JP5594137B2 - カプシノイドを生合成する遺伝子改変植物 - Google Patents

Description

本発明は、カプシノイド類の生合成量が上昇した遺伝子改変植物、当該遺伝子改変植物の作出方法、および当該遺伝子改変植物からのカプシノイド類の製造方法などに関する。

トウガラシの辛味成分であるカプサイシノイド（カプサイシン、ジヒドロカプサイシン等）は、エネルギー代謝を促進し、中枢神経を刺激してホルモン分泌を促し、脂肪分解酵素を活性化するので、肥満予防に効果がある。また、胃腸内を殺菌し免疫力を強める働きがあり、免疫力賦活作用や疲労回復にも効果がある。しかし、カプサイシノイドは粘膜を刺激するため、大量に摂取すると胃腸の調子が悪くなることもある。また、日本人には辛味を苦手とする人が少なくない。

辛味の少ないトウガラシとして矢澤らにより選抜固定されたトウガラシの無辛味固定品種である「ＣＨ−１９甘」（品種登録第１０３７５号）は、辛味を呈さない新規なカプシノイド類を多量に含有することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。このカプシノイド類に属する化合物（バニリルアルコールの脂肪酸エステル、カプシエイト、ジヒドロカプシエイト等、以下単に「カプシノイド」または「カプシノイド類」ということがある。）は、カプサイシノイドとは異なり、辛味を示さないものの、免疫の賦活化作用、エネルギー代謝の活性化作用、酸素消費量の亢進作用等を有することが報告されており（例えば、特許文献１、２、非特許文献２参照）、サプリメントなどの原料として今後の応用が期待されている。

多くのトウガラシにおいては、フェニルアラニンを前駆体として、フェルラ酸、バニリン等を経て、バニリルアミンが形成され、分岐鎖脂肪酸とカプサイシノイドシンターゼによりカプサイシノイドが生合成される（図１（ａ）参照）。これに対し、ＣＨ−１９甘ではカプサイシノイドがほとんど作られず、代わりにカプシノイドが生合成されるが、その理由は長年不明であった。

前述のとおり、カプシノイド類は、辛味をほとんど示さず、且つカプサイシノイドと同様に優れた生理活性を示すので、サプリメントなどの原料として今後の応用が期待されている。したがって、カプシノイド類の生合成経路を解明し、新たにカプシノイド類を産生しうる植物体を育種・開発することが望まれている。

特開平１１−２４６４７８号公報 特開２００１−０２６５３８号公報

矢澤ら、園芸学会雑誌、５８巻、６０１−６０７頁、１９８９年 Biosci. Biotech. Biochem.,65 (12), 2735-2740 (2001)

したがって、本発明の目的は、カプシノイド類の生合成経路を解明することであり、当該知見に基づいて、現在カプシノイド類を生産することが知られているＣＨ−１９甘以外の植物から、遺伝子改変により、カプシノイド類産生能を有する植物を提供することである。

本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、ＣＨ−１９甘では、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒するアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるｐＡＭＴ遺伝子に挿入変異が存在することを見出した。即ち、ＣＨ−１９甘では、その親品種である辛味品種「ＣＨ−１９辛」のｐＡＭＴ遺伝子のコード領域中における一塩基挿入変異のために終止コドンが生じ、機能的なアミノトランスフェラーゼが産生されないことが明らかとなった。本発明者らは、当該ｐＡＭＴ遺伝子の変異の結果、ＣＨ−１９甘では、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応に代わって、バニリンからバニリルアルコールへの還元反応が支配的となり、さらに分岐鎖脂肪酸とのエステル化反応の結果、カプシノイド類が形成されるとの仮説を立てた（図１（ｂ）参照）。
本発明者らは、かかる仮説を立証すべく、辛味品種であるタカノツメにｐＡＭＴのアンチセンス核酸を導入したトランスジェニック植物を作製した。得られたトランスジェニック植物のうち、ｐＡＭＴ遺伝子の発現が顕著に低下した系統では、カプサイシノイドの産生が低下する一方、カプシノイドの産生が大きく増大していることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである：
［１］野生株と比べて、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素の発現または活性が低下していることを特徴とする、カプシノイド類産生能を有する遺伝子改変植物；
［２］前記酵素がｐＡＭＴ遺伝子産物である、上記［１］に記載の植物；
［３］前記酵素の発現または活性の低下が、該酵素遺伝子の破壊もしくは変異、該遺伝子転写産物の分解もしくは翻訳抑制、または該酵素のバニリンへの作用の阻害によるものである、上記［１］または［２］に記載の植物；
［４］野生株がカプサイシノイド生合成系を有する、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の植物；
［５］野生株がトウガラシ属に属する植物である、上記［４］に記載の植物；
［６］カプサイシノイド生合成系を有する植物において、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素の発現または活性を低下せしめる遺伝子改変を行うことを含む、カプシノイド類産生能を有する遺伝子改変植物の作出方法；
［７］遺伝子改変が、前記酵素遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ、ｉＲＮＡ、リボザイムもしくはドミナントネガティブ変異体をコードするＤＮＡの導入、ノックアウト法もしくは変異原処理による該遺伝子の破壊、および該酵素に対する抗体をコードする遺伝子の導入からなる群より選択される、上記［６］に記載の方法；
［８］前記酵素がｐＡＭＴ遺伝子産物である、上記［６］または［７］に記載の方法；
［９］カプサイシノイド生合成系を有する植物がトウガラシ属に属する、上記［６］〜［８］のいずれかに記載の方法；および
［１０］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の植物の果実からカプシノイド類を回収することを含む、カプシノイド類の製造方法。

本発明により、カプシノイド類を実質的に産生しないか、少量しか産生しない植物種においても、カプシノイド類の産生を増大させることが可能となる。

予想されるカプサイシン（ａ）およびカプシエイト（ｂ）の合成経路を示す図である。 ｐＡＭＴ遺伝子をアンチセンス方向に挿入したＴｉ-プラスミドベクター、pIG121-Hmの模式図である。 形質転換トウガラシの葉片より抽出したＤＮＡを鋳型とするゲノムPCRの結果を示す図である。Ｍはマーカー、Ｃはコントロール（遺伝子を導入していないタカノツメ）、各数字は選抜した形質転換トウガラシ個体を示す。 形質転換トウガラシおよびＣＨ−１９甘、タカノツメの果実中のカプシエイト含量（ａ）およびカプサイシン含量（ｂ）の分析結果を示す図である。 形質転換トウガラシおよびタカノツメの果実中のｐＡＭＴ遺伝子の転写発現の解析結果を示す図である。 形質転換トウガラシ果実から抽出したタンパク質のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。各レーンは、１：ＣＨ−１９辛、２：ＴＧ−１、３：ＴＧ−３、４：ＴＧ−８、５：ＴＧ−１４、６：ＣＨ−１９甘を示す。

本発明は、野生株と比べて、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素の発現または活性が低下した、カプシノイド類産生能を有する遺伝子改変植物を提供する。

本発明において「野生株」とは、本発明の遺伝子改変の対象となる植物を意味する。本発明に用いられ得る野生株は、カプサイシノイドの生合成に必要な酵素群（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、桂皮酸４−ヒドロラーゼ(Ca4H)、クマル酸３−ヒドロラーゼ(Ca3H)、カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ(COMT)、カプサイシノイドシンターゼ(CS)）を機能的な状態で発現する植物であればいかなるものであってもよい。これらの酵素群は該植物が元来有するものであってもよいし、それらの１つ以上の酵素が外来遺伝子の発現により提供されるものであってもよい。好ましくは、本発明に用いられ得る野生株は、元来カプサイシノイド生合成能を有する植物であり、より好ましくは、トウガラシ属（Capsicum）に属する植物、例えば、C. annuum（タカノツメ、ＣＨ−１９辛、ヤツブサ、トラノオ、フシミ、など）、C. baccatum（アヒ・アマリージョなど）、C. chinense（ハバネロ、ブート・ジョロキアなど）、C. frutescens（キダチトウガラシなど）、C. pubescens（ロコトなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素は、上記野生株が産生するアミノトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質であって、バニリンを基質とし得るものであれば特に制限はないが、好ましくは、ハバネロで見出された、イネおよびトマトのGABAアミノトランスフェラーゼと高いホモロジーを有するアミノトランスフェラーゼｐＡＭＴ（Putative Aminotransferase）遺伝子、あるいは他の植物品種におけるそのオルソログによってコードされるアミノトランスフェラーゼである。

より具体的には、本発明のｐＡＭＴ蛋白質（ｐＡＭＴ遺伝子産物ともいう）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同等以上のアミノトランスフェラーゼ活性（例えば、0.5倍以上、好ましくは0.7倍以上）を有する蛋白質である。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＨ−１９辛由来のｐＡＭＴ蛋白質の天然のアレル変異体、遺伝子多型、あるいは他の植物品種におけるそのオルソログのアミノ酸配列などを意味する。例えば、他の植物品種におけるｐＡＭＴのオルソログとしては、ハバネロ由来のｐＡＭＴ（Refseq No. AAC78480）、イネのGABAアミノトランスフェラーゼ（Refseq No. AAQ14479）およびトマトのGABAアミノトランスフェラーゼ（Refseq No. AAO92257）等が挙げられる。

上記「実質的に同一のアミノ酸配列」は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、最も好ましくは97％以上の類似性（好ましくは、同一性）を有することが望ましい。ここで「類似性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。本明細書におけるアミノ酸配列の類似性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。

本発明は、少なくとも部分的には、カプシノイド生合成系の酵素群が、バニリンからバニリルアルコールへの還元反応を触媒するものを除いて、カプサイシノイド生合成系を構成する酵素群と共通であり、生成するカプシノイドとカプサイシノイドの量比は、上記還元反応と、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応との、いずれの反応がより支配的に進行するかに依存することの発見に基づく。従って、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素の発現または活性を野生株よりも低下させることにより、バニリンからバニリルアルコールへの還元反応がより支配的となり、その結果、カプシノイドの産生能を向上させることができる。

バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素の「発現」とは、当該酵素をコードする遺伝子（例、ｐＡＭＴ遺伝子等）から、翻訳産物（即ち、タンパク質）が産生され、かつ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。酵素の「発現が低下した」とは、結果として、遺伝子改変植物の植物体内に存在する該酵素の蛋白質量が、野生株におけるそれに比べて有意に低下している状態を意味する。したがって、酵素の発現を低下させる遺伝子改変は、例えば、遺伝子レベル、転写レベル、転写後調節レベル、翻訳レベル、翻訳後修飾レベルなどの任意の段階で行うことができる。

例えば、酵素の発現を遺伝子レベルで抑制する遺伝子改変としては、該酵素遺伝子の破壊や機能欠損変異の導入が挙げられる。ここで「機能欠損変異」とは、遺伝子改変植物において、野生株と比べて有意にカプシノイドの産生が増大する程度に、該酵素の活性が低下するような変異であればよく、必ずしも完全に酵素活性を消失しなくともよい。これらの遺伝子改変は、相同組換えを利用した酵素遺伝子のノックアウト（もしくはノックイン）技術により達成され得る。
酵素遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、遺伝子改変の対象となる植物（即ち、野生株）由来の該酵素遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を常法に従って単離し（例えば、ｐＡＭＴ遺伝子の場合、配列番号１に示されるＣＨ−１９辛由来のｐＡＭＴ ｃＤＮＡの塩基配列の全部もしくは一部を含む核酸をプローブとして、野生株から単離したゲノムＤＮＡより作製したゲノムＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法によりｐＡＭＴゲノムＤＮＡをクローン化することができる）、例えば、(1)そのエキソン部分やプロモーター領域に他のＤＮＡ断片（例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等の選択マーカー遺伝子）を挿入することによりエキソンもしくはプロモーターの機能を破壊するか、(2)Cre-loxP系やFlp-frt系を用いて酵素遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、(3)蛋白質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にするか、あるいは(4)転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリアデニル化シグナルなど）を挿入して、完全なｍＲＮＡの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（ターゲッティングベクター）を、相同組換えにより野生株の酵素遺伝子座に組み込ませる方法などが好ましく用いられ得る。
選択マーカー遺伝子は、対象植物の細胞内で機能し得る任意のプロモーターを含む発現カセットの形態であることが好ましいが、該遺伝子が標的酵素遺伝子の内在性プロモーターの制御下におかれるように挿入される場合、選択マーカー遺伝子にはプロモーターを必要としない。

通常、植物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる酵素遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザンハイブリダイゼーション法もしくはＰＣＲ法による組込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はHSV-tk遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより酵素遺伝子座にターゲッティングされた細胞はHSV-tk遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。あるいは、HSV-tk遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。導入ＤＮＡの存在は、出現した耐性コロニーの一部をＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけることにより確認することができる。

酵素の発現を遺伝子レベルで抑制する別の遺伝子改変としては、変異原処理による酵素遺伝子への機能欠損変異の導入が挙げられる。変異原処理としては、野生株のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘発するものであれば、任意のものを用いることができる。具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などが挙げられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も変異原として用いることができる。変異原を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書店） 日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Nature Genet.), 314 (2000)等に記載の方法が用いられ得る。酵素遺伝子の機能欠損変異体は、標的タンパク質の量を指標として選択することができる。例えば、ｐＡＭＴの場合、ｐＡＭＴタンパク質のポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット解析を行い、ｐＡＭＴタンパク質の量を調べることができる。ｐＡＭＴタンパク質量が有意に低下した植物について、植物体の一部から単離した酵素遺伝子の塩基配列を決定することにより、該遺伝子への変異の導入を確認することができる。

酵素の発現を翻訳レベルで抑制する遺伝子改変としては、例えば、酵素遺伝子の転写産物を分解する活性を有する核酸、あるいは該転写産物から酵素蛋白質への翻訳を抑制する核酸の導入が挙げられる。このような核酸としては、該酵素のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
標的酵素のｍＲＮＡの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列とは、対象植物体内の生理的条件下において、該ｍＲＮＡの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該ｍＲＮＡの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、ｍＲＮＡの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、最も好ましくは約97％以上の類似性を有する塩基配列である。本発明における「塩基配列の類似性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。

より具体的には、例えば酵素がｐＡＭＴの場合、ｐＡＭＴ ｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、(a)配列番号１に示される塩基配列または(b)該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質と同等の活性を有する蛋白質をコードする配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。ストリンジェント条件下とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。

ｐＡＭＴ ｍＲＮＡは、好ましくは、配列番号１に示される塩基配列を含むＣＨ−１９辛のｐＡＭＴ ｍＲＮＡ、あるいは他の植物品種におけるそれらのオルソログ（例えば、ハバネロ由来のｐＡＭＴ（Refseq No. AF085149）、イネのGABAアミノトランスフェラーゼ（Refseq No. AF297651）およびトマトのGABAアミノトランスフェラーゼ（Refseq No. AY240231）等）、さらにはそれらの天然のアレル変異体、遺伝子多型である。

「標的酵素のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、標的酵素のｍＲＮＡに特異的に結合することができ、且つ該ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約20塩基以上含むものである。

具体的には、標的酵素のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の(a)〜(c)のいずれかのものが好ましく例示される。
(a) 標的酵素のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡ
(b) 標的酵素のｍＲＮＡに対するｉＲＮＡ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）
(c) 標的酵素のｍＲＮＡに対するリボザイム

(a) 標的酵素のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡ
本発明における「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的ｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的ｍＲＮＡと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。アンチセンスＲＮＡの標的領域は、該アンチセンスＲＮＡがハイブリダイズすることにより、結果として標的ｍＲＮＡから酵素蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該酵素をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡの全配列が挙げられる。
さらに、本発明のアンチセンスＲＮＡは、標的酵素のｍＲＮＡとハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡである該酵素の遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。

(b) 標的酵素のｍＲＮＡに対するｉＲＮＡ
本明細書においては、標的酵素のｍＲＮＡに相補的なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆるｉＲＮＡもまた、標的酵素のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。ｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer;Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。

(c) 標的酵素のｍＲＮＡに対するリボザイム
リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。標的酵素のｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。

標的酵素のｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡが、例えば100bp以上の比較的長いものであれば、常法に従って標的酵素のｃＤＮＡをクローニングし、これをそのまま、あるいは適当な制限酵素で消化して所望の領域を含む所望の長さに断片化した後、対象植物の細胞内で機能し得るプロモーターの下流に、アンチセンス方向で連結することにより作製することができる。アンチセンスＲＮＡが、例えば100bp以下の比較的短いものであれば、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて化学合成することもできる。
標的酵素のｍＲＮＡに対するｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｍＲＮＡ上の標的配列（例えば200〜500塩基程度）をRT-PCRにより増幅して２本鎖ＤＮＡを調製した後、制限酵素およびリガーゼを用いて、２つの該２本鎖ＤＮＡを適当なリンカー配列を介してセンスの向きとアンチセンスの向きとに連結して、ヘアピン型ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡとして構築することができる。リンカー配列は、構築されたＤＮＡが転写された際にヘアピン型ｄｓＲＮＡを形成し得るようなループを形成しうる限り、その配列や長さに特に制限はないが、例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子をリンカー配列として用いると、ヘアピン型ｄｓＲＮＡからのｉＲＮＡの切り出しを該レポーター遺伝子の発現を検出することによりモニターすることができる。
標的酵素のｍＲＮＡに対するリボザイムをコードするＤＮＡは、デザインされたリボザイムの塩基配列を有するＤＮＡを、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて合成することにより調製することができる。

標的酵素のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、いかなる遺伝子工学的手法によって対象植物に導入されてもよく、例えば、該核酸を含むように遺伝子操作されたウイルスゲノムを有する植物ウイルスによる感染、あるいは該核酸を含有する発現ベクターによる対象植物細胞の形質転換が挙げられる。
好ましくは、本発明の遺伝子改変植物は、対象植物（野生株）細胞で機能し得るプロモーターの制御下にある上記核酸を含む発現ベクターで、該野生株の細胞を形質転換することにより得られる、トランスジェニック植物である。

野生株の細胞で機能し得るプロモーターは、野生株として使用される植物種に応じて適宜選択され得るが、一般に植物細胞で構成的に発現する遺伝子プロモーター、好ましくは植物または植物ウイルス由来の構成的プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等）、あるいは野生株の標的酵素遺伝子の内在のプロモーター等が挙げられる。

本発明の発現ベクターにおいて、標的酵素のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、野生株の細胞で機能し得るプロモーターによりその転写が制御されるように、該プロモーターの下流に配置される。該核酸配列の下流には、野生株の細胞で機能し得る転写終結シグナル（ターミネーター領域）がさらに付加されていることが好ましい。このようなターミネーターとしては、例えば、ＮＯＳ（ノパリン合成酵素）遺伝子ターミネーター等が挙げられる。

本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列等のシス調節エレメントをさらに含んでいてもよい。また、該発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子マーカー等の形質転換体選択のためのマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NPTII）遺伝子、ハイグロマイシンシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（PAT）遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子等をさらに含むことが望ましい。
さらに、大量調製および精製を容易にするために、該発現ベクターは、大腸菌での自律複製を可能にする複製起点および大腸菌での選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等）を含むことが望ましい。本発明の発現ベクターは、簡便には、pUC系またはpBR系の大腸菌ベクターのクローニング部位に上記核酸の発現カセットと必要に応じて選択マーカー遺伝子を挿入することにより構築することができる。

アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）やアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）による感染を利用して上記核酸を導入する場合には、該細菌が保持するＴｉまたはＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（植物染色体に転移する領域）内に該核酸の発現カセットを挿入して用いることができる。アグロバクテリウム法による形質転換の標準的な方法ではバイナリーベクター系が使用される。Ｔ−ＤＮＡ転移に必要な機能は、Ｔ−ＤＮＡ自身とＴｉ（またはＲｉ）プラスミドの両者から独立に供給され、それぞれの構成要素は別々のベクター上に分割できる。バイナリープラスミドはＴ−ＤＮＡの切り出しと組込みに必要な両端の25bpボーダー配列を有し、クラウンゴール（または毛状根）を引き起こす植物ホルモン遺伝子が除去されており、同時に外来遺伝子の挿入の余地を与えている。このようなバイナリーベクターとして、例えばpBI101やpBI121（ともにCLONTECH社）などが市販されている。なお、Ｔ−ＤＮＡの組込みに作用するvir 領域は、ヘルパープラスミドと呼ばれる別のＴｉ（またはＲｉ）プラスミド上にあってトランスに作用する。

植物の形質転換には、従来公知の種々の方法を使用することができる。例えば、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの細胞壁分解酵素処理により、対象植物の細胞からプロトプラストを単離し、該プロトプラストと上記ｐＡＭＴ遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターとの懸濁液にポリエチレングリコールを加えてエンドサイトーシス様の過程で該発現ベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（ＰＥＧ法）、ホスファチジルコリン等の脂質膜小胞内に超音波処理等により発現ベクターを入れ、該小胞とプロトプラストをＰＥＧ存在下に融合させる方法（リポソーム法）、ミニセルを用いて同様の過程で融合させる方法、プロトプラストと発現ベクターの懸濁液に電気パルスを印加して外液中のベクターをプロトプラスト内に取り込ませる方法（エレクトロポーレーション法）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、プロトプラストから植物体へ再分化させる培養技術を必要とする点で煩雑である。細胞壁を有するインタクトな細胞への遺伝子導入手段としては、マイクロピペットを細胞に刺し込み、油圧やガス圧でピペット内のベクターＤＮＡを細胞内に注入するマイクロインジェクション法、およびＤＮＡをコーティングした微小金属粒子を火薬の爆発やガス圧を利用して加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法等の直接導入法と、アグロバクテリウムによる感染を利用した方法とがある。マイクロインジェクションは操作に熟練を要し、また、扱える細胞数が少ないという欠点がある。したがって、操作の簡便性を考慮すれば、アグロバクテリウム法およびパーティクルガン法により植物を形質転換することが好ましい。パーティクルガン法は、栽培中の植物の頂端分裂組織に直接遺伝子を導入することが可能である点でさらに有用である。また、アグロバクテリウム法において、バイナリーベクターに植物ウイルス、例えばトマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）等のジェミニウイルスのゲノムＤＮＡをボーダー配列の間に同時に挿入することにより、栽培中の植物の任意の部位の細胞に注射筒などを用いて菌懸濁液を接種するだけで、植物体全体にウイルス感染が拡がり、同時に目的遺伝子も植物体全体に導入される。

但し、パーティクルガン法やアグロバクテリウム法では、遺伝子導入がキメラとなる場合が多いので、生殖系列（germ line）の細胞に高頻度に上記核酸が導入されるような試料細胞を、形質転換のために使用する必要がある。例えば、胚、胚軸切片、胚形成カルス（embryogenic callus）、単離した生長点等が挙げられる。一方、プロトプラストを用いる上記の各形質転換法およびマイクロインジェクション法は、単一の細胞からの再分化植物の選択が可能なので、全細胞にｐＡＭＴ遺伝子が導入されたホモジニアスなトランスジェニック植物を取得するという観点からは優れた形質転換手段といえる。

以下に、具体例として、トウガラシ属植物における、アグロバクテリウムによる目的核酸の導入および形質転換細胞の植物体への再生法を示すが、これは単なる例示であって、本発明の遺伝子改変植物の作出方法は、これに何ら限定されない。
トウガラシ植物の種子を滅菌後、適当な種子発芽用培地（例、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地など）に播種し、無菌的に栽培する。一方で、プロモーターに目的核酸が接続され、且つカナマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドにより形質転換したアグロバクテリウムを培養し、適当な培地で希釈してアグロバクテリウム液を調製する。発芽した子葉をアグロバクテリウム液に約10分間程度浸漬した後、所望の植物ホルモン（例えば、IAA、NAAなどのオーキシン類、カイネチン、ベンジルアデニンなどのサイトカイニン類）およびカナマイシンおよびハイグロマイシン系抗生物質を添加した選択培地（例、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地など）に移植し、20〜30℃で培養する。得られたカナマイシンおよびハイグロマイシン耐性のカルスや実生を、必要に応じてベンジルアデニンを添加した再分化（発根）培地（例、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地など）に移植して再分化（発根）を誘導し、幼植物体を得る。数枚の本葉が観察されたら、幼植物体を土壌に移植して馴化させ、バイオトロン等の制御された温室内で栽培を行う。このようにして得られた形質転換体から種子や果実を得ることができる。

上記形質転換体より、常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、導入した目的核酸をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行ない、形質転換の有無を確認することができる。また、目的核酸を特異的に増幅するプライマーを合成して、ＰＣＲ法により形質転換の有無を確認することもできる。
また、形質転換体や、非形質転換体より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、標的酵素のｍＲＮＡの発現量の変化を定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンハイブリダイゼーション等により調べることができる。あるいは、形質転換体や、非形質転換体より、常法に従って蛋白質を抽出し、標的酵素に対する抗体を用いて、標的酵素の蛋白質の発現量の変化をイムノアッセイ（ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＦＩＡ法など）により調べることができる。上述のように、植物における遺伝子組換え事象の大半は非相同組換えによることから、導入された核酸が組み込まれた染色体領域の位置効果のために、すべてのトランスジェニック植物において、標的酵素の発現が野生株と比べて低下するとは限らない。したがって、上記のようにして、形質転換体と非形質転換体とで、標的酵素のＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルでの発現量を測定し、比較することにより、トランスジェニック植物において標的酵素の発現が野生株に比べて低下していることを確認することにより、目的の遺伝子改変植物を取得することができる。

このようにして得られるトランスジェニック植物の自家受粉により得られる種子から分化する植物には、野生株と比べて標的酵素の発現が低下し、その結果カプシノイドの産生能が野生株に比べて増大したものが、目的核酸の組込み様式に応じて統計的に一定の比率で含まれる。再分化当代（Ｒ０）植物体の自家受粉により得られるＲ１種子から分化する植物における、該改良されたカプシノイド産生能の出現比率は、通常メンデル則に従う。例えば、該目的核酸が一遺伝子座にヘテロに（heterozygous）組み込まれた場合、Ｒ１種子では改良されたカプシノイド産生能は３：１の割合で分離する。Ｒ１種子から分化させたＲ１植物のうち改良されたカプシノイド産生能を有するものを栽培し、自家受粉させて得られるＲ２種子において、改良されたカプシノイド産生能がすべての種子で保持されていれば、該Ｒ１植物は導入された核酸についてホモ接合体（homozygote）であり、改良されたカプシノイド産生能が３：１に分離すれば、該Ｒ１植物は導入された核酸についてヘテロ接合体（heterozygote）であると決定できる。このようにして選抜された、導入された核酸についてホモ接合体である遺伝子改変植物は、改良されたカプシノイド産生能が固定された系統として極めて有用である。尚、カプシノイドは果実（果皮、胎座など）に蓄積するので、カプシノイド産生能をより早い段階で知るには、葉などの組織でも発現する、標的酵素の発現または活性を指標とすることが望ましい。

バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素の活性を阻害する遺伝子改変としては、公知のものであれば特に限定されないが、例えば当該酵素に対する抗体遺伝子の導入およびドミナントネガティブ変異体遺伝子の導入などが挙げられる。

抗体遺伝子はＨ鎖およびＬ鎖の植物体内でのアッセンブリ効率などの障壁を回避するように、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製される単鎖抗体をコードするものであることが望ましい。このような抗体は、常法により標的酵素蛋白質もしくはそのフラグメントで免疫したマウスから、抗体産生ハイブリドーマを作製し、該細胞から該抗体遺伝子を常法によりクローニングし、その断片を適宜リンカーＤＮＡを介して連結することにより調製することができる。

ドミナントネガティブ変異体とは、標的酵素に対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。該ドミナントネガティブ変異体は、基質であるバニリンに対して野生株に内在の標的酵素と競合することで、間接的にその機能を阻害することができる。該ドミナントネガティブ変異体は、標的遺伝子をコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体は、ＰＣＲや公知のキットを用いる自体公知の方法により作製できる。

抗体遺伝子やドミナントネガティブ変異体をコードするＤＮＡを対象植物に導入し、トランスジェニック植物を取得する方法は、標的酵素のｍＲＮＡの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の導入に関して上記したと同様の方法が、好ましく使用され得る。

得られた遺伝子改変植物において、標的酵素の活性が野生株に比べて低下していることは形質転換体と非形質転換体とで、標的酵素の活性を測定し、比較することにより、目的の遺伝子改変植物を取得することができる。例えば、標的酵素がｐＡＭＴの場合、胎座や花などから蛋白質を抽出し、該抽出液にバニリンを添加して一定時間インキュベートした後、生成したバニリルアミンをＨＰＬＣなどにより定量することにより、酵素活性を調べることができる。

以上のようにして得られる、野生株と比べて、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素の発現または活性が低下した遺伝子改変植物は、該野生株よりもカプシノイド類の産生能が増大している。「産生能が増大する」とは、元来カプシノイド類を産生する能力を有する野生株に対して、カプシノイド類の産生能がさらに上昇することであってもよいし、元来カプシノイド類の産生が認められなかった植物が、新たに産生能を獲得することであってもよい。

本発明はまた、本発明の遺伝子改変植物からのカプシノイド類を回収することによる、カプシノイド類の製造方法を提供する。カプシノイド類を回収する方法としては、公知のいかなる方法を用いてもよく、例えば、上記特許文献１（特開平１１−２４６４７８号公報）、特開２００２−２２６４４５号公報、特開２００４−０１８４２８号公報、国際公開ＷＯ２００５／１２２７８７号公開パンフレット及び／又は国際公開２００６／０４３６０１号公開パンフレットに記載された方法を用いることができるが、これらに限定されない。

実施例１：ｐＡＭＴ遺伝子発現抑制形質転換トウガラシの作出
ＣＨ−１９甘から抽出したcDNAよりRT-PCRで増幅したｐＡＭＴ遺伝子を、Ti-プラスミドベクターpIG121-HmのGUS領域にアンチセンス方向に挿入した（図２）。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA101株に導入し、トウガラシの形質転換に用いた。
タカノツメの種子を70％エタノールで1分、2％次亜塩素酸ナトリウムで15分間表面殺菌し、滅菌水で3回濯ぎ、MS培地に播種した。10日後に発芽した子葉を切り取り、10 mg/lベンジルアデニン（BA）を含むMS培地に置床した。16時間日長、25℃で24時間培養を行った後、50 mg/lカナマイシンおよび50 mg/lハイグロマイシンを含むYEP培地で24時間培養したアグロバクテリウム液に10分間浸漬させた。余分なアグロバクテリウム液を取り除くために、滅菌した濾紙に葉片を載せ、その後、再度10 mg/l ベンジルアデニン（BA）を含むMS培地に置床した。暗所で3日間Co-cultivationを行った後、葉片は10 mg/l BA、50 mg/lカナマイシンおよび300 mg/lカルベニシリンを含むMS培地（選抜培地）に移植し、16時間日長、25℃で培養を行った。アグロバクテリウムの増殖を抑えるために、選抜培地は10日〜2週間ごとに新しい培地に移植した。選抜を開始してから1〜2ヶ月後に再分化したシュートは、50 mg/lカナマイシンおよび300 mg/lカルベニシリンを含むMS培地（発根培地）に移植し、発根を誘導した。発根した16株の植物を土壌に移植し，バイオトロンにて栽培を行った。選抜した個体の葉片よりDNAを抽出し、ベクター内のNPTII遺伝子を増幅させるプライマーを用いて、ゲノムPCR解析を行った。PCR産物は、1.5％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、選抜した個体にはNPTII遺伝子が導入されていることが分かった（図３）。

実施例２：形質転換トウガラシのカプシエイトおよびカプサイシン含量の測定
形質転換トウガラシ16株および遺伝子を導入していないタカノツメより、それぞれ果実を採取し、常法に従ってカプシエイトおよびカプサイシンの含量の測定を行った。その結果、形質転換トウガラシ3個体（TG-3, 8 および14）は、対照のタカノツメよりも多量のカプシエイトを含んでいることが分かった。また、TG-3およびTG-8は、他の株に比べてカプサイシン含量が低かった（図４（ａ）および４（ｂ））。

実施例３：形質転換トウガラシ果実中のｐＡＭＴ遺伝子の転写発現解析
カプシエイト含量が高かった株の果実よりRNAを抽出し、内在性のｐＡＭＴ遺伝子の転写量についてRT-PCR分析を行った結果、カプシエイト含量が高かった株はｐＡＭＴ遺伝子の転写発現が抑制されていることが分かった。一方、遺伝子が導入されていてもカプシエイト含量が高くなかった株では、内在性のｐＡＭＴ遺伝子の転写発現が抑制されていないことが分かった（図５）。以上の結果より、ｐＡＭＴ遺伝子の発現を抑制することで、人為的にカプシエイトを合成するように植物を改変できることが分かった。

実施例４：形質転換トウガラシ果実におけるｐＡＭＴタンパク質量の解析
ＣＨ−１９辛より単離したｐＡＭＴ遺伝子の全長を大腸菌での発現系のベクター（pColdIベクター，タカラバイオ(株)）のマルチクローニングサイトに挿入した。得られたベクターはChaperon Competent Cell BL21（タカラバイオ(株)）に形質転換した。20 mg/lクロラムフェニコール、50 mg/lアンピシリン、10μl/lテトラサイクリン、1 g/l L-アラビノースを含むLB培地500 mlで、10時間37℃で振とう培養した。培養液のOD600が0.6になったら、1 mMのIPTGを添加し、15℃で24時間振とう培養を行った。
増殖した菌を遠心分離によって回収し、QIAexpress Ni-NTA Fast Start Kit (QIAGEN社)を用いて、タンパク質の抽出およびHisタグ精製を行った。精製したタンパク質はSDS-PAGEにより確認を行った。このタンパク質をウサギに注射し、ポリクローナル抗体の作製を行った。
作製したポリクローナル抗体を用いて、果実より抽出したタンパク質を1 mg SDS-PAGEで電気泳動し、ウエスタンブロット解析を行った。その結果、カプシエイトの蓄積が認められたTG-3およびTG-8ではｐＡＭＴタンパク質量が顕著に減少し、TG-14においてもCH-19辛に比べて減少していることが分かった（図６）。

以上より、カプサイシノイド類を生合成するトウガラシのｐＡＭＴ遺伝子の発現を抑制することにより、カプシノイドの生合成量が上昇した植物体を作出できることが示された。

本発明によれば、従来カプシノイド類を産生しなかったか、産生量の低かった植物からカプシノイド類を高生産させることが可能であり、医薬や健康食品などの種々の分野での応用が期待されるカプシノイド類を、安価かつ大量に提供することができる点で有用である。

本出願は、日本で出願された特願２００８−１６３８８４（出願日２００８年６月２３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (4)

1. カプサイシノイド生合成系を有する、トウガラシ属に属する辛味品種植物において、バニリンからバニリルアミンへのアミノ基転移反応を触媒する酵素の発現または活性を低下せしめる遺伝子改変を行うこと、並びに遺伝子改変前の植物におけるカプシノイド類産生量と比べて、カプシノイド類産生量が増大した植物を選択することを含む、カプシノイド類産生能が増大した遺伝子改変植物の作出方法であって、該酵素は、
   （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＣＨ−１９辛由来のputative aminotransferase（ｐＡＭＴ）蛋白質；あるいは
   （ｂ）（ａ）の蛋白質の天然のアレル変異体もしくは遺伝子多型、またはＣＨ−１９辛以外の品種における（ａ）の蛋白質のオルソログ
   である、方法。
2. 前記酵素の発現または活性の低下が、該酵素遺伝子の破壊もしくは変異、該遺伝子転写産物の分解もしくは翻訳抑制、または該酵素のバニリンへの作用の阻害によるものである、請求項１に記載の方法。
3. 遺伝子改変が、前記酵素遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ、ｉＲＮＡ、リボザイムもしくはドミナントネガティブ変異体をコードするＤＮＡの導入、ノックアウト法もしくは変異原処理による該遺伝子の破壊、および該酵素に対する抗体をコードする遺伝子の導入からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により得られたカプシノイド類産生能が増大した遺伝子改変植物の果実からカプシノイド類を回収することを含む、カプシノイド類の製造方法。