JPH0453429A

JPH0453429A - 形質転換された木本性植物のプロトプラスト、コロニー又はカルス、苗条原基並びに木本性形質転換植物及び該植物を作出する方法

Info

Publication number: JPH0453429A
Application number: JP2162695A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Ota; 勉太田; Keigo Doi; 敬悟土肥; Satoru Kawazu; 哲河津; Kazuya Ito; 一弥伊藤; Masaru Shibata; 勝柴田
Original assignee: Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1990-06-22
Filing date: 1990-06-22
Publication date: 1992-02-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、木本性植物に効率よく外来遺伝子を導入して
、木本性形質転換植物を作出する方法に関するものであ
る。

〔従来の技術〕

植物のもつ遺伝子形質を改変する方法として遺伝子組換
えの技術が登場してほんの数年である。その進歩と普及
の速度は著しく、イネ、タバコ、トマトなど草本性植物
ではすでに多くの形質転換個体が得られている。木本性
植物においては、ポプラ（Ｆｉｌｌａｔｔｉ、ｅｔ　ａ
Ｌ、、１９８７．Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　２０６＋１９２−１９９
）、クルミ（ＭｃＧｒａｎａｈａｎｅｔ　ａｔ、　、　
１９８８．８ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６＋８０
０−８０４）、リンゴ（Ｊａｍｅｓ　ｅｔ　ａＬ、、１
９８９．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、、　７：６５
Ｂ−６６１）や、本発明者等の発明に係る植物の形質転
換体を作出する方法（特開平２−１３８９６６号公報）
等少数の例が報告されているにすぎない。

しかし、これらの木本性植物に関する例はすべて土壌細
菌の一種であるアグロバクテリウムを利用した外来遺伝
子の導入方法であるが、これらの方法によってもユーカ
リをはじめとする有用広葉樹の場合には、形質転換個体
を作出することはできない。

アグロバクテリウムを用いる外来遺伝子を導入する方法
には、アグロバクテリウムが感染する樹種が限られてい
ること、アグロバクテリウムとの共存培養によりその後
の植物再生が不能になる場合があること、単細胞由来の
形質転換体を得ることは困難であり、キメラになる可能
性が残ること、遺伝子をＴｉプラスミド上の特定の部分
に導入するまでの手順が複雑であること、除菌が困難で
ある等の問題点がある。

また、植物への外来遺伝子の導入方法には、上記のよう
な間接的な手段の他に、植物細胞をプロトプラストの形
にして直接外来遺伝子を導入する方法がある。なかでも
プロトプラストに電気パルスを印加し、外来遺伝子を導
入するエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）は、−度に大量の細胞を処理することがで
き、しかもプロトプラストの形にしてから外来遺伝子を
導入するため、再生させた場合完全な単細胞由来の形質
転換体が得られるため有効な手段である。

方、本発明者等は再生を目的とする木本性植物のプロト
プラストを分裂能の高い草本性植物のプロトプラストと
共存させて培養し、コロニーあるいはカルスを得た後、
回転培養器に移して苗条原基を作出し、さらに植物体を
再生することを特徴とする木本性植物のプロトプラスト
から植物体を再生する方法を提案した（特開平２−１２
８６３１号公報）。そして、この方法によってユーカリ
等の木本性植物のプロトプラストを植物体に再生させる
ことが可能となった。

本発明者等は上記のような、アグロバクテリウムを利用
した遺伝子導入における問題点を解決して、ユーカリ等
の木本性植物においても容易に形質転換植物を製造する
方法について研究を重ねた結果、本発明を完成するに至
った。

〔発明が解決しようとする課題］本発明は、植物細胞中に外来遺伝子を導入し、植物体を
再生させる場合にこれまで試みられてきた方法では困難
な、あるいは不可能な種類の木本性植物において、形質
転換植物を製造する方法に関するものである。

すなわち、形質転換させることを目的とする木本性植物
のプロトプラスト及び外来遺伝子を含むプラスミドを液
体媒体に懸濁し、電気ノ（ルスを印加して該プラスミド
を該プロトプラストに導入した後、プロトプラストの分
裂能の高い種類の草本性植物のプロトプラストを培養の
初期に共存させて、木本性植物のコロニーあるいはカル
スを形成させ、形成されたコロニーあるいはカルスを回
転培養して苗条原基を作出し、得られた苗条原基から木
本性の形質転換植物を再生する方法を提供することを目
的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、１、　木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプ
ラストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入し
てなる形質転換されたプロドプラスト。

２．　木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプ
ラストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入し
、次いで草本性植物のプロトプラストと共存させて培養
して得られた木本性植物の形質転換されたコロニーある
いは形質転換され、たカルス。

３、　木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプ
ラストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入し
、次いで草本性植物のプロトプラストと共存させて培養
し、木本性植物のコロニーあるいはカルスを得た後、光
照射下に回転培養して作出された木本性植物の形質転換
された苗条原基。

４、　木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプ
ラストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入し
、次いで草本性植物のプロトプラストと共存させて培養
し、木本性植物のコロニーあるいはカルスを得た後、光
照射下に回転培養して苗条原基を作出し、さらにこの苗
条原基から再生された木本性形質転換植物。

５、　木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプ
ラストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入し
、形質転換された植物体を再生することを特徴とする木
本性形質転換植物を作出する方法。

である。

本発明に使用する植物の種類は特に限定されるものでは
ないが、再生を目的とする木本性植物としては、ユーカ
リ、マングローブ、アカシア、パラゴムツキ、コーヒー
等の常緑広葉樹類、ポプラ、キリ、コナラ、クヌギ、シ
ラカバ　ハンノキ、エンジュ、ミズナラ、ホウツキ、ウ
ルシ、ヤナギ、クワ等の落葉樹類、マツ、スギ、ヒノキ
、モミ、トウヒ、アスナロ、カラマツ、メタセコイヤ等
の針葉樹類、さらにミカン、オレンジ、クレープフルー
ツ、ナシ、モモ、スモモ、ビワ、ブドウ、カキ、イチジ
ク、アーモンド、マンゴウ、レイク、アンプ、クルミ、
アセロラ、キイライフルーツ、アケビ、ラズベリクース
ベリー　パパイヤ等の果樹類やバラ、ウメ、ツバキ、サ
クシ、サルスベリ、ハナミズキ、ナシテン、ヂンチョウ
ゲさらにはキョウチクトウ等の花木類等がある。

一方、プロトプラストの分裂能の高い草本性の植物とし
てはケナフ、タバコ、ペチュニア等が用いらる。

本発明に用いるプロトプラストを単離するために使用す
るカルス、苗条原基、及び苗条の作出方法、プロトプラ
ストの単離・調整方法は、本発明者等が提案した方法（
特開昭６３−３０１７８４号公報、特開平２−１２８６
３１号公報）に従って行えばよい。以下、本発明で使用
するプラスミド、エレクトロポレーションの方法、形質
転換されたプロトプラストの混合、形質転換されたプロ
トプラストの培養方法、形質転換個体の選抜方法、形質
転換された苗条原基の作出方法、さらに形質転換植物の
再生方法等について詳しく説明する。

本発明で使用するプラスミド本発明で使用するプラスミドは、木本性植物で機能する
プロモーター、外来遺伝子、及び木本性植物で機能する
ターミネータ−を有するものである。

プロモーターとしては、例えば、カリフラワモザイクウ
イルス由来の３５ＳＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ３５　Ｓ）
　　　１９　Ｓ　　ＲＮＡ遺伝子（ＣａＭＶ１９Ｓ）の
プロモーター　あるいは、ツバリン合成酵素（ＮＯ３）
遺伝子由来のプロモーター等を使用し、外来遺伝子とし
ては、例えば、ネオマイシンフォスフオドランスフェラ
ーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ハイグ
ロマイシンフォスフオドランスフェラーゼ遺伝子等を使
用することができる。さらにターミネータ−としては、
例えばカリフラワーモザイクウィルス由来のターミネー
タ−ＮＯ３遺伝子由来のターミネータ−等を使用するこ
とができる。

本発明においては、２つ以上の外来遺伝子を使用し、か
つ、そのうち１つは目的とするコロニーを選択する際に
有効な、所謂選抜マーカー遺伝子を使用するのが好まし
い。かかる選抜マーカー遺伝子としては、ネオマイシン
フォスフオドランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシ
ンフォスフオドランスフェラーゼ遺伝子が好ましい。

本発明においては、選抜マーカー遺伝子と他の外来遺伝
子を同一のプラスミド中に有するものを使用してもよい
し、選抜マーカー遺伝子を有するプラスミドと他の外来
遺伝子を有するプラスミドとを併用してもよい。

エレクトロポレーションの方法例えば１〜１００μｇ／−の上記プラスミドと上記木本
性植物由来のプロトプラスト１０５〜１０６個／−とを
、０〜１００ｍＭの２−　（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ
）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＢＳ）
　　　０〜７０　ｍＭのＫ［：１　０．４〜０．６Ｍの
マニトール、０〜５％のポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）　　Ｏ〜２００μｇ／ｍｆのキャリアＤＮＡを含む
バッファー等の液体媒体中に懸濁し、これに電気パルス
を印加してプラスミドをプロトプラスト中に導入する。

電気パルス処理は、２２〜１０００μＦのコンデンサー
を用いて１００〜５００Ｖ／ｃｍの初期電圧の直流パル
スで印加するのが好適である。

形質転換されたプロトプラストの混合電気パルス処理後、木本性植物由来の苗条原基より作出
したプロトプラストと草本性植物由来のプロトプラスト
をぞれぞれ１０４ないし１０５個／ｍｌの濃度に調整す
る。そして、両プロトプラストの混合割合を１：５〜５
：１として混合し、植物の組織培養培地、例えばガンボ
ーグの８５培地、ムラシゲ・スクーグのＭＳ培地等に植
物ホルモン類、例えばナフタレン酢酸（ＮＡＡ）２．４
−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）インドール酢
酸（ＩＡＡ）等のオーキシン類およびベンジルアデニン
（ＢＡ）　　　１−（２−クロロ−４−ピリジル）−３
−フェニル尿素＜４ＰＵ）　　カイネチン、ゼアチン、
チジアソ′ロン（Ｎ−ｐｈｅｎｙｌ−Ｎ’　　１，２．
３−ｔｈｉｄｉａｚｏｌ−５−ｙｌａｒｅａ。

ＳＤＳ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等のサイトカイニン類を
添加した液体培地で培養する。支持体剤としては、寒天
、アガロースまたはジェランガム（例えばＫｅｌｃｏｄ
ｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｍｅｒｃｋ社製など）などを用いう
る。この際支持体剤を低濃度で含有させることも可能で
ある。

培養条件は、初期には暗所で培養し、プロトプラストの
生育に伴って徐々に明るくするのが好適である。また、
培養期間中の温度としては２０℃ないしは３０℃が好ま
しいが、特に２５℃ないし２８℃の間が好ましい。

プロトプラストの培養は、溶解した寒天培地に流し込む
方法や液体培地に懸濁する方法等で行い、培養後３０〜
６０日後、さらに例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（６４１
８）　　５〜３０　ｕ　ｇ／−、カナマイシン１００〜
１０００μｇ／ｄ、ハイグロマイシン１０〜５００μｇ
／ｍｌ’等の抗生物質を添加し、選抜期間１０〜３０日
間で目的とする木本性形質転換植物のコロニーあるいは
カルスが形成される。

形質転換された苗条原基の作出方法得られたコロニーあるいはカルスを例えば、０４１８５
〜３０μｇ／ｍｌ、カナマイシン１００〜１、０００　
μｇ／ｒｎｌ、　ハイグロマイシン１０〜５００μｇ／
ｍｆ等の抗生物質を添加したガンボーグのＢ５培地ある
いはムラシゲ・スクーグのＭＳ培地にオーキシンおよび
サイトカイニンさらにショ糖を添加した液体培地の中で
回転培養する。

培養条件は１〜１０　ｒｐｍの回転速度、２．０００〜
２０．ＯＤＤルクスの照度、そして、２０〜３０℃の温
度とする。１４〜４０日間隔で新鮮培地へ継代して培養
を継続する。回転培養をはじ約てから４０日〜１２０日
で形質転換された苗条原基が得られる。

形質転換された植物体の再生方法回転培養装置で培養して得られた形質転換された苗条原
基を、苗条を再生するための培地、例えば、ガンボーグ
のＢ５培地、ムラシゲ・スクーグのＭＳ培地等に植物ホ
ルモン類として、例えばナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、
２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，１−Ｄ）　　イ
ンドール酢酸（ＩＡＡ）等のオーキシン類およびベンジ
ルアデニン（ＢＡ）　　　４ＰＵ、カイネチン、ゼ゛ア
チン等のサイトカイニン類を添加したもので培養する。

培養は２０〜３０℃の温度、２．０００〜３．０００ル
クスの照度で約６０日間行って苗条を再生させ、さらに
、発根用培地、例えばガンボーグのＢ５培地、ムラシゲ
・スクーグのＭＳ培地等にＮＡＡ、２．４−Ｄ、Ｉ　Ａ
Ａ等のオーキシン類を添加したもので培養し発根させて
完全な形質転換植物をプロトプラストから再生させる。

以下、実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

〔実施例〕

供試植物木本性植物としてユーカリ（Ｂｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓ
ａｌ＋−ｇｎａ）を、また、これと共存させて培養する
草本性植物としてケナフ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｃａｎｎ
ａｈｉｎｕｓ）を使用した。

プロトプラストの単離・調整方法ユーカリの苗条原基およびケナフのカルス各１ｇに対し
て、それぞれ各２０ｒｄの酵素液（１％セルラーゼ・オ
ノズカＲ３，０，０５％ペクトリアーゼＹ−２３，１％
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）１３％マニトール、ｐ
Ｈ５，６）を加えて２７℃の温度、３０ｒｐｍの振盪回
数で１５時間の酵素処理を行って、両植物のプロトプラ
ストを別々に単離した。

得られたプロトプラスト懸濁液をナイロンメツシュ（２
２５メツシユ）でろ過して未消化の細胞塊等を除き、さ
らに７５０　丁ｐｍで３分間の遠心分離処理をして酵素
液とプロトプラストを分離し、洗い液（１３％マニトー
ル）で２回洗浄した後にユーカリプロトプラストのみを
電気パルス処理に供した。

エレクトロポレーション上記で調整したユーカリプロトプラストを、７０ｍＭの
ＫＣＩ　、　　５ｍＭのＭＥＳ、９％のマニトール、１
％のポリエチレングリコール、１００μｇ／蔵のキャリ
アＤＮＡを含むｐＨ５，６のバッファーに１×１０６個
／ｍ１．となるように懸濁した。

この懸濁液に、プロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓ　。

外来遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ遺伝子及びター
ミネータ−としてＮＯ３遺伝子由来のターミネータ−と
、その近傍にプロモーターとしてＮＯ３遺伝子由来のプ
ロモーター、外来遺伝子としてネオマイシンフォスフオ
ドランスフェラーゼ遺伝子及びＮＯ３由来のターミネー
タ−を有するプラスミド（ｐ２Ｎ−ＧＵＳ）　２０μｇ
／ｍｆを添加し、４℃で５分間冷却した後、滅菌したプ
ラスチックセルに移し、平行電極を用い、直流の電気パ
ルスを印加した。その際、８００μＦのコンデンサーを
用いて２５０Ｖ／ｃｍの初期電圧をかけた。

パルス印加後、４℃で２０分間冷却後、３０分間室温で
静置し、遠心分離して、沈降したプロトプラストを培養
に移した。

法形質転換されたプロトプラストの培養培地は、表−１に
示したガンボーグの８５培地に５　ｍｇ／ｌのＮＡＡ、
　０．５ｍｇ／ｊ！のチジアゾロン、１％のショ糖、９
％のマニトールを加えたものを使用した。この培地に形
質転換されたユーカリのプロトプラストとケナフのプロ
トプラストを３：１　（ユーカリ３、ケナフ１）の割合
で、２．５×１０４個／ｍｌの濃度になるように混合し
て直径６ｃｍのシャーレにプレートした。なお、プレー
トａは１シヤーレ当たり３−とじた。

プレートした形質転換されたプロトプラストを、２７℃
の温度の暗条件で４０日間培養した後、表−１に示すガ
ンボーグのＢ５培地に、０．０２ｍｇ／Ｉ２のＮＡＡ、
Ｏ１５ｍｇ／βの４ＰＵ。

１％のショ糖、３％のマニトール、１０μｇ／ｒｎｌの
Ｇ４１８を加えた液体選抜培地に移し、暗条件で２０日
間培養した。

そして、形質転換体の選抜によって得られたユーカリの
コロニーを表−１に示すガンボーグのＢ５培地に、０．
０２　ｍｇ／　Ｉ！のＮＡＡ、０．５ｍｇ／Ｉ２の４Ｐ
Ｕ、１％のショ糖、１０μｇ／ｍＩ！のＧ４１８を加え
た液体培地２５ｍｊ’を入れた直径２５ｍｍ、長さ２０
０ｍｍの試験管に移した。そして、回転培養装置で２ｒ
ｐｍで回転しながら２７℃の温度で、３．０００〜１０
，０００ルクスの範囲の光を照射して培養した。

約３０日間隔で継代しながら回転培養を継続した結果、
移植後約１２０日で苗条原基が作比されたので、次にこ
れを苗条再生培地に移植して、２７℃で１６時間の明条
件下で培養した。

苗条再生培地（ガンボーグのＢ５培地に、０、０２　ｍ
ｇ／　Ｉ！のＮＡＡ、　０．２ｍｇ／ｊ？のＢＡ、１％
のショ糖、０．６％の寒天を添加した培地）に移植して
約３０日後に苗条が再生した。これをさらに表−２に示
す発根用の培地に移植して同様の条件で培養したところ
、発根して形質転換された植物体が再生された（第１図
）表−１プロトプラストの培養に用いた培地の組成表−２発根用培地の組成上記で得られた植物体より常法に基づいてＤＮＡを抽出
し、サザンプロット分析を行い導入した遺伝子の存在確
認した（第２図）。

第２図において、ｍｌ＜　１−２　列は、ネオマイシンフォスフオドラン
スフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ断片（図中矢印）を示し、
夫々５１］ｇ、５０ｐｇを表す。

第３−９列は形質転換ユーカリのＤＮＡを制限酵素Ｄｒ
ａｌで切断したものを示す。

第１０列は形質転換されていないユーカリのＤＮＡを制
限酵素０ｒａｌで切断したもの（コントロ−ル）を示す
。

また、β−グルクロニダーゼ遺伝子の導入については、
選抜されたコロニーの培地中に５−Ｂｒ４Ｊ：ｌ−３−
ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ　ａｃ
ｉｄを加え、コロニーが青く発色することにより、その
遺伝子の発現が確認された。

〔発明の効果〕

本発明は木本性植物由来の新規な形質転換されたプロト
プラスト、該プロトプラストを培養して得られたコロニ
ーあるいはカルス、該コロニーあるいはカルスより作出
された苗条原基、該苗条原基から再生された木本性形質
転換植物及び該木本性形質転換植物を作出する方法を提
供するもので、木本性植物の新品種の創成に極めて有効
な生成物並びに方法を提供するものである。

なお、本発明の形質転換された植物は、縦木、さし木、
取り木等の手段で増殖できることはいうまでもない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による形質転換されたユーカリ幼植物
の発芽・発根の状態を示す写真、第２図は、本発明方法
により形質転換されたユカリから抽出したＤＮＡのネオ
マイシンフォスフオドランスフェラーゼ遺伝子をプロー
ブとするサザンプロット分析を示す写真に基づいて作成
した図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプラ
ストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入して
なる形質転換されたプロトプラスト。２、木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプラ
ストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入し、
次いで草本性植物のプロトプラストと共存させて培養し
て得られた木本性植物の形質転換されたコロニーあるい
は形質転換されたカルス。３、木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプラ
ストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入し、
次いで草本性植物のプロトプラストと共存させて培養し
、木本性植物のコロニーあるいはカルスを得に後、光照
射下に回転培養して作出された木本性植物の形質転換さ
れた苗条原基。４、木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプラ
ストにエレクトロポレーシヨンにより遺伝子を導入し、
次いで草本性植物のプロトプラストと共存させて培養し
、木本性植物のコロニーあるいはカルスを得た後、光照
射下に回転培養して苗条原基を作出し、さらにこの苗条
原基から再生された木本性形質転換植物。５、木本性植物由来の苗条原基より作出したプロトプラ
ストにエレクトロポレーションにより遺伝子を導入し、
形質転換された植物体を再生することを特徴とする木本
性形質転換植物を作出する方法。