CN102065680B

CN102065680B - 能生物合成辣椒素酯类物质的基因修饰植物

Info

Publication number: CN102065680B
Application number: CN200980123801.4A
Authority: CN
Inventors: 木坂广明; 郎亚琴; 杉山立志; 三轮哲也
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2008-06-23
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2029-06-19
Also published as: KR20110020307A; EP2305025B1; EP2305025A4; CN102065680A; US20110166371A1; JP5594137B2; ES2529466T3; JPWO2009157376A1; KR101389060B1; EP2305025A1; US9340795B2; WO2009157376A1; BRPI0914419A2

Abstract

本发明提供了生物合成数量增加的辣椒素酯类物质的基因修饰植物，产生该基因修饰植物的方法和由该基因修饰植物的辣椒素酯类物质的生产方法。更具体地，本发明提供了能产生辣椒素酯类物质的基因修饰植物，其与野生株相比，显示了催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的降低的表达或活性，和类似物。作为抑制酶的表达或活性的方法，可以提及编码针对该靶基因的反义RNA、iRNA、核酶或显性-失活突变体的DNA的引入，通过敲除方法或诱变剂处理的基因破坏，编码对该酶的抗体的基因的引入等。

Description

能生物合成辣椒素酯类物质的基因修饰植物

技术领域

本发明涉及生物合成数量增加的辣椒素酯类物质的基因修饰植物，生产该基因修饰植物的方法，由该基因修饰植物的辣椒素酯类物质的生产方法等。

背景技术

类辣椒素(辣椒素，二氢辣椒素等)，其是智利辣椒的辛辣组分，有效预防肥胖，因为其促进能量代谢，刺激中枢神经促进激素分泌和激活脂肪分解酶。另外，它消毒了胃肠道并且改善了免疫性，还有效激活免疫性和减轻疲劳。然而，因为类辣椒素刺激粘膜，大量摄取可扰乱胃肠状况。而且，许多日本人不喜欢辛辣味道。

作为较少辛辣性的智利辣椒，“CH-19 Sweet”(品种登记号10375)，其是由Yazawa等选择并且固定的非辛辣性固定品种的智利辣椒，已经被报道包含大量的新型辣椒素酯类物质(例如非专利文献1)。这样的化合物，属于辣椒素酯类物质(香草醇的脂肪酸酯、辣椒素酯、二氢辣椒素酯等，在下文中有时简称为“辣椒素酯类物质”或“辣椒素酯类物质类”)，不同于类辣椒素并且不具有辛辣味道。然而，它们已经被报道显示出免疫性提高作用、能量代谢激活作用、氧消耗促进作用等(例如专利文件1和2，和非专利文献2)，并且被期望在未来是补充物等的原料。

在大多数智利辣椒中，香草胺由苯丙氨酸通过阿魏酸、香草醛等形成，而类辣椒素是由香草胺和支链脂肪酸通过类辣椒素合成酶制备的(图1(a))。与此相对，类辣椒素几乎没有在CH-19 Sweet中制备反而制备了辣椒素酯类物质。然而，为此的原因多年未知。

如上所述，辣椒素酯类物质具有一些辛辣味道，但是显示出类似于类辣椒素的那些的优良的生理活性。因此，期望作为补充物等的原料的未来应用。因此，期望阐明辣椒素酯类物质的生物合成路径以便繁育和开发能够产生辣椒素酯类物质的新的植物品种。

[现有技术]

[专利文件]

专利文件1: JP-A-11-246478

专利文件2: JP-A-2001-026538

[非专利文件]

非专利文件1: Yazawa et al., Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, vol. 58, pages 601-607, 1989

非专利文件2: Biosci. Biotech. Biochem., 65 (12), 2735-2740 (2001)。

发明内容

本发明所要解决的问题

因此，本发明的目的是阐明辣椒素酯类物质的生物合成路径并且，基于该发现，提供能从除目前已知产生辣椒素酯类物质的CH-19 Sweet以外的植物通过基因修饰产生辣椒素酯类物质的植物。

解决该问题的手段

本发明人已经进行了深入研究以实现上述目的并且发现，在CH-19 Sweet中，编码催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的转氨酶的pAMT基因包含插入突变。也就是说，关于CH-19 Sweet已经阐明了由于在辛辣品种“CH-19 Hot”(其是CH-19weet的亲代品种)的pAMT基因的编码区中一个碱基的插入突变产生终止密码子，并且没有产生功能性转氨酶。本发明人假设由于pAMT基因的突变，在CH-19 Sweet中从香草醛到香草醇的还原反应变为主导，代替了从香草醛到香草胺的氨基转移，并且进一步的与支链脂肪酸的酯化反应导致辣椒素酯类物质产生(图1(b))。

为验证该假设，本发明人已经制备了具有被引入辛辣品种(辣椒（Capsicum annuum）品种‘朝天椒（Takanotsume）’)的pAMT反义核酸的转基因植物。已经发现，在所获得的转基因植物中显示出显著降低的pAMT基因的表达的谱系中，类辣椒素的产生降低，但辣椒素酯类物质的产生显著地增加。

本发明人基于这些发现已经进行了进一步的研究并且完成了本发明。

因此，本发明提供以下：

[1]一种能产生辣椒素酯类物质的基因修饰植物，其相比于野生株来说显示出催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的降低的表达或活性。

[2]上述[1]中所述的植物，其中上述的酶是pAMT基因产物；

[3]上述[1]或[2]中所述的植物，其中上述的酶的降低的表达或活性是由以下引起的：该酶基因的破坏或突变，该基因的转录产物的分解或翻译抑制，或该酶对香草醛的作用的抑制。

[4]上述[1]至[3]中任一项所述的植物，其中该野生株具有类辣椒素生物合成系统；

[5]上述[4]中所述的植物，其中该野生株是属于辣椒属的植物；

[6]一种生产能产生辣椒素酯类物质的基因修饰植物的方法，包括进行基因修饰以降低在具有类辣椒素生物合成系统的植物中催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的表达或活性；

[7]上述[6]中所述的方法，其中该基因修饰选自编码针对上述的酶基因的反义RNA、iRNA、核酶或显性-失活突变体的DNA的引入，通过敲除方法或诱变剂处理的基因破坏和编码对该酶的抗体的基因的引入；

[8]上述[6]或[7]中所述的方法，其中上述的酶是pAMT基因产物。

[9]上述[6]至[8]中任一项所述的方法，其中具有类辣椒素生物合成系统的植物属于辣椒属；和

[10]一种生产辣椒素酯类物质的方法，其包括从上述[1]至[5]中任一项所述的植物的果实中回收辣椒素酯类物质。

本发明的效果

本发明使得能够在基本上不产生辣椒素酯类物质或仅仅产生少量的辣椒素酯类物质的植物品种中还增加辣椒素酯类物质的产生。

附图说明

图1显示了辣椒素(a)和辣椒素酯(b)的预期的合成路径。

图2是具有在反义方向中插入的pAMT基因的Ti-质粒载体，pIG121-Hm的示意图。

图3显示了使用从转化的智利辣椒的叶片提取的DNA作为模板的基因组PCR的结果，其中M是标记物，C是对照物(没有基因修饰的辣椒品种‘朝天椒’)，并且每个数字显示所选择的转化的智利辣椒个体。

图4显示了转化的智利辣椒和CH-19 Sweet，和辣椒品种‘朝天椒’的果实的辣椒素酯含量(a)和辣椒素含量(b)的分析结果。

图5显示了在转化的智利辣椒和辣椒品种‘朝天椒’的果实中pAMT基因的转录表达的分析结果。

图6显示了通过蛋白质印迹分析的从转化的智利辣椒的果实提取的蛋白质的分析结果，其中各泳道是1: CH-19 Hot, 2: TG-1, 3: TG-3, 4: TG-8, 5: TG-14, 6: CH-19 Sweet。

具体实施方式

本发明提供了一种能产生辣椒素酯类物质的基因修饰植物，其相比于野生株来说显示出催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的降低的表达或活性。

在本发明中，“野生株”是指这样的植物，其是在本发明中的基因修饰的目标。待用于本发明中的野生株可以是任何一种，只要它官能地表达酶基团(例如苯丙氨酸解氨酶(PAL)，肉桂酸4-水解酶(Ca4H)，香豆酸3-水解酶(Ca3H)，咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)，类辣椒素合成酶(CS))，其为类辣椒素的生物合成所需的。植物可以天生地具有这样的酶基团，或可以通过外源基因的表达来提供一种或多种酶。优选地，可为本发明使用的野生株是天生地具有类辣椒素产生能力的植物，更优选属于辣椒属的植物。其实例包括但不局限于辣椒（C. annuum） (品种‘朝天椒’, CH-19 Hot, 彩椒(Yatsufusa)’, ‘虎尾草(Toranoo)’, ‘甜椒(Fushimiama)’等)，番椒（C. baccatum） (黄椒（aji amarillo）等)，灯笼椒（C. chinense ）(古巴辣椒（habanero pepper）, 印度鬼椒（Bhut Jolokia）等)，小米椒（C. frutescens ）(小米椒（Capsicum frutescens L.）等)，和彩叶椒（C. pubescens） (茸毛椒（rocoto）等)。

没有特别地限制催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶，只要它是具有转氨酶活性并且通过上述野生株产生的蛋白质，其可以使用香草醛作为底物。优选的是存在于古巴辣椒中的具有与来自稻或番茄的GABA转氨酶高同源性的转氨酶pAMT(假定的转氨酶)基因，和在其它植物品种中通过其直向同源物(ortholog)编码的转氨酶。

更具体地说，本发明的pAMT蛋白质(也称为pAMT基因产物)是这样的蛋白质，其包含与SEQ ID NO: 2显示的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列，并且具有与由SEQ ID NO: 2显示的氨基酸序列构成的蛋白质至少等价(例如0.5倍或更大，优选地0.7倍或更大)的转氨酶活性。在本文中，“基本上相同的氨基酸序列”是指衍生自SEQ ID NO: 2显示的氨基酸序列构成的CH-19 Hot的pAMT蛋白质的天然等位基因变异体或基因多态性的氨基酸序列，和其它植物品种等中的它的直向同源物的氨基酸序列。其它植物品种中的pAMT的直向同源物的实例包括衍生自古巴辣椒的pAMT(Refseq No. AAC78480)，来自稻的GABA转氨酶(Refseq No. AAQ14479)和来自番茄的 GABA转氨酶(Refseq No. AAO92257)等可以被提及。

上述“基本上相同的氨基酸序列”令人期望地具有不少于80%，优选地不少于90%，更优选地不少于95%，最优选地不少于97%的与SEQ ID NO: 2显示的氨基酸序列的相似性(优选地，一致性)。在本文中“相似性”是指，当使用本领域已知的数学算法比对两个氨基酸序列时，在最佳比对中相同的和相似的氨基酸残基与总重叠氨基酸残基的比例(%)(优选地，算法可以考虑将空位引入序列之一或两者用于最佳比例)。在以下条件(预期值=10；允许空位；基质=BLOSUM62; 过滤=关)下，使用同源性计算算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，可以计算本说明书中的氨基酸序列的相似性。

在本发明中，辣椒素酯类物质生物合成系统的酶基团至少部分与构成类辣椒素生物合成系统的酶基团一样，除了催化从香草醛到香草醇的还原反应的那些之外，并且本发明基于如下发现：所产生的辣椒素酯类物质和类辣椒素的定量比取决于上述还原反应和从香草醛到香草胺的氨基转移反应哪一个更占优势地进行。因此，通过相比于野生株降低催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的表达或活性，从香草醛到香草醇的还原反应变得更占主导，结果辣椒素酯类物质产生能力可以被改善。

催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的“表达”是指翻译产物(即，蛋白质)是由编码该酶的基因(例如pAMT基因等)产生的，并且以机能状态在其作用位点定位。酶的“较低的表达”是指，相比于野生株来说，存在于基因修饰植物中的该酶的蛋白质量显著降低的结果。因此，在任何阶段，例如在基因水平，转录水平，转录后调节水平，翻译水平，翻译后修饰水平等，可以进行基因修饰至较低的酶表达。

例如，作为在基因水平抑制酶表达的基因修饰，可以提及破坏该酶基因和引入功能性缺陷的突变。在本文中，“功能性缺陷的突变”可以是降低该酶活性的突变，使得相比于野生株来说，辣椒素酯类物质产生显著地增加，和非必须完全消除酶活性的突变。这样的基因修饰可以通过利用同源重组的酶基因的敲除(或敲入)技术来实现。

作为敲除酶基因的具体手段，可以优选地使用这样的方法，其包括通过常规方法分离衍生自待作为基因修饰的目标的植物(即，野生株)的酶基因(基因组DNA)(例如在pAMT基因的情况下，pAMT基因组DNA可以使用含SEQ ID NO: 1所显示的源自CH-19 Hot的pAMT cDNA的全部或部分碱基序列的核酸作为探针，通过菌落或噬斑杂交方法自从由野生株分离的基因组DNA制备的基因组DNA文库克隆)并且通过同源重组等将具有为灭活该基因而构建的DNA序列的DNA链(目标载体)插入野生株的酶基因位点。例如，通过下述方式制备具有为灭活该基因而构建的DNA序列的DNA链(目标载体)

(1) 将其它的DNA片段(例如耐药性基因、报告基因等的选择标记基因)插入其外显子区域或启动子区域来破坏外显子或启动子功能，

(2) 通过使用Cre-loxP系统或Flp-frt系统劈开全部或部分的该酶基因来删除该基因，

(3) 将终止密码子插入蛋白质编码区来防止蛋白质的完全翻译，或

(4) 插入终止基因转录的DNA序列(例如多聚腺苷酸化信号等)到转录区域来防止完全的mRNA的合成。

选择标记基因优选地是表达盒(expression cassette)的形式，其包含任何在目标植物中能在细胞内起作用的启动子。当插入该基因使得其被置于该目标酶基因的内源性启动子的控制下时，选择标记基因不需要启动子。

通常，在植物中的基因重组大部分是非同源的，并且被引入的DNA随机被插入染色体的任何位置。因此，仅仅通过同源重组靶向到酶基因的克隆的有效的选择，不能基于选择耐药性、报告基因的表达等的检测来实现。因此，通过Southern杂交方法或PCR方法的任何所选择的克隆的重组位点的确认变得必需。因此，例如，当赋予丙氧鸟苷敏感性的源自单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-tk)基因在目标载体中在与目标序列同源的区域外连结时，具有随机插入其中的该载体的细胞具有HSV-tk基因，并且因此，该细胞不能在含丙氧鸟苷的培养基中生长。然而，通过同源重组靶向酶基因位点的细胞变为耐受丙氧鸟苷，因为它不具有HSV-tk基因并且可以被选择。备选地，例如，当白喉毒素基因代替该HSV-tk基因被连结时，因为具有随机插入其中的该载体的细胞被它产生的毒素杀死，在不存在药物的情况下，还可以选择同源性重组体。引入的DNA的存在可以通过将一部分的形成的耐受菌落施加到PCR或Southern杂交来确认。

作为在基因水平抑制酶表达的另一基因修饰，可以提及通过诱变剂处理将功能性缺陷的突变引入酶基因。作为诱变剂处理，可以使用任何一种，只要它在野生株的DNA中诱发点突变、删除或移码突变。特别地，可以提及用乙基亚硝基脲，亚硝基胍，苯并芘，吖啶染料，辐射等的处理。另外，还可以使用各种烷化剂和致癌物质作为诱变剂。作为使诱变剂与细胞反应的方法，可以使用以下文献中描述的方法：Technique of Tissue Culture, 3rd edition (Asakura Publishing Co., Ltd.), The Japan Tissue Culture Association ed. (1996), Nature Genet., 314 (2000)等。使用目标蛋白质的量作为指标，可以选择酶基因的功能性缺陷的变体。在pAMT的情况下，例如，使用针对pAMT蛋白质的多克隆抗体，可以进行蛋白质印迹分析，并且可以确定pAMT蛋白质的量。至于显示出显著降低的pAMT蛋白质水平的植物，将突变引入该基因可以通过测定从植物的一部分分离的该酶基因的核苷酸序列来确认。

作为在翻译水平的抑制酶表达的基因修饰，可以提及引入具有分解酶基因的转录产物的活性的核酸，或抑制转录产物翻译为酶蛋白质的核酸。作为这样的核酸，可以提及含与该酶的mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列或该序列的一部分的核酸。

与目标酶的mRNA的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列是指这样的核苷酸序列，在受体植物中的生理条件下其具有能结合到mRNA的目标序列并且抑制其翻译的水平的互补。特别地，例如，核苷酸序列具有和与该mRNA的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列(即，mRNA互补链的核苷酸序列)重叠的区域不少于约80%，优选地不少于约90%，更优选地不少于约95%，最优选地不少于约97%的相似性。在以下条件(预期值=10；允许空位；过滤=开；相配得分=1；失配得分=-3)下，使用同源计算算法NCBIBLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，可以计算本发明中的“核苷酸序列的相似性”。

更具体地说，例如，当该酶是pAMT时，与pAMT mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列的实例包括

(a) 由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或

(b) 在严格条件下杂交至如下核苷酸序列的核苷酸序列，其是与编码具有相当于由SEQ ID NO: 2显示的氨基酸序列构成的蛋白质的活性的蛋白质的序列互补的或基本上互补的核苷酸序列。在严格的条件下是指，例如，以下文献中所描述的条件：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6, 1999, 例如，用6×SSC (氯化钠/柠檬酸钠)/45°C杂交，然后用0.2×SSC/0.1% SDS/50 - 65°C洗涤一次或多次等，并且本领域技术人员能够适当地选择杂交条件，得到与其等价的严格。

pAMT mRNA优选地是含由SEQ ID NO: 1显示的核苷酸序列的CH-19 Hot的pAMT mRNA，或在其它植物品种中的其直向同源物(例如源自古巴辣椒的pAMT(Refseq No. AF085149)，稻的GABA转氨酶(Refseq No. AF297651)和番茄的GABA转氨酶(Refseq No. AY240231)等)，或进一步地，天然等位基因变体，或其基因多态性。

在长度和位置方面，没有特别地限制“与目标酶的mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列的部分”，只要它可以特定地结合到目标酶mRNA并且抑制从该mRNA的蛋白质的翻译。但是，从序列特异性的方面来说，它包含至少10个碱基，优选地不少于约15个碱基，更优选地不少于约20个碱基的与该目标序列互补的或基本上互补的部分。

特别地，含与目标酶的mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列或这样的序列的一部分的该核酸的优选的实例包括以下(a)至(c)。

(a) 针对目标酶mRNA的反义RNA

(b) 针对目标酶mRNA的iRNA(干扰RNA)

(c) 针对目标酶mRNA的核酶

(a) 针对目标酶mRNA的反义RNA

在本发明中的“反义RNA”是含与目标mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸，并且具有通过与目标mRNA形成特定的和稳定的双链抑制蛋白质合成的功能。在长度方面，不特别地限制反义RNA的目标区域，只要该反义RNA的杂交导致抑制目标mRNA翻译为酶蛋白质，并且其可以是编码该酶的总mRNA序列或其部分序列，其中较短的是约10个碱基长，较长的是总mRNA序列。

而且，本发明的反义RNA不仅可以杂交至目标酶mRNA来抑制翻译为蛋白质，也可以结合到该酶的基因，其是双链DNA，而形成三链体并且抑制转录为RNA(抗基因(anti-gene))。

(b) 针对目标酶mRNA的iRNA

在本说明书中，双链RNA由以下构成：与目标酶mRNA互补的寡RNA和其互补的链，即iRNA，也被定义为包涵在含与目标酶的mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸内。在线虫、昆虫、植物等中，很久以来已经知道双链RNA的细胞内引入导致与其RNA互补的mRNA的分解，所谓的RNA干扰(RNAi)的现象。自从这种现象被证实广泛发生于动物细胞中[Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]，其已经广泛地用作核酶的备选技术。基于待作为目标的mRNA的核苷酸序列的信息并且使用市售可得的软件(例如RNAi Designer；Invitrogen)，iRNA可以被适当地设计。

(c) 针对目标酶mRNA的核酶

作为具有最宽实用性的核酶，可以提及在感染性RNA如类病毒、拟病毒中发现的自剪接的RNA，并且已知锤头型、发夹型等。锤头型具有仅仅约40个碱基显示出酶活性，并且有可能通过使与具有锤头结构的部分相邻的两端上的若干碱基(总共约10个碱基)形成与mRNA期望切割位点互补的序列而单独特异性地使目标mRNA裂解。因为这类核酶仅仅包含RNA作为底物，其是进一步有利的，因为其不攻击基因组DNA。当目标酶mRNA本身具有双链结构时，目标序列可以通过使用杂化核酶被转化为单链，其中连结了能够特异性地结合到RNA解旋酶的源自病毒核酸的RNA基序[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)]。而且，为促进转移到细胞质，可以使用杂化核酶，其中通过修饰tRNA获得的序列被进一步连结[Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)]。

编码针对该目标酶的mRNA的反义RNA的DNA，当反义RNA比较长，并且是例如不少于100个bp时，可以通过下述方式产生，根据常规方法克隆该目标酶的cDNA，并且直接将其连结，或者在通过用合适的限制酶消化分裂为含期望区域的期望长度后，连结到能在反义方向中在目标植物的细胞中起作用的启动子的下游。当反义RNA比较短并且例如是100个bp或更小时，其还可以通过市售可得的DNA/RNA自动合成仪来化学合成。

编码针对目标酶mRNA的iRNA的DNA可以构建为编码发夹型dsRNA的DNA，这是通过下述方式实现的：通过RT-PCR扩增mRNA上的目标序列(例如，约200-500个碱基)而得到双链DNA，并且通过使用限制酶和连接酶经由合适的连接体序列在正义方向和反义方向中连结两个双链DNA。在它的序列和长度方面没有特别地限制该连接体序列，只要其可以形成能够在构建的DNA的转录时形成发夹型dsRNA的环。例如，当报告基因如β-葡糖苷酸酶基因用作连接体序列时，通过检测报告基因的表达，可以监测从该发夹型dsRNA切断iRNA。

编码针对目标酶mRNA的核酶的DNA可以通过由DNA/RNA自动合成仪合成具有设计的核酶的核苷酸序列的DNA来制备。

通过任何基因工程方法可以将含与目标酶的mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸引入目标植物。例如，可以提及用含基因工程处理以包含该核酸的病毒基因组的植物病毒感染，和用含该核酸的表达载体转化目标植物细胞。

优选地，本发明的基因修饰植物是在能在目标植物(野生株)细胞中起作用的启动子的控制下用含上述核酸的表达载体通过转化该野生株的细胞获得的转基因植物。

能在野生株细胞中起作用的启动子可以根据用作该野生株的植物品种适当地选择。通常，可以提及在植物细胞中固有表达的基因启动子，优选地，衍生自植物或植物病毒的固有启动子(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、CaMV 19S启动子、NOS启动子等)，或在野生株目标酶基因中的顺式启动子等。

在本发明的表达载体中，含与目标酶的mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸位于能在野生株细胞中起作用的启动子的下游，以便其转录可以由该启动子调节。优选地，在该核酸序列的下游，进一步添加能在野生株中起作用的转录终止信号(终止子区域)。该终止子的实例包括NOS(胭脂氨酸合成酶)基因终止子等。

本发明的表达载体可以进一步包含顺-调节元件如增强子序列等。而且，期望该表达载体进一步包含用于选择转化体的标记基因如耐药性基因标记等[例如，新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因，潮霉素磷酸转移酶(HPT)草胺膦乙酰转移酶(PAT)基因，抗草甘膦(glyphosate)基因等。

而且，为有助于大规模制备和提纯，期望该表达载体包含在大肠杆菌中使得能够自发复制的复制起点和在大肠杆菌中的选择标记基因(例如，氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因等)。本发明的表达载体可以通过下述方式来方便地构建，将上述核酸的表达盒和，根据必需的选择标记基因，插入pUC或pBR大肠杆菌载体的克隆位点。

当上述核酸通过利用以根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）或发根土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染引入时，该核酸的表达盒可以被插入细菌所保留的Ti或Ri质粒上的T-DNA区域(待转移到植物染色体的区域)，并且投入使用。对于通过土壤杆菌方法的转化的标准方法，使用二元载体系统。T-DNA转移所需的作用独立地由T-DNA本身和Ti(或Ri)质粒提供，并且每个组成因子可以在不同的载体上分开。在为T-DNA的切断和插入所需的两端上，二元质粒具有25个bp边界序列，并且没有引起冠婴(或发根)的植物激素基因，因此同时得到插入外源基因的空间。作为这样的二元载体，例如，pBI101、pBI121(都是CLONTECH)等是市售可得的。在插入T-DNA时起作用的vir区域位于不同的Ti(或Ri)质粒上，被称为辅助质粒。

通常已知的各种方法可用于转化植物。其实例包括：这样的方法，其包括通过用细胞壁分解酶如纤维素，半纤维素等处理从目标植物的细胞中分离原生物，并且向该原生物和含上述pAMT基因表达盒的表达载体的悬浮液添加聚乙二醇以便通过类似胞吞的方法(PEG法)将表达载体插入该原生物；这样的方法，其包括通过声处理等将表达载体插入脂质膜泡如磷脂酰胆碱等，并在PEG存在下融合该泡和原生物(脂质体方法)；这样的方法，其包括通过相似的方法使用迷你细胞的融合；和这样的方法，其包括向原生物和表达载体的悬浮液施加电脉冲以便将胞外溶液中的载体插入该原生物(电穿孔方法)。然而，这些方法是复杂的，因为用于从原生物至植物的再分化的培养技术是必需的。作为转基因到具有细胞壁的完整细胞中的方法，可以提及显微注射方法，其包括将微量吸液管推入细胞，并通过液压或气压胞内注入该移液管中的载体DNA；直接引入方法，其包括通过火药爆炸或气压使以DNA涂布的金属微粒加速以便胞内引入，如粒子枪方法等，和这样的方法，其利用以土壤杆菌进行感染。显微注射具有缺陷，其操作需要实践，并且可操作的细胞的数量少。因此，考虑操作的便利性，优选通过土壤杆菌方法或粒子枪方法转化植物。粒子枪方法是更有用的，因为在收割前基因可直接被引入植物的顶端分生组织。而且，在土壤杆菌方法中，通过在二元载体的边界序列间同时插入植物病毒，例如，双生病毒的基因组DNA如番茄金色花叶病毒(TGMV)等，仅通过在收割前在植物的任何部分用注射筒等嫁接细胞悬浮液至细胞，病毒感染遍及整个植物，并且目标基因被同时引入整个植物。

然而，在粒子枪方法和土壤杆菌方法中，因为转基因常常是嵌合体的，允许以高频率在种系细胞中引入上述核酸的样品细胞需要用于转化。例如，可以提及胚，下胚轴切片，胚性愈伤组织，分离的生长点等。另一方面，因为上述使用原生物和显微注射方法的转化方法允许选择从单个细胞再分化植物，它们是获得具有引入整个细胞的pAMT基因的同质转基因植物的优异的转化手段。

作为特定的实例，在辣椒属植物中，通过土壤杆菌引入目标杆菌和转化的细胞引入植物的再生方法在下文中显示，其仅是实例并且根本没有限制本发明的基因修饰植物的生产方法。

智利辣椒植物的种子被杀菌，播种在合适的种子萌芽培养基(例如MS培养基，LS培养基，B5培养基等)上，并且无菌生长。另一方面，培养具有与目标核酸相连接的并且用具有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的质粒转化的启动子的土壤杆菌，并且用合适的培养基稀释而得到土壤杆菌溶液。将发芽后的子叶浸在土壤杆菌溶液中约10分钟，移植到用期望的植物激素(例如茁长素如IAA、NAA等，细胞分裂素如激动素，苄基腺嘌呤等)和卡那霉素和潮霉素抗生素添加的选择培养基(例如MS培养基，LS培养基，B5培养基等)，并且在20-30℃下培养。所获得的卡那霉素和潮霉素抗性愈伤组织和秧苗被移植到根据需要添加苄基腺嘌呤的再分化(生根)培养基(例如MS培养基，LS培养基，B5培养基等)以便诱发再分化(生根)，由此获得秧苗植物。当观察到数个真叶时，将该秧苗植物移植到土壤以便环境适应，并且在受控温室如生物气候室等中生长。可以从由此获得的转化株获得种子和果实。

根据常规方法从上述转化株提取基因组DNA，用合适的限制性内切酶使该DNA被切割，使用引入的目标核酸作为探针进行Southern杂交，由此可以证实存在或不存在转化。另外，通过合成引物（所述引物特异性地扩增该目标核酸）并且进行PCR方法，也可以证实存在或不存在转化。

此外，通过常规方法可以从转化株或非转化株中提取RNA，并且通过定量RT-PCR、Northern杂交等可以检查目标酶mRNA在表达水平的变化。备选地，可以通过常规方法从转化株或非转化株中提取蛋白质，并且可以通过免疫测定(RIA方法，ELISA方法，FIA方法等)通过使用该目标酶的抗体检查目标酶蛋白质在表达水平的变化。如上所述，因为在植物中大部分的基因重组事件源于非同源重组，由于以该引入的核酸插入的染色体区域的位置效应，与野生株相比，在全部的转基因植物中，目标酶的表达不总是下降。因此，如上所述，通过测量和比较在该目标酶的RNA水平或蛋白水平下的转化株和非转化株的表达量，可以证实与在野生株中相比，在转基因植物中的该目标酶的更低表达，基于此，可以获得目标基因修饰植物。

根据该目标核酸的插入方式，以一定比例在统计上包含由通过由此获得的转基因植物(与野生株相比，其显示出更低的目标酶表达，结果与野生株相比显示出较高的辣椒素酯类物质产生能力)的自体受精获得的种子分化的植物。在从通过再分化代(R0)植物的自体受精获得的R1种子分化的植物中改进的辣椒素酯类物质产生能力的出现比例通常遵循Mendel法则。例如，当目标核酸杂合插入一个基因位点时，基于改进的辣椒素酯类物质产生能力，R1种子被分成3:1。在从该R1种子分化的R1植物中，具有改进的辣椒素酯类物质产生能力的那些被种植并且自体受精而得到R2种子。当在全部种子中保持了改进的辣椒素酯类物质产生能力时，该R1植物被确定为对于被引入的核酸的纯合子，而当改进的辣椒素酯类物质产生能力以3:1显示时，该R1植物被确定为对于被引入的核酸的杂合子。由此选择的基因修饰植物，其是对于被引入的核酸的纯合子，作为固定地具有改进的辣椒素酯类物质产生能力的株非常有用。因为辣椒素酯类物质积聚在果实(果皮，胎座等)中，通过期望地使用也在组织如叶等中表达的目标酶的表达或活性作为指标，可以在早期阶段获知辣椒素酯类物质产生能力。

没有特别地限制抑制催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的活性的基因修饰，只要它是已知的。例如，可以提及将抗体基因引入该酶，引入显性-失活突变体基因等。

为避免困难如植物等中的H链和L链的组装效率，期望抗体基因编码由基因工程制备的单链抗体，如scFv、scFv-Fc、微抗体、双特异抗体等。这样的抗体可以通过如下方式来制备：由通过常规方法由用目标酶蛋白质或其片段免疫的小鼠制备产生抗体的杂交瘤，通过常规方法由该细胞克隆该抗体基因，并适当地通过连接体DNA连结该片段。

显性-失活突变体是指由于引入突变到目标酶中而活性降低的突变体。在显性-失活突变体中，通过野生株中的目标内源酶与该底物香草醛竞争性相互作用，可以间接地抑制该酶的功能。通过将突变引入编码该靶基因的核酸，可以产生显性-失活突变体。该突变的实例包括氨基酸突变，其引起由功能位点提供的功能的降低(例如删除，取代或添加一个或多个氨基酸)。通过PCR或使用已知的试剂盒的本身已知的方法，可以产生显性-失活突变体。

作为引入编码抗体基因的DNA和显性-失活突变体到目标植物中而得到转基因植物的方法，优选地使用类似于上述用于引入含与目标酶的mRNA的核苷酸序列互补的或基本上互补的核苷酸序列或其一部分的核酸的方法的方法。

因此，通过测量和比较转化株和非转化株之间的该目标酶的活性，可以证实与野生株中相比，在所获得的基因修饰植物中该目标酶的更低的活性，基于此，可以获得目标基因修饰植物。例如，当目标酶是pAMT时，从胎座、花等中提取蛋白质，将香草醛添加到提取物并且培养混合物一段给定时间，通过HPLC等量化所得的香草胺，由此可以检查该酶活性。

如上述所获得的基因修饰植物，其与野生株相比显示了催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的降低的表达或活性，与野生株相比，显示出提高的辣椒素酯类物质产生能力。“提高的产生能力”可以是与天生具有产生辣椒素酯类物质的能力的野生株相比，进一步提高的辣椒素酯类物质产生能力，或者由天生不能产生辣椒素酯类物质的植物所新获得的产生能力。

本发明还提供辣椒素酯类物质的生产方法，包括从本发明的基因修饰植物回收辣椒素酯类物质。作为回收辣椒素酯类物质的方法，可以使用任何已知的方法，例如，可以无限制地使用上述专利文件1(JP-A-11-246478)、JP-A-2002-226445、JP-A-2004-018428、WO2005/122787和/或2006/043601中所述的方法。

实施例

实施例1：产生pAMT基因表达-抑制性转化的智利辣椒

在反义方向，将用从CH-19 Sweet提取的cDNA通过RT-PCR扩增的pAMT基因插入Ti-质粒载体pIG121-Hm的GUS区域中(图2)。该质粒被引入根癌土壤杆菌EHA101株并且用于转化智利辣椒。

辣椒品种‘朝天椒’的种子表面用以下杀菌：70%乙醇1分钟，2%次氯酸钠15分钟，用无菌水漂洗3次，在MS培养基中播种。切取10天后发芽的子叶并且移植到含10mg/l苄基腺嘌呤(BA)的MS培养基。在25℃下进行16小时昼长培养24小时，并且将该子叶浸渍于在含50mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素的YEP培养基中培养24小时的土壤杆菌悬浮液10分钟。为除去残余的土壤杆菌悬浮液，该叶子被置于消毒滤纸上，然后再一次移植到含10mg/l苄基腺嘌呤(BA)的MS培养基。在暗处共培养3天后，将叶子移植到含10mg/lBA，50mg/l卡那霉素和300mg/L羧苄西林的MS培养基(选择培养基)，并且在25℃下进行16小时昼长培养。为抑制土壤杆菌的生长，该选择培养基每10天-2周用新的培养基更换。从选择开始起1-2月再分化的幼苗被移植到含50mg/l卡那霉素和300mg/l羧苄西林的MS培养基(生根培养基)来诱发生根。16株的生根植物被移植到土壤，并且在人工气候室中生长。从选择的个体的叶子提取DNA，使用在载体中扩增NPTII基因的引物进行基因组PCR分析。该PCR产物被用于1.5%琼脂糖凝胶电泳，并且用溴化乙锭染色。结果，发现该选择的个体具有引入其中的NPTII基因(图3)。

实施例2:测量转化的智利辣椒的辣椒素酯和辣椒素含量

在没有引入基因的情况下从16株的转化的智利辣椒和辣椒品种‘朝天椒’中采取果实，通过常规方法测定辣椒素酯和辣椒素含量。结果，相比于对照辣椒品种‘朝天椒’，发现3个转化的智利辣椒果实(TG-3、8和14)含更大量的辣椒素酯。相比于其它株，TG-3和TG-8具有更低的辣椒素含量(图4(a)和4(b))。

实施例3：在转化的智利辣椒果实中pAMT基因的转录和表达分析

从具有较高的辣椒素酯含量的株的果实中提取RNA，并且进行内源性pAMT基因的转录量的RT-PCR分析。结果，发现具有高辣椒素酯含量的株显示出pAMT基因的抑制的转录和表达。另一方面，在其中尽管已经引入该基因但辣椒素酯含量不高的株中，内源性pAMT基因的转录和表达未被抑制(图5)。由以上结果，已经发现通过抑制pAMT基因的表达，植物可以被改变以人工地合成辣椒素酯。

实施例4：在转化的智利辣椒果实中pAMT蛋白质量的分析

从CH-19 Hot分离的全长pAMT基因被插入大肠杆菌表达载体(pColdI载体，Takara Bio Inc.)的多克隆位点。所获得的载体用Chaperon Competent CellBL21(Takara Bio Inc.)转化并且在37℃下在含20mg/l氯霉素，50mg/l氨苄青霉素，10μl/l四环素和1g/l L-阿糖的LB培养基(500ml)中振荡培养10小时。当培养基显示0.6的OD600时，添加1mM IPTG并在15℃下振荡培养该混合物24小时。

生长的大肠杆菌通过离心回收，并且使用QIAexpress Ni-NTA Fast Start Kit (QIAGEN)进行蛋白质提取和Histag提纯。通过SDS-PAGE证实提纯的蛋白质。将该蛋白质注入兔以产生多克隆抗体。

使用所产生的多克隆抗体，通过1mg SDS-PAGE电泳从该果实中提取的该蛋白质并且通过蛋白质印迹分析。结果，显示辣椒素酯累积的TG-3和TG-8显示出显著降低的pAMT蛋白质量。此外，在TG-14中，pAMT蛋白质量低于CH-19 Hot(图6)。

从上文中，已经表明生物合成类辣椒素的智利辣椒的pAMT基因的表达的抑制使得能够产生显示出辣椒素酯类物质生物合成的数量增加的植物。

产业实用性

根据本发明，从通常不能产生辣椒素酯类物质或能产生小量辣椒素酯类物质的植物能够大量产生辣椒素酯类物质。本发明是有用的，因为它可以大量且低成本地提供辣椒素酯类物质，其被期望可适用于不同的领域，如药物、健康食品等。

本申请基于在日本申请的专利申请No.2008-163884(申请日:2008年6月23日)，其内容全文包含在此。

序列表

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> 能生物合成辣椒素酯类物质的基因修饰植物

<130> 091394

<150> JP2008-163884

<151> 2008-6-23

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1616

<212> DNA

<213> CH-19 hot

<220>

<221> CDS

<222> (77)..(1456)

<400> 1

tctttctctt tccttagcaa ttttctccat attttgacta attattaagt cataattttc 60

aagaaatctt gaagga atg gcc aat att act aat gaa ttt atg gga cat gat 112

Met Ala Asn Ile Thr Asn Glu Phe Met Gly His Asp

1 5 10

atg ttg gca ccc ttt act gcg gga tgg cag agt gat atg gaa cct tta 160

Met Leu Ala Pro Phe Thr Ala Gly Trp Gln Ser Asp Met Glu Pro Leu

15 20 25

gtt ata gaa aag tcg gag ggc tct tat gtc tat gac ata aat ggg aag 208

Val Ile Glu Lys Ser Glu Gly Ser Tyr Val Tyr Asp Ile Asn Gly Lys

30 35 40

aag tat ctt gac act tta tct ggt tta tgg tgc aca aca tta ggg gga 256

Lys Tyr Leu Asp Thr Leu Ser Gly Leu Trp Cys Thr Thr Leu Gly Gly

45 50 55 60

agt gag act cga ctt gtt gaa gct gca aat aaa caa ctc aat aca ttg 304

Ser Glu Thr Arg Leu Val Glu Ala Ala Asn Lys Gln Leu Asn Thr Leu

65 70 75

cca ttt tat cat tca ttt tgg aat cga acc aca aaa cct tct ttg gat 352

Pro Phe Tyr His Ser Phe Trp Asn Arg Thr Thr Lys Pro Ser Leu Asp

80 85 90

ctt gca aag gag ctc cta aat atg ttt act gca aat aaa atg gcc aaa 400

Leu Ala Lys Glu Leu Leu Asn Met Phe Thr Ala Asn Lys Met Ala Lys

95 100 105

gtt ttt ttc act aat agc gga tca gaa gcc aat gac act cag gtg aag 448

Val Phe Phe Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Gln Val Lys

110 115 120

ctg gtg tgg tat tac aat aat gcc ctt ggg agg cca cag aaa aag aaa 496

Leu Val Trp Tyr Tyr Asn Asn Ala Leu Gly Arg Pro Gln Lys Lys Lys

125 130 135 140

att att gct cga gca aaa gca tat cat ggt tcc act tac att tct gct 544

Ile Ile Ala Arg Ala Lys Ala Tyr His Gly Ser Thr Tyr Ile Ser Ala

145 150 155

ggt ctc tct ggg ctt cct cca atg cat caa aaa ttt gat ttg cca cct 592

Gly Leu Ser Gly Leu Pro Pro Met His Gln Lys Phe Asp Leu Pro Pro

160 165 170

cca ttt gtt ctg cac act gag tgc cct cat tat tgg gcc tat cac ttg 640

Pro Phe Val Leu His Thr Glu Cys Pro His Tyr Trp Ala Tyr His Leu

175 180 185

cca ggt gaa acc gaa gag gaa ttc tct act agg ttg gca aat aat ttg 688

Pro Gly Glu Thr Glu Glu Glu Phe Ser Thr Arg Leu Ala Asn Asn Leu

190 195 200

gaa agt ctt ata ctc aac gag ggg cct gaa aca gta gct gct ttc att 736

Glu Ser Leu Ile Leu Asn Glu Gly Pro Glu Thr Val Ala Ala Phe Ile

205 210 215 220

gcc gaa cca gtc cta gga gca gca ggt gta ata ctt cct ccc gca aca 784

Ala Glu Pro Val Leu Gly Ala Ala Gly Val Ile Leu Pro Pro Ala Thr

225 230 235

tat ttt gat aag gtt caa gct att tta agg aaa cat gac att ctt ttt 832

Tyr Phe Asp Lys Val Gln Ala Ile Leu Arg Lys His Asp Ile Leu Phe

240 245 250

atc gcg gat gag gtg gta tgt gga ttt gga aga ctt ggg aca atg ttt 880

Ile Ala Asp Glu Val Val Cys Gly Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met Phe

255 260 265

ggc agt gat aaa tac aac att aaa cct gat ctt gtc tct gta gca aag 928

Gly Ser Asp Lys Tyr Asn Ile Lys Pro Asp Leu Val Ser Val Ala Lys

270 275 280

gca ctt tct tct gga tat atg cca att gcc gct gtc ctt gta agc cag 976

Ala Leu Ser Ser Gly Tyr Met Pro Ile Ala Ala Val Leu Val Ser Gln

285 290 295 300

aaa att tct agt gtc atc ctt tct gaa agc aat aaa att ggt gcc ttt 1024

Lys Ile Ser Ser Val Ile Leu Ser Glu Ser Asn Lys Ile Gly Ala Phe

305 310 315

tgc cat gga ttt act tat tcc gga cac cct gtt gcg tgc gca gtt gca 1072

Cys His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Cys Ala Val Ala

320 325 330

ttg gaa gca ttg aag atc tat aag gaa aga aat att act gag gtg gtg 1120

Leu Glu Ala Leu Lys Ile Tyr Lys Glu Arg Asn Ile Thr Glu Val Val

335 340 345

aac aaa ata tca caa aag ttt caa gaa ggt ttg aaa gca ttc gcc gac 1168

Asn Lys Ile Ser Gln Lys Phe Gln Glu Gly Leu Lys Ala Phe Ala Asp

350 355 360

agt ccc ata att ggg gag ata agg gga act ggt ttg gca ctt tct aca 1216

Ser Pro Ile Ile Gly Glu Ile Arg Gly Thr Gly Leu Ala Leu Ser Thr

365 370 375 380

gag ttt gtg aac aat aaa tct cct aat gat ccc ttt cca tat gaa tgg 1264

Glu Phe Val Asn Asn Lys Ser Pro Asn Asp Pro Phe Pro Tyr Glu Trp

385 390 395

gct gtc ggt aca tat ttt gga gca caa tgt gct aag tac ggg atg ttg 1312

Ala Val Gly Thr Tyr Phe Gly Ala Gln Cys Ala Lys Tyr Gly Met Leu

400 405 410

gta agt tcc act ggt gat cat gta aat atg gct cca cca ttt acc ttg 1360

Val Ser Ser Thr Gly Asp His Val Asn Met Ala Pro Pro Phe Thr Leu

415 420 425

agt ctt gaa gaa ctt gat gag ttg ata cgc ata tat ggg aaa gca ttg 1408

Ser Leu Glu Glu Leu Asp Glu Leu Ile Arg Ile Tyr Gly Lys Ala Leu

430 435 440

aag gat act gaa aag aga gtt gaa gaa ctc aag tct cag aag aag taa 1456

Lys Asp Thr Glu Lys Arg Val Glu Glu Leu Lys Ser Gln Lys Lys

445 450 455

aagctcacgg cgaaagcttg tttatcctaa aaaagaagag agaaaaaatg atcagatttc 1516

ctctttgtgc tattctacta gtaataaata atgttctcct tgcaactttg cactagagat 1576

tttctattga aagagctttt gttatccaca attatttaca 1616

<210> 2

<211> 459

<212> PRT

<213> CH-19 hot

<400> 2

Met Ala Asn Ile Thr Asn Glu Phe Met Gly His Asp Met Leu Ala Pro

1 5 10 15

Phe Thr Ala Gly Trp Gln Ser Asp Met Glu Pro Leu Val Ile Glu Lys

20 25 30

Ser Glu Gly Ser Tyr Val Tyr Asp Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Leu Asp

35 40 45

Thr Leu Ser Gly Leu Trp Cys Thr Thr Leu Gly Gly Ser Glu Thr Arg

50 55 60

Leu Val Glu Ala Ala Asn Lys Gln Leu Asn Thr Leu Pro Phe Tyr His

65 70 75 80

Ser Phe Trp Asn Arg Thr Thr Lys Pro Ser Leu Asp Leu Ala Lys Glu

85 90 95

Leu Leu Asn Met Phe Thr Ala Asn Lys Met Ala Lys Val Phe Phe Thr

100 105 110

Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Gln Val Lys Leu Val Trp Tyr

115 120 125

Tyr Asn Asn Ala Leu Gly Arg Pro Gln Lys Lys Lys Ile Ile Ala Arg

130 135 140

Ala Lys Ala Tyr His Gly Ser Thr Tyr Ile Ser Ala Gly Leu Ser Gly

145 150 155 160

Leu Pro Pro Met His Gln Lys Phe Asp Leu Pro Pro Pro Phe Val Leu

165 170 175

His Thr Glu Cys Pro His Tyr Trp Ala Tyr His Leu Pro Gly Glu Thr

180 185 190

Glu Glu Glu Phe Ser Thr Arg Leu Ala Asn Asn Leu Glu Ser Leu Ile

195 200 205

Leu Asn Glu Gly Pro Glu Thr Val Ala Ala Phe Ile Ala Glu Pro Val

210 215 220

Leu Gly Ala Ala Gly Val Ile Leu Pro Pro Ala Thr Tyr Phe Asp Lys

225 230 235 240

Val Gln Ala Ile Leu Arg Lys His Asp Ile Leu Phe Ile Ala Asp Glu

245 250 255

Val Val Cys Gly Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met Phe Gly Ser Asp Lys

260 265 270

Tyr Asn Ile Lys Pro Asp Leu Val Ser Val Ala Lys Ala Leu Ser Ser

275 280 285

Gly Tyr Met Pro Ile Ala Ala Val Leu Val Ser Gln Lys Ile Ser Ser

290 295 300

Val Ile Leu Ser Glu Ser Asn Lys Ile Gly Ala Phe Cys His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Cys Ala Val Ala Leu Glu Ala Leu

325 330 335

Lys Ile Tyr Lys Glu Arg Asn Ile Thr Glu Val Val Asn Lys Ile Ser

340 345 350

Gln Lys Phe Gln Glu Gly Leu Lys Ala Phe Ala Asp Ser Pro Ile Ile

355 360 365

Gly Glu Ile Arg Gly Thr Gly Leu Ala Leu Ser Thr Glu Phe Val Asn

370 375 380

Asn Lys Ser Pro Asn Asp Pro Phe Pro Tyr Glu Trp Ala Val Gly Thr

385 390 395 400

Tyr Phe Gly Ala Gln Cys Ala Lys Tyr Gly Met Leu Val Ser Ser Thr

405 410 415

Gly Asp His Val Asn Met Ala Pro Pro Phe Thr Leu Ser Leu Glu Glu

420 425 430

Leu Asp Glu Leu Ile Arg Ile Tyr Gly Lys Ala Leu Lys Asp Thr Glu

435 440 445

Lys Arg Val Glu Glu Leu Lys Ser Gln Lys Lys

450 455

Claims

1.一种生产具有提高的辣椒素酯类物质产生能力的基因修饰植物的方法，包括进行基因修饰以降低在具有类辣椒素生物合成系统属于辣椒属的植物中催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的表达或活性，使从香草醛到香草醇的还原反应变得更占主导，进一步的进行与支链脂肪酸的酯化反应，结果提高辣椒素酯类物质的产生能力，其中，该酶为下述

(a) pAMT基因产物，其由源自辣椒品种CH-19 Hot的SEQ ID NO: 2显示的氨基酸序列构成。

2.根据权利要求1的方法，其进一步包括选择与非基因修饰植物相比表现出辣椒素酯类物质产生的量增加的植物。

3.根据权利要求1或2的方法，其中该基因修饰选自编码针对上述的酶基因的反义RNA、iRNA、核酶或显性-失活突变体的DNA的引入，通过敲除方法或诱变剂处理的基因破坏和编码对该酶的抗体的基因的引入。

4.一种生产辣椒素酯类物质的方法，其包括从基因修饰植物的果实回收辣椒素酯类物质，该基因修饰植物与其野生株相比显示出催化从香草醛到香草胺的氨基转移反应的酶的降低的表达或活性，使从香草醛到香草醇的还原反应变得更占主导，进一步的进行与支链脂肪酸的酯化反应，结果与其野生株相比显示出提高的辣椒素酯类物质产生能力，该野生株具有类辣椒素生物合成系统属于辣椒属，其中，该酶为下述

5.根据权利要求4的方法，其中上述的酶的降低的表达或活性是由以下引起的：该酶基因的破坏或突变、该基因的转录产物的分解或翻译抑制、或该酶对香草醛的作用的抑制。

6.根据权利要求5的方法，其中该基因修饰植物通过上述权利要求1～3中任一项的方法获得。