528的转基因玉米株系。由于野生型(WT)玉米中ZmmiR528的高表达水平，因此仅获得了一个株系(OE)(图17E)(Zhao等，2012)。由于ZmmiR528家族有两个成员，因此难以使用CRISPR/Cas9系统生成ZmmiR528功能丧失的突变体。因此，如Yan等(2012)所述设计了靶向ZmMIR528a和ZmMIR528b的短串联靶模拟物，并将其引入玉米中。通过小RNA Northern印迹测定，验证了ZmMIR528a和ZmMIR528b破坏的有效性，并选择了两个独立的敲低株系(TM-3和TM-7)进行后续分析(图17E)。ZmLAC3和ZmLAC5的mRNA丰度由ZmmiR528的过表达而降低，但由ZmmiR528的敲低而增加(图17G)，进一步表明ZmLAC3和ZmLAC5由ZmmiR528直接调节。
氮供应对ZmmiR528的调控及其在维管组织中的特异性表达促使我们分析其在木质素生物合成中的潜在作用。有趣的是，ZmmiR528丰度与水培玉米幼苗中木质素含量呈负相关，而与纤维素和半纤维素含量则不相关(图17F)。TM转基因玉米中木质素的含量是WT中的～1.5倍高(图17F)。此外，OE转基因玉米茎秆的韧皮部比WT或TM转基因玉米的韧皮部的细胞数较少且细胞直径更大，说明书韧皮部细胞在OE转基因玉米中排列较松散。因此，我们评价了转基因玉米植株在氮奢华条件下的抗倒伏性。在氮奢华条件下，OE转基因玉米比WT或TM转基因玉米更容易倒伏(图17A)。与该表型一致，OE转基因玉米的耐皮透度计抗性和AcBr木质素含量远低于WT或TM转基因玉米(图17B和C)。TM和OE转基因玉米中的纤维素和半纤维素含量与WT中相似(图17D)。这些结果表明，ZmmiR528通过影响木质素含量来影响氮奢华条件下玉米的抗倒伏性。
VI.ZmLAC3的过表达增加了玉米中木质素的含量
漆酶是在许多生物中发现的含铜糖蛋白。已经证明漆酶是必需的，并且在拟南芥的维管发育过程中，在木质素聚合中与过氧化物酶非冗余地起作用(Zhao等，2013)。为了进一步表征ZmmiR528在玉米木质素生物合成中的功能，我们在组成型泛素动子的控制下，生成了过表达ZmLAC3(ZmmiR528靶标之一)的转基因玉米植物。两个转基因株系(#3和#4)基于其ZmLAC3的高水平表达，被选择用于进一步分析(图19A)。WT和ZmLAC3OE转基因玉米幼苗茎秆和叶的间苯三酚染色表明ZmLAC3的过表达增加了木质素含量(图18A)。例如，在氮奢华和氮充足的条件下，木质素的异位沉积在ZmLAC3OE转基因玉米的茎秆表皮中很明显，而在WT玉米的茎秆表皮中则没有(图18A)。根据AcBr分析，在氮奢华条件下，ZmLAC3OE转基因玉米中成熟茎秆中木质素含量比WT高11％-20％(图18B)。ZmLAC3OE转基因玉米中的耐皮透度计抗性也比野生型玉米中的高(图18C)。与在ZmmiR528 TM转基因玉米中观察到的一致，在氮奢华条件下，与WT玉米相比，ZmLAC3的过表达不影响纤维素和半纤维素含量(图18D和E)。
VII.ZmmiR528和氮供应影响ZmPAL的表达
为了深入了解ZmmiR528介导的信号通路中的分子事件，我们使用RNA测序(RNA-seq)比较了WT和ZmmiR528 TM转基因玉米的整个转录组谱。从15天龄水培近交株系的叶片中提取总RNA，并向转基因玉米提供充足的氮。每种基因型都有3次生物学重复，并使用Illumina高通量测序技术对文库进行测序。这六个RNA文库产生了超过2.8亿个原始读数。丢弃无法映射到玉米基因组的序列，仅对那些完全映射的序列进行进一步分析。每个基因的丰度表达为每一百万个映射读数、每一千个碱基的片段(Trapnell等，2010)。在非胁迫条件下，与WT相比，ZmmiR528 TM转基因玉米中，约2328个基因显示出统计学上的显著变化。在ZmmiR528 TM转基因玉米中，差异表达基因(DEG)中有1048个被下调，而1281个被上调。通过对UniProt数据库(http://www.uniprot.org/blast/)进行BLAST搜索，我们在功能上注释了DEG的1932个。在DEG中，据报道UDP-糖基转移酶72B1(UGT72B1)催化木质素单体的葡萄糖缀合，并对于拟南芥中正常细胞壁木质化至关重要(Lin等，2016)。AtABCG29是参与木质素生物合成的对-香豆基醇转运蛋白(Alejandro等，2012)。在ZmmiR528 TM转基因玉米中，这些基因在玉米中的相应直系同源基因GRMZM2G156026和GRMZM2G366146的转录本显著上调。基因本体(GO；http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/)分析表明，注释的DEG主要参与GO：0006950(对应激的反应；p＝1.70E-6)，GO：0019748(次级代谢过程；p＝6.80E-6)，GO：0044271(细胞氮化合物生物合成过程；p＝0.0008)，GO：0005618(细胞壁；p＝2.60E-14)，和GO：0030054(细胞连接；p＝5.60E-10)。
GRMZM2G170692和GRMZM2G334660引起了我们的注意，因为它们分别编码苯丙氨酸解氨酶7(PAL7)和PAL8。PAL不仅催化了一系列酶促反应的第一步，这些反应从苯丙氨酸生成木质素单体，而且还是苯丙氨酸(phenylpropanoid)-氮循环中的关键环节(Cant6n等，2005；Vanholme等，2008)。在氮充足的条件下，ZmmiR528负影响ZmPAL7和ZmPAL8表达，即ZmPAL7和ZmPAL8 mRNA水平在ZmmiR528 TM转基因玉米中最高，随后依次是WT和ZmmiR528OE转基因玉米(图20)。这些结果在ZmLAC3OE转基因玉米中得到了进一步验证(图19B)。氮不足显著诱导了WT、ZmmiR528 OE和TM转基因玉米中ZmPAL7和ZmPAL8的表达，在ZmmiR528 TM转基因玉米中观察到了最高的诱导作用(图20)。在氮奢华的条件下，ZmmiR528 TM转基因玉米中的ZmPAL7和ZmPAL8表达水平与氮充足的条件下的相似。相反，在氮奢华条件下，在WT和ZmmiR528OE转基因玉米中表达水平显著降低(图20)。还通过实时RT-PCR测定了这些转基因玉米株系中另外七个ZmPAL的表达水平。与ZmPAL7和ZmPAL8一致，ZmPAL1和ZmPAL3的mRNA水平受氮供应、ZmmiR528和ZmLAC3丰度的调节(图20和19B)。
VIII.讨论
尽管玉米是研究植物发育和进化的重要模型，但对玉米的研究却落后于水稻和拟南芥的研究，这可能是因为转基因玉米的低转化效率和有限的遗传背景。迄今为止，玉米中唯一功能上表征的miRNA是ZmmiR156(Chuck等，2007a)，ZmmiR164(Li等，2012)，ZmmiR166(Juarez等，2004)和ZmmiR172(Lauter等，2005，Chuck等，2007b)。在本研究中，我们发现ZmmiR528，通过负调控ZmLAC3和ZmLAC5 mRNA的丰度，影响氮奢华条件下的玉米的木质素生物合成和抗倒伏性，为氮素和木质素生物合成之间的关系提供了重要的见解。
在中国，在氮奢华条件下的倒伏是限制玉米产量的主要问题。在杨树中，木质部次生细胞壁中的木质素在氮奢华条件下会减少，但在氮限制性条件下会持续沉积(Camargo等，2014)。在牧草中，木质素含量通过氮施肥而增加(Collins等，1990)。在这里，我们量化了氮处理对玉米中木质素组成和含量的影响。氮奢华显著抑制了玉米幼苗中H、G和S单体的生成以及总木质素含量。TGA1/4和NAC4转录因子是硝酸盐响应网络的关键调节因子(Vida1等，2013；Alvarez等，2014)。在ZmMIR528a/b的1.5-kb启动子区域中发现了与这些转录因子相对应的结合位点，表明ZmMIR528a/b的表达可以通过氮处理来调节，并且茎秆-环qRT-PCR证实了这一假说。ZmMIR528a/b可以直接切割ZmLAC3和ZmLAC5，木质素含量在ZmmiR528敲低突变体和ZmLAC3过表达的转基因玉米中特别地提高。木质素的异位沉积在这些株系的茎杆表皮中是明显的。虽然在拟南芥lac4lac11lac17三重突变体中，木质素单体的生物合成基因几乎没有受到影响(Zhao等，2013)，但在目前的研究中，ZmmiR528的敲低和ZmLAC3的过表达显著提高了PAL的表达水平。在氮豪华条件下，ZmmiR528 TM转基因玉米中的ZmPAL表达水平比WT或ZmmiR528 OE转基因玉米中的高得多。综上所述，miR528的水平升高以及ZmLAC和ZmPAL的丰度降低，可以解释玉米在氮奢华条件下的抗倒伏性降低(图21)。
如前所述，miRNA528是单子叶植物特异性的miRNA。尽管miRNA528的成熟序列(5′-UGG AAG GGG CAU GCA GAG GAG-3′)在水稻和玉米中相同，但miRNA528在这些物种中的功能却有所不同。在水稻中，OsmiR528通过下调AO来促进免疫反应(Wu等人，2017)。我们在本氏烟草和5′RACE中使用了共表达，以确定与大米相比，玉米中的ZmLAC3和ZmLAC5是ZmmiR528的真实靶标。ZmLAC3的过表达增加了玉米中木质素的含量，这与ZmMIR528a/b TM转基因玉米的表型一致。另外，ZmmiR528在玉米叶和茎秆的韧皮部中特异性表达。总之，我们的结果表明，通过调节ZmLAC3和ZmLAC5，ZmmiR528影响玉米木质素的生物合成。
漆酶的转录调控对于拟南芥中次生壁的形成非常重要(Mitsuda等，2007，Zhou等，2009，Wang等，2010)。尽管拟南芥缺少miRNA528，但它还有其他的提供与木质素生物合成相关的重要功能的miRNA。例如，miRNA408在拟南芥中的过表达下调了LAC13和ARPN mRNA的水平并增加营养生长(Zhang和Li，2013)；miRNA397b通过调节参与木质素生物合成的漆酶来调节拟南芥中的木质素含量和种子数量(Wang等，2014)；和miRNA857通过调节LAC7来调节拟南芥中维管组织的次级生长(Zhao等，2015)。因此，我们推断木质素生物合成的转录后调控在单子叶植物和双子叶植物之间是保守的。
玉米除了是人类的食物来源之外，还是用于生物燃料生产的重要原料和家畜的重要饲料作物。使用玉米生产生物燃料需要除去木质素，并且木质素影响饲料作物的可消化性(Zhou等，2009)。因为ZmmiRNA528 OE转基因玉米具有降低的木质素含量，它可用于生物燃料生产或饲料。最重要的是，当前研究的结果表明，可以对ZmmiR528和ZmLAC模块进行改造，以减少氮奢华条件下玉米的倒伏。
IX.方法
植物材料和生长条件
将大小均一的种子在10％H2O2中表面灭菌20分钟。将它们浸泡在饱和CaSO4溶液中并连续通风6小时后，将种子在粗石英砂中发芽，直到可见两片叶子为止。按Zhao等(2012)所述对幼苗进行水培，以评估对氮充足(4mM NO3 -，在全强度Hoagland营养液中的浓度)、氮奢华(8mM NO3 -)或氮不足条件(0.04mM NO3 -)的反应。玉米还可以在土壤中生长，以测定氮奢华条件下的抗倒伏性。对于土壤培养，在自然条件下将植物在装有10公斤土壤的花盆中生长70天。种植前，将6.2g尿素，12.1g过磷酸钙和5.5g硫酸钾混合到每个盆栽土壤中。盆栽试验中尿素肥料的量比实际投入量高约两倍。在玉米V6阶段，向每个盆中施用额外的2g尿素。
转基因玉米的构建与产生
通过PCR扩增没有3′UTR的ZmLAC3的cDNA。从基因组DNA扩增围绕ZMMIR528b序列的包括折回结构的～80bp片段。为了生成ZmmiR528敲低突变体ZmmiR528 TM，我们设计了靶向ZmMIR528a和ZmMIR528b的短串联靶模拟物，如Yan等(2012)所述。使用BamHI限制性位点通过In-Fusion反应，在水稻泛素启动子控制下，将扩增的片段克隆到pCUB载体中。
在CaMV35S启动子的控制下，将含有链霉菌属吸湿性草丁膦乙酰转移酶(phosphinothricinacetyltransferase)(bar)基因的构建的质粒电穿孔到根癌农杆菌EHA105中。在中国国家种子集团生命科学和技术中心，通过与EHA105共培养，转化玉米近交系ZZC01的不成熟胚。用逐渐增加浓度的双丙氨膦选择转化体。产生20个以上独立的转基因事件，并对具有单拷贝或低拷贝数的事件进行进化，以便与玉米近交株系ZZC01自交或杂交，产生T1种子。在实时qRT-PCR分析后，将具有确认的转基因表达的T1植物自花授粉以产生T2种子。T2纯合系用于所有实验。
木质素、纤维素和半纤维素含量的分析
对15天龄的经水培生长的玉米植物的不同部分和V9生长期从土壤生长的玉米底部起的第三节间进行取样。将样品在45℃下干燥7天，然后研磨成细粉。木质素组成通过硫代酸解测定(Lapierre等，1995)。AcBr方法用于测定总木质素含量，如Fukushima和 Hatfield(2004)所述。使用改良的NREL程序测定纤维素和半纤维素含量(Sluiter等， 2008)。
维管结构的组织化学分析
我们对15天龄水培玉米的相同位置和30天龄水培玉米根部上方的茎秆的第一个2cm处的相同位置的叶子进行了采样。如先前所述，通过Wiesner染色将这些样品的维管结构可视化(Berthet等，2011)。
RNA分析
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从近交株系和转基因玉米中提取总RNA。对于ZmmiR528的定量，如先前所述进行了茎秆-环qRT-PCR(Chen等，2005)。实时RT-PCR和切割位点映射按照Zhao等(2012)的描述进行。
本氏烟草中的瞬时表达
用引物扩增包括折返结构的ZmLAC3、ZmLAC5和ZmMIR528b的全长cDNA序列。使用Bam HI限制性位点通过In-Fusion反应，将扩增的片段克隆到pCPB载体中。将质粒电穿孔到根癌农杆菌GV3101中，并如Li等(2008)所述在烟草表皮细胞中瞬时表达。渗透后2天收获叶子，并如上所述进行RNA分析。
原位杂交
ZmmiR528的原位杂交是按照Trevisan等(2012)的描述进行的。对于ZmLAC5探针，扩增具有高特异性的385bp片段，并将其克隆到pGEM-T-easy载体(Promega)中。使用T7或SP6 RNA聚合酶通过体外转录产生相应的有义和反义探针。ZmLAC5的原位杂交如先前所述(Zhang等，2007)进行。
断裂力的测量
在V9生长阶段，从土壤种植的玉米底部开始的第三节间用于测量。用微型测试仪(microtester)(AWOS-SL04)记录了折断茎秆所需的力。测量了每种基因型的十株植物，所有测量均在相同条件下进行。
细胞数和大小
为了确定每种基因型的韧皮部细胞数量和直径，将从底部开始的第二片叶子的相同部分在0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的2.5％戊二醛中于4℃固定过夜，并在1％OsO4中固定2h。电子断层图是用在80kV下操作的HT7700透射电子显微镜(Hitachi)收集的。ImagePro Plus 6.0用于测量韧皮部细胞直径。
实施例7：CRISPR/Cas9介导的miRNA528 a和b编辑。
产生了两对独立的MIRNA528 gRNA：
528a：TCAGGGTCAGTTTGCTCTGCTGG(SEQ ID NO：33)，TGCGCAGTTGCCCTGTGATGAGG(SEQ ID NO：36)
528b：TCTCTAGTTCTGGGAGTTCCTGG(SEQ ID NO：40)和AAAACTCAGAAGCGCAACCGAGG(SEQ ID NO：43)
此后，通过In-Fusion反应，使用HindIII限制性位点将片段克隆到pCPB载体中。sgRNA和hSpCas9的示意图如图22所示。
实施例9：实地研究
我们制作了miR528敲低的转基因(雌性)植物，并将其与倾向于倒伏的雄性杂交。然后将F1代与易倒伏的近交系回交。如图23中的照片所示，与已经与易倒伏植物(WTxhybrids)杂交而没有任何阴性表型(例如延迟开花时间)的野生型植物相比，所得到的植物在田间的倒伏(当暴露于倒伏条件下)增加了。抗倒伏植物可以用作雄性或雌性亲本以产生新的杂种。
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序列表
SEQ ID NO：1漆酶3氨基酸
Figure BDA0002515773860000841
SEQ ID NO：2漆酶3基因组核酸
Figure BDA0002515773860000842
Figure BDA0002515773860000851
SEQ ID NO：3漆酶3 CDS核酸
Figure BDA0002515773860000852
Figure BDA0002515773860000861
SEQ ID NO：4漆酶5氨基酸
Figure BDA0002515773860000862
SEQ ID NO：5漆酶5基因组核酸(GRMZM2G367668)
Figure BDA0002515773860000863
Figure BDA0002515773860000871
SEQ ID NO：6漆酶5CDS核酸
Figure BDA0002515773860000872
Figure BDA0002515773860000881
SEQ ID NO：7 STTM核酸序列
Figure BDA0002515773860000882
SEQ ID NO：8STTM RNA序列
Figure BDA0002515773860000883
SEQ ID NO：9：miR528 RNA序列
Figure BDA0002515773860000884
SEQ ID NO：10miR528核酸序列
Figure BDA0002515773860000885
SEQ ID NO：11：pCUB载体序列
Figure BDA0002515773860000886
Figure BDA0002515773860000891
Figure BDA0002515773860000901
Figure BDA0002515773860000911
Figure BDA0002515773860000921
Figure BDA0002515773860000931
Figure BDA0002515773860000941
Figure BDA0002515773860000951
Figure BDA0002515773860000961
SEQ ID NO：12(PCR扩增产物)
Figure BDA0002515773860000962
Figure BDA0002515773860000971
SEQ ID NO：13(miR528的前体的核酸序列)
Figure BDA0002515773860000972
SEQ ID NO：14(miR528的前体RNA)
Figure BDA0002515773860000973
SEQ ID NO：15(miR528)
Figure BDA0002515773860000974
SEQ ID NO：16(GRMZM2G367668转录本的相应DNA)
Figure BDA0002515773860000981
Figure BDA0002515773860000991
SEQ ID NO：17(GRMZM2G169033转录本的相应DNA)
Figure BDA0002515773860000992
Figure BDA0002515773860001001
Figure BDA0002515773860001011
SEQ ID NO：18(GRMZM2G169033转录本的探针)
Figure BDA0002515773860001012
SEQ ID NO：19(GRMZM2G367668转录本的探针)
Figure BDA0002515773860001013
SEQ ID NO：31(tracrRNA)
Figure BDA0002515773860001014
SEQ ID NO：32(miR528a)
Figure BDA0002515773860001015
SEQ ID NO：33(miR528a靶标1)
Figure BDA0002515773860001016
SEQ ID NO：34(miR528a原间隔子1)
Figure BDA0002515773860001017
SEQ ID NO：35(miR528a完整sgRNA 1)
Figure BDA0002515773860001018
SEQ ID NO：36(miR528a靶标2)
Figure BDA0002515773860001019
SEQ ID NO：37(miR528a原间隔子2)
Figure BDA00025157738600010110
SEQ ID NO：38(mi528a完整sgRNA 2)
Figure BDA00025157738600010111
SEQ ID NO：39(miR528b)
Figure BDA0002515773860001021
SEQ ID NO：40(miR528b靶标1)
Figure BDA0002515773860001022
SEQ ID NO：41(miR528b原间隔子1)
Figure BDA0002515773860001023
SEQ ID NO：42(mi528b完整sgRNA 1)
Figure BDA0002515773860001024
SEQ ID NO：43(miR528b靶标2)
Figure BDA0002515773860001025
SEQ ID NO：44(miR528b原间隔子2)
Figure BDA0002515773860001026
SEQ ID NO：45(miR528b完整sgRNA 2)
Figure BDA0002515773860001027
SEQ ID NO：46(启动子序列(ZmUbi)向导Cas9
Figure BDA0002515773860001028
Figure BDA0002515773860001031
SEQ ID NO：47Cas9
Figure BDA0002515773860001032
Figure BDA0002515773860001041
Figure BDA0002515773860001051
SEQ ID NO：48：gRNA序列
Figure BDA0002515773860001052
SEQ ID NO：49miR528a核酸序列
Figure BDA0002515773860001053
SEQ ID NO：50：miR528b核酸序列
Figure BDA0002515773860001054
SEQ ID NO：51：Lac3靶标1
Figure BDA0002515773860001055
SEQ ID NO：52：Lac3原间隔子1
Figure BDA0002515773860001056
SEQ ID NO：53：Lac3完整sgRNA 1：
Figure BDA0002515773860001057
SEQ ID NO：54：Lac3靶标2
Figure BDA0002515773860001058
SEQ ID NO：55：Lac3原间隔子2
Figure BDA0002515773860001059
SEQ ID NO：56：Lac3完整sgRNA 2：
Figure BDA00025157738600010510
SEQ ID NO：57：Lac5靶标1
Figure BDA0002515773860001061
SEQ ID NO：58：Lac5原间隔子1
Figure BDA0002515773860001062
SEQ ID NO：59：Lac5完整sgRNA 1
Figure BDA0002515773860001063
SEQ ID NO：60：Lac5靶标2
Figure BDA0002515773860001064
SEQ ID NO：61：Lac5原间隔子2
Figure BDA0002515773860001065
SEQ ID NO：62：Lac5完整sgRNA 2
Figure BDA0002515773860001066
SEQ ID NO：63LbCpf1的DNA序列：
Figure BDA0002515773860001067
Figure BDA0002515773860001071
SEQ ID NO：64：LbCpf1的蛋白序列：
Figure BDA0002515773860001072
SEQ ID NO：65：LAC3的替换序列(粗体为人工miR528结合位点)：
Figure BDA0002515773860001081
SEQ ID NO：66：LAC3的替换序列(粗体为人工miR528结合位点)：
Figure BDA0002515773860001082
SEQ ID NO：72：SEQ ID NO：35的RNA序列(miR528a完整sgRNA 1)
Figure BDA0002515773860001083
SEQ ID NO：73：SEQ ID NO：38的RNA序列(mi528a完整sgRNA 2)
Figure BDA0002515773860001084
SEQ ID NO：74：SEQ ID NO：42的RNA序列(mi528b完整sgRNA 1)
Figure BDA0002515773860001085
SEQ ID NO：75：SEQ ID NO：45的RNA序列(miR528b完整sgRNA 2)
Figure BDA0002515773860001086
SEQ ID NO：76：SEQ ID N0：53的RNA序列(Lac3完整sgRNA 1)
Figure BDA0002515773860001087
SEQ ID NO：77：SEQ ID N0：56的RNA序列(Lac3完整sgRNA 2)
Figure BDA0002515773860001088
SEQ ID NO：78：SEQ ID N0：59的RNA序列(Lac5完整sgRNA 1)
Figure BDA0002515773860001089
SEQ ID NO：79：SEQ ID N0：62的RNA序列(Lac5完整sgRNA 2)
Figure BDA0002515773860001091
Figure IDA0002515773910000011
Figure IDA0002515773910000021
Figure IDA0002515773910000031
Figure IDA0002515773910000041
Figure IDA0002515773910000051
Figure IDA0002515773910000061
Figure IDA0002515773910000071
Figure IDA0002515773910000081
Figure IDA0002515773910000091
Figure IDA0002515773910000101
Figure IDA0002515773910000111
Figure IDA0002515773910000121
Figure IDA0002515773910000131
Figure IDA0002515773910000141
Figure IDA0002515773910000151
Figure IDA0002515773910000161
Figure IDA0002515773910000171
Figure IDA0002515773910000181
Figure IDA0002515773910000191
Figure IDA0002515773910000201
Figure IDA0002515773910000211
Figure IDA0002515773910000221
Figure IDA0002515773910000231
Figure IDA0002515773910000241
Figure IDA0002515773910000251

Claims (108)

1.改变对植物倒伏的抗性的方法，该方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平和/或改变miR528的表达或活性。
2.权利要求1的方法，其中所述方法增加对植物倒伏的抗性，并且其中所述方法包括增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述漆酶基因选自漆酶3和漆酶5。
4.上述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQID NO:1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物，和/或如SEQ ID NO:4中定义的漆酶5多肽或其功能性变体或同源物。
5.权利要求4的方法，其中编码漆酶3的所述核酸包含如SEQ ID NO:2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，且其中编码漆酶5的所述核酸包含如SEQ ID NO:5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
6.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调控序列可操作地连接的如SEQ ID NO:7或16中定义的核酸序列或其功能变体。
7.权利要求4或6中任一项所述的方法，其中所述调控序列是组成型启动子或强启动子。
8.权利要求2的方法，其中所述miR528的活性是使用至少一种miR528抑制剂降低的。
9.权利要求8所述的方法，其中所述miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO:8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
10.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因中，其中所述漆酶多肽包含在miR528结合位点中的至少一个突变和/或将至少一个突变引入到miR528和/或b基因或所述miR528启动子中。
11.权利要求10所述的方法，其中所述漆酶基因选自漆酶3和漆酶5，且其中所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO:1中定义的多肽，并且其中所述漆酶5基因编码如SEQ ID NO:4中定义的多肽。
12.权利要求10所述的方法，其中将至少一个突变引入选自SEQ ID NO:3的位置1至12的至少一个位置或选自SEQ ID NO:2的位置191至211的至少一个位置或选自SEQ ID NO:6的位置48至68的至少一个位置。
13.权利要求12所述的方法，其中使用靶向基因组修饰优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9，引入所述突变。
14.权利要求12所述的方法，其中使用诱变优选TILLING或T-DNA插入，引入所述突变。
15.权利要求1所述的方法，其中所述方法降低对植物倒伏的抗性，并且其中所述方法包括降低至少一个漆酶基因的表达和/或提高miR528的表达或活性。
16.权利要求15所述的方法，其中所述漆酶基因选自漆酶3和漆酶5，并且其中所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO:1中定义的多肽，并且其中所述漆酶5基因编码如SEQ ID NO:4中定义的多肽。
17.权利要求15或16所述的方法，其中所述方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因和/或启动子中，其中与野生型或对照多肽相比，所述突变降低所述漆酶核酸的表达。
18.权利要求17所述的方法，其中使用靶向基因组修饰优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9，引入所述突变。
19.权利要求17所述的方法，其中使用诱变优选TILLING或T-DNA插入，引入所述方法。
20.权利要求15或16所述的方法，其中所述方法包括使用RNA干扰来减少或消除至少一个漆酶核酸，优选漆酶3和/或5核酸，的表达。
21.权利要求15或16所述的方法，其中所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO:10中定义的miR528或其功能变体。
22.权利要求15或16所述的方法，其中所述方法包括引入包含SEQ ID NO:9或其功能变体的miR528。
23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中与对照或野生型植物相比，所述植物具有增加的木质素含量。
24.前述权利要求中任一项所述的方法，其中与野生型或对照植物相比，至少一个漆酶基因的表达或水平和/或miR528的表达或活性改变。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中与对照或野生型植物相比，根抗倒伏性改变。
26.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物是玉米。
27.增加产量、种子品质和茎杆强度中的至少一个的方法，所述方法包括增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性。
28.改变植物中木质素含量的方法，该方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平和/或改变miR528的表达或活性。
29.基因改变的植物、其部分或植物细胞，其中所述植物的特征在于至少一个漆酶基因的表达或水平的改变和/或miR528的表达或活性的改变。
30.权利要求29所述的基因改变的植物，其中所述植物的特征在于木质素含量的改变。
31.权利要求29或30所述的基因改变的植物，其中所述植物的特征在于与野生型或对照植物相比，至少一个漆酶基因的表达增加和/或miR528的表达或活性降低。
32.权利要求31所述的基因改变的植物，其中所述植物表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO:1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物，和/或编码如SEQ ID NO:4中定义的漆酶5多肽或其功能性变体或同源物的核酸。
33.权利要求32所述的基因改变的植物，其中编码漆酶3的所述核酸包含如SEQ ID NO:2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，且其中编码漆酶5的所述核酸包含如SEQ IDNO:5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
34.权利要求31所述的基因改变的植物，其中所述植物表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调控序列可操作地连接的如SEQ ID NO:7或16中定义的核酸序列或其功能变体。
35.权利要求32或34所述的基因改变的植物，其中所述调控序列是组成型启动子或强启动子。
36.权利要求31所述的基因改变的植物，其中所述植物表达至少一种miR528抑制剂。
37.权利要求36所述的基因改变的植物，其中所述miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO:8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
38.权利要求31所述的基因改变的植物，其中所述植物在至少一个编码漆酶核酸的核酸中包含至少一个突变，优选其中所述漆酶核酸选自漆酶3和5，并且其中所述突变在miR528结合位点中和/或是在miR528和/或b基因或miR528启动子中的至少一个突变。
39.权利要求38所述的基因改变的植物，其中使用靶向基因组修饰优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9，引入所述突变。
40.权利要求38所述的基因改变的植物，其中使用诱变优选TILLING或T-DNA插入，引入所述突变。
41.权利要求38至40中任一项所述的基因改变的植物，其中所述突变在选自SEQ IDNO:3的位置1至12的至少一个位置或选自SEQ ID NO:6的位置48至68的至少一个位置处引入。
42.权利要求31所述的基因改变的植物，其中所述植物表达至少一种miR528抑制剂，其中所述miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO:8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
43.权利要求29或30所述的基因改变的植物，其中所述植物的特征在于与野生型或对照植物相比，至少一个漆酶基因的表达降低和/或miR528的表达或活性增加。
44.权利要求43所述的基因改变的植物，其中所述植物表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO:10中定义的miR528或其功能变体，或其中所述植物表达包含SEQ ID NO:9的miR528或其功能变体。
45.权利要求44所述的基因改变的植物，其中所述植物在至少一个编码漆酶核酸的核酸中包含至少一个突变，优选地，其中所述漆酶核酸选自漆酶3和5，并且其中与野生型或对照多肽相比，所述突变降低所述漆酶核酸的表达。
46.权利要求45所述的基因改变的植物，其中所述核酸编码如SEQ ID NO:1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物和/或编码如SEQ ID NO:4中定义的漆酶5多肽或其功能变体或同源物的核酸。
47.权利要求45或46所述的基因改变的植物，其中使用靶向基因组修饰优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9，引入所述突变，或者其中使用诱变优选TILLING或T-DNA插入，引入所述突变。
48.权利要求43所述的基因改变的植物，其中所述植物表达RNAi分子，与野生型或对照植物相比，所述RNAi分子降低至少一个漆酶3和/或5核酸的表达。
49.权利要求29至48中任一项所述的基因改变的植物，其中所述植物是玉米。
50.产生具有改变的对植物倒伏抗性的植物的方法，所述方法包括改变至少一个漆酶基因的表达或水平和/或改变miR528的表达或活性。
51.权利要求50所述的方法，其中与野生型或对照植物相比，所述植物具有改变的木质素含量。
52.权利要求50所述的方法，其中所述植物具有增加的对植物倒伏抗性，并且其中所述方法包括增加至少一个漆酶基因的表达和/或降低miR528的表达或活性。
53.权利要求52所述的方法，其中所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO:1中定义的漆酶3多肽或其功能变体或同源物和/或如SEQ ID NO:4中定义的漆酶5多肽或其功能性变体或同源物。
54.权利要求53所述的方法，其中编码漆酶3的所述核酸包含如SEQ ID NO:2或3中定义的序列或其功能变体或同源物，且其中编码漆酶5的所述核酸包含如SEQ ID NO:5或6中定义的序列或其功能变体或同源物。
55.权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含与调控序列可操作地连接的如SEQ ID NO:7或16中定义的核酸序列或其功能变体。
56.权利要求53或55中任一项所述的方法，其中所述调控序列是组成型启动子或强启动子。
57.权利要求52所述的方法，其中使用至少一种miR528抑制剂，降低所述miR528的活性。
58.权利要求57所述的方法，其中所述miR528抑制剂是包含如SEQ ID NO:8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
59.权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因中，其中所述漆酶多肽在miR528结合位点中包含至少一个突变，其中优选地所述漆酶基因选自漆酶3和漆酶5，并且其中所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO:1中定义的多肽，和其中所述漆酶5基因编码如SEQ ID NO:4中定义的多肽。
60.权利要求59所述的方法，其中至少一个突变在选自SEQ ID NO:3的位置1至12的至少一个位置或选自SEQ ID NO:6的位置48至68的至少一个位置处引入。
61.权利要求59所述的方法，其中使用靶向基因组修饰优选ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9，引入所述突变，或者其中使用诱变优选TILLING或T-DNA插入，引入所述突变。
62.权利要求50所述的方法，其中所述植物具有降低的对倒伏的抗性，并且其中所述方法包括降低至少一个漆酶基因的表达和/或提高miR528的表达或活性。
63.权利要求62所述的方法，其中所述漆酶基因选自漆酶3和/或漆酶5，并且其中所述漆酶3基因编码如SEQ ID NO:1中定义的多肽，并且其中所述漆酶5基因编码如SEQ ID NO:4中定义的多肽。
64.权利要求62或63所述的方法，其中所述方法包括将至少一个突变引入至少一个漆酶基因和/或启动子中，其中与野生型或对照多肽相比，所述突变降低所述漆酶核酸的表达。
65.权利要求64所述的方法，其中使用靶向基因组修饰优选ZFN，TALEN或CRISPR/Cas9，引入所述突变，或者其中使用诱变优选TILLING或T-DNA插入，引入所述方法。
66.权利要求62所述的方法，其中所述方法包括使用RNA干扰来减少或消除至少一个漆酶核酸，优选漆酶3和/或5核酸，的表达。
67.权利要求62所述的方法，其中所述方法包括引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含至少一个可操作地连接至调控序列的核酸，其中所述核酸编码如SEQ ID NO:10中定义的miR528或其功能变体。
68.权利要求67所述的方法，其中所述方法包括引入包含SEQ ID NO:9的miR528或其功能变体。
69.权利要求50至68中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括测量倒伏的变化，优选与对照或野生型植物相比倒伏的变化。
70.权利要求50至69中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使植物再生并筛选倒伏的改变。
71.权利要求50至70中任一项所述的方法，其中所述植物是玉米。
72.由权利要求50至71中任一项获得或可获得的植物。
73.核酸构建体，其包含编码如SEQ ID NO:7或16中定义的miR528抑制剂或其功能变体的核酸序列。
74.包含权利要求73所述的核酸构建体的载体。
75.miR528抑制剂，其包含具有如SEQ ID NO:8中定义的RNA序列或其功能变体的RNA分子。
76.宿主细胞，其包含权利要求73所述的核酸构建体，权利要求74所述的载体或权利要求75所述的miR528抑制剂。
77.权利要求76所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌或植物细胞。
78.表达权利要求73所述的核酸构建体、权利要求74所述的载体或权利要求75所述的miR528抑制剂的转基因植物。
79.权利要求78所述的转基因植物，其中所述植物是玉米。
80.权利要求73所述的核酸构建体、权利要求74所述的载体或权利要求75所述的miR528抑制剂与对照或野生型植物相比在增加植物抗倒伏性中的用途。
81.权利要求73所述的核酸构建体、权利要求所述74的载体或权利要求75所述的miR528抑制剂与对照或野生型植物相比在植物中调节木质素合成、调节木质素含量和/或启动子木质素合成中的用途。
82.权利要求81所述的用途，其中与对照或野生型植物相比，权利要求73所述的核酸构建体、权利要求所述74的载体或权利要求75所述的miR528抑制剂在植物中增加木质素合成和/或增加木质素含量。
83.权利要求81或82所述的用途，其中在植物茎秆和/或根中增加木质素合成和/或木质素含量。
84.核酸构建体，其包含核酸序列，所述核酸序列编码至少一个能够结合至少一个miR528基因的DNA结合结构域，或至少一个能够结合至少一个漆酶3基因的DNA结合结构域，或至少一个能够结合至少一个漆酶5基因的DNA结合结构域。
85.权利要求84所述的核酸构建体，其中所述核酸序列编码至少一个原间隔子元件，并且其中所述原间隔子元件的序列选自SEQ ID NO:34、37、41、44或52、55、58或61或具有与SEQ ID NO:34、37、41、44、52、55、58或61至少90％同一性的序列。
86.权利要求84或85所述的核酸构建体，其中所述构建体进一步包含编码CRISPR RNA(crRNA)序列的核酸序列，其中所述crRNA序列包含原间隔子元件序列和额外的核苷酸。
87.权利要求84至86中任一项所述的核酸构建体，其中所述构建体进一步包含编码反式激活RNA(tracrRNA)的核酸序列，其中优选地所述tracrRNA是SEQ ID NO:31中定义的或其功能变体。
88.权利要求84至87中任一项所述的核酸构建体，其中所述构建体编码至少一个单向导RNA(sgRNA)，其中所述sgRNA包含所述tracrRNA序列和所述crRNA序列，其中所述sgRNA包含选自以下的序列或由其组成：SEQ ID NO:35、38、42、45或53、56、58或62，或其功能变体。
89.权利要求84至88中任一项所述的核酸构建体，其中所述构建体通过启动子可操作地连接。
90.权利要求89所述的核酸构建体，其中所述启动子是组成型启动子。
91.权利要求84至90中任一项所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体进一步包含编码CRISPR酶的核酸序列。
92.权利要求91所述的核酸构建体，其中所述CRISPR酶是Cas或Cpf1蛋白。
93.权利要求92所述的核酸构建体，其中所述Cas蛋白是Cas9或其功能变体。
94.权利要求84所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体编码TAL效应子。
95.权利要求84或94所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体进一步包含编码核酸内切酶或其DNA切割结构域的序列。
96.权利要求95所述的核酸构建体，其中所述核酸内切酶是FokI。
97.单向导(sg)RNA分子，其中所述sgRNA包含crRNA序列和tracrRNA序列，其中所述crRNA序列能够结合选自SEQ ID NO:33、36、40、43的至少一个序列或选自SEQ ID NO:51、54、57或60的至少一个序列或其变体。
98.分离的植物细胞，其被至少一个权利要求84至96中任一项所述的核酸构建体或至少一种如权利要求97所述的sgRNA转染。
99.分离的植物细胞，其被至少一个权利要求84-90中任一项所述的核酸构建体和第二核酸构建体转染，其中所述第二核酸构建体包含编码Cas蛋白，优选Cas9蛋白或其功能变体的核酸序列。
100.权利要求99所述的分离的植物细胞，其中所述第二核酸构建体在用权利要求84至90中任一项所述的核酸构建体之前、之后或同时转染。
101.基因修饰的植物，其中所述植物包含如权利要求98至100中任一项限定的转染细胞。
102.根据权利要求101所述的基因修饰的植物，其中编码sgRNA的所述核酸和/或编码Cas蛋白的所述核酸以稳定形式整合。
103.提高对植物倒伏的抗性的方法，所述方法包括在植物中引入并表达权利要求84至96中任一项所述的核酸构建体，或权利要求97中任一项的sgRNA，其中优选地所述提高是相对于对照或野生型植物。
104.通过权利要求103所述的方法获得或可获得的植物。
105.如权利要求84至96中任一项所述的核酸构建体或权利要求97所述的sgRNA在提高对植物倒伏的抗性中的用途。
106.权利要求105所述的用途，其中所述核酸构建体或sgRNA降低植物中miRNA528的表达和/或活性。
107.用于获得如权利要求31中限定的基因修饰的植物的方法，所述方法包括：
a)选择植物的部分；
b)用权利要求84至96中任一项所述的核酸构建体或权利要求97所述的sgRNA分子转染段落(a)的所述植物的部分的至少一个细胞。
c)使至少一个源自经转染细胞的植物再生；
d)选择根据(c)段获得的一个或更多个植物，所述植物在所述植物中显示至少一种miRNA528核酸的表达降低。
108.用于鉴定和/或选择优选地与野生型或对照植物相比，具有提高的抗倒伏性的植物的方法，所述方法包括在植物或植物种质中检测漆酶3基因和/或启动子、漆酶5基因和/或启动子或miR528a和/或b基因和/或启动子中的至少一个多态性或突变，其中与没有所述突变的植物相比，所述多态性或突变导致漆酶3和/或5的表达增加和/或miR528的表达/活性降低；并选择所述植物或其后代。
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