JP6059446B2 - ヤトロファ属植物の細胞に由来するシュートの発根を促進させる方法 - Google Patents

Description

本発明はヤトロファ属植物の細胞に由来するシュートの発根を促進させる方法に関する。

近年、石油などの化石燃料資源の枯渇に備え、トウモロコシやサトウキビなどの植物体からバイオディーゼル燃料を生産する試みが数多く行われている。この植物体として、ヤトロファ属植物が注目を浴びている。ヤトロファ属植物は非食用植物であって、害虫や病原体に強い耐性を有し、痩せた土地でも栽培できるので食糧や農地との競合がなく、また、ヤトロファの種子には約３０〜４０％の油脂が含まれているので高い収率で油脂を回収できるという種々の利点があるからである。しかし、ヤトロファ属の植物は亜熱帯から熱帯地域でしか栽培することができず、結実回数も年に１回であり、実の大きさも小さいので、自然栽培では多くの採油量を望むことができない。

そこで、植物培養細胞（カルス）を安定的に生産し、カルスからバイオディーゼル燃料を生産することが試みられている。例えば、特許文献１には、ヤトロファ属植物から誘導したカルス細胞からヤトロファ油を抽出する方法が開示されている。この方法は、植物培養用のMurashige-Skoog培地（ＭＳ培地）と３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などの種々の植物成長調節物質（ＰＧＲ：Plant Growth Regulator）とを用いて誘導したカルスを液体培地で増殖させ、その後増殖させたカルスから油脂を抽出する方法である。しかし、この方法ではカルスに含まれる油脂量が少なく、多量の油脂を生産するには不向きである。

栽培されたヤトロファ属植物からの生産量を増大させるためには、例えば、耐乾燥性や耐寒性などの耐ストレス性の改良や種子中の油脂を増やす改良を行うことが考えられ、そのためには、植物細胞に標的遺伝子を導入し、所望する性質を付与するという細胞工学を利用する方法が利用される。その場合、標的遺伝子を導入した植物細胞を植物体に効率的に再分化させることが望まれている。

ヤトロファ属植物の細胞の効率的な再分化については、例えば、特許文献２に、初期培地で外植体からシュートを形成させる工程と、増殖および伸長用の培地にシュートを移植する工程と、伸長したシュートを発根用の培地に移植する工程とにより、ヤトロファ属植物の植物体を再生する方法が開示されている。この方法においては、各培地として植物成長調節物質が０．０１〜１０ｍｇ/Ｌの濃度で加えられたＭＳ培地等が用いられ、増殖および伸長用の培地ならびに発根用の培地にはそれぞれ異なる植物成長調節物質、例えば前者には６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）が、後者にはＩＢＡが加えられた培地が用いられている。

特許文献３には、ヤトロファ属植物の葉片をチジアズロン（ＴＤＺ）、ＢＡＰおよびＩＢＡを含む初期培地を用いて大量培養する工程と、ＴＤＺ、ＢＡＰ、ジベレリン酸およびＩＢＡを含む培地で増殖および伸長させる工程と、ＩＢＡを含む培地で発根させる工程とによって、カルスを経ることなくヤトロファ属植物の植物体を再生させる方法が開示されている。

非特許文献１には、アグロバクテリウム法により遺伝子導入されたヤトロファの形質転換体から子葉を形成させる方法が開示されている。この方法では、子葉外植体の形質転換体から、植物成長調節物質としてベンジルアデニン（ＢＡ）およびＩＢＡを含むＭＳ培地でカルス形成が行われ、形成されたカルスからＢＡ、ＩＢＡおよびジベレリン酸（ＧＡ３）を含む培地でシュートの形成が行われている。そして、ＩＢＡを含む１／２濃度のＭＳ培地（１／２ＭＳ培地）で発根が行われている。

非特許文献２には、植物成長調節物質としてＴＤＺ、ＩＢＡおよびＢＡの２種又は３種の組み合わせにより、ヤトロファ属植物の葉片から不定芽シュートを形成させ、さらに、ＢＡ、カイネチン（ＫＮ）、ＩＡＡおよびＧＡ３を含むＭＳ培地で多芽化および伸長を起こさせたことが報告されている。この報告によると、ＢＡおよびＩＢＡの組み合わせはカルス形成にはよいが、不定芽の誘導にはＴＤＺ、ＢＡおよびＩＢＡの組み合わせが好ましいとされている。

アグロバクテリウム菌の存在下で超音波処理を行って遺伝子を導入する方法（ＳＡＡＴ法）によると、遺伝子が安定に導入されるだけでなく、遺伝子の導入率や再分化する確率が高められることが報告されている（非特許文献３および４）。非特許文献３では、ヤトロファ属植物以外の植物についてであるが、超音波処理を行って遺伝子を導入した形質転換体から植物体への再分化が試みられている。これによると、植物ホルモンとして２，４−Ｄ、ＢＡＰ、ＩＡＡおよびアセトシリンゴンを含む培地で形質転換体からカルスを形成し、その後、ＢＡＰ、ＫＮおよびＩＡＡを含むＭＳ培地でシュート形成した後、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ＩＡＡおよびＫＮを含むＭＳ培地で発根させ、当該発根したシュートを１／２ＭＳ培地に移植している。

ヤトロファ属植物以外の植物においても種々の組織培養が行われている。特許文献４では、メンタ属植物のシュートから植物体に再分化させる際に、プリン塩基系のサイトカイニンを含む培地でシュートを伸長させ、次いで植物成長調節物質を含まない培地に移植して発根させる方法が開示されている。

特許文献５には、ヤトロファ属植物の細胞について、数少ない種類の植物成長調節物質の使用によりカルスから植物体への再分化を可能にする方法が記載されている。具体的には、植物成長調節物質としてＩＢＡとＢＡのみを含むＭＳ培地でヤトロファ属植物の細胞からシュートを形成させる工程と、前記形成されたシュートを植物成長調節物質としてＢＡのみを含むＭＳ培地に移植して伸長させる工程と、前記伸長させたシュートを植物成長調節物質としてＩＢＡのみを含む１／２ＭＳ培地に移植して発根させる工程との３工程によって、植物体を作出している。

特開２００９−１４８１９２号公報 ＵＳ２００８−０１９６１２１公報 ＷＯ２００８／０１２８３２公報 特開平５−３１６８９５号公報 特開２０１１−１５５９６８号公報

Li et al., Establishment of an Agrobacterium-mediated cotyledon disc transformation method for Jatropha curcas, Plant Cell Tiss. Organ. Cult., 2008, Vol.92, No2, pp.173-181） Ajay C. Deore et al., High-frequency plant regeneration from leaf-disc cultures of Jatropha curcas L.: an important biodiesel plant, Plant Biotechnol. Rep., 2008, 2, 7-11 Harold N. Trick et al., SAAT: Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation, Transgenic Research 6, 329-336, 1997 Malabika Roy Pathak et al., An effective method of sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of chickpeas, Plant Cell Tiss. Organ. Cult., 2008, 93, 65-71

先行技術文献に記載の従来のヤトロファ属植物の組織培養方法は、発芽数や発根までに至る成功率が低いという問題があり、また組織培養におけるシュート形成、伸長、発根の各段階で、数多くの植物成長調節物質の種類や濃度を変えることが必要があり、またはそれぞれの培養環境に工夫を要するものであった。それらの問題を解決したものが特許文献５の方法であるが、その特許文献５の方法は発根の段階で十分に発根しない場合があり、特に形質転換した細胞に適用した場合にそれが顕著であった。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、ヤトロファ属植物の細胞、特に形質転換した細胞に由来するシュートの発根を十分に確実に促進する方法を提供することである。

その課題を解決するために、本発明者らは、ヤトロファ属植物の形質転換した細胞に由来するシュートの発根に使用する培地について検討した結果、特許文献５の方法で十分に発根しない理由は１／２ＭＳ培地に含まれているアンモニウムイオンによって培地のｐＨが培養中に低下するためと考えた。そこで、植物培養用培地中のアンモニウムイオン濃度を下げたところ、意外にも該シュートの発根が格段に増えることを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の通りである。

［１］ ヤトロファ属植物の細胞に由来するシュートの発根を促進させる方法であって、
植物成長調節物質として３−インドール酪酸のみを含み、０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンおよび１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンを含む植物培養用培地で、該シュートを生育させることによる、方法。
［２］ ０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンおよび１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンを含む植物培養用培地がガンボーグＢ５培地であり、
３−インドール酪酸の培地中の濃度が０．１〜０．５ｍｇ／Ｌである、［１］記載の方法。

［３］ ヤトロファ属植物の細胞から、該ヤトロファ属植物を作出させる方法であって、
植物成長調節物質として０．０５〜０．６ｍｇ／Ｌの３−インドール酪酸および０．５〜３．５ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンのみを含むＭＳ培地で、ヤトロファ属植物の細胞からシュートを形成させる工程と、
植物成長調節物質として０．５〜３．５ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンのみを含むＭＳ培地に、前記形成されたシュートを移植して伸長させる工程と、
植物成長調節物質として０．１〜０．５ｍｇ／Ｌの３−インドール酪酸のみを含むガンボーグＢ５培地に、前記伸長させたシュートを移植して発根させる工程とを有する、方法。
［４］ ヤトロファ属植物の細胞が形質転換された細胞である、［１］〜［３］のいずれか記載の方法。
［５］ ヤトロファ属植物の細胞がストレス耐性遺伝子で形質転換された細胞である、［１］〜［３］のいずれか記載の方法。

［６］ ［５］記載の方法で作出させたストレス耐性遺伝子で形質転換されたヤトロファ属植物。
［７］ ［６］記載のストレス耐性遺伝子で形質転換されたヤトロファ属植物から収穫される種子。
［８］ ［７］記載の種子を圧搾して精製することによる、ヤトロファ油の製造方法。
［９］ ［８］記載の製造方法で製造される、ヤトロファ油。
［１０］ 植物成長調節物質として０．１〜０．５ｍｇ／Ｌの３−インドール酪酸のみを含むガンボーグＢ５培地。

本発明の方法によって、ヤトロファ属植物の細胞、特に形質転換した細胞に由来するシュートの発根を十分に確実に促進させることができる。

プラスミドベクターpGWB11-AtPPATの発現カセットを示す図である。各記号は、それぞれ以下の意味を表す。RB：T-DNAの右端。LB：T-DNAの左端。NOS-P：NOSプロモーター。nptII：neomycin phosphotransferase遺伝子。NOS-T：NOSターミネーター。35S-P：カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター。AtPPAT：シロイヌナズナのPPAT。Hpt：hygromycin phosphotransferase遺伝子。矢印：遺伝子の5'-3'の方向。 フィリピン系統のヤトロファに由来し、AtPPATで形質転換された細胞の発育状況を示す写真である。シュートの形成工程にある、子葉の外植体（ａ）と成葉の外植体（ｂ）の再分化されたシュートを示す。シュートの伸長工程にある、子葉の外植体（ｃ）と成葉の外植体（ｄ）の伸長したシュートを示す。発根工程にある、子葉の外植体（ｅ）と成葉の外植体（ｆ）の幼苗を示す。 形質転換体の分子分析を示す図である。ＰＣＲ増幅によって、形質転換体のゲノムに含まれるAtPPAT遺伝子の大きさ480bpのフラグメントが観察されている。ＭはＤＮＡのマーカーであり、ＤＷはＤＮＡの代わりに蒸留水を用いたものである。Ｐはポジティブコントロール（ベクターpGWB11-AtPPAT）であり、ＷＴは野生型である。 タイ系統（ａ〜ｄ）およびタンザニア系統（ｅ〜ｇ）のヤトロファに由来し、AtPPATで形質転換された細胞の発育状況を示す写真である。（ａ，ｂ，ｅ，ｆ）は、シュートの伸長工程にある伸長したシュートを示す。（ｃ，ｄ，ｇ）は、発根工程にある幼苗を示す。 タイ系統（ａ）およびタンザニア系統（ｂ）のヤトロファに由来するAtPPATで形質転換された外植体のＰＣＲ分析を示す図である。

本発明のヤトロファ属植物の細胞に由来するシュートの発根を促進させる方法は、植物成長調節物質として３−インドール酪酸のみを含み、０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンおよび１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンを含む植物培養用培地で、該シュートを生育させることを特徴とする。

「ヤトロファ属植物（Jatropha属植物）」は、熱帯地方原産のトウダイグサ科の潅木を言い、例えばヤトロファ・ポダグリカ（Jatropha podagurica：和名 サンゴアブラギリ）、ヤトロファ・ムルチフィダ（Jatropha multifida：和名 サケバヤトロファ）、ヤトロファ・ベルランディエリ（Jatropha berlandieri：和名 ニシキサンゴ）、ヤトロファ・インテゲリマ（Jatropha integerrima：和名 ナンヨウサクラ）、ヤトロファ・クルカス（Jatropha curcas：和名ナンヨウアブラギリ）等が含まれる。本発明で使用されるヤトロファ属植物は特に限定されないが、現油脂含量が多いという点で、ヤトロファ・クルカスが好適に用いられる。

「ヤトロファ属植物の細胞」としては、ヤトロファ属植物に由来する分化していない細胞が挙げられる。当該細胞は、ヤトロファ属植物の植物体から得られる外植体を用いて植物細胞を脱分化させて、分化していない細胞の塊であるカルスとして調製することができる。本発明においては、外植体として、例えば子葉、若葉等が好適に用いることができる。当該細胞には、ヤトロファ属植物の外植体から直接調製される野生型の細胞、およびその野生型の細胞を特定遺伝子で形質転換した細胞等が含まれる。
「シュート」とは、細胞培養において通常用いられる意義で用いられ、茎葉分化できる状態にある状態を意味する。

「植物成長調節物質」は、植物の伸長や分化に影響を及ぼす物質を言い、細胞分裂に関与すると言われているサイトカイニン、細胞伸長に関与していると言われているオーキシンの両者を含み、植物ホルモンを含む意味で用いられる。植物成長調節物質としては、例えば、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、チジアズロン（ＴＤＺ）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）等が挙げられる。

「０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンおよび１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンを含む植物培養用培地」としては、具体的には、ガンボーグＢ５培地（Ｂ５培地とも言う）等が挙げられる。当該植物培養用培地におけるアンモニウムイオンは、いかなる対イオンと塩を形成していてもよく、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等が挙げられる。植物培養用培地中のアンモニウムイオンとしての濃度は、好ましくは０．１〜４ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられ、より好ましくは１〜３ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられ、特に好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられる。２ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンの濃度は、例えば硫酸アンモニウムで言えば、１３２ｍｇ／Ｌに相当する。当該植物培養用培地における硝酸イオンは、いかなる対イオンと塩を形成していてもよく、例えば、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸マグネシウム等が挙げられる。植物培養用培地中の硝酸イオンとしての濃度は、好ましくは１５〜４０ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられ、より好ましくは２５ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられる。２５ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンの濃度は、例えば硝酸カリウムで言えば、２４２６ｍｇ／Ｌに相当する。

特許文献５では、ヤトロファ属植物の細胞に由来するシュートの発根に用いる培地は１／２ＭＳ培地である。しかし、１／２ＭＳ培地を用いた場合、シュートの発根が不十分であることがあり、特に形質転換した細胞に由来するシュートの場合は、それが顕著であった。１／２ＭＳ培地には、硝酸アンモニウムが８２５ｍｇ／Ｌと大量に含まれており、そのアンモニウムイオンは窒素源であると共に、培地のｐＨを維持する作用を有している。しかし、アンモニウムイオンが窒素源としてシュートに用いられてその濃度が低下すると、培地のｐＨが極端に低下すると考えられ、そのために、シュートの発根が阻害されたと考えた。そこで、上記の「０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンおよび１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンを含む植物培養用培地」を用いたところ、シュートの発根の効率が顕著に促進された。本植物培養用培地では、同じく窒素源として用いられる硝酸イオンを一定濃度に留めつつ、アンモニウムイオンの濃度を下げているところに特徴がある。

「０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンおよび１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンを含む植物培養用培地」の発根用の培地（Root Induction培地：ＲＩ培地）にはＩＢＡが含まれ、その濃度は、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．２ｍｇ／Ｌ、最適には０．２ｍｇ／Ｌである。当該培地としては、０．７％程度の寒天が添加された固体培地が用いられる。
２〜３ｃｍ程度の大きさになった伸長したシュートを、上記のＲＩ培地に移植して、発根を促進させる。シュートの発根促進においては、４〜８週間、温度や湿度、照明時間が管理された人工的な環境下で行われる。温度、湿度などの培養条件は適宜変更されうるが、例えば２５〜３０℃、６５〜８５％ＲＨ、約２,０００ルクスの照明の下、１６時間の明時間という培養条件が例示される。

また、本発明のヤトロファ属植物の細胞から、該ヤトロファ属植物を作出させる方法は、以下の３つの工程からなる方法である。
［工程ａ］植物成長調節物質として０．０５〜０．６ｍｇ／ＬのＩＢＡおよび０．５〜３．５ｍｇ／ＬのＢＡのみを含むＭＳ培地で、ヤトロファ属植物の細胞からシュートを形成させる工程
［工程ｂ］植物成長調節物質として０．５〜３．５ｍｇ／ＬのＢＡのみを含むＭＳ培地に、前記形成されたシュートを移植して伸長させる工程
［工程ｃ］植物成長調節物質として０．１〜０．５ｍｇ／ＬのＩＢＡのみを含むＢ５培地に、前記伸長させたシュートを移植して発根させる工程

工程ａは、植物成長調節物質としてＩＢＡとＢＡのみを含むＭＳ培地（Shoot Regeneration培地：ＳＲ培地）によりシュート形成が行われる。ＩＢＡ濃度は０．０５〜１．０ｍｇ／Ｌであり、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ／Ｌ、最適には０．５ｍｇ／Ｌである。また、ＢＡ濃度は０．５〜３．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜３ｍｇ／Ｌであり、最適には３ｍｇ／Ｌである。これらの濃度外では、シュートの形成数が低下したり、シュートの安定した成長が見られなくなる。なお、シュート形成には、前記培地に０．８％程度の寒天が加えられた固体培地が好ましく用いられる。また、成葉の場合は、子葉と異なり、再分化の能力が劣り、内部ホルモンも相違するため、まず、ＴＤＺを含むＳＲ培地で、２週間程度培養して、シュートを誘導する。その後、ＴＤＺの影響を残さないように、ＴＤＺを含まないＳＲ培地に移して、子葉と同様に培養を行うことが好ましい。ＴＤＺの濃度としては、例えば０．１〜１ｍｇ／Ｌが挙げられる。
シュート形成は、４〜８週間、温度や湿度、照明時間が管理された人工的な環境下で行われる。温度、湿度などの培養条件は適宜変更されうるが、例えば２５〜３０℃、６５〜８５％ＲＨ、約２,０００ルクスの照明の下、１６時間の明時間という培養条件が例示される。

工程ｂで、カルスから得られたシュートは、植物成長調節物質としてＢＡのみを含むＭＳ培地（Shoot Elongation培地：ＳＥ培地）に移植され、さらに４〜８週間、培養される。移植は、シュートからの発芽が視認され、その後安定して成長したことが確認できた際に行われる。ＢＡ濃度は０．５〜３．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５〜２ｍｇ／Ｌであり、最適には２ｍｇ／Ｌである。この濃度外では伸長速度が遅くなったり、発芽数が少なくなる傾向にある。この培地にも０．７％程度の寒天が加えられた固体培地が好ましく用いられる。当該培地においては、シュートが伸長するだけでなく、新たなシュートも形成される。
工程ｃは、前記の通り、実施できる。

形質転換に用いられる「対象遺伝子」としては、ヤトロファ属植物の性質を改良させる遺伝子が挙げられ、例えば、乾燥、塩、低温等のストレスに対する耐性を向上させる遺伝子、実の中の油脂含量を増やす遺伝子、結実数を増やす遺伝子等が挙げられる。乾燥、塩、低温等のストレスに対する耐性を向上させる遺伝子の例としては、例えば、補酵素Ａの生合成に関わるPPAT（Phosphopantetheine adenylyltransferase）遺伝子（配列番号１）、NF-YB（Plant Nuclear Factor YB）遺伝子（ＷＯ２０１１／１２５７４８公報）、およびグリシンベタインの生合成に関わるGSMT（Glycine sarcosine methyltransferase）遺伝子とDMT（N,N-dimethylglycine methyltransferase）遺伝子との組合せ等が挙げられる。

ヤトロファ属植物の細胞の形質転換に用いられる「形質転換方法」としては、アグロバクテリウム菌を利用した方法、ガンシューティング法等が例示される。アグロバクテリウム菌を感染させる方法としては、培地中でアグロバクテリウム菌と単純接触させるだけでなく、例えば非特許文献３に記載されたように、アグロバクテリウム菌と接触させる際に超音波処理を行うＳＡＡＴ法やアグロバクテリウム菌の懸濁液に砂を加えた状態で振動を与えるSandvortex法などアグロバクテリウム菌の感染力を高める方法が好ましい。好ましくは、形質転換した後、カルスを形成させる。

ヤトロファ属植物に由来する形質転換細胞から、本発明の方法を用いて作出した植物体は、形質転換処理を施した「Ｔ１世代」のほか、その植物の種子から得られる「Ｔ２世代」、薬剤選抜あるいはＰＣＲ法、サザン法等による解析により形質転換であることが判明した「Ｔ２世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（Ｔ３世代）などの後代植物も含まれる。

「ヤトロファ油」は、本発明の方法で作出されたヤトロファから収穫される種子から、常法に従って製造することができる。例えば、種子を圧搾して原料油を得て、その原料油をフィルターでろ過することで、バイオディーゼルとして使用しうるヤトロファ油を製造することができる。ヤトロファ油をさらに精製したい場合は、例えば蒸留により精製することでき、また特開２０１０−２０９１７７号公報に記載された方法でホルボールエステルを除去することもできる。

本発明を実施するための形態を実施例により説明する。下記実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。

（１）ヤトロファの外植体の調製
フィリピン系統、タイ系統およびタンザニア系統のヤトロファ・クルカスの子葉および若葉を用いた。フィリピン系統のヤトロファ・クルカスの種子はフィリピンロスバノス大学から入手した。タイ系統およびタンザニア系統のヤトロファ・クルカスの種子は鳥取大学乾燥地研究センターから入手した。子葉の外植体は、Khemkladngoen N, et al., J. Biosci Bioeng 111: 67-70 (2011)に記載の方法に従って調製した。成葉の外植体については、まず、土壌に生育するヤトロファ・クルカスの若葉を採取し、家庭用漂白剤を水道水で１０倍に希釈した液を用いて１０分間滅菌した。若葉を滅菌水で３回洗浄し、ペーパータオルで水分を取り除き、約５×５ｍｍの大きさに細断した。形質転換まで少なくとも２日間、葉をPre-conditioning培地に２５℃で浸漬した。

（２）プラスミドの調製およびアグロバクテリウムの形質転換
シロイヌナズナのPPAT（AtPPAT）遺伝子のコード配列（配列番号１：At2g18250／GenBankアクセス番号 NM-127383）をGateway（登録商標）クローニングシステム（Invitrogen）を用いてクローニングした。カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）の35SプロモーターおよびNOSターミネーターを有し、FLAG発現カセットが付加されているGatewayバイナリベクター pGWB11（Nakagawa T, et. al., J. Biosci. Bioeng 104: 34-41 (2007)）を用いて、AtPPAT発現プラスミドベクターpGWB11-AtPPATを得た。続いて、エレクトロポレーション法を用いて、上記プラスミドでアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens LBA4404）を形質転換し、この形質転換アグロバクテリウムを、ＹＥＢ液体培地（５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン添加）で、３０℃、２日間振とう培養した後、遠心分離により集菌した。集菌した菌をＹＥＢ培地に再懸濁して、感染用菌液を調製した。

（３）ヤトロファ細胞の形質転換
アグロバクテリウムを用いる形質転換は、Khemkladngoen N, et. al., Plant Biotechnol Rep 5: 235-243 (2011)および特許文献５に記載の方法に従って実施した。すなわち、（２）で得られた形質転換されたアグロバクテリウムを、光波長６００ｎｍ、光路長１ｃｍで細胞濁度０．５になるようにして懸濁液を作製した。この液１０〜１２．５ｍＬを５０ｍＬのプラスティックチューブに分注し、（１）で得られた子葉片および成葉片を加えた。ここに５０〜７０メッシュサイズの白石英砂（Sigma-Aldrich社製）を適量加え、１分間、超音波を与え、９分間、ロータリー式の振動装置（VORTEX-GENIE 2 エムエス機器株式会社）で振とうさせて（Sandvortex法）、子葉片および成葉片に傷害処理を与えた。そして２５℃、遮光条件下で３日間静置培養して、アグロバクテリウムと共培養した。共培養培地としては、Pre-conditioning培地にアセトシリンゴンを添加したCo-cultivation培地を用いた。その後、アグロバクテリウムを感染させた子葉片および成葉片からアグロバクテリウムを除くために、２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムナトリウムを加えた滅菌水に数分間浸漬した。

（４）シュートの形成工程
子葉の場合は、セフォタキシムナトリウム２００ｍｇ／Ｌおよびカナマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むシュート再分化培地（Shoot Regeneration培地）ＳＲ−ＩＩ培地を用いて、（３）で得られた形質転換ヤトロファ細胞を、２５℃で２，０００ルクスで１６時間の明時間の環境で８週間、培養した。これによって、残存するアグロバクテリウムが死滅して、上記の発現カセットがヤトロファの染色体ゲノムに安定して挿入された形質転換体がスクリーニングされ、シュートの誘導および増殖が促進した。
成葉の場合は、子葉と異なり、再分化の能力が劣り、内部ホルモンも相違するため、まず、ＴＤＺ０．５ｍｇ／Ｌを含むシュート再分化培地ＳＲ−Ｉ培地で、２週間培養して、シュートを誘導した。その後、子葉で用いたＳＲ−ＩＩ培地に移して、子葉の場合と同様に培養を行い、シュートの増殖を促進させた。

（５）シュートの伸長工程
シュートの伸長工程は、Khemkladngoen N, et. al., Plant Biotechnol Rep 5: 235-243 (2011)および特許文献５に記載の方法に従って、実施した。具体的には、（４）で形成されたシュートを植物成長調節物質としてＢＡ（２ｍｇ／Ｌ）のみを含み、０．７％の寒天を含むＭＳ固体培地（ＳＥ−Ｉ培地，その後ＳＥ−ＩＩ培地）に移植して、２５℃の温度、２,０００ルクスの照明下１６時間の明時間の培養条件で４〜６週間培養した。

（６）シュートの発根工程
（５）で約２〜３ｃｍ程度の高さに伸長したシュートを、発根を促進させるために、ＩＢＡ０．２ｍｇ／Ｌのみを含む発根用培地に移植した。培養条件は（５）のシュートの伸長工程と同様である。
（ａ）１／２ＭＳ培地
まず、特許文献５に記載の発根用培地である１／２ＭＳ培地（ＲＩ培地（比較例））を用いて培養した。この培地には、アンモニウムイオンは１０．３ｍｍｏｌ／Ｌが含まれ、硝酸イオンは１９．７ｍｍｏｌ／Ｌが含まれている。この培養の結果、（５）で得られたシュートからは、シュート１本当たり根が１〜２本しか発根しなかった。
（ｂ）ガンブローグＢ５培地
次に、Ｂ５培地（ＲＩ培地（実施例））を用いて培養した。この培地には、アンモニウムイオンは２．０３ｍｍｏｌ／Ｌが含まれ、硝酸イオンは２４．７ｍｍｏｌ／Ｌが含まれている。この培養の結果、（５）で得られたシュートからは、２〜４週間後にシュート１本当たり根が平均３〜４本、発根した。

（７）使用した培地組成
（１）〜（６）で用いた培地を以下に示す。
＜ＭＳ基本培地＞
ＭＳ １ｘ，（ｐＨ５．８）
スクロース ３％
ミオイノシトール １００ｍｇ／Ｌ
チアミン塩酸塩（ｐＨ５．８） １０ｍｇ／Ｌ
寒天 ０．８％

＜Pre-conditioning培地＞
ＭＳ基本培地
６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ） １ｍｇ／Ｌ
３−インドール酪酸（ＩＢＡ） ０．０７５ｍｇ／Ｌ
＜Co-cultivation培地＞
ＭＳ基本培地
６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ） １ｍｇ／Ｌ
３−インドール酪酸（ＩＢＡ） ０．０７５ｍｇ／Ｌ
アセトシリンゴン（ＡＳ） ２０ｍｇ／Ｌ

＜ＳＲ−Ｉ培地＞
ＭＳ基本培地
チジアズロン（ＴＤＺ） ０．５ｍｇ／Ｌ
６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ） １ｍｇ／Ｌ
３−インドール酪酸（ＩＢＡ） ０．０７５ｍｇ／Ｌ
セフォタキシムナトリウム ２００ｍｇ／Ｌ
カナマイシン ２０ｍｇ／Ｌ
＜ＳＲ−ＩＩ培地＞
ＭＳ基本培地
６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ） ３ｍｇ／Ｌ
３−インドール酪酸（ＩＢＡ） ０．５ｍｇ／Ｌ
セフォタキシムナトリウム ２００ｍｇ／Ｌ
カナマイシン ２０ｍｇ／Ｌ

＜ＳＥ−Ｉ培地＞
ＭＳ基本培地
６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ） ２ｍｇ／Ｌ
セフォタキシムナトリウム ２００ｍｇ／Ｌ
カナマイシン ２０ｍｇ／Ｌ
＜ＳＥ−ＩＩ培地＞
ＭＳ基本培地
６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ） ２ｍｇ／Ｌ
カナマイシン ２０ｍｇ／Ｌ

＜ＲＩ培地（比較例）＞
ＭＳ ０．５ｘ，（ｐＨ５．８）
スクロース ３％
ミオイノシトール １００ｍｇ／Ｌ
チアミン塩酸塩（ｐＨ５．８） １０ｍｇ／Ｌ
３−インドール酪酸（ＩＢＡ） ０．２ｍｇ／Ｌ
寒天 ０．８％
＜ＲＩ培地（実施例）＞
ガンボーグＢ５培地 １ｘ，（ｐＨ５．８）
スクロース ２％
ミオイノシトール １００ｍｇ／Ｌ
チアミン塩酸塩（ｐＨ５．８） １０ｍｇ／Ｌ
３−インドール酪酸（ＩＢＡ） ０．２ｍｇ／Ｌ
寒天 ０．７％

（８）シュートの発育状況
フィリピン系統のヤトロファに由来し、AtPPATで形質転換された細胞の発育状況を示す写真を図２に示す。順調に再分化および発根が進行していることが分かる。また、図２から、野生型と比較すると、表現型の変化がないことが分かる。
また、タイ系統およびタンザニア系統のヤトロファについての形質転換細胞の発育状況を示す写真を図４に示す。図４から分かる通り、本発明は、フィリピン系統だけではなく、タイ系統にもタンザニア系統にも同様に適用できることが分かる。

（９）形質転換された幼苗の分子分析
（６）で得られた幼苗の若葉およびコントロール（野生型ヤトロファ）の若葉から、マニュアルに従ってDNeasy Plant Mini kit（QIAGEN）を用いて、ゲノムＤＮＡを単離した。Go Taq Green Master Mix（Promega）を用いて、単離したゲノムＤＮＡについて以下のプライマー（配列番号２および３）を用いてＰＣＲ分析を行い、AtPPATをコードする481bpのフラグメントを増幅した。
（AtPPATのフォワードプライマー：配列番号２）
5'- GCTCCGGAAGATTCAAAGAT -3'
（AtPPATのリバースプライマー：配列番号３）
5'- TCTCAGCCTCCATTTTTCTC -3'
９５℃、２分間保持した後、［９５℃，３０秒→５０℃，３０秒→７２℃，４０秒］を３５回繰り返し、次いで、７２℃、５分間保持した後、４℃まで冷却して、ＰＣＲ反応を行った。反応終了後、ＰＣＲ生成物を１％アガロース上で電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色して、ＵＶトランスイルミネーターで可視化した。

フィリピン系統に由来する幼苗の若葉の分析結果を図３に示す。ここから、すべての幼苗でゲノム上にAtPPAT遺伝子が組み込まれていることが分かる。また、タイ系統およびタンザニア系統に由来する幼苗の若葉の分析結果を図５に示す。幼苗のゲノムに同様にAtPPAT遺伝子が組み入れられていることが分かる。

本発明の方法によって、ヤトロファ属植物の細胞、特に形質転換した細胞に由来するシュートの発根を十分に確実に促進する方法を提供することができる。

Claims (4)

1. ヤトロファ属植物の細胞に由来するシュートの発根を促進させる方法であって、
   植物成長調節物質として０．１〜０．５ｍｇ／Ｌの３−インドール酪酸のみを含み、０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンおよび１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンを含むガンボーグＢ５培地で、該シュートを生育させることによる、方法。
2. ヤトロファ属植物の細胞から、該ヤトロファ属植物を作出させる方法であって、
   植物成長調節物質として０．０５〜０．６ｍｇ／Ｌの３−インドール酪酸および０．５〜３．５ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンのみを含むＭＳ培地で、ヤトロファ属植物の細胞からシュートを形成させる工程と、
   植物成長調節物質として０．５〜３．５ｍｇ／Ｌのベンジルアデニンのみを含むＭＳ培地に、前記形成されたシュートを移植して伸長させる工程と、
   植物成長調節物質として０．１〜０．５ｍｇ／Ｌの３−インドール酪酸のみを含み、０．０１〜５ｍｍｏｌ／Ｌのアンモニウムイオンおよび１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの硝酸イオンを含むガンボーグＢ５培地に、前記伸長させたシュートを移植して発根させる工程とを有する、方法。
3. ヤトロファ属植物の細胞が形質転換された細胞である、請求項１または２に記載の方法。
4. ヤトロファ属植物の細胞がストレス耐性遺伝子で形質転換された細胞である、請求項１または２に記載の方法。

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