JPH04278084A - 細胞融合によって得られる倍数性細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞融合によって得ら
れた倍数性プロトプラストを培養する方法に関し、さら
に詳しくは、これまで行われている通常のプロトプラス
トの培養法では植物体に再生することが困難な、あるい
は不可能な種類の木本性植物であっても、その細胞融合
によって得られた倍数性細胞から苗条原基集塊を誘導す
ることを可能にし、植物の新品種創成に極めて有効な方
法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】木本性植物の細胞融合については、その
基礎となるプロトプラストの培養が困難である場合が多
く、カンキツ類（小林、大河原　　１９９０，植物細胞
工学，２巻：４５〜４９）以外その報告例はほとんどな
い。本発明者らはすでにユーカリをはじめとする木本性
植物のプロトプラストの培養方法について提案した（特
願昭６３−２８６８５０号）。その方法によれば、ユー
カリ等の木本性植物のプロトプラストから植物体を再生
させることが可能となった。しかし、細胞融合によって
作出される倍数性細胞の培養法については全く知られて
いなかった。そこで細胞融合によって体細胞雑種の作出
の基礎となる倍数性細胞の培養法について、鋭意検討を
行った結果、本発明を完成するに至った。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は従来技術では
不可能であった細胞融合によって作出された倍数性細胞
の培養方法を提供するものである。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本発明は、木本性植物
のプロトプラストの細胞融合によって得られる倍数性細
胞を分裂・増殖活性の旺盛な草本性植物のプロトプラス
トとの共存下に培養し、増殖させ、さらに得られた倍数
性のコロニーを回転培養に移し、苗条原基集塊の誘導を
行うことを特徴とする倍数性細胞の培養方法である。以
下、本発明に用いる草本性植物のカルスおよび木本性植
物の苗条原基集塊の作出方法、プロトプラストの単離、
調整方法、細胞融合法そしてプロトプラストの培養培地
ならびに培養条件等について詳しく説明する。

【０００５】草本性植物のカルスの作出方法草本性植物
、例えばケナフの種子をエタノールの７０％水溶液およ
び１０倍に希釈したアンチホルミン液で殺菌した後、無
菌的に植物の基本培地である例えばガンボーグ（　Ｇａ
ｍｂｏｒｇ　）のＢ５培地、あるいはムラシゲ・スクー
グ（　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆　Ｓｋｏｏｇ　）のＭＳ培
地等に寒天，ゲランガムなどの支持体材を加えた培地上
にそれぞれ置床し、２０〜３０℃に調節した室内で無菌
的に発芽生育させる。

【０００６】生長した葉、茎、根，胚軸等の組織の一部
を切り取ってＢ５培地、ＭＳ培地に植物ホルモン類、例
えばナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸（２，４−Ｄ）あるいはインドール酢酸（Ｉ
ＡＡ）等のオーキシン類、およびベンジルアデニン（Ｂ
Ａ）、カイネチン、１−（２−クロロ−４−ピリジル）
−３−フェニルウレア（４ＰＵ）あるいはゼアチン等の
サイトカイニン類を添加した寒天培地に置床する。この
際どちらか一方の種類の植物ホルモン類のみを添加した
培地を使用することも可能である。これを２０〜３０℃
の温度、２，０００〜５，０００ルクスの照度で約３０
〜９０日間培養を行ってカルスを得る。

【０００７】木本性植物の苗条原基集塊の作出方法草本
性植物の場合と同様に、あるいは、樹種によって殺菌方
法を変えて殺菌し、寒天培地上で発芽させる。次に、生
長した苗条の２〜３個の微小な葉原基を含む茎頂部を無
菌的に実体顕微鏡下でピンセットとメスを用いて摘出す
る。摘出した茎頂部を２，０００〜２０，０００ルクス
の連続照明下で０．５〜１０ｒｐｍの低速で回転する竪
型回転培養装置を使用して培養する。培地としては、Ｂ
５培地等に植物ホルモン類、例えばＮＡＡ、２，４−Ｄ
あるいはＩＡＡ等のオーキシン類およびＢＡ、カイネチ
ン、４ＰＵあるいはゼアチン等のサイトカイニン類を添
加した液体培地を用いて、２０〜３０℃で３０〜６０日
間培養することによって苗条原基集塊を得る。

【０００８】上記説明のとおり、苗条原基は主に茎頂部
から誘導されるが、ほかに、茎、葉、胚軸、未熟あるい
は成熟した胚などから誘導されたカルスおよびこれらの
カルスから誘導された体細胞胚、さらには種子の胚から
も誘導することが可能である。なお、木本性植物として
は、ユーカリ、マングローブ、アカシア、パラゴムノキ
、コーヒー等の常緑広葉樹類、ポプラ、キリ、コナラ、
クヌギ、ウルシ等の落葉広葉樹類、マツ、スギ、ヒノキ
、モミ、トウヒ、カラマツ等の有用針葉樹類、さらにミ
カン、ブドウ、イチジク、アーモンド、マンゴウ等の果
樹類や、バラ、ウメ、ツバキ、サクラ等の花木類等を用
いうる。

【０００９】プロトプラストの単離・調整法上記の方法
で得たカルスおよび苗条原基集塊を材料に、０．０５〜
０．１％の濃度のペクトリアーゼＹ−２３、１％の濃度
のセルラーゼ・オノズカＲＳおよび１３％マニトールを
含む酵素液を加えて、２０〜３０℃の温度で６〜２４時
間、２０〜３０ｒｐｍの振盪速度で振盪処理してそれぞ
れの植物のプロトプラストを単離する。次に、酵素液を
除いてプロトプラストを洗浄したのち、プロトプラスト
の濃度を調整する。

【００１０】木本性植物のプロトプラストの融合方法単
離、調整した木本性植物のプロトプラストを、一般的に
用いられている細胞融合法、例えばポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）法、電気刺激法などにより融合処理を行
う。これによって、倍数性プロトプラストが得られる。

【００１１】プロトプラストの培養方法融合・調整して
得られた目的とする木本性植物のプロトプラスト（倍数
性細胞）と、これと共存して培養する草本性植物のプロ
トプラストをそれぞれ１０４　ないし１０５　コ／ｍｌ
の濃度に調整する。次に、両プロトプラストを１：３〜
３：１の割合で混合して、例えばガンボーグのＢ５培地
、ムラシゲ・スクーグのＭＳ培地等をプロトプラストの
性質に応じて選択し、植物ホルモン類、例えばＮＡＡ、
２，４−ＤあるいはＩＡＡ等のオーキシン類およびＢＡ
、カイネチン、４ＰＵあるいはゼアチン等のサイトカイ
ニン類を添加した液体培地あるいは培地固化剤であるゲ
ランガムを添加した培地で培養する。この際どちらか一
方の種類の植物ホルモン類のみを添加した培地を使用す
ることも可能である。培養の初期には暗所で培養し、プ
ロトプラストの分裂、生育に伴って徐々に明るくするの
が好適である。また、培養期間中の温度としては、２５
℃ないし２８℃の間の温度が好ましい。

【００１２】

【実施例】次に、実施例によって、本発明をさらに具体
的に説明する。 実施例−１ 供試植物 倍数性細胞の作出を目的とする木本性植物としてユーカ
リ（　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓａｌｉｇｎａ、以下Ｅ
．ｓａｌｉｇｎａ　と記す）を、またこれと共存培養す
る草本性植物としてケナフ（　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｃａ
ｎｎａｂｉｎｕｓ　）を用いた。 Ｅ．ｓａｌｉｇｎａ　の苗条原基集塊の作出方法Ｅ．ｓ
ａｌｉｇｎａ　の種子を１０倍に希釈したアンチホルミ
ンで１時間殺菌し、さらに、無菌的に７０％の濃度のエ
タノールで１５秒間および５倍に希釈したアンチホルミ
ンに２０分間浸漬して殺菌後、滅菌水で３回洗浄した。 次に、無菌的に表１に示すガンボーグＢ５培地に３％の
ショ糖および０．６％の寒天を含む培地上に植え付けた
。

【００１３】培養は、２８℃の温度、４，０００ルクス
の照度、１６時間の明条件下で行った。植え付け後約２
０日間生育させた幼植物から、０．１％ポリビニルピロ
リドン（ＰＶＰ）を加えた液中で約０．５ｍｍの大きさ
の２〜３個の微小な葉原基を含む茎頂部を摘出する。こ
れをＢ５培地に植物ホルモンとして０〜０．０５ｍｇ／
ｌのＮＡＡ、０．２〜０．５ｍｇ／ｌの４ＰＵおよびシ
ョ糖３％を添加し、ｐＨ５．６に調整した液体培地に入
れ竪型回転培養装置で培養する。培養条件としては、２
８℃の温度、最高照度１５，０００ルクス、２ｒｐｍの
回転速度を用いた。約４カ月で苗条原基集塊が誘導され
る。これをプロトプラストの単離および細胞融合の材料
とした。なお、この苗条原基集塊は、新鮮な培地に継代
をすることにより、維持することができる。

【００１４】

【表１】

【００１５】ケナフ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｃａｎｎａｂ
ｉｎｕｓ）のカルスの誘導 ケナフの種子をエタノール７０％および１０倍に希釈し
たアンチホルミン液で殺菌した後、無菌的に植物の組織
培養培地であるガンボーグのＢ５培地にショ糖３％を加
えた寒天培地上で発芽、生育させた。これから茎頂を含
む茎を長さ約１ｃｍに切断し、これをＢ５培地に植物ホ
ルモンとして２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄと０．０１ｍｇ／
ｌのＢＡを添加した寒天培地上に置床した。これを２８
℃の温度、３，０００ルクスの照度で培養した。培養開
始後、約４０日で黄白色のカルスを得た。これをプロト
プラストの単離・調整用の材料とした。

【００１６】プロトプラストの単離・調整上記の方法で
得られたＥ．ｓａｌｉｇｎａ　の苗条原基集塊約１ｇに
対して２０ｍｌの酵素液（１％セルラーゼオノズカＲＳ
、０．０５％ペクトリアーゼＹ−２３、１％ＰＶＰ、１
３％マニトール、ｐＨ５．６）を加えて２８℃の温度、
振盪回数３０ｒｐｍで１６時間の酵素処理を行ってプロ
トプラストを単離した。一方、ケナフのカルスについて
も同様にしてプロトプラストを単離した。

【００１７】得られたＥ．ｓａｌｉｇｎａ　のプロトプ
ラストの懸濁液をナイロンメッシュ（２５０メッシュ）
でろ過して未消化の細胞塊等を除き、さらに遠心分離処
理して酵素液とプロトプラストを分離し、１３％マニト
ールで２回洗浄した後、１０６　コ／ｍｌのプロトプラ
ストの濃度に調整し融合に供試した。また、ケナフのプ
ロトプラストは５×１０４　コ／ｍｌの濃度に調整して
、共存培養に供試した。

【００１８】プロトプラストの融合と培養方法上記の方
法より調整したＥ．ｓａｌｉｇｎａ　のプロトプラスト
を、分子量１，５４０〜６，０００の４０％ポリエチレ
ングリコール液（４０％ＰＥＧ，６０ｍＭ　　Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸，６０ｍＭ塩化カルシウム）で融合処理を行う。そ
の後、０．５Ｍマニトール、５０ｍＭ　　ＣａＣｌ２　
液（洗い液）でプロトプラストを洗浄することにより細
胞融合したプロトプラストを得た。

【００１９】次に、融合したＥ．ｓａｌｉｇｎａ　のプ
ロトプラストを５×１０４　コ／ｍｌの濃度に調整し、
これにケナフのプロトプラストを３：１（ユーカリ３：
ケナフ１）の割合で混合する。これを表１に示したガン
ボーグのＢ５培地にＮＡＡ５ｍｇ／ｌ、ＢＡ０．５ｍｇ
／ｌ、ショ糖１％、マニトール９％およびＧｅｌｒｉｔ
ｅ　０．０５％を含む培地２ｍｌに懸濁して直径６ｃｍ
のシャーレにプレートした。 プレートしたプロトプラストを最初は暗条件で培養し、
プロトプラストの分裂に合わせてマニトール濃度を培養
開始後４０日で６％、６０日で３％、さらに９０日目に
０％の順に下げた。温度は２８℃で培養した。

【００２０】培養後約４０日目から明条件として、６０
日目からは、表１に示すガンボーグのＢ５培地にＮＡＡ
を０．０２ｍｇ／ｌ、４ＰＵを０．２ｍｇ／ｌ、ショ糖
１％を加えたものに寒天を０．６％加えて固めたコロニ
ー増殖用培地に、赤色化したＥ．ｓａｌｉｇｎａ　のコ
ロニーのみを移植して増殖させた。そして、コロニーが
約１５ｍｍの大きさに増殖した時に、次に示す方法で染
色体数を調査して倍数性コロニーを選抜した。

【００２１】倍数性細胞の選抜 （１）融合して得られたコロニーを前処理として４℃の
温度に２４時間置いた。 （２）つぎに、細胞を固定するために、７０％エタノー
ル：酢酸（３：１）液に浸漬した。 （３）直径１〜１．５ｍｍの大きさの試料を取り、スラ
イドガラスの上で５回純水で洗浄して固定液を除去した
。 （４）６０℃のＩＮ　　ＨＣｌを加え１０分間加水分解
した。 （５）純水で５回洗浄し、その後ろ紙で水分を十分に除
去した。 （６）シッフ染色液（１０％修正石炭酸フクシン液；　
Ｇａｍｂｏｒｇ＆Ｗｅｔｔｅｒ　１９７５，Ｐｌａｎｔ
　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　
Ｐ６０−６１）をコロニーに滴下して、乾燥を防ぐため
に加湿チャンバーに入れて２０分間染色する。次に、カ
バーガラスをのせ横方向へ動かさない様に親指で細胞を
押しつぶす。 （７）顕微鏡で染色体数を調査して倍数性コロニーを選
抜した。なお、ユーカリの染色体数は２ｎ＝２２である
。

【００２２】倍数性細胞からの苗条原基集塊の作出方法
上記の方法により倍数性が確認されたコロニーを、無菌
的にＢ５培地に植物ホルモンとして０．０２ｍｇ／１の
ＮＡＡ，０．５ｍｇ／１の４ＰＵおよび１％のショ糖，
３％のマニトール（培養後約１ケ月間のみ添加、その後
は０％）を添加し、ｐＨを５．８に調整した液体培地に
入れ竪型回転培養装置で培養した。培養条件としては２
８℃の温度、最高照明度１５，０００ルクス、２ｒｐｍ
の回転速度を用いた。約４ケ月で苗条原基集塊が誘導さ
れた。 なお、この苗条原基集塊は新鮮な培地に継代することに
より、維持、増殖が可能である。

【００２３】実施例−２ 供試植物 倍数性細胞の作出を目的とする木本性植物としてＥｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ　ｓａｌｉｇｎａおよびＥｕｃａｌｙｐ
ｔｕｓ　ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓの２種のユーカリ
を、またこれと共存培養する草本性植物としてケナフを
用いた。実施例−１と同様の方法によりプロトプラスト
を単離・融合することにより倍数性細胞を得た。さらに
、得られた倍数性細胞を回転培養装置で約４ケ月回転培
養することにより苗条原基集塊を得た。

【００２４】実施例−３ 供試植物 細胞融合して、倍数性および異数性細胞の作出を目的と
する木本性植物としてＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓａｌｉ
ｇｎａおよび　　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｅｇｌｕｐ
ｔａ　の２種のユーカリを、またこれと共存培養する草
本性植物としてケナフを用いた。実施例−１と同様の方
法によりプロトプラストを単離・融合することにより倍
数性細胞を得た。さらに、得られた倍数性細胞を回転培
養装置で約４ケ月回転培養することにより苗条原基集塊
を得た。

【００２５】実施例−４ 供試植物 細胞融合して、倍数性細胞の作出を目的とする木本性植
物としてＥｕｃａｌｙｐｔｕｓｓａｌｉｇｎａ　および
　Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓの２種のユー
カリを、またこれと共存培養する草本性植物としてケナ
フを用いた。実施例−１と同様の方法によりプロトプラ
ストを単離・融合することにより倍数性細胞を得た。さ
らに、得られた倍数性細胞を回転培養装置で約４ケ月回
転培養することにより苗条原基集塊を得た。

【００２６】

【発明の効果】以上説明したようにこれまでは植物、特
にユーカリなどの木本性植物の組織から単離・調整した
プロトプラストの細胞融合によって得られた倍数性細胞
を培養することは困難であった。しかし、細胞融合後、
分裂活性の高い草本性植物のプロトプラスト、あるいは
植物体再生をする能力のある草本性植物のプロトプラス
トと混合して培養することによって、容易に倍数性細胞
の培養・増殖が可能となり、植物の新品種創成に極めて
有力な方法を提供する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　木本性植物のプロトプラストの細胞融
   合によって得られる倍数性細胞を、分裂・増殖の旺盛な
   草本性植物のプロトプラストとの共存培養下で培養し、
   増殖させ、さらに得られた倍数性のコロニーを回転培養
   に移し、苗条原基集塊の誘導を行うことを特徴とする倍
   数性細胞の培養方法。