JPH02138966A - 植物の形質転換体を作出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は苗条原基集塊を細片化したもの、またはこれを
液体培地で振盪培養して得られた漬条原Ｘ集塊を細片化
したものとＡｇｒｏｂａｃｔ、ｅｒｉ、ｕｍｔｕｍｅ　
ｆａｅ　ｉ　ｅｎｓ菌とを共存培養することにより植物
の形質転換体を作出する方法に関するものである。

本発明を応用することによって形質転換の目的とする外
来遺伝子を導入しだＡｐ；ｒＯ’ｂａｅｔｅｒｊｕｍｔ
ｕｍｅｆａｃｉｃ＋ｎｓ菌と形質転換の対象とする植物
の苗条原基集塊とを共存培養して新しい性質を持った植
物を創成することが容易になる。

〔従来技術〕

これまでにＡｇｒｏｂａ、ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ
ａｃｉＯｎｓ　菌が有するＴ１　　プラスミド（腫瘍の
誘導因子）の１６染力を利用して形質転換をおへなう技
術として、植物体接種法、す・−７デイスク法、さらに
はプロトプラストとの共存培養法等が挙げらする。

まず植物体接種法は、無菌栽培した若い植物体の茎を切
断し、その切シロにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ菌を塗付することによシ植物体にＴｉ
　プラスミドを導入して、外来遺伝子を持つ細胞を植物
体に再生する技術である。

リーフディスク法は植物体の葉からベーパーバンチでリ
ーフディスクを切シ取Ｖ）　Ａｇｒｏｂａｃｔ−ｅｒｉ
ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌の培養液中につけるこ
とによシ、上記と同様に外来遺伝子を導入して、形質転
換を起こした細胞より植物体を再生する技術である。

いずれも手法は簡単であるが形質転換カルス、および茎
１葉が現れるのに時間がかかる欠点がある。

以上のように植物組織に菌を感染させるほかにプロトプ
ラストに直接菌を感染させる方法もある。すなわち葉肉
または培養して得られた細胞から作出した細胞プロトプ
ラストを培養して、分裂を開始した時期にＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ−ｃｉｅｎｓ菌を加え、
共存培養することによシ、Ｔｉプラスミドを導入する手
法である。この手法によシ多数の形質転換体が得られる
がプロトプラストの培養条件、さらに植物体の再生条件
等が植物種２品種によって異なるため難しい手法である
。例えば、木本性植物では、ポプラ、カンキツ類等２〜
３の植物に限定される。

以上の従来技術に対し、本発明は処理方法が極めて容易
であシ、処理後は苗化培地に移植すれば簡単にかつ大量
に形質転換体を得ることができる。すなわち、処理方法
が簡便で、形質転換率が極めて高い画期的な形質転換技
術を提供するに至った。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ菌を植物に感染させて、形質転換体を得る従来
の方法に比べて次の点を解決した。

１）組織に感染させて植物体を再分化する場合、カルス
を経由するため、再分化能の低い植物には殆ど応用でき
なかった。しかし、苗条原基に感染させて植物体を得る
場合には、全くその心配がなく、完全に形質転換体を分
離かつ固定化できる。

２）単細胞またはプロトプラストに感染させて植物体を
再分化する場合には、コロニーの形成、カルスの形成、
さらにはカルスからの苗化が必須のプロセスになってい
る。しかし、苗条原基に感染させる場合には、上記と同
様、全く再分化のプロセスが不要であり、形質転換を起
こした植物を直接、短期間に効率よく分離しかつ固定化
できる。

３）従来の方法では、双子葉植物にしか応用できなかっ
たＴ１プラスミド法を、苗条原基を使うことによシ単子
葉植物にも応用できる。

いずれにしても、従来技術では問題となっていた宿主域
、処理方法９時間、再分化能さらには形質転換率等の問
題点を一挙に大幅に解決する形質転換技術、を発明する
に至った。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は草本性植物あるいは木本性植物から作出した苗
条原基集塊を細片化したもの、またはこれを液体培地で
振盪培養して得られた苗条原基集塊を細片化したものと
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌
との共存培養によ＃）ＴｉプラスミドのＴ−領域（ここ
に外来、ＪＩ伝子を組換えておく）を含む形質転換した
植物を再生する方法である。

本発明に使用する植物の種類はとくに限定されるもので
はないが、主にユーカリ、アカシア。

パラゴムツキ、コーヒー等の常緑広葉樹類、ポプラ、キ
リ、コナヲ、クヌギ、ウルシ等の落葉広葉１［、マツ、
スギ、ヒノキ、モミ、トウヒ。

カラマツ等の有用針葉樹類、さらにミカン、レモン、リ
ンゴ、モモ、アボカド、キウィ、カキ。

クルミ、ブドウ等の果樹類やバラ、ツバキ、ウメ、サク
ラ等の花木類等である。さらに、ペチュニア、コスモス
、アサガオ、ダリア、テッポウユリ、ネジパナ、アプヲ
ギク、ハマギク、ノジギク、クレビス、ハブロパップス
の草木類あるいはタバコ、アサ、イネ、コムギ、トマト
。

ホウレンソウ、ダイズ、アスパラガス、エンドウ、ザラ
ダナ、シュンギク、スイカ、ソフマメ。

チシャ、ｔ−ウモロコシ、ニンジン、レタス、サトイモ
、ニンニク、等の作物類の草木性植物も含まれる。

以下、本発明に用いる邑条原括集塊の作出方法、　Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍａｆａｃｊ、ｅｎｓ菌
の培養法そして共存培養ならびに選抜培地、培養条件等
について詳しく説明する。

苗条原基集塊作出法 形質転換の対象となる植物の茎を殺菌した後に、生侵点
を含む茎頂部約１１５四を無菌的に切シ出し、これを植
物の組織培養培地、例えばガンボーグの１１３５培地あ
るいはムラシゲ・スクーグのＭＳ培地等に植物ホルモン
類、例えばナツタ１／ン酢酸（ＮＡＡ）、２．４−ジク
ロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ　）　、あるいはイン
ドール酢酸（ＩＡＡ）等のオーキシン類、およびベンジ
ルアデニン（Ｂ　Ａ、　）、ＫＴ−３０，カイネチンお
よびゼアチン等のサイトカイニン類を添加した液体培地
に植えつける。

これを２０−！ｉｎ℃の温度、’）−ｏ　ｏ　ｏ〜２　
［ＬＯ００／Ｌ’クスの照度、１〜ｆ　Ｏｒｐｍの回転
数で回転培養を行うことによ９ｍ条原基集塊（４）が得
られる。これをガンボーグのＢ５培地あるいはムラシゲ
・スクーグのＭＳ培地に２．４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）あるいは
インドール酢酸（ＪＡ、　Ａ　）等のオーキシン類およ
びベンジルアデニン（Ｔ３Ａ）、カイネチン、ＫＴ−３
０あるいはゼアチン等のサイトカイニン類さらにシヨ翁
を添加した「洗い液」と共にホモジナイザーで１０．０
００〜５０、ｏ　ｏ　ｏ　ｒｐｍの回転数で５〜２０秒
処理して０６５〜３−の大きさに細片化し、これを目の
荒いナイロンメツシュで濾過して分画し、次に洗い液で
１〜５回十分に洗浄する。

なお、細片化する方法としては、ホモジナイザーの利用
だけでなく、ピンセットでやや荒く細片化することも可
能である。

このようにして得た材料を組織培養培地である液体培地
に植付け、２０〜３０°Ｃの温度、ｓ、ｏｏｏ〜２１１
０００／１ノクスの照度で１２−１６時間の明条件、８
０−１０　Ｏｒｐｍの回転数で振盪培養を行うことによ
シ大量の醒条原基集塊（９）が得られる。この大量の苗
条原基集塊を得る方法は先に提案した（特願昭６２−２
０４２６９号）。

使用するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ菌としては、野生株および腫瘍形成能を除去し
たいわゆる非武装株を用いることが可能である。

−５０〜−８０°Ｃで保存しであるＡｇｒｏｂａｅｉｅ
−ｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　　菌を窒素源、
有機化合物。

イースト抽出物等を添加した寒天培地に植付け、増殖し
たＳｉｎｇｌｅ　ｃａ］−ｏｎｙを取り出して同じ組成
の液体培地で２４時間振盪培養したのち、集菌して、１
０６〜１ｏ’　／　ｎｔｔの濃度で、細片化した苗条原
基集塊と混合ｌ−てガンボー・グのＢ５培地、あるいは
ムラシゲ・スクーグのＭ　Ｓ培地を用い、植物ホルモン
類としては、例えばナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２．４
−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、あるいはイ
ンドール酢酸（ＩＡＡ）等のオーキシン類、およびベン
ジルアデニン（ＢＡ）、ＫＴ−３０、カイキチンおよび
ゼアチン等のサイトカイニン類を用い、２０〜５０℃の
温度、Ｄ〜１００　ｒｐｍの振盪速度で共存培養を行う
。

いわゆる静置培養（振盪速度０）の場合には寒天を含有
させることも可能である。

形質転換体選抜法 細片化した苗条原基集塊とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆδｃ１θｎｓ繭とを約４８時間、共存培養し
た後ニパンコマイシン、力ｐペニシリン、テｌ−ヲサイ
クリン、アンピシリン等の抗生物質を添加した培地に移
植する。そして、４〜３０日間培養後、野生株のＡｇｒ
ｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｅｉｅｎｓ　菌を
使用した場合ホルモンフリーのガンポーグのＢ５培地、
あるいはムラシゲ・スクーグのＭＳ培地に移植し培養す
ると、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ−ｍｅｆａ−
ｅｉｅｎｓ菌が感染して形質転換した苗条原基集塊のみ
が増殖する。

一方、非武装化され、さらにカナマイシン抵抗性などの
選抜マーカーを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ−ｉｕｍ　
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌を使用した場合、植物ホルモ
ン類としてナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２．４−ジクロ
ロフェノキシ酢酸（ｚ、４−Ｄ）６．６いはインドール
酢酸（工ＡＡ）などのオーキシン類とベンジルアデニン
（ＢＡ）、ＫＴ−３０。

カイネチンおよびゼアチンなどのサイトカイニン類を含
むガンボーグのＢ５培地あるいはムラシゲ・スクーグの
ＭＳ培地に移植して培養すると、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌が感染して形質転換
した苗条原基集塊のみが増殖する。

一方、感染していないものは増殖することが出来ず、形
は小さく色は悪くなる。そこで、この形と色を基準にし
て形質転換した苗条原基集塊の選抜を容易に行うことが
できる。

形質転換苗条原基集塊から植物体を再生する方法 このようにして増殖させた苗条原基集塊を、ａυ 回転培養によりて苗条原基集塊の作出に用いたのと同様
な苗化用の液体培地に移植して、１５〜３０℃の温度、
１，０００〜４，０００７Ｌ’クスの照度の下で静置培
養すると、多数の茎葉体を生じる。

次に、これを発根培地に１本ずつ分離、移植して発根さ
せると、完全な植物体になる。ただし、この形質転換苗
条原基には変異体と正常体が混在していることもあるの
で、この場合、通常の個体選抜をする必要がある。なお
植物体が出来るまでの期間は、静置培養開始後約３カ月
である。

以下、実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕 供試植物 ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｃｈａｒｋｏｗｉｅｎｓｉｅ
　ｘ　Ｐ、　ｃａｕｄｉｎａＯＦ−２０） 切り出してきたポプラの茎を７０％エタノ−ｙｖ　オヨ
７ｊ　７倍に希釈したアンチホルミン液で殺菌した後に
生長点を含む茎頂部（約α５ｆｉ）を無菌的に切り出し
、これを植物の組織培養培地であるガンボーグのＢＳ培
地に植物ホルモン類としてナフタレ／酢酸を（１０５■
／　ｔ　ｓベンジルアデニンをα４岬／ｌの割合で添加
し、またｐＨを５６に調整した液体培地に植えつけた。

これを２８℃の温度、２，０００〜２０．００　ＯＡ’
クスの照度、そして２　ｒｐｍの回転数で回転培養した
。

培養開始後、４０日で直径的１０ｍの大きさの緑色の苗
条原基集塊を得た。更に、３週間後これを直径５〜１０
ｍに分割して新鮮な培地に植え継ぎ、植え継いでから２
週間培養したものを１ａｍｇ前後の大きさに細片化する
ために、材料１ｆに対して、ガンボーグのＢ５培地にα
０４′ｑ／１のナフタレン酢酸、α５ｙｐｑ／ｌのベン
ジルアデニン、さらに３％のショ糖を加えてｐＨ５，６
に調整した洗い液１５−を加えて２［Ｌｏｏｏｒｐｍで
１０秒間ホモジナイズ処理した。これをナイロンメツシ
ュで濾過して磨砕液から細胞片のみを分画し、洗い液で
２回洗浄した。

洗浄した材料１ｔに対して１００−の液体培地（ガンボ
ーグのＢ５培地にナフタレン酢酸をＱ、ｏｓｑ／ｚ、ベ
ンジルアデニンを（１４Ｗ　／　Ｌ添加し、ｐＨを５．
６に調整したもの）を加え５００−のフラスコに入れＩ
　Ｅｌ、Ｏｏ　Ｏｙクスの照度で１２時間の明条件、２
７℃、１．　ＯＯｒｐｍの条件下で振盪培養した。これ
を第１図に示す。

使用したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ菌の系統は野生株のＣ５８である。この系統は
Ｋａｏ等のＭｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　、
　１８８．４２５（１９８２）に記載されてお、９．Ａ
ＴＣＣに５５９７Ｄの寄託番号で寄託されている。

一８０℃で保存しであるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　
ｔｕ−ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｃ５８菌を微生物培養用培
地であるＬ　（Ｌｅｎｎｏｘ　）　　培地（ペプトン１
ｏｔ／ｌ、イ−スト抽出物５９／ｌ、塩化ナトリウム１
０１Ｆ／ｌ、ｐＨ７，２）に接種して２８℃の温度、６
゜０００／ｌ／クスの照度において静置培養し、増殖さ
せ、ここから単一のコロニーのみを選択して、５００−
のコルベンに分□７主された５０−の同じ組成の液体培
地に１−植菌し一晩振盪培養する。

４、６０　Ｏｒｐｍで１０分間遠心し２て集菌し、２×
１０″／−の画幅濁液を、ガンボ・−グのＢ５培地にナ
フタレン酢酸０．０５　ｑ／　ｔ　ｐベンジ〜アゾ＝ｙ
ａ４ｗｙ／ｌ、５ｚ−ｘ糖５％を加え、ｐＨ５，６に調
整１〜た１００−の液体培地で増殖中の上記の細片化し
た苗条原基集塊に２−加え、２８°ｃ１振盪回数１０　
Ｏｒｐｍの条件下で４８時間培養した。

形質転換体選抜法 細片化した苗条原基集塊とＡｇｒｏｂａ、ｅｔｅｒｉｕ
、ｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌を４８時間共存培養した
あと苗条原基集塊を遠心処理して集め洗浄する。洗浄後
、抗生物質として２５ｒｙｑ／ｌのバンコマイシン、２
ｏａｔｒｑ／ｌのカルベニシリンをガンボーグのＢ５培
地にナフタレン酢酸ａｏｓ１Ｒ９／ｚ。

ベンジルアデニン０．４■／ｌおよびショ糖３％と共に
加えｐＩ（５，６に調整後再び振盪して２０日間培養す
る。

次に、形質転換体を選抜するためにホルモンのみを除い
た（ホルモンフリーの）同一培地に移植して翫０００ル
クス、温度条件は２８°ｃ１振盪回数１０　Ｏｒｐｍで
培養した。その結果形質転換苗条原板集塊のみを形と色
から容易に選抜することができる。すなわち、形質転換
を起こした醒条原基は第２図に示すように発育が旺盛で
色は緑色を示しているため、肉眼選抜は容易であった。

なお、第６図は形質転換をおこしていない苗条原基をホ
ルモンのみを除いた（ホルモンフリーの）同一培地に移
植して同様に培養して得られたものを示す。

〔実施例２〕 供試植物 ポプラ（Ｐｏ℃ｕｌｕｓ　ｅｈａｒｋｏｗｉｅｎｓｉｓ
　Ｘ　Ｐ、ｅａｕｄｊｎａＯＰ−２０） 箔条原基集塊作出法 切り出してきたポプラの茎を７０％エタノールおよび７
倍に希釈したアンチホルミン液で殺菌１７た後に生侵点
を含む茎石部（約１５　ｖｍ　）を無菌的に切り出し、
これを植物の組織培養培地であるガンボーグのＢ５培地
に植物ホルモン類としてナフタレン酢酸をｏｏｓｖｑ／
ｌ、ベンジルアデニンを０，４η／ｌの割合で添加し、
まだｐＨをｉ６に調整した液体培地に植えつけた。

これを２８℃の温度、ス０００へ−２（ＬＯＯロルクス
の照度、そして２　ｒｐｍの回転数で回転培養した。

培養開始後、４０日で直径約１０ｍの大きさの緑色の苗
条原基集塊を得た。更に、３週間後これを直径５〜１０
＋ｍに分割して新鮮な培地に植え継いでから２週間培養
したものを、ビンセットでほぐすように細片化し、ガン
ボーグのＢ５培地にナフタレン酢酸を［１０５■／１％
ンジルアデニンを０４■／　ｔ　ＦＡ加しｐＨ５，６に
調整した液体培地に浸し、１２時間の明条件、２７℃で
２４時間静置培養する。

ｍ条原基小塊とＡｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ
ｆａｅｉｅｎｓ菌との共存培養 使用１）たＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆ；ｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ菌の系統は非武装株のＬＢＡ４４０４であ
る。これはＣ１ｏｎｔｅｅｈ　Ｌａｂｏｒｏｔａｒｉｅ
ｓ、Ｉｎｅ、ＵＳＡから市販されているＧＵＳ　ｆｌ；
、ｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ、　ｓｙｓＪｅｍ　　に含まれ
ている系統である。いわゆるバイナリ−ベクターシステ
ムで、実際に使用したＴ、　Ｂ　Ａ　４４０４にはｖｉ
ｒ領域のみを含むＴ１　プラスミドとカナマイシン抵抗
性遺伝子が座上するプラスミドｐＴ３１１０１が含まれ
ている。従って、カナマイシン添加の培地によって、形
質転換苗条原基の選択が可能となる。

一８０℃で保存しであるＡｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　
ｔｕ−ｍｅｆａｅｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４菌を微生物
培養用培地であるＬ（Ｌｅｎｎｏｘ）培地（ペプトン１
ｏｔ／ｌ、イースト抽出物ｓｒ／ｌ、塩化ナトリウム１
０２／ｌ、ｐＨ７，２）に接種して２８°Ｃの温度、５
．０００〜クスの照度において静置培養１７、増殖させ
、ここから単一のコロニーのみを選択して５００−のコ
ルベンに分注された５０−の同じ組成の液体培地に１４
植菌し一晩振盪培養する。

４、６００　ｒｐｍで１０分間遠心して集菌し、２Ｘ１
０８／−の菌懸濁液に上記のようにして細片化された苗
条原基集塊を３０分浸す。次に、過剰のＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０
４菌を濾紙で吸いとったのち、ガンボーズＢ５培地にす
７タＬ／ン酢ｍｔ　ｎ、　［１５ｍｙ／ｌ、ベンジルア
デニンを０４■／１．ショ糖３％を加え、ｐＨ５，６に
調整した寒天培地（０，４％）に埋め込んで共存培養し
た。

ピンセットにて細片化した苗条原基集塊とＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４
０４菌とを４８時間共存培養したあと苗条原基集塊をピ
ンセットで集め洗浄する。洗浄後、抗生物質として５０
０ｑ／ｌのカルベニシリンと５ｏＷＩＩ／ｌのカナマイ
シンを、さらにホルモンとして＋１０５１ｑ／１のナフ
タレン酢酸、ｏ、ａｑ／ｌのベンジルアデニンおよびシ
ョ糖を１％加えたＢ５培地（ｐＨ５，６）に移植し、４
日間回転培養する。

次に形質転換体を選抜するためにＢ５培地にｏ、ａ２ｍ
ｉ／ｌのナフタレン酢酸、αａ２ｔｒｑ／ｌのベンジル
アデニン、３％のショ糖、α６％の寒天、５００η／１
のカルベニシリンおよび５０岬／ｌのカナマイシンを添
加した苗条再生培地に移植し、これを２８°Ｃで１６時
間の日長条件で培養した。その結果、苗条再生培地に移
植して約２０日後形質転換苗条原基集塊のみから苗条が
再生した。これを第４図に示す。

〔実施例３〕 供試植物 りＶビス（Ｃｒｅｐｉｓ　ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ　）苗
条原基集塊作出法 田中隆荘（１９８３）、（ｒ種苗産業と育種新技術ＪＰ
、１７１−１９７、シーエムシー刊）に準拠して苗条原
基集塊を作出した。使用した培地はガンボーグのＢ５培
地に０．５η／ｌのす７１’Ｖン酢酸、［１Ｌ５ｑ／ｌ
のベンジルアデニン、さらに３％のショ糖を加えてｐＨ
を５．６に調整したものである。苗条原基集塊は２２°
Ｃの温度、２．０００〜１５，０００／ｌ／クスの照度
、そして２ｒｐｍの回転数で回転培養した。

供試したＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ菌は実施例２と同様である。

一８０°Ｃで保存しであるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｔｕ−ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４　菌を微
生物培養用培地であるＬ（Ｌｅｎｎｏｘ）培地（ペプト
ン１０ｆ／１１イーヌＦ抽出物５１／Ｌ、塩化ナトリウ
ム１０ｆ／ｌ、ｐＨ７，２）に接種して２８°Ｃの温度
、４０００ルクスの照度において静置培養し、増殖させ
、ここから単一のコロニーのみを選択して５０〇−のコ
ルベンに分注された５０−の同じ組成の液体培地に１−
植菌し一晩振盪培養する。４，６００　ｒｐｍで１０分
間遠心して集菌し、２　Ｘ　１０”／ｒＮｔの菌懸濁液
に上記のようにして細片化された苗条原基集塊を３０分
浸す。次に、過剰のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４０４菌を濾紙で吸いと
ったのち、ガンボーズＢ５培地にナフタレン酢酸ｋ　ｎ
、　ｓ　ｙｑ／ｌ、ベンジルアデニンをαｓ　ＭＩ／　
ｔ　、ショ糖３％をくわえ、ｐ’Ｈ５，６に調整した寒
天培地（Ｑ、４％）に埋め込み共存培養した。

形質転換選抜法 ピンセットにて細片化した苗条原基集塊とＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＬＢＡ４４
０４菌とを４８時間共存培養したあと苗条原基集塊をピ
ンセットで集め洗浄する。洗浄後、抗生物質として５０
ａｖｙ／ｌの力μべ＝シリンとの５ｏ１ｑ／ｚカナマイ
シンを、さらにホルモンとしてα５ｙａｙ／ｌのナフタ
レン酢酸、ａ、５■／ｌのベンジルアデニンおよびショ
糖を３％加えたＢ５培地（ｐＨ５，６）に移植し、４日
間回転培養する。

次に形質転換体を選抜するためにＭＳ培地にａ、ｏ２ｗ
ｙ／ｌのペンシルアデニン、５％のショ糖、１６％の寒
天、５００　”ＩＦ７　ｔのカルベニシリンおよび５０
岬／ｌのカナマイシンを添加した苗条再生培地に移植し
、これを２８°Ｃで１６時間の日長条件で培養した。そ
の結果、苗条再生培地に移植して約１４日後形質転換苗
条原基集塊のみから苗条が再生した。これを第５図に示
す。

〔発明の効果〕

以上説明したように、これまで植物細胞中に遺伝子を導
入して形質転換する場合、材料の供給又は手法の適用が
困難で、さらに形質転換率が極めて低いなど問題点が多
かったが細片化した苗条原基集塊とＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ菌との共存培養によシ、形質転換体を容易に作
出することが可能になった。

これは植物の遺伝子組換え法としては全く新規かつ独創
的なものであシ、極めて利用価値の高い方法を提供した
。

【図面の簡単な説明】

第１図は共存培養に用いたポプラの苗条原基集塊を、第
２図はホルモンフリー培地で増殖した形質転換苗条原基
集塊を、第５図はホルモンフリー培地で増殖した形質転
換していない直条原基集塊を、第４図はカナマイシン添
加培地で選抜された苗条原基集塊からの苗条と、第５図
はカナマイシン添加培地で選抜された苗条原基集塊から
再生した苗条を示す写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、苗条原基集塊を細片化したもの、またはこれを液体
   培地で振盪培養して得られた苗条原基集塊を細片化した
   ものとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅ
   ｎｓ菌を液体培地中で共存培養させることを特徴とする
   植物の形質転換体を作出する方法。 ２、苗条原基集塊とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ
   ｅｆａｃｉ−ｅｎｓ菌を２０〜５０℃の範囲内の温度、
   ０〜１００ｒｐｍの範囲内の振盪数で２４〜４８時間振
   盪培養する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、共存培養の液体培地として、ガンボーグのＢ５培地
   又はムラシゲ・スクーグのＭＳ培地を用いる特許請求の
   範囲第１号記載の方法。 ４、植物ホルモンとしてオーキシン類又はサイトカイニ
   ン類を含む液体培地を用いる特許請求の範囲第１項記載
   の方法。