WO2023008076A1 - グリコアルカロイドを低減した遺伝子改変ジャガイモ、及びその作製方法 - Google Patents

グリコアルカロイドを低減した遺伝子改変ジャガイモ、及びその作製方法 Download PDF

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WO2023008076A1
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potato
cslm
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nucleic acid
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洋三 柳楽
晴康 濱田
亮 遠藤
直行 梅基
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株式会社カネカ
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Definitions

  • the present invention relates to genetically modified potatoes with reduced glycoalkaloids, and methods for producing the same.
  • SGA steroidal glycoalkaloids
  • solanine and chaconine which are toxic substances.
  • SGA accumulates in potato tubers and shoots emerging from the tubers.
  • a low concentration of SGA causes an unpleasant taste such as harshness, and a high concentration of SGA causes food poisoning. Therefore, keeping the SGA content of potatoes low is an important issue in potato breeding.
  • potatoes temporarily stop growing and developing during the dormancy period of several months after harvesting, but they cannot be stored for a long time because they start sprouting after dormancy. Therefore, controlling potato sprouting is an important issue in the potato processing industry.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Solanine and chaconine synthesizing genes PGA1, PGA2, and 16DOX have been shown to suppress sprouting in potatoes (Non-Patent Documents 1 and 2). On the other hand, even if SSR2 and PGA4, which are solanine and chaconine synthesis genes, are knocked down, sprouting of potatoes cannot be suppressed, and the mechanism of sprouting control has not been elucidated.
  • the object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the past and to achieve the following objects. That is, the present invention aims to provide a genetically modified potato in which the SGA content is reduced, sprouting is delayed, and senescence is suppressed by modifying the endogenous gene of potato, and an efficient method for producing the same. aim.
  • the inventors of the present invention conducted intensive research to achieve the above object, and as a result, developed a method for producing genetically modified potatoes, which comprises the step of introducing deletion, insertion, or substitution into the potato CSLM gene. It has been found that, by adopting this method, it is possible to provide a genetically modified potato having a reduced SGA content, delayed sprouting, and suppressed senescence, and an efficient method for producing the same, by modifying the endogenous gene of potato. .
  • the present invention is based on the above findings by the present inventors, and the means for solving the above problems are as follows. Namely ⁇ 1> A genetically modified potato characterized by introducing a deletion, insertion, or substitution into the CSLM gene. ⁇ 2> A method for producing a genetically modified potato, comprising the step of introducing deletion, insertion, or substitution into the potato CSLM gene. ⁇ 3> A method for editing the genome of potato, comprising the step of introducing a deletion, insertion, or substitution into the CSLM gene of potato using a genome editing means.
  • a composition for producing genetically modified potatoes comprising either an enzyme or a nucleic acid encoding the nucleic acid-metabolizing enzyme.
  • a method for judging a genetically modified potato comprising the step of judging whether the potato is a genetically modified potato, using the presence or absence of deletion, insertion, or substitution of the CSLM gene in the potato as an index.
  • the above-mentioned problems in the conventional art can be solved and the above-mentioned objects can be achieved.
  • SGA content is reduced, sprouting is delayed, and senescence is suppressed by modifying the endogenous genes of potatoes. , genetically modified potatoes, and efficient production methods thereof.
  • FIG. 1 is a photograph of tubers of SSR2 gene-silenced potato lines showing the state of sprouting after the tubers have been placed in the dark at 20°C.
  • FIG. 2 is a photograph of a tuber of a PGA4 gene-silenced potato line showing the state of sprouting after the tuber has been placed in the dark at 20°C.
  • FIG. 3 shows the structure of the vector used for transformation.
  • FIG. 4 shows the base sequence near the target sequence of genome editing of the CSLM gene (first row), and the base sequence determined by cloning the amplified fragment containing the genome editing region from the genome-edited individual (second row) (pSuehiro117#343).
  • FIG. 4 shows the base sequence near the target sequence of genome editing of the CSLM gene (first row), and the base sequence determined by cloning the amplified fragment containing the genome editing region from the genome-edited individual (second row) (pSuehiro117#343).
  • FIG. 5 shows the base sequence near the target sequence of genome editing of the CSLM gene (first row), and the base sequence determined by cloning an amplified fragment containing the genome editing region from the genome-edited individual (second row) (pSuehiro117#389).
  • FIG. 6 shows the results of quantitative analysis of glycoalkaloid content in genome-edited transformants.
  • FIG. 7 is a photograph of a tuber of a CSLM gene genome-edited potato line showing the state of sprouting seven weeks after being placed in the dark at 20°C.
  • FIG. 8 is a graph showing the average sprout length and the total sprout length of tubers of genome-edited potato lines of the CSLM gene seven weeks after being placed in the dark at 20°C.
  • FIG. 9 is a photograph of a tuber of a CSLM gene genome-edited potato line showing the sprouting state immediately after being placed in the dark at 20°C.
  • FIG. 10 is a photograph of tubers showing the state of sprouting seven weeks after the CSLM gene genome-edited potato line tubers were placed in the dark at 20°C.
  • FIG. 11 is a photograph of tubers showing the state of sprouting 9 weeks after the CSLM gene genome-edited potato line tubers were placed in the dark at 20°C.
  • FIG. 12 is a graph showing the average sprout length and the total sprout length of sprouts 9 weeks after the CSLM gene genome-edited potato line was placed in the dark at 20°C.
  • the genetically modified potato has a deletion, insertion, or substitution introduced into the cellulose synthase like M gene (hereinafter referred to as CSLM gene).
  • CSLM gene is also known as the GAME15 gene.
  • the CSLM gene is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. and a nucleotide sequence that encodes a homologue of a protein having the amino acid sequence of The homologue is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 22 is preferably 80% or more, and 85%.
  • a sequence identity of ⁇ 90% is more preferred, a sequence identity of ⁇ 90% is more preferred, a sequence identity of ⁇ 95% is particularly preferred, and a sequence identity of ⁇ 99% is most preferred.
  • the base sequence encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 22 is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the homologue is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the sequence identity with the sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 23 is preferably 80% or more, such as 85%.
  • a sequence identity of ⁇ 90% is more preferred, a sequence identity of ⁇ 90% is more preferred, a sequence identity of ⁇ 95% is particularly preferred, and a sequence identity of ⁇ 99% is most preferred.
  • deletion, insertion, or substitution is not particularly limited as long as the deletion, insertion, or substitution is artificially introduced, and can be appropriately selected depending on the purpose. , or permutations, or combinations thereof.
  • the deletion is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, and includes deletions resulting in frameshift mutations, deletions resulting in in-frame mutations, and the like. Among these, deletions resulting in frameshift mutations are preferred.
  • the deletion resulting in the frameshift mutation is obtained by introducing a deletion of a number of bases other than a multiple of 3 bases.
  • the deletion resulting in the in-frame mutation is obtained by introducing a deletion of a multiple of 3 bases.
  • the deletion site is preferably a site encoding an active site, an allosteric site, an interaction site between proteins, or the like, or in the vicinity thereof.
  • the insertion is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Among these, an insertion resulting in a frameshift mutation is preferred.
  • the insertion resulting in the frameshift mutation is obtained by introducing an insertion of a number of bases other than a multiple of 3 bases.
  • the insertion resulting in the in-frame mutation is obtained by introducing an insertion of a multiple of 3 bases.
  • the insertion site is preferably a site encoding an active site, an allosteric site, an interaction site between proteins, or the like, or in the vicinity thereof.
  • the substitution is not particularly limited as long as it is a non-synonymous substitution, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the substitution site is preferably a site encoding an active site, an allosteric site, an interaction site between proteins, or the like, or in the vicinity thereof.
  • the genetically modified potato preferably has a reduced glycoalkaloid content compared to the genetically unmodified potato.
  • the reduction in the glycoalkaloid content is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. is more preferred, 10% or less is particularly preferred, and below the detection limit is most preferred.
  • the glycoalkaloid is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose, but solanine or chaconine is preferable. Among these, it is preferred that the solanine and chaconine contents are reduced compared to the genetically unmodified potato.
  • the decrease in the solanine content is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. It is more preferably 10% or less, particularly preferably 10% or less, and most preferably less than the detection limit.
  • the reduction in the chaconine content is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. It is more preferably 10% or less, particularly preferably 10% or less, and most preferably less than the detection limit.
  • the glycoalkaloid content is measured by the following method. About 100 mg of potato leaves are frozen in liquid nitrogen and ground in a mixer mill (1/30 sec for 2 minutes). Add 300 ⁇ L of methanol to the crushed leaves and sonicate for 10 minutes. Centrifugation (15000 rpm for 10 minutes) is performed and the supernatant is collected. This extraction operation is repeated three times, the recovered supernatant is dried under reduced pressure, and the residue is redissolved in 200 ⁇ L of methanol. 180 ⁇ L of methanol is added to 20 ⁇ L of the redissolved solution, and glycoalkaloids are analyzed using LC-MS (manufactured by Waters, product name: UPLC-ESI-MS ACQUITY).
  • LC-MS manufactured by Waters, product name: UPLC-ESI-MS ACQUITY
  • ACQUITY HSS T3 1.8 ⁇ m ⁇ 2.1 ⁇ 100 mm (manufactured by Waters) is used as a column.
  • Gradient elution was 0-30 min, 90% A/10% B to 45% A/55% B, 30-31 min, 45% A/55% B to 100% B, 31-35 min, 100% B. by holding on.
  • Glycoalkaloids are quantified by comparison with a standard.
  • the genetically modified potato has a reduced sprout length in the dark after the post-harvest dormancy period, compared to the genetically unmodified potato.
  • the sprout length is measured by the following method. Potatoes cultured in a test tube are conditioned and cultivated in culture soil (PRO-MIX BX, manufactured by Premier) in a closed greenhouse (23°C, 16 hours illumination (photon flux density 32 ⁇ E/m2s)/8 hours no illumination). and harvest the tubers. After harvesting, store at 4 ° C. for about 3 months, then store at 20 ° C. in the dark for 7 weeks or 9 weeks, measure the sprout length of each sprout of 5 mm or more in the tuber, and measure the sprout length of each sprout in the tuber. Determine the average sprout length or the total sprout length of each sprout in the tuber. The sprout length is measured using at least 3 tubers and the average value is obtained.
  • the decrease in sprout length is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 80% or less relative to genetically unmodified potatoes. , is more preferably 70% or less, more preferably 50% or less, particularly preferably 30% or less, and most preferably 20% or less.
  • the reduction in sprout length (the total sprout length of each sprout in a tuber) is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 80% or less relative to genetically unmodified potatoes. , is more preferably 70% or less, more preferably 50% or less, particularly preferably 30% or less, and most preferably 20% or less.
  • the sprout length reduction it is preferable that the average sprout length of each sprout in the tuber or the total sprout length of each sprout in the tuber is reduced, and the sprout length of each sprout in the tuber. and the total sprout length of each sprout in the tuber are reduced.
  • the method for producing the genetically modified potato includes the step of introducing a deletion, insertion, or substitution into the potato CSLM gene, and may further include other steps.
  • the step of introducing deletion, insertion, or substitution into the CSLM gene of potato is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include methods using genome editing.
  • the method using genome editing is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the method of introduction is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples include a method of shooting a potato with microparticles coated by editing means.
  • the genome editing means is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the genome editing means may be a genome editing vector.
  • the genome-editing vector is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include vectors based on binary vectors.
  • the sequence contained in the genome editing vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a sequence encoding a protein that binds to the CSLM gene, or a guide RNA that targets the CSLM gene is included, and other sequences may be included.
  • the partial sequence of the CSLM gene recognized by the protein that binds to the CSLM gene is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. ), TGCAAAGATTCCGATCT (SEQ ID NO: 4) and AATGGTATTCACTGCCA (SEQ ID NO: 5).
  • the lower limit of the length of the guide RNA is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. More than 19 nucleotides are particularly preferred, more than 19 nucleotides are particularly preferred, and more than 20 nucleotides are most preferred.
  • the upper limit of the length of the guide RNA is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Subnucleotides are particularly preferred.
  • Said guide RNA may comprise a guide sequence fused to the tracr sequence.
  • Mutations may be introduced into the CSLM gene by inserting or replacing foreign DNA by recombination between the cleaved sites.
  • the nucleic acid-metabolizing enzyme is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, and includes nucleases, deaminase, and the like.
  • the nucleic acid metabolizing enzyme may contain one or more nuclear localization signals (NLS).
  • the nuclease is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and includes CAS nuclease of CRISPR-CAS system, zinc finger nuclease, protein expressing zinc finger nuclease activity, TAL effector nuclease (TALEN), TARGET AID, meganuclease and the like.
  • the nuclease may be derived from a different biological species, and for example, genes of animals, plants, microorganisms, viruses, etc., or artificially synthesized genes can be used.
  • the CAS nuclease is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose. is preferred. Said Cas nuclease may be codon optimized for expression in eukaryotic cells. The Cas nuclease can direct cleavage of one or two strands at the localization of a target sequence.
  • the Cas9 is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, including Cas9 of Streptococcus pneumoniae, Cas9 of Streptococcus pyogenes, Cas9 of Thermophilus (Streptococcus thermophilus), Cas9 of Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) and the like can be mentioned, but Cas9 of Streptococcus pyogenes is preferred.
  • It may also be a mutant Cas9 derived from these organisms, or a D10A mutant of Cas9 known to function as a nickase (a DNA-cleaving enzyme that nicks only one DNA strand) It may well be a Cas9 homologue, or an ortholog.
  • the nuclease domain in the TALEN is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. and nuclease domains derived from Among these, FokI is preferred.
  • the TAL-effector DNA-binding domain in the TALEN is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include those derived from plant pathogens of the genus Xanthomonas.
  • the deaminase is not particularly limited as long as it has deaminase activity, and can be appropriately selected according to the purpose. can do.
  • sequences are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include promoters, enhancers, insulators, introns, terminators, poly-A addition signals, selectable marker genes, and the like.
  • the promoter may be non-plant-derived DNA as long as it functions in potato and is constitutively expressed, or can induce expression in a specific tissue or at a specific developmental stage of potato.
  • Specific examples include cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, El2-35S omega promoter, nopaline synthase gene promoter (Pnos), maize-derived ubiquitin promoter, rice-derived actin promoter, tobacco-derived PR protein promoter, ADH. promoter, RuBisco promoter, and the like. Sequences that enhance translational activity, such as the tobacco mosaic virus omega sequence, can be used to increase translation efficiency.
  • proteins can be translated from multiple coding regions by inserting an IRES (internal ribosomal entry site) as a translation initiation region 3'-downstream of the promoter and 5'-upstream of the translation initiation codon.
  • IRES internal ribosomal entry site
  • the terminator may be a sequence capable of terminating the transcription of the gene transcribed by the promoter and having a poly A addition signal. Terminator, CaMV 35S terminator and the like.
  • selection marker gene examples include herbicide resistance genes (third intron of phytoene desaturase gene (AT4g14210), bialaphos resistance gene, glyphosate resistance gene (EPSPS), sulfonylurea resistance gene (ALS), etc.), drug resistance Gene (tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance gene, etc.), fluorescence or luminescence reporter gene (luciferase, ⁇ -galactosidase , ⁇ -glucuronidase (GUS), green fluorescence protein (GFP), etc.), neomycin phosphotransferase II (NPT II), and enzyme genes such as dihydrofolate reductase.
  • herbicide resistance genes third intron of phytoene desaturase gene (AT4g14210), bialaphos resistance gene, glyphosate resistance gene (EPSPS),
  • the method for introducing the genome-editing vector into Agrobacterium is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include freeze-thaw method and electroporation method.
  • the method of infecting the potato with the Agrobacterium is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, a method of infecting potato stems or microtubers with the Agrobacterium. mentioned.
  • the method of injecting the microparticles coated with the genome editing means into potatoes is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. There is a method of shooting into the axillary bud.
  • the fine particles are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. It is preferable to use a material that is less likely to cause harm to the body, and examples thereof include metal fine particles, ceramic fine particles, and glass fine particles.
  • the fine metal particles are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include fine metal particles and fine alloy particles. Gold particles, tungsten particles, and the like are preferable as the metal single fine particles.
  • the lower limit of the average particle diameter of the fine particles is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose. Preferably, 0.6 ⁇ m or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the average particle diameter of the fine particles is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose. , is particularly preferably 1.2 ⁇ m or less, more preferably 1.1 ⁇ m or less, and most preferably 1.0 ⁇ m or less.
  • the average particle diameter is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, and examples thereof include number average particle diameter.
  • the shape of the fine particles is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the coating method is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. / Or protein, CaCl 2 , spermidine or the like is added while stirring with a vortex mixer or the like to coat the microparticles with nucleic acid and/or protein, and the microparticles are washed with ethanol or phosphate-buffered saline (PBS or the like). methods and the like.
  • the fine particles can be applied to the macrocarrier film as uniformly as possible using a micropipette or the like, and then dried in an aseptic environment such as a clean bench.
  • a hydrophilic macrocarrier film it is preferable to use a hydrophilic macrocarrier film.
  • the hydrophilic macrocarrier film may be obtained by attaching a hydrophilic film to the macrocarrier film, or by applying a hydrophilic coating.
  • Techniques for hydrophilizing films include techniques using surfactants, photocatalysts, and hydrophilic polymers.
  • the hydrophilic polymer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include polyethylene glycol, hydroxyethyl methacrylate, hydroxypropyl methacrylate, dihydroxyethyl methacrylate, diethylene glycol methacrylate, triethylene glycol methacrylate, and polyethylene glycol.
  • Hydrophilic compounds such as methacrylate, vinylpyrrolidone, acrylic acid, acrylamide, dimethylacrylamide, glucoxyoxyethyl methacrylate, 3-sulfopropylmethacryloxyethyldimethylammonium betaine, 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine, 1-carboxydimethylmethacryloyloxyethylmethammonium Examples include polymers of monomers.
  • the coverage rate of the fine particles is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the means for shooting the fine particles is not particularly limited as long as it can shoot the fine particles into plant cells, and includes a particle gun (gene gun) in the particle gun method. From the viewpoint of introduction efficiency, a method of introducing into the plumule or axillary bud using the particle gun method is preferable.
  • the method of introduction into the plumule or axillary bud using the particle gun method is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • a plate on which the axillary shoot apex is placed is installed in a particle gun device, and a high-pressure gas is emitted from a gas acceleration tube toward the macrocarrier film.
  • the high-pressure gas is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include helium.
  • the particle gun device is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include Biolistic (registered trademark) PDS-1000/He Particle Delivery System (BIO-RAD).
  • the upper limit of the distance between the stopping plate and the target shoot apex is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. More preferably, 6 cm or less is particularly preferable.
  • the lower limit of the distance between the stopping plate and the target shoot apex is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. More preferred.
  • the gas pressure of the particle gun device is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably 1,100 to 1,600 psi, more preferably 1,200 to 1,500 psi.
  • the lower limit of the number of times the fine particles are shot into the shoot apex is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the upper limit of the number of times the fine particles are shot into the shoot apex is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose. .
  • Examples of the other steps include a step of selecting individuals into which deletion, insertion, or substitution has been introduced into the potato CSLM gene.
  • the selection step is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include a method of selection using a drug resistance gene.
  • the potato genome editing method includes the step of introducing deletion, insertion, or substitution into the potato CSLM gene using genome editing means, and may further include other steps.
  • the step of introducing a deletion, insertion, or substitution into the CSLM gene of potato using the genome-editing means includes introducing a deletion, insertion, or substitution into the CSLM gene of potato using the genome-editing means described above. The method is as follows.
  • composition for producing genetically modified potatoes encodes a protein that binds to the CSLM gene, a nucleic acid that encodes a protein that binds to the CSLM gene, a guide RNA that targets the CSLM gene, or a guide RNA that targets the CSLM gene. It contains any nucleic acid, a nucleic acid-metabolizing enzyme, or a nucleic acid encoding the nucleic acid-metabolizing enzyme, and may further contain other components.
  • nucleic acid-metabolizing enzymes any of the nucleic acids encoding the nucleic acid-metabolizing enzymes are as described above.
  • the method for determining a genetically modified potato includes a step of determining whether or not the potato is a genetically modified potato based on the presence or absence of deletion, insertion, or substitution of the CSLM gene in the potato, and may further include other steps. can.
  • the step of judging whether or not the potato is a genetically modified potato based on the presence or absence of deletion, insertion, or substitution of the CSLM gene in the potato is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, a method of analyzing the potato CSLM gene sequence and comparing it with the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 23 can be used.
  • the method for determining a genetically modified potato it is possible to efficiently determine whether or not the potato is a genetically modified potato in which the endogenous gene modification of the potato reduces the SGA content, delays sprouting, and suppresses senescence. can.
  • RNAi binary vector pKT251 for gene silencing was constructed.
  • Agrobacterium tumefaciens strain GV3101mp90 (pMP90RK-retaining strain described in Mol Gen Genet (1986) 204:383-396) with pKT251) into which this plasmid was introduced was used by Monnma, T. et al. (1990).
  • GV3101mp90 pMP90RK-retaining strain described in Mol Gen Genet (1986) 204:383-396
  • pKT251 was used by Monnma, T. et al. (1990).
  • Recent study for genetic engineering of soybean glycinin gene Plant Tissue Cult. Lett.
  • FIG. 1 is a photograph taken 13 weeks after the start of the test in the dark at 20°C.
  • RNAi binary vector pKT250 for PGA4 gene silencing was constructed in the same manner as in Comparative Example 1 using the fragment.
  • Agrobacterium tumefaciens strain introduced with this plasmid (GV3101mp90 (pMP90RK-retaining strain described in Mol Gen Genet (1986) 204:383-396) with pKT250) described in Non-Patent Document 1 “Gene-Silenced Potatoes” Transformation of S. tuberosum cv. Sassy was carried out using the method of S. tuberosum cv.
  • FIG. 2 is a photograph taken 14 weeks after the start of the test in the dark at 20°C.
  • the expression analysis of the CSLM gene was performed using NGS data registered in the NCBI database, SRX3127474: Solanum tuberosum, Atlantic, leaf, RNA-Seq using Trinity (https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki ), Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml), DEGseq (Original site), and eXpress (Original site) to determine the gene expression level (fpkm: fragments per kilobase of pre-made primers) , one of the general indices of the expression level), the fpkm value was calculated to be 236.88, suggesting that the CSLM gene is involved in glycoalkaloid biosynthesis.
  • Example 2 Acquisition of genome sequence of potato CSLM gene>
  • the genomic DNA of "Sassie” manufactured by Germicopa was synthesized.
  • PCR was performed at an annealing temperature of 55°C (30 cycles, using PrimeSTAR (registered trademark) manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the resulting PCR amplification product is cloned into pENTR/D-TOPO (registered trademark) vector (manufactured by Thermo Fisher) to obtain a gene fragment, and the first exon TGCAAAGATTCCGATCTaccaccaattgacgtAATGGTATTCACTGCCA (SEQ ID NO: 3) has no polymorphism. It was confirmed.
  • Example 3 Preparation of genome editing vector for potato CSLM gene> Based on the genomic DNA sequence identified in Example 2, the platinum TALEN vector pSuehiro117, which recognizes the upper case region of the sequence TGCAAAGATTCCGATCTaccaccaattgacgtAATGGTATTCACTGCCA (SEQ ID NO: 3), was created according to Yasumoto et al. (Plant Biotechnol 2019 36: 167-173). (Fig. 3 vector pSuehiro117).
  • Fig. 3 shows the right border (RB) and left border (LB) of the T-DNA of the gene part to be introduced, and the internal structure of those borders.
  • the boxes in FIG. 3 indicate each exon.
  • Example 4 Preparation of potato CSLM gene transformants>
  • the vector prepared in Example 3 was introduced into Agrobacterium tumefaciens GV3101mp90 strain (pMP90RK-bearing strain described in Mol Gen Genet (1986) 204:383-396) by the freeze-thaw method.
  • Agrobacterium tumefaciens GV3110mp90 strain containing the vector was added to YEB liquid medium containing 50 ppm kanamycin [5 g / L beef extract, 1 g / L yeast extract, 5 g / L peptone, 5 g / L sucrose, 2 mM magnesium sulfate (pH 7.2). )] at 28° C.
  • the stems of potato cultivar "Sassie” that were cultured in a test tube and cut into 3-5 mm pieces without nodes were used as materials for Agrobacterium infection. After soaking it in the aforementioned Agrobacterium infection solution, it was placed on sterilized filter paper to remove excess Agrobacterium. Placed on MS medium (containing 2 ppm of Zeatin, 0.05 ppm of IAA, 100 ⁇ M of acetosyringone, and 0.8% of agar) in a petri dish, cultured at 25° C. for 3 days, illuminated for 16 hours (photon flux density: 32 ⁇ E/m2s) / 8 hours under the condition of non-illumination.
  • MS medium containing 2 ppm of Zeatin, 0.05 ppm of IAA, 100 ⁇ M of acetosyringone, and 0.8% of agar
  • NP2 TAAAGCACGAGGAAGCGGT (SEQ ID NO: 20) and NP3: GCACAACAGACAATCGGCT (SEQ ID NO: 21) were used as primers for specifically amplifying the kanamycin resistance gene sequence. From the above, pSuehiro117#343 line and pSuehiro117#389 line of transformed potato plants into which pSuehiro117 was introduced were obtained.
  • Heteroduplex mobility assay was used to evaluate whether or not the genome was site-specifically edited in the strains obtained.
  • PCR 35 cycles, using TakaraTaq manufactured by Takara Bio Inc.
  • PCR 35 cycles, using TakaraTaq manufactured by Takara Bio Inc.
  • PCR 35 cycles, using TakaraTaq manufactured by Takara Bio Inc.
  • a microchip electrophoresis device "MultiNA” was performed. (Shimadzu Corporation).
  • HMA heteroduplex mobility analysis
  • multiple bands were observed in comparison with the control, and pSuehiro117#343 and pSuehiro117#389 were confirmed to be genome-edited individuals.
  • the gRNA amplified fragment DNA in the genome of the leaves of the transformants of pSuehiro117#343 and pSuehiro117#389 was subjected to TOPO (registered trademark) TA Cloning (registered trademark). (trademark) Kit for Sequencing (manufactured by Thermo Fisher) to obtain gene fragments. About 16 base sequences were determined, and genome editing was confirmed (Fig. 4 pSuehiro117#343, Fig. 5 pSuehiro117#389). "-" in Figures 4 and 5 indicates a deletion. From these results, it was confirmed that both strains do not have an intact CSLM gene.
  • Example 6 Quantification of glycoalkaloid content in genome-edited potato lines of CSLM gene> About 100 mg of leaves of the obtained individuals were frozen with liquid nitrogen and crushed with a mixer mill (1/30 sec for 2 minutes). 300 ⁇ L of methanol was added to the crushed leaves and sonicated for 10 minutes. Centrifugation (15000 rpm for 10 minutes) was performed to collect the supernatant. This extraction operation was repeated three times, the recovered supernatant was dried under reduced pressure, and the residue was redissolved in 200 ⁇ L of methanol.
  • Example 7 Production of tubers from genome-edited potato lines of potato CSLM gene and confirmation of germination> Potatoes cultured in vitro (non-transformant of Sassi (NT), transformant of pSuehiro117#343, and transformant of pSuehiro117#389) were conditioned and cultured with culture soil (PRO-MIX BX, manufactured by Premier). was cultivated in a closed greenhouse (23° C., 16 hours illumination (photon flux density 32 ⁇ E/m 2 s)/8 hours no illumination), and the tubers were harvested. After harvesting, the plants were stored at 4°C for about 3 months.
  • FIG. 7 is a photograph of 7 weeks after the start of the test in the dark at 20° C.
  • Example 8 Reconfirmation of tuber proliferation and sprouting suppression of genome-edited potato line of potato CSLM gene>
  • Potato tubers obtained in Example 7 non-transformant of Sassi (NT), transformant of pSuehiro117#343, and transformant of pSuehiro117#389) were added to culture soil (PRO-MIX BX, manufactured by Premier). was cultivated in a closed greenhouse (23° C., 16 hours illumination (photon flux density 32 ⁇ E/m 2 s)/8 hours no illumination) to grow tubers.
  • FIG. 9 shows photographs immediately after the start of the test
  • FIG. 10 shows photographs taken at 7 weeks from the start of the test
  • FIG. 11 shows photographs taken at 9 weeks after the start of the test. body: center, transformant of pSuehiro117#389: right).
  • sprout lengths of 5 mm or more were measured, and the measured values, average sprout lengths, and total sprout lengths are shown in Table 2 and FIG.
  • tubers that do not have a sprout length of 5 mm or more are indicated as "N.D.” and excluded from the average calculation.
  • Embodiments of the present invention include, for example, the following.
  • ⁇ 1> A genetically modified potato characterized by introducing a deletion, insertion, or substitution into the CSLM gene.
  • ⁇ 2> The genetically modified potato according to ⁇ 1> above, wherein the glycoalkaloid content is 50% or less of the genetically unmodified potato.
  • ⁇ 3> The genetically modified potato according to ⁇ 2>, wherein the glycoalkaloid is solanine or chaconine.
  • ⁇ 4> The genetically modified potato according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the sprout length in the dark after the dormancy period after harvesting is 50% or less of that of the unmodified potato. be.
  • ⁇ 5> A method for producing a genetically modified potato, comprising the step of introducing deletion, insertion, or substitution into the potato CSLM gene.
  • ⁇ 6> A method for editing the genome of potato, comprising the step of introducing a deletion, insertion, or substitution into the CSLM gene of potato using a genome editing means.
  • the genome editing means uses a protein that binds to the CSLM gene, a nucleic acid that encodes a protein that binds to the CSLM gene, a guide RNA that targets the CSLM gene, or a nucleic acid that encodes a guide RNA that targets the CSLM gene.
  • nucleic acid-metabolizing enzyme contains either a nuclease or a deaminase.
  • a protein that binds to the CSLM gene a nucleic acid that encodes a protein that binds to the CSLM gene, a guide RNA that targets the CSLM gene, or a nucleic acid that encodes the guide RNA that targets the CSLM gene, and nucleic acid metabolism
  • a composition for producing genetically modified potatoes comprising either an enzyme or a nucleic acid encoding the nucleic acid-metabolizing enzyme.
  • a method for judging a genetically modified potato comprising the step of judging whether the potato is a genetically modified potato, using the presence or absence of deletion, insertion, or substitution of the CSLM gene in the potato as an indicator.

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Abstract

ＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモ、及びジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモの作製方法である。

Description

グリコアルカロイドを低減した遺伝子改変ジャガイモ、及びその作製方法
　本発明は、グリコアルカロイドを低減した遺伝子改変ジャガイモ、及びその作製方法に関する。
　ジャガイモは、有毒物質であるソラニン、チャコニン等のステロイドグリコアルカロイド（ＳＧＡ）を合成する。
　ＳＧＡは、ジャガイモの塊茎、及び塊茎から出る芽に蓄積される。低濃度のＳＧＡは、えぐみなどの不快な味の原因となり、高濃度のＳＧＡは、食中毒の原因となる。そのため、ジャガイモのＳＧＡ含量を低く抑えることは、ジャガイモ育種において重要な課題である。
　また、ジャガイモは、収穫後数か月間の休眠期間では、成長や発生が一時的に停止するが、休眠後に萌芽が始まるため、長期保存することができない。そのため、ジャガイモの萌芽を制御することは、ジャガイモ加工業において重要な課題である。
　これまでに、ソラニン、チャコニン合成系遺伝子である、ＰＧＡ１、ＰＧＡ２、１６ＤＯＸをノックダウンすることにより、ジャガイモの萌芽が抑制されることが示されている（非特許文献１、及び２）。
　一方、ソラニン、チャコニン合成系遺伝子である、ＳＳＲ２、ＰＧＡ４をノックダウンしても、ジャガイモの萌芽は抑制することができず、萌芽制御のメカニズムは解明されていない。
　最近、ＲＮＡｉを用いた、ＧＡＭＥ１５遺伝子の発現抑制により、ＳＧＡ含量が低減されることが示されたが、ジャガイモの萌芽抑制については報告されていない（特許文献１）。
　したがって、ジャガイモの内生遺伝子の改変により、ＳＧＡ含量が低下し、かつ、萌芽が遅延し、老化抑制されている、遺伝子改変ジャガイモ、及びその効率的な作製方法は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められている。
米国特許出願公開第２０１９／００５９３１４号明細書
Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　２０１６　１７１：２４５８－２４６７ Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　２０１７　１７５：１２０－１３３
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ジャガイモの内生遺伝子の改変により、ＳＧＡ含量が低下し、かつ、萌芽が遅延し、老化抑制されている、遺伝子改変ジャガイモ、及びその効率的な作製方法を提供することを目的とする。
　本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモの作製方法を採用することにより、ジャガイモの内生遺伝子の改変により、ＳＧＡ含量が低下し、かつ、萌芽が遅延し、老化抑制されている、遺伝子改変ジャガイモ、及びその効率的な作製方法が提供できることを知見した。
　本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下のとおりである。即ち、
　＜１＞　ＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモである。
　＜２＞　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモの作製方法である。
　＜３＞　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を、ゲノム編集手段を用いて導入する工程を含むことを特徴とする、ジャガイモのゲノム編集方法である。
　＜４＞　ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする核酸、ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモ作製用組成物である。
　＜５＞　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子の欠失、挿入、又は置換の存否を指標に、遺伝子改変ジャガイモであるか否かを判定する工程を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモの判定方法である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ジャガイモの内生遺伝子の改変により、ＳＧＡ含量が低下し、かつ、萌芽が遅延し、老化抑制されている、遺伝子改変ジャガイモ、及びその効率的な作製方法を提供することができる。
図１は、ＳＳＲ２遺伝子のサイレンシングジャガイモ系統の塊茎を２０℃暗所に置いた後の萌芽の状態を示す塊茎の写真である。 図２は、ＰＧＡ４遺伝子のサイレンシングジャガイモ系統の塊茎を２０℃暗所に置いた後の萌芽の状態を示す塊茎の写真である。 図３は、形質転換に使用したベクターの構造を示す図である。 図４は、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集の標的配列近傍の塩基配列と（１段目）、ゲノム編集された個体からゲノム編集領域を含む増幅断片をクローニングして塩基配列を決定したものと（２段目以降）、のアライメント結果を示す図である（ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３）。 図５は、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集の標的配列近傍の塩基配列と（１段目）、ゲノム編集された個体からゲノム編集領域を含む増幅断片をクローニングして塩基配列を決定したものと（２段目以降）、のアライメント結果を示す図である（ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９）。 図６は、ゲノム編集された形質転換体についてグリコアルカロイド含量を定量分析した結果である。 図７は、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統の塊茎を２０℃暗所に置いた後７週目の萌芽の状態を示す塊茎の写真である。 図８は、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統の塊茎を２０℃暗所に置いた後７週目の萌芽の萌芽長の平均値及び萌芽長の合計値を示すグラフである。 図９は、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統の塊茎を２０℃暗所に置いた直後の萌芽の状態を示す塊茎の写真である。 図１０は、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統の塊茎を２０℃暗所に置いた後７週目の萌芽の状態を示す塊茎の写真である。 図１１は、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統の塊茎を２０℃暗所に置いた後９週目の萌芽の状態を示す塊茎の写真である。 図１２は、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統の塊茎を２０℃暗所に置いた後９週目の萌芽の萌芽長の平均値及び萌芽長の合計値を示すグラフである。
　（遺伝子改変ジャガイモ）
　前記遺伝子改変ジャガイモは、ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｌｉｋｅ　Ｍ遺伝子（以下、ＣＳＬＭ遺伝子と表記する。）に欠失、挿入、又は置換が導入されている。前記ＣＳＬＭ遺伝子は、別名ＧＡＭＥ１５遺伝子である。
　前記ＣＳＬＭ遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、配列番号１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列、配列番号１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログをコードする塩基配列などが挙げられる。
　前記ホモログとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号１又は配列番号２２の配列との配列同一性が、８０％以上の配列同一性が好ましく、８５％以上の配列同一性がより好ましく、９０％以上の配列同一性がさらに好ましく、９５％以上の配列同一性が特に好ましく、９９％以上の配列同一性が最も好ましい。
　前記配列番号１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、配列番号２又は配列番号２３の配列を有する遺伝子、配列番号２又は配列番号２３の配列を有する遺伝子のホモログなどが挙げられる。
　前記ホモログとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、配列番号２又は配列番号２３の配列との配列同一性が、８０％以上の配列同一性が好ましく、８５％以上の配列同一性がより好ましく、９０％以上の配列同一性がさらに好ましく、９５％以上の配列同一性が特に好ましく、９９％以上の配列同一性が最も好ましい。
　前記欠失、挿入、又は置換としては、人為的に前記欠失、挿入、又は置換が導入されている限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記欠失、挿入、又は置換のいずれかであっても、これらの組合せであってもよい。
　前記欠失としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、フレームシフト変異となる欠失、インフレーム変異となる欠失などが挙げられる。これらの中でも、フレームシフト変異となる欠失が好ましい。
　前記フレームシフト変異となる欠失は、３の倍数以外の塩基数の塩基の欠失を導入することにより得られる。
　前記インフレーム変異となる欠失は、３の倍数の塩基数の塩基の欠失を導入することにより得られる。
　前記インフレーム変異となる欠失としては、欠失部位が活性部位、アロステリック部位、若しくはタンパク質間の相互作用部位等、をコードする部位など、又はその近傍であることが好ましい。
　前記挿入としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、フレームシフト変異となる挿入、インフレーム変異となる挿入などが挙げられる。これらの中でも、フレームシフト変異となる挿入が好ましい。
　前記フレームシフト変異となる挿入は、３の倍数以外の塩基数の塩基の挿入を導入することにより得られる。
　前記インフレーム変異となる挿入は、３の倍数の塩基数の塩基の挿入を導入することにより得られる。
　前記インフレーム変異となる挿入としては、挿入部位が活性部位、アロステリック部位、若しくはタンパク質間の相互作用部位等、をコードする部位など、又はその近傍であることが好ましい。
　前記置換としては、非同義置換である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記置換部位としては、活性部位、アロステリック部位、若しくはタンパク質間の相互作用部位等、をコードする部位など、又はその近傍であることが好ましい。
　前記遺伝子改変ジャガイモは、グリコアルカロイド含量が、遺伝子未改変ジャガイモと比較して低下していることが好ましい。
　前記グリコアルカロイド含量の低下としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、遺伝子未改変ジャガイモに対して、５０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、２０％以下がさらに好ましく、１０％以下が特に好ましく、検出限界以下が最も好ましい。
　前記グリコアルカロイドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ソラニン、又はチャコニンが好ましい。
　これらの中でも、ソラニン、及びチャコニン含量が、遺伝子未改変ジャガイモと比較して低下していることが好ましい。
　前記ソラニン含量の低下としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、遺伝子未改変ジャガイモに対して、５０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、２０％以下がさらに好ましく、１０％以下が特に好ましく、検出限界以下が最も好ましい。
　前記チャコニン含量の低下としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、遺伝子未改変ジャガイモに対して、５０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、２０％以下がさらに好ましく、１０％以下が特に好ましく、検出限界以下が最も好ましい。
　前記グリコアルカロイド含量は、以下の方法により測定する。
　ジャガイモの葉約１００ｍｇを液体窒素で凍結させ、ミキサーミルで破砕する（１／３０ｓｅｃ　２分間）。破砕した葉に、３００μＬのメタノールを加え、１０分間ソニーケーションする。遠心分離（１５０００ｒｐｍ　１０分間）を行い、上清を回収する。この抽出操作を３回繰り返し、回収した上清を減圧乾固し、残渣を２００μＬメタノールに再溶解する。再溶解液２０μＬに１８０μＬのメタノールを加え、ＬＣ－ＭＳ（ウォーターズ社製、製品名：ＵＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ　ＡＣＱＵＩＴＹ）を用い、グリコアルカロイドを分析する。カラムはＡＣＱＵＩＴＹ　ＨＳＳ　Ｔ３　１．８μｍ　φ２．１×１００ｍｍ（ウォーターズ社製）を用いる。ＬＣ分析においては、移動相Ａ：０．１％ギ酸水、移動相Ｂ：アセトニトリルでグラジエント溶出を行う。グラジエント溶出は、０－３０分，９０％　Ａ／１０％　Ｂから４５％　Ａ／５５％　Ｂ、３０－３１分，４５％　Ａ／５５％　Ｂから１００％　Ｂ、３１－３５分，１００％　Ｂで保持することによって行う。標品と比較してグリコアルカロイドの定量を行う。
　前記遺伝子改変ジャガイモは、収穫後の休眠期間終了後の暗所における萌芽長が、遺伝子未改変ジャガイモと比較して低下していることが好ましい。
　前記萌芽長は、以下の方法により測定する。
　試験管内で培養したジャガイモを馴化し、培養土（ＰＲＯ－ＭＩＸ　ＢＸ、プレミア社製）にて、閉鎖温室（２３℃、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明）で栽培し、塊茎を収穫する。収穫後、４℃で約３か月貯蔵し、その後、２０℃暗所にて７週間又は９週間貯蔵し、塊茎における、５ｍｍ以上の各萌芽の萌芽長を計測し、前記塊茎における各萌芽の萌芽長の平均値、又は前記塊茎における各萌芽の萌芽長の合計値を求める。
　前記萌芽長の測定は、少なくとも３個の塊茎を使用して行い、その平均値を求める。
　前記萌芽長（塊茎における各萌芽の萌芽長の平均値）の低下としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、遺伝子未改変ジャガイモに対して、８０％以下が好ましく、７０％以下がより好ましく、５０％以下がさらに好ましく、３０％以下が特に好ましく、２０％以下が最も好ましい。
　前記萌芽長（塊茎における各萌芽の萌芽長の合計値）の低下としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、遺伝子未改変ジャガイモに対して、８０％以下が好ましく、７０％以下がより好ましく、５０％以下がさらに好ましく、３０％以下が特に好ましく、２０％以下が最も好ましい。
　前記萌芽長の低下としては、前記塊茎における各萌芽の萌芽長の平均値、又は前記塊茎における各萌芽の萌芽長の合計値、が低下していることが好ましく、前記塊茎における各萌芽の萌芽長の平均値、及び前記塊茎における各萌芽の萌芽長の合計値、が低下していることがより好ましい。
　（遺伝子改変ジャガイモの作製方法）
　前記遺伝子改変ジャガイモの作製方法は、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノム編集を用いる方法などが挙げられる。
　前記ゲノム編集を用いる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノム編集手段を用いて、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する方法などが挙げられる。
　前記導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ゲノム編集手段をアグロバクテリウムに導入し、ジャガイモに前記アグロバクテリウムを感染させる方法、前記ゲノム編集手段により被覆された微粒子をジャガイモに撃ち込む方法などが挙げられる。
　前記ゲノム編集手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質、前記ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする核酸、ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、の組合せなどが挙げられ、その他の核酸、その他のタンパク質を含んでいてもよい。
　前記ゲノム編集手段は、ゲノム編集ベクターであってもよい。
　前記ゲノム編集ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バイナリーベクターを基本とするベクターなどが挙げられる。
　前記ゲノム編集ベクターに含まれる配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする配列、又はＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素をコードする核酸と、の組合せなどが挙げられ、その他の配列を含んでいてもよい。
　前記ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質が認識する、ＣＳＬＭ遺伝子の部分配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴａｃｃａｃｃａａｔｔｇａｃｇｔＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡ（配列番号３）、又はＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴａｃｃａｃｃａａｔｔｇａｃｇｔＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡ（配列番号３）の配列の大文字領域である、ＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号４）及びＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡ（配列番号５）などが挙げられる。
　前記ガイドＲＮＡの長さの下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５ヌクレオチド以上が好ましく、１６ヌクレオチド以上がより好ましく、１７ヌクレオチド以上がさらに好ましく、１８ヌクレオチド以上が特に好ましく、１９ヌクレオチド以上がさらに特に好ましく、２０ヌクレオチド以上が最も好ましい。
　前記ガイドＲＮＡの長さの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０ヌクレオチド以下が好ましく、２５ヌクレオチド以下がより好ましく、２２ヌクレオチド以下がさらに好ましく、２０ヌクレオチド以下が特に好ましい。
　前記ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含んでいてもよい。
　前記ＣＳＬＭ遺伝子は、切断した部位の間に、組換えによる外来ＤＮＡ挿入又は置換することによる変異を導入してもよい。
　前記核酸代謝酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼなどが挙げられる。前記核酸代謝酵素は、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含んでいてもよい。
　前記ヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムのＣＡＳヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を発現するタンパク質、ＴＡＬ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＲＧＥＴ　ＡＩＤ、メガヌクレアーゼなどが挙げられる。また、前記ヌクレアーゼは、由来する生物種が異なるものであってもよく、例えば、動物、植物、微生物、ウイルスなどの遺伝子や、人工合成遺伝子を用いることができる。
　前記ＣＡＳヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素などが挙げられるが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ９が好ましい。
　前記Ｃａｓヌクレアーゼは、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されていてもよい。前記Ｃａｓヌクレアーゼは、標的配列の局在における１つ、又は２つの鎖の開裂を指向し得る。
　前記Ｃａｓ９としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＣａｓ９、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９などが挙げられるが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９が好ましい。また、これらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９であってもよく、ニッカーゼ（一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素）として機能することが知られているＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体であってもよく、Ｃａｓ９ホモログ、又はオルソログであってもよい。
　前記ＴＡＬＥＮにおける、ヌクレアーゼドメインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、ＡｌｗＩ、ＦｏｋＩなどの、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインが挙げられる。
　これらの中でも、ＦｏｋＩが好ましい。
　前記ＴＡＬＥＮにおける、ＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメインとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原菌由来のものなどが挙げられる。
　前記デアミナーゼとしては、脱アミノ化酵素活性を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに付加して使用することができる。
　前記その他の配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、イントロン、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子などが挙げられる。
　前記プロモーターとしては、ジャガイモにおいて機能し、構成的に発現するか、ジャガイモの特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｅｌ２－３５Ｓオメガプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＲｕＢｉｓｃｏプロモーターなどが挙げられる。
　翻訳活性を高める配列、例えば、タバコモザイクウイルスのオメガ配列を用いて翻訳効率を上げることができる。また、翻訳開始領域としてＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）をプロモーターの３’－下流側で、翻訳開始コドンの５’－上流側に挿入することで複数のコーディング領域からタンパク質を翻訳させることもできる。
　前記ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結でき、ポリＡ付加シグナルを有する配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ　３５Ｓターミネーターなどが挙げられる。
　前記選抜マーカー遺伝子としては、例えば、除草剤耐性遺伝子（フィトエンデサチュラーゼ遺伝子（ＡＴ４ｇ１４２１０）の第３イントロン、ビアラホス耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子（ＥＰＳＰＳ）、スルホニル尿素系耐性遺伝子（ＡＬＳ）など）、薬剤耐性遺伝子（テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光、又は発光レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ　ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの酵素遺伝子が挙げられる。
　前記ゲノム編集ベクターをアグロバクテリウムに導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結融解法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
　前記ジャガイモに前記アグロバクテリウムを感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジャガイモの茎、又はマイクロチューバーに前記アグロバクテリウムを感染させる方法などが挙げられる。
　前記ゲノム編集手段により被覆された微粒子をジャガイモに撃ち込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ゲノム編集手段により被覆された微粒子をジャガイモの幼芽又は腋芽に撃ち込む方法などが挙げられる。
　前記微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、撃ち込み時における細胞内への貫通力を高める点から、高比重で、かつ、化学的に不活性であり生体に害を及ぼしにくいものが好ましく、例えば、金属微粒子、セラミック微粒子、ガラス微粒子などが挙げられる。
　前記金属微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、金属単体微粒子、合金微粒子などが挙げられる。
　前記金属単体微粒子としては、金粒子、タングステン粒子などが好ましい。
　前記微粒子の平均粒径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．３μｍ以上が好ましく、０．４μｍ以上がより好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましく、０．６μｍ以上が特に好ましい。
　前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１．５μｍ以下が好ましく、１．４μｍ以下がより好ましく、１．３μｍ以下さらに好ましく、１．２μｍ以下が特に好ましく、１．１μｍがさらに特に好ましく、１．０μｍ以下が最も好ましい。
　前記平均粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、個数平均粒径などが挙げられる。
　前記微粒子の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、球形、立方体、ロッド状、板状などが挙げられるが、これらの中でも球形が好ましい。
　前記被覆の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微粒子を、洗浄滅菌し、該微粒子、核酸（組換えベクター、直鎖状ＤＮＡ、ＲＮＡなど）及び／又はタンパク質、ＣａＣｌ２、スペルミジン等をボルテックスミキサーなどで攪拌しながら加えて、核酸及び／又はタンパク質を微粒子にコーティング（被覆）し、エタノール、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳなど）で洗浄する方法などが挙げられる。
　前記微粒子は、マイクロピペットなどを用いてマクロキャリアフィルムに可能な限り均一に塗布した後、クリーンベンチなどの無菌環境中で乾燥させることができる。タンパク質をコートした微粒子の場合は、親水性のマクロキャリアフィルムを用いるのが好ましい。
　前記親水性のマクロキャリアフィルムは、マクロキャリアフィルムに親水性フィルムを貼付しても良いし、親水性コーティングを施しても良い。
　フィルムを親水化する手法としては、界面活性剤や光触媒、親水性ポリマーを利用する手法などが挙げられる。
　前記親水性ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ビニルピロリドン、アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、グルコキシオキシエチルメタクリレート、３－スルホプロピルメタクリルオキシエチルジメチルアンモニウムベタイン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、１－カルボキシジメチルメタクリロイルオキシエチルメタンアンモニウム等の親水性モノマーの重合体などが挙げられる。
　前記微粒子の被覆率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記微粒子の全表面であってもよいし、一部であってもよい。
　前記微粒子を撃ち込む手段としては、微粒子を植物細胞に撃ち込むことができるものであれば特に制限はなく、パーティクルガン法におけるパーティクルガン（遺伝子銃）などが挙げられる。導入効率の点から、パーティクルガン法を用いて幼芽又は腋芽に導入する方法が好ましい。
　前記パーティクルガン法を用いて幼芽又は腋芽に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、微粒子が塗布されたマクロキャリアフィルム、ターゲットの幼芽又は腋芽の茎頂を置床したプレートをパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ガスをマクロキャリアフィルムに向かって発射する方法などが挙げられる。マクロキャリアフィルムはストッピングプレートで止まるが、マクロキャリアフィルムに塗布されていた微粒子はストッピングプレートを通過して、ストッピングプレートの下に設置したターゲットに貫入し、目的遺伝子が導入される。
　前記高圧ガスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヘリウムなどが挙げられる。
　前記パーティクルガン装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）　ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）などが挙げられる。
　前記ストッピングプレートとターゲットとなる茎頂との距離の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９ｃｍ以下が好ましく、８ｃｍ以下がより好ましく、７ｃｍ以下がさらに好ましく、６ｃｍ以下が特に好ましい。
　前記ストッピングプレートとターゲットとなる茎頂との距離の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２ｃｍ以上が好ましく、３ｃｍ以上がより好ましく、４ｃｍ以上がさらに好ましい。
　前記パーティクルガン装置のガス圧としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１，１００～１，６００ｐｓｉが好ましく、１，２００～１，５００ｐｓｉがより好ましい。
　前記茎頂に微粒子を撃ち込む回数の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２回以上が好ましく、３回以上がより好ましく、４回以上がさらに好ましい。
　前記茎頂に微粒子を撃ち込む回数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０回以下が好ましく、１５回以下がより好ましく、１０回以下がさらに好ましい。
　前記その他の工程としては、例えば、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入された個体を選抜する工程などが挙げられる。
　前記選抜する工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬剤耐性遺伝子により選別する方法などが挙げられる。
　（ジャガイモのゲノム編集方法）
　前記ジャガイモのゲノム編集方法は、ゲノム編集手段を用いて、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記ゲノム編集手段を用いて、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程は、前述のゲノム編集手段を用いて、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する方法のとおりである。
　（遺伝子改変ジャガイモ作製用組成物）
　前記遺伝子改変ジャガイモ作製用組成物は、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする核酸、ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含み、さらにその他の成分を含むことができる。
　前記ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする核酸、ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかとは、前述のとおりである。
　（遺伝子改変ジャガイモの判定方法）
　前記遺伝子改変ジャガイモの判定方法は、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子の欠失、挿入、又は置換の存否を指標に、遺伝子改変ジャガイモであるか否かを判定する工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
　前記ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子の欠失、挿入、又は置換の存否を指標に、遺伝子改変ジャガイモであるか否かを判定する工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子配列を解析し、配列番号２又は配列番号２３のＤＮＡ配列と比較する方法などが挙げられる。
　前記遺伝子改変ジャガイモの判定方法により、ジャガイモの内生遺伝子の改変により、ＳＧＡ含量が低下し、かつ、萌芽が遅延し、老化抑制されている、遺伝子改変ジャガイモであるか否かが効率的に判定できる。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
＜比較例１：ＳＳＲ２サイレンシングジャガイモ系統からの塊茎の作製と萌芽の確認＞
　ＳＳＲ２のｃＤＮＡ配列（配列番号６）から、下記プライマー　ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧ：プライマー１（配列番号７）とＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＧＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡ：プライマー２（配列番号８）を用いたＰＣＲ反応により、２６９ｂｐの部分断片を増幅した。
　当該２断片（標的配列センス鎖及び標的配列アンチセンス鎖）及びシロイヌナズナＡｔ４ｇ１４２１０遺伝子の第３イントロン配列（ループ配列）を、Ｔ－ＤＮＡ領域にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＣａＭＶ３５Ｓターミネーターの間に挿入することで、ＳＳＲ２遺伝子サイレンシング用のＲＮＡｉバイナリーベクターｐＫＴ２５１を構築した。本プラスミドが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス株（ＧＶ３１０１ｍｐ９０（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８６）　２０４：３８３－３９６に記載のｐＭＰ９０ＲＫ保持株）　ｗｉｔｈ　ｐＫＴ２５１）により、Ｍｏｎｎｍａ，　Ｔ．　（１９９０）．　Ｒｅｃｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｌｙｃｉｎｉｎ　ｇｅｎｅ．　Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔ．　Ｌｅｔｔ．　７：５７－６３に記載の方法を用いて、サッシー（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　ｃｖ．Ｓａｓｓｙ）の形質転換を行った。
　下記プライマー　ＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴ：プライマー３（配列番号９）とＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴ：プライマー４（配列番号１０）を用いたゲノミックＰＣＲ反応により、カナマイシン耐性遺伝子がゲノムに挿入された培養苗を選抜し、さらに下記プライマー　ＣＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＡ：プライマー５（配列番号１１）とＴＣＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＴＣＡＧ：プライマー６（配列番号１２）を用いたＲＴ－ＰＣＲ解析により、ＳＳＲ２遺伝子発現量が極めて少ないか、当該遺伝子発現が認められない、ＳＳＲ２－ＲＮＡｉジャガイモ系統（＃２、＃１０、＃１１、＃１２）を取得した。
　前記ＳＳＲ２－ＲＮＡｉジャガイモ系統（＃２、＃１０、＃１１、＃１２、及びサッシーの非形質転換体（ＮＴ））について、試験管内で培養したジャガイモを馴化し、培養土（ＰＲＯ－ＭＩＸ　ＢＸ、プレミア社製）にて、閉鎖温室（２３℃、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明）で栽培し、塊茎を収穫した。
　収穫後、４℃で約３か月貯蔵し、休眠期間が終了した後に、２０℃暗所にて萌芽を観察した。図１は、２０℃暗所での試験開始から１３週目の写真である。
＜比較例２：ＰＧＡ４サイレンシングジャガイモ系統からの塊茎の作製と萌芽の確認＞
　ＰＧＡ４のｃＤＮＡ配列（配列番号１３）から、下記プライマー　ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴ：プライマー７（配列番号１４）とＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡ：プライマー８（配列番号１５）を用いたＰＣＲ反応により、３９４ｂｐの部分断片を増幅した。
　当該断片を用いて、比較例１と同様の手法により、ＰＧＡ４伝子サイレンシング用のＲＮＡｉバイナリーベクターｐＫＴ２５０を構築した。本プラスミドが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス株（ＧＶ３１０１ｍｐ９０（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８６）　２０４：３８３－３９６に記載のｐＭＰ９０ＲＫ保持株）　ｗｉｔｈ　ｐＫＴ２５０）により、非特許文献１「Ｇｅｎｅ－Ｓｉｌｅｎｃｅｄ　Ｐｏｔａｔｏｅｓ」に記載の方法を用いて、サッシー（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　ｃｖ.Ｓａｓｓｙ）の形質転換を行った。
　前記プライマー３（配列番号９）と４（配列番号１０）を用いたゲノミックＰＣＲ反応により、カナマイシン耐性遺伝子がゲノムに挿入された培養苗を選抜し、さらにプライマー９（配列番号１６）：ＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＧＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧとプライマー１０（配列番号１７）：ＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＣＡを用いたＲＴ－ＰＣＲ解析により、ＰＧＡ４遺伝子発現量が極めて少ないか、当該遺伝子発現が認められない、ＰＧＡ４－ＲＮＡｉジャガイモ系統（＃９、＃１１、＃１６、＃２２）を取得した。
　前記ＰＧＡ４－ＲＮＡｉジャガイモ系統（＃９、＃１１、＃１６、＃２２、及びサッシーの非形質転換体（ＮＴ））について、試験管内で培養したジャガイモを馴化し、培養土（ＰＲＯ－ＭＩＸ　ＢＸ、プレミア社製）にて、閉鎖温室（２３℃、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明）で栽培し、塊茎を収穫した。
　収穫後、４℃で約３か月貯蔵し、休眠期間が終了した後に、２０℃暗所にて萌芽を観察した。図２は、２０℃暗所での試験開始から１４週目の写真である。
＜実施例１：ジャガイモＣＳＬＭ遺伝子の取得＞
　ジャガイモ（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のゲノムデータベース（Ｓｐｕｄ　ＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｓｏｌａｎａｃｅａｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）において、１２番染色体のグリコアルカロイド生合成遺伝子の隣にグリコアルカロイド生合成遺伝子と共発現している、ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｌｉｋｅ　Ｍ遺伝子（ＣＳＬＭ遺伝子）　Ｓｏｔｕｂ０７ｇ０１６５３０．１．１が存在することが知られていた（ＩｔｋｉｎらＳｃｉｅｎｃｅ　２０１３　３４１：１７５－９）。
　なお、現在では、前記ジャガイモ（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）のゲノムデータベース（Ｓｐｕｄ　ＤＢ：ｈｔｔｐ：／／ｓｏｌａｎａｃｅａｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）において、前記「Ｓｏｔｕｂ０７ｇ０１６５３０．１．１」（配列番号２）に代えて、「Ｓｏｌｔｕ．ＤＭ．０７Ｇ０１４１５０．１」（配列番号２３）が登録されている。「Ｓｏｔｕｂ０７ｇ０１６５３０．１．１」に比べ「Ｓｏｌｔｕ．ＤＭ．０７Ｇ０１４１５０．１」は、開始コドンの位置が１２塩基前方にあり、「Ｓｏｌｔｕ．ＤＭ．０７Ｇ０１４１５０．１」のストップコドンの位置が後方へと変更されている。「Ｓｏｔｕｂ０７ｇ０１６５３０．１．１」の配列と、「Ｓｏｔｕｂ０７ｇ０１６５３０．１．１」に対応する「Ｓｏｌｔｕ．ＤＭ．０７Ｇ０１４１５０．１」の配列との配列相同性は９９％であり、どちらも同じものとして扱うことができる。
　前記ＣＳＬＭ遺伝子の発現解析を、ＮＣＢＩのデータベースに登録されているＮＧＳデータである、ＳＲＸ３１２７４７４：Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ，Ａｔｌａｎｔｉｃ，ｌｅａｆ，ＲＮＡ－Ｓｅｑを、Ｔｒｉｎｉｔｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｒｉｎｉｔｙｒｎａｓｅｑ／ｔｒｉｎｉｔｙｒｎａｓｅｑ／ｗｉｋｉ）、Ｂｏｗｔｉｅ（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｗｔｉｅ－ｂｉｏ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）、ＤＥＧｓｅｑ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｉｔｅ）、ｅＸｐｒｅｓｓ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｓｉｔｅ）を用いて遺伝子発現量（ｆｐｋｍ：ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｒｅａｄｓ　ｍａｐｐｅｄ、発現量の一般的指標の１つ）を解析したところ、ｆｐｋｍ値は２３６．８８と算出でき、前記ＣＳＬＭ遺伝子が、グリコアルカロイド生合成に関与することが示唆された。
＜実施例２：ジャガイモＣＳＬＭ遺伝子のゲノム配列の取得＞
　実験に供するジャガイモ品種である、「サッシー」における、ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム配列を同定するため、上記Ｓｏｔｕｂ０７ｇ０１６５３０．１．１の配列を元に、「サッシー」（ジェルミコパ社製）のゲノムＤＮＡに対し、合成したプライマー　ＧＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＧＴ：Ｕ１１５３（配列番号１８）とＡＴＧＡＣＡＡＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡ：Ｕ１１５４（配列番号１９）を用いて、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（３０サイクル、タカラバイオ社製　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）を使用）を行った。
　得られたＰＣＲ増幅産物をｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（サーモフィッシャー社製）へクローニングして、遺伝子断片を取得し、第１エクソンのＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴａｃｃａｃｃａａｔｔｇａｃｇｔＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡ（配列番号３）には多型がないことを確認した。
＜実施例３：ジャガイモＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ベクターの作製＞
　実施例２にて同定したゲノムＤＮＡ配列を元に、ＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＧＡＴＣＴａｃｃａｃｃａａｔｔｇａｃｇｔＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡ（配列番号３）の配列の大文字領域を認識する、プラチナＴＡＬＥＮベクターｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７を、安本ら（Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２０１９　３６：１６７－１７３）に従い作成した（図３　ベクターｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７）。
　図３において、導入する遺伝子部分のＴ－ＤＮＡのライトボーダー（ＲＢ）、レフトボーダー（ＬＢ）、及び、それらボーダーの内部の構造を示す。図３のｂｏｘは、各エクソンを示す。
＜実施例４：ジャガイモＣＳＬＭ遺伝子の形質転換体の作製＞
　実施例３で作製したベクターを凍結融解法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１ｍｐ９０株（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８６）　２０４：３８３－３９６に記載のｐＭＰ９０ＲＫ保持株）に導入した。ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１１０ｍｐ９０株を、５０ｐｐｍのカナマイシン含有ＹＥＢ液体培地［５ｇ／Ｌビ－フエキス、１ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ蔗糖、２ｍＭ硫酸マグネシウム（ｐＨ７．２）］にて２８℃、１２時間振とう培養した。培養液１．５ｍＬを１０，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離して集菌後、１．５ｍＬの、３％蔗糖含有ＭＳ培地（Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ．　１９６２　１５：４７３－４９７）に再懸濁し、感染用菌液とした。
　試験管内で培養した、ジャガイモ品種「サッシー」の、節を含まない３－５ｍｍに切断した茎をアグロバクテリウム感染用の材料とした。これを上記のアグロバクテリウムの感染用菌液に浸した後、滅菌済みの濾紙上に置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内のＭＳ培地（Ｚｅａｔｉｎ　２ｐｐｍ、ＩＡＡ　０．０５ｐｐｍ、アセトシリンゴン１００μＭ、及び寒天０．８％を含む）上に置き、培養は３日間２５℃、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。
　ついで、アセトシリンゴンの代わりにカルベニシリン２５０ｐｐｍを含む培地上で１週間培養した。その後、さらにカナマイシン５０ｐｐｍを含む培地上に移し、２週間ごとに継代した。この間に不定芽が形成され、シュートを生じた。
　伸張したシュートをカルベニシン２５０ｐｐｍ及びカナマイシン１００ｐｐｍを含み、植物生長調節物質を含まないＭＳ培地に置床した。
　カナマイシン耐性の生長した植物体の中から、外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、ＰＣＲ（条件：９５℃５分間、（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間）を３０回、７２℃１０分間）を行うことで検出し、該再分化植物体が形質転換植物体であることを確認した。
　ここで、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーとして、ＮＰ２：ＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴ（配列番号２０）とＮＰ３：ＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴ（配列番号２１）を用いた。
　以上から、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７が導入された、ジャガイモの形質転換植物体各ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３系統、及びｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９系統を取得した。
＜実施例５：ジャガイモＣＳＬＭ遺伝子がゲノム編集されたジャガイモ系統の確認＞
　得られた系統において、部位特異的にゲノムが編集されているか否かの評価には、ヘテロ二本鎖移動度分析（ＨＭＡ：Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　Ｍｏｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ）を用いた。
　ＣＳＬＭ遺伝子の標的配列を挟んだ上記プライマー（配列番号１８及び１９）を用い、アニール温度５５℃にてＰＣＲ（３５サイクル、タカラバイオ社製　ＴａｋａｒａＴａｑを使用）を行い、マイクロチップ電気泳動装置「ＭｕｌｔｉＮＡ」（島津製作所）で解析を行った。
　ヘテロ二本鎖移動度分析（ＨＭＡ）においては、対照と比較して複数のバンドが認められた結果より、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９はゲノム編集個体であることが確認できた。
　そこで、ゲノム編集によって得られた欠失の塩基配列を確認するため、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９の形質転換体の葉の、ゲノムにおけるｇＲＮＡの増幅断片ＤＮＡをＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（サーモフィッシャー社製）へクローニングし、遺伝子断片を取得した。
　約１６の塩基配列を決定し、ゲノム編集が起きていることを確認した（図４　ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３、図５　ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９）。
　図４及び図５の「－」は欠失を示す。
　これらの結果から、両系統は無傷のＣＳＬＭ遺伝子を持たない系統であることが確認できた。
＜実施例６：ＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統のグリコアルカロイド含量の定量＞
　得られた個体の葉約１００ｍｇを液体窒素で凍結させ、ミキサーミルで破砕した（１／３０ｓｅｃ　２分間）。
　破砕した葉に、３００μＬのメタノールを加え、１０分間ソニーケーションした。遠心分離（１５０００ｒｐｍ　１０分間）を行い、上清を回収した。この抽出操作を３回繰り返し、回収した上清を減圧乾固し、残渣を２００μＬメタノールに再溶解した。
　再溶解液２０μＬに１８０μＬのメタノールを加え、ＬＣ－ＭＳ（ウォーターズ社製、製品名：ＵＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ　ＡＣＱＵＩＴＹ）を用い、グリコアルカロイドを分析した。カラムはＡＣＱＵＩＴＹ　ＨＳＳ　Ｔ３　１．８μｍ　φ２．１×１００ｍｍ（ウォーターズ社製）を用いた。
　ＬＣ分析においては、移動相Ａ：０．１％ギ酸水、移動相Ｂ：アセトニトリルでグラジエント溶出を行った。グラジエント溶出は、０－３０分，９０％　Ａ／１０％　Ｂから４５％　Ａ／５５％　Ｂ、３０－３１分，４５％　Ａ／５５％　Ｂから１００％　Ｂ、３１－３５分，１００％　Ｂで保持することによって行なった。
　標品と比較してソラニンとチャコニンの定量を行った。その結果、図６に示すとおり、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９の形質転換体はグリコアルカロイド生成が認められなかった。
＜実施例７：ジャガイモＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統からの塊茎の作製と萌芽の確認＞
　試験管内で培養したジャガイモ（サッシーの非形質転換体（ＮＴ）、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３の形質転換体、及びｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９の形質転換体）を馴化し、培養土（ＰＲＯ－ＭＩＸ　ＢＸ、プレミア社製）にて、閉鎖温室（２３℃、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明）で栽培し、塊茎を収穫した。
　収穫後、４℃で約３か月貯蔵し、休眠期間が終了した後に、各区３塊茎を２０℃暗所にて萌芽を観察した。図７は、２０℃暗所での試験開始から７週目の写真である（サッシーの非形質転換体（ＮＴ）：左、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３の形質転換体：中央、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９の形質転換体：右）。
　萌芽長を計測し、計測値並びに萌芽長の平均値及び萌芽長の合計値を表１及び図８に示した。塊茎のやわらかさ（老化）を観察し、表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図６から８、及び表１の結果より、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に、欠失、挿入、又は置換を導入することで、ＳＧＡ含量が低下し、かつ、萌芽が遅延した遺伝子改変ジャガイモが得られることが明らかになった。
　さらに、前記ＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されている遺伝子改変ジャガイモでは、塊茎の硬度が増加しており、老化抑制されていることが示唆された。
＜実施例８：ジャガイモＣＳＬＭ遺伝子のゲノム編集ジャガイモ系統の塊茎増殖と萌芽抑制の再確認＞
　実施例７で取得したジャガイモ塊茎（サッシーの非形質転換体（ＮＴ）、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３の形質転換体、及びｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９の形質転換体）を、培養土（ＰＲＯ－ＭＩＸ　ＢＸ、プレミア社製）にて、閉鎖温室（２３℃、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明）で栽培し、塊茎を増殖させた。
　収穫後、５℃で約３か月貯蔵し、休眠期間が終了した後に、各区１５塊茎を２０℃暗所に移し萌芽試験を開始した。図９は、試験開始直後、図１０は試験開始から７週目、図１１は試験開始から９週目の写真である（サッシーの非形質転換体（ＮＴ）：左、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３４３の形質転換体：中央、ｐＳｕｅｈｉｒｏ１１７＃３８９の形質転換体：右）。試験開始から９週目において、５ｍｍ以上の萌芽長を計測し、計測値並びに萌芽長の平均値及び萌芽長の合計値を表２及び図１２に示した。
　表２において、５ｍｍ以上の萌芽長を有さない塊茎については、「Ｎ．Ｄ．」と表記し、平均の計算から除外した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図９から１２、及び表２の結果より、ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に、欠失、挿入、又は置換を導入することで、萌芽が遅延した遺伝子改変ジャガイモが得られることが明らかになった。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　ＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモである。
　＜２＞　グリコアルカロイド含量が、遺伝子未改変ジャガイモに対して、５０％以下である、前記＜１＞に記載の遺伝子改変ジャガイモである。
　＜３＞　前記グリコアルカロイドが、ソラニン、又はチャコニンである、前記＜２＞に記載の遺伝子改変ジャガイモである。
　＜４＞　収穫後の休眠期間終了後の暗所における萌芽長が、遺伝子未改変ジャガイモに対して、５０％以下である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の遺伝子改変ジャガイモである。
　＜５＞　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモの作製方法である。
　＜６＞　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を、ゲノム編集手段を用いて導入する工程を含むことを特徴とする、ジャガイモのゲノム編集方法である。
　＜７＞　前記ゲノム編集手段が、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする核酸、ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含む、前記＜６＞に記載のジャガイモのゲノム編集方法である。
　＜８＞　前記核酸代謝酵素が、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼのいずれかを含む、前記＜７＞に記載のジャガイモのゲノム編集方法である。
　＜９＞　ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする核酸、ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモ作製用組成物である。
　＜１０＞　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子の欠失、挿入、又は置換の存否を指標に、遺伝子改変ジャガイモであるか否かを判定する工程を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモの判定方法である。

Claims (10)

  1. 　ＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換が導入されていることを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモ。
  2. 　グリコアルカロイド含量が、遺伝子未改変ジャガイモに対して、５０％以下である、請求項１に記載の遺伝子改変ジャガイモ。
  3. 　前記グリコアルカロイドが、ソラニン、又はチャコニンである、請求項２に記載の遺伝子改変ジャガイモ。
  4. 　収穫後の休眠期間終了後の暗所における萌芽長が、遺伝子未改変ジャガイモに対して、５０％以下である、請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子改変ジャガイモ。
  5. 　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を導入する工程を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモの作製方法。
  6. 　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子に欠失、挿入、又は置換を、ゲノム編集手段を用いて導入する工程を含むことを特徴とする、ジャガイモのゲノム編集方法。
  7. 　前記ゲノム編集手段が、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする核酸、ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含む、請求項６に記載のジャガイモのゲノム編集方法。
  8. 　前記核酸代謝酵素が、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼのいずれかを含む、請求項７に記載のジャガイモのゲノム編集方法。
  9. 　ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質、ＣＳＬＭ遺伝子と結合するタンパク質をコードする核酸、ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ、又は前記ＣＳＬＭ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡをコードする核酸のいずれかと、核酸代謝酵素、又は前記核酸代謝酵素をコードする核酸のいずれかと、を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモ作製用組成物。
  10. 　ジャガイモのＣＳＬＭ遺伝子の欠失、挿入、又は置換の存否を指標に、遺伝子改変ジャガイモであるか否かを判定する工程を含むことを特徴とする、遺伝子改変ジャガイモの判定方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20190059314A1 (en) * 2013-06-05 2019-02-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Plant with altered content of steroidal alkaloids

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAKAYASU MASARU, UMEMOTO NAOYUKI, OHYAMA KIYOSHI, FUJIMOTO YOSHINORI, LEE HYOUNG JAE, WATANABE BUNTA, MURANAKA TOSHIYA, SAITO KAZU: "A Dioxygenase Catalyzes Steroid 16α-Hydroxylation in Steroidal Glycoalkaloid Biosynthesis", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 175, no. 1, 1 September 2017 (2017-09-01), Rockville, Md, USA , pages 120 - 133, XP093028363, ISSN: 0032-0889, DOI: 10.1104/pp.17.00501 *
UMEMOTO NAOYUKI, NAKAYASU MASARU, OHYAMA KIYOSHI, YOTSU-YAMASHITA MARI, MIZUTANI MASAHARU, SEKI HIKARU, SAITO KAZUKI, MURANAKA TOS: "Two Cytochrome P450 Monooxygenases Catalyze Early Hydroxylation Steps in the Potato Steroid Glycoalkaloid Biosynthetic Pathway", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 171, no. 4, 1 August 2016 (2016-08-01), Rockville, Md, USA , pages 2458 - 2467, XP093028360, ISSN: 0032-0889, DOI: 10.1104/pp.16.00137 *

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