JP2016063785A - 植物配偶子の電気融合による同質および異質倍数性植物の作出 - Google Patents
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Abstract
【課題】植物から採取した卵細胞と精細胞を人工的に融合させて、倍数体の植物細胞及び交雑植物を効率良く製造する方法の提供。
【解決手段】（ａ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、（ｂ）卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される１以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、を含む、倍数体の植物細胞の製造方法。当該方法により作製した倍数体の植物細胞を分化させる工程を含む、植物の倍数体を製造する方法。前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞が前記精細胞の由来する種と同種由来であるか、工程（ａ）において融合させる精細胞と卵細胞は同一の種由来であり、工程（ｂ）において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞の１以上が前記精細胞の由来する種とは異なる種由来である方法。
【選択図】なし
【解決手段】（ａ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、（ｂ）卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される１以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、を含む、倍数体の植物細胞の製造方法。当該方法により作製した倍数体の植物細胞を分化させる工程を含む、植物の倍数体を製造する方法。前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞が前記精細胞の由来する種と同種由来であるか、工程（ａ）において融合させる精細胞と卵細胞は同一の種由来であり、工程（ｂ）において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞の１以上が前記精細胞の由来する種とは異なる種由来である方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、倍数体の植物細胞の製造方法、植物の倍数体を製造する方法及び倍数体の植物細胞に関する。
農業や園芸の市場では、より大きな果実のなる植物体や大きな花が咲く植物体、及び、これまでにない性質を有する交雑植物のニーズがある。そのような形質の植物体は、例えば、倍数性を高める方法や、種間交雑で得られることが知られている。
倍数体は、種子、芽生え及び茎頂などに、細胞分裂時における核の分離を阻害する試薬であるコルヒチンで処理することにより作出できることが知られている。しかし、コルヒチンで処理する手法は倍数体の作出効率が悪く、さらに、高次の倍数体を得ることは非常に困難である。このため、作出効率の良い倍数体の作出方法が求められている。また、植物には異種間での受精を起こりにくくする機構が存在するため、交雑植物の作出は困難であり、効率の良い種間交雑技術が望まれている。
近年、植物から採取した精細胞と卵細胞を人工的に融合させる人工受精が試みられている。非特許文献１には、トウモロコシの卵細胞及び精細胞を電気融合して受精細胞を作出し、それを植物体にまで培養する方法が記載されている。また、非特許文献２には、イネの雌雄配偶子の単離方法が記載されており、非特許文献３及び非特許文献４には、イネの雌雄配偶子の電気融合により、受精卵を作出し、それを植物体にまで培養する方法が記載されている。このような人工的な細胞の融合技術は、望ましい形質を有する植物体の作出技術への応用が期待されている。
Kranz E. and Lorz H. (1993) In vitro fertilization with isolated, single gametes results in zygotic embryogenesis and fertile maize plants. Plant Cell 5:739-746.
Uchiumi T., Komatsu S., Koshiba T. and Okamoto T. (2006) Isolation of gametes and central cells from Oryza sativa L. Sex. Plant Reprod. 19:37-45.
Uchiumi T.,Uemura I. and Okamoto T. (2007) Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.) Planta 226:581-589.
Okamoto T. (2011) In vitro fertilization with rice gametes: production of zygotes and zygote and embryo culture. Methods Mol. Biol. 710:17-27.
本発明は、植物から採取した卵細胞と精細胞を人工的に融合させて、倍数体の植物細胞及び交雑植物を効率良く製造する方法を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するために卵細胞と精細胞の融合方法について鋭意研究を行った。鋭意検討の結果、卵細胞と精細胞を融合して受精細胞を作出し、この受精細胞に卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞を融合させることによって、倍数体及び交雑植物を効率よく作出可能なことを見出した。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］倍数体の植物細胞の製造方法であって、
（ａ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
（ｂ）卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される１以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、を含む製造方法。
（ａ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
（ｂ）卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される１以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、を含む製造方法。
［２］工程（ａ）又は工程（ｂ）の前に、２つの卵細胞を融合させて１つの融合細胞を作製する工程（α）をさらに有し、
工程（ｂ）では、工程（α）で作製した融合細胞の１つ以上を前記受精細胞に順次融合させる、［１］に記載の方法。
工程（ｂ）では、工程（α）で作製した融合細胞の１つ以上を前記受精細胞に順次融合させる、［１］に記載の方法。
［３］工程（ａ）において融合させる精細胞と卵細胞は同一の種由来であり、
工程（ｂ）において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞が前記精細胞の由来する種と同種由来である、［１］又は［２］に記載の方法。
工程（ｂ）において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞が前記精細胞の由来する種と同種由来である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］工程（ａ）において融合させる精細胞と卵細胞は同一の種由来であり、
工程（ｂ）において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞の１以上が前記精細胞の由来する種とは異なる種由来である、［１］又は［２］に記載の方法。
工程（ｂ）において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞の１以上が前記精細胞の由来する種とは異なる種由来である、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］倍数体の植物細胞の製造方法であって、
（ａ）１つの卵細胞にｘ個の卵細胞を融合させて１つの融合細胞を作製する工程と、
（ｂ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
（ｃ）ｙ個の卵細胞を、工程（ｂ）で作製した受精細胞に融合させる工程（ただし、ｙは、少なくとも１以上であって、（ｘ−５）〜（ｘ＋５））と、
（ｄ）工程（ａ）で作製した前記融合細胞をさらに、工程（ｃ）で得た卵細胞を融合させた受精細胞に融合させる工程と、を含む製造方法。
（ａ）１つの卵細胞にｘ個の卵細胞を融合させて１つの融合細胞を作製する工程と、
（ｂ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
（ｃ）ｙ個の卵細胞を、工程（ｂ）で作製した受精細胞に融合させる工程（ただし、ｙは、少なくとも１以上であって、（ｘ−５）〜（ｘ＋５））と、
（ｄ）工程（ａ）で作製した前記融合細胞をさらに、工程（ｃ）で得た卵細胞を融合させた受精細胞に融合させる工程と、を含む製造方法。
［６］細胞の融合を電気融合により行う、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の製造方法。
［７］精細胞と卵細胞とを融合させる際の直流電圧は１２〜１５ｋＶであり、そして、卵細胞同士を融合させる際の直流電圧は、精細胞と卵細胞とを融合させる際の直流電圧の０．７〜０．８倍である、［６］に記載の製造方法。
［８］精細胞と卵細胞を電気融合する際の電極間距離は１００〜２００μｍであり、そして、卵細胞と卵細胞を電気融合する際の電極間距離は、精細胞と卵細胞とを融合させる際の電極間距離の３〜５倍である、［６］又は［７］に記載の製造方法。
［９］卵細胞と卵細胞を電気融合する際の浸透圧は、３７０〜５００mosmol/kg H2Oである、［６］〜［８］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１０］精細胞及び卵細胞が単子葉植物由来である、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の製造方法。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を分化させる工程を含む、分化した植物の倍数体を製造する方法。
［１２］［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の倍数体の植物細胞の製造方法により製造した、倍数体の植物細胞。
本発明は、受精細胞に卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞を融合させることによって、倍数体の植物細胞及び交雑植物を効率良く製造することができる。
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
＜倍数体の植物細胞の製造方法＞
第一の態様において本発明は、（ａ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、（ｂ）卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される１以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、を含む倍数体の植物細胞の製造方法を提供する。
第一の態様において本発明は、（ａ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、（ｂ）卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される１以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、を含む倍数体の植物細胞の製造方法を提供する。
本明細書において「倍数体」とは、１細胞内に３組以上のゲノムを有する個体をいう。ゲノムとは、それぞれの生物の生活機能の調和を保つ上に欠くことのできない染色体の１組をいう。１つのゲノムをＡで表すと二倍性の生物の体細胞と生殖細胞のゲノム構成はそれぞれＡＡとＡになる。ゲノムをｎ組有する場合には、ｎ倍体と表記する（ｎは整数）。すなわち、本明細書において、「倍数体」とは三倍体以上の植物細胞又は当該細胞を有する植物を意味する。
倍数体には、同質倍数体と異質倍数体があり、同質倍数体は細胞中のすべてのゲノムが同一の種から由来している場合をいい、異質倍数体は細胞中のゲノムが２以上の種から由来している場合を言う。
本明細書において「精細胞」とは、雄ずいの葯の中において、花粉母細胞の減数分裂により形成される雄性配偶子を意味する。精細胞の単離方法は限定されないが、例えば、適切な浸透圧の溶液に葯から採取した花粉を浸すと、数分後には、花粉から精細胞を含む花粉内容物が溶液中に放出されるので、顕微鏡下においてガラスキャピラリーを用いて精細胞を単離することができる。
本明細書において「卵細胞」とは、雌ずいの中において、胚嚢母細胞の減数分裂により形成される雌性配偶子を意味する。卵細胞の単離方法は限定されないが、例えば、適切な浸透圧の溶液中において子房を切断し、その切断面から出てきた卵細胞を顕微鏡下においてガラスキャピラリーを用いて単離することができる。
本明細書において「受精細胞」とは、精細胞と卵細胞とが融合した細胞を意味する。
本明細書において「細胞融合」「細胞を融合させる」とは、同種あるいは異種の２個以上の細胞の細胞質を融合させることをいい、本明細書において「融合細胞」とは、同種あるいは異種の２個以上の細胞の細胞質を融合させることによって形成された細胞を意味する。細胞を融合する方法は特に限定されないが、電気融合により行うのが好ましい。
電気融合により細胞融合を行う場合、電圧、電極間距離等の条件は、細胞の大きさ等に応じて決めればよい。
例えば、精細胞と卵細胞とを融合させる際の直流電圧は、下限を１０ｋＶ以上にすることが好ましく、１１ｋＶ以上にすることがより好ましく、１２ｋＶ以上にすることがさらに好ましい。また、上限を１７ｋＶ以下にすることが好ましく、１６ｋＶ以下にすることがより好ましく、１５ｋＶ以下にすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
卵細胞同士を融合させる際の直流電圧は、下限を、精細胞と卵細胞とを融合させる際の直流電圧の０．５倍以上にすることが好ましく、０．６倍以上にすることがより好ましく、０．７倍以上にすることがさらに好ましい。また、上限を０．９５倍以下にすることが好ましく、０．９倍以下にすることがより好ましく、０．８倍以下にすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。また、卵細胞同士を融合させる際の直流電圧は、下限を６ｋＶ以上にすることが好ましく、７ｋＶ以上にすることがより好ましく、８ｋＶ以上にすることがさらに好ましい。また、上限を、１２ｋＶ以下にすることが好ましく、１１ｋＶ以下にすることがより好ましく、１０ｋＶ以下にすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
受精細胞と卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞とを融合させる際の直流電圧は、下限を６ｋＶ以上にすることが好ましく、７ｋＶ以上にすることがより好ましく、８ｋＶ以上にすることがさらに好ましい。また、上限を１２ｋＶ以下にすることが好ましく、１１ｋＶ以下にすることがより好ましく、１０ｋＶ以下にすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
精細胞又は卵細胞と、卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞とを電気融合して１つの融合細胞を作製する際、電極間距離は、下限を、融合させる細胞の直径の和の２倍以上にすることが好ましく、２．５倍以上にすることがより好ましく、３倍以上にすることがさらに好ましい。また、上限を６倍以下にすることが好ましく、５倍以下にすることがより好ましく、４倍以下にすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。細胞の直径を測定する方法としては、顕微鏡に装着した測微接眼レンズを用いて直径を測定する方法や、顕微鏡で撮影した画像をコンピュータに取り込み、画像解析ソフトウェアで測定する方法がある。
精細胞と卵細胞を電気融合する際に電極間距離は、下限を８０μｍ以上とすることが好ましく、９０μｍ以上とすることがより好ましく、１００μｍ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を２４０μｍ以下とすることが好ましく、２２０μｍ以下とすることがより好ましく、２００μｍ以下とすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
２つの卵細胞を電気融合して１つの融合細胞を作製する際に電極間距離は、下限を、精細胞と卵細胞とを融合させる際に使用する電極間距離の２倍以上にすることが好ましく、２．５倍以上にすることがより好ましく、３倍以上にすることがさらに好ましい。また、上限を７倍以下にすることが好ましく、６倍以下にすることがより好ましく、５倍以下にすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。また、卵細胞と卵細胞を電気融合する際の電極間距離は、下限を２００μｍ以上とすることが好ましく、２５０μｍ以上とすることがより好ましく、３００μｍ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を７００μｍ以下とすることが好ましく、６００μｍ以下とすることがより好ましく、５００μｍ以下とすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
受精細胞と卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞とを融合させる際に電極間距離は、下限を２００μｍ以上とすることが好ましく、２５０μｍ以上とすることがより好ましく、３００μｍ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を７００μｍ以下とすることが好ましく、６００μｍ以下とすることがより好ましく、５００μｍ以下とすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
精細胞と卵細胞を電気融合する際の溶液の浸透圧は、下限を３８０mosmol/kg H2O以上とすることが好ましく、３９０mosmol/kg H2O以上とすることがより好ましく、４００mosmol/kg H2O以上とすることがさらに好ましい。また、上限を４７０mosmol/kg H2O以下とすることが好ましく、４６０mosmol/kg H2O以下とすることがより好ましく、４５０mosmol/kg H2O以下とすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
卵細胞と卵細胞を電気融合する際の溶液の浸透圧は、下限を３７０mosmol/kg H2O以上とすることが好ましく、３８０mosmol/kg H2O以上とすることがより好ましく、３９０mosmol/kg H2O以上とすることがさらに好ましい。また、上限を５００mosmol/kg H2O以下とすることが好ましく、４８０mosmol/kg H2O以下とすることがより好ましく、４６５mosmol/kg H2O以下とすることがさらに好ましい。また、４５０mosmol/kg H2Oとすることが最も好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。繰り返し電気融合を行う場合は、電気融合を終えた際に融合細胞を３５０〜４００mosmol/kg H2Oの低浸透圧の溶液に一度移し、電気融合を行う際に再度浸透圧を高めることが好ましい。
受精細胞と卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞を電気融合する際の溶液の浸透圧は、下限を３７０mosmol/kg H2O以上とすることが好ましく、３８０mosmol/kg H2O以上とすることがより好ましく、３９０mosmol/kg H2O以上とすることがさらに好ましい。また、上限を５００mosmol/kg H2O以下とすることが好ましく、４７０mosmol/kg H2O以下とすることがより好ましく、４５０mosmol/kg H2O以下とすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。繰り返し電気融合を行う場合は、電気融合を終えた際に融合細胞を３５０〜４００mosmol/kg H2Oの低浸透圧の溶液に一度移し、電気融合を行う際に再度浸透圧を高めることが好ましい。
本発明において使用する細胞は、植物細胞由来の細胞であればよく、単子葉植物や双子葉植物であってもよく、単子葉植物が好ましく、例えばイネ、ミナトカモジグサ、又はコムギが好ましい。
上記（ａ）工程において、精細胞と卵細胞は、同一の種由来であることが好ましい。
上記（ｂ）工程において、受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞は、（ａ）工程において使用する精細胞と同種由来であっても異なる種由来であってもよい。異なる種由来である場合、本発明の方法により得られる植物細胞は交雑植物となりうる。
卵細胞と精細胞とが融合すると細胞壁が形成される。細胞壁が形成されると細胞融合が阻害されるため、受精細胞への卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞の融合は、受精細胞の作製後に速やかに行い、細胞壁の形成開始前に完了することが好ましい。具体的には、卵細胞と精細胞とを融合させてから、好ましくは、２０分以内、より好ましくは１０分以内、さらに好ましくは５分以内に、受精細胞を卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞と融合させることが好ましい。
上記（ａ）工程又は（ｂ）工程の前に２つの卵細胞を融合させて１つの融合細胞を得て、（ｂ）工程において、その融合細胞を１つ以上受精細胞に順次融合させることが好ましい。卵細胞を１つずつ受精細胞に融合させる場合と比べて、２つの卵細胞の融合細胞を受精細胞に融合させる場合のほうが、短時間で多くの卵細胞を受精細胞に融合させることができるため好ましい。また、卵細胞を１つずつ受精細胞に融合させる場合と比べて、２つの卵細胞の融合細胞を受精細胞に融合させる場合のほうが、融合させる細胞同士の大きさの差が低減する。細胞同士の大きさが同程度であると、電気融合による融合効率が高まるため好ましい。本態様は特に、１２倍体以下、１０倍体以下、８倍体以下の作製に有効である。
融合させる細胞同士の細胞質の大きさの差が小さいほど電気融合による融合効率が高まる。このため、より高次の倍数体を作製する場合は、卵細胞を融合させた受精細胞に対して、これと同程度の大きさの卵細胞同士の融合細胞を融合させることが好ましい。受精細胞は、卵細胞と精細胞の２つの細胞が融合しているが、精細胞の細胞質は卵細胞と比較して非常に小さい。このため、卵細胞を融合させた受精細胞の細胞質の量を算出する場合は、受精細胞自体の大きさを１つの卵細胞の大きさとして考えてもよい。
卵細胞同士の融合細胞と、卵細胞を融合させた受精細胞とを融合させる態様において、卵細胞同士の融合細胞を作製する際に１つの卵細胞に融合させる卵細胞数と、受精細胞に融合させる卵細胞数の差は、５個以下の卵細胞数であることが好ましく、４個以下の卵細胞数であることがより好ましく、３個以下の卵細胞数であることがさらに好ましい。例えば、ｘ個（ｘは整数である）の卵細胞を１つの卵細胞に融合させて得た１つの融合細胞には、（ｘ−５）〜（ｘ＋５）個の卵細胞を融合させた受精細胞を融合させることが好ましく、（ｘ−４）〜（ｘ＋４）個の卵細胞を融合させた受精細胞を融合させることがより好ましく、（ｘ−３）〜（ｘ＋３）個の卵細胞を融合させた受精細胞を融合させることがさらに好ましい。本態様において、ｎ個（ｎは整数である）の卵細胞を、卵細胞、融合細胞又は受精細胞の融合先の細胞に融合させる場合は、ｎ個の卵細胞のうち、一部又は全部を１つずつ融合先の細胞に融合させてもよく、一部又は全部をそれぞれ融合させて融合細胞を作製し、この融合細胞を融合先の細胞に融合させてもよい。
＜分化した倍数体植物を製造する方法＞
第二の態様において、本発明は、上記の倍数体の植物細胞の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を分化させる工程を含む、植物の倍数体を製造する方法を提供する。植物細胞を分化させる工程は、植物細胞を培養して、球状様胚又はカルスを形成させることを含む。所望により、この球状様胚又はカルスをさらに、不定胚、不定芽、不定根、又は、根、茎及び葉を有する植物体に分化させてもよい。
＜分化した倍数体植物を製造する方法＞
第二の態様において、本発明は、上記の倍数体の植物細胞の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を分化させる工程を含む、植物の倍数体を製造する方法を提供する。植物細胞を分化させる工程は、植物細胞を培養して、球状様胚又はカルスを形成させることを含む。所望により、この球状様胚又はカルスをさらに、不定胚、不定芽、不定根、又は、根、茎及び葉を有する植物体に分化させてもよい。
倍数体の植物細胞を分化させる工程は特に限定されないが、例えば、次のように行うことができる。
まず、倍数体の植物細胞を、７％マンニトール液滴（４５０mosmol/kg H2O）の中に入れて細胞内の浸透圧を高める。その後、植物細胞を２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸などのオーキシンを添加した、液体のＭＳ培地（T. Murashige et al., Physiol. Plant., 15, 473 (1962)）、Ｂ５培地（O.L.Gamborg et al, Experimental Cell Research, 50, 151-158 (1968)）、Ｎ６培地（Chu et al., Sci. Sinica, 18, 659-668(1975)）等に投入して一晩静置した後、穏やかに振とう培養する。振とう速度は、３０〜５０rpmが好ましく、３５〜４５rpmがより好ましい。培養の温度は、２４〜２８℃が好ましく、２５〜２７℃がより好ましい。培養は暗下で行うことが好ましい。培地へのオーキシンの添加濃度は、０．１〜０．３ｍｇ／Ｌが好ましく、０．１５〜０．２５ｍｇ／Ｌがより好ましい。培地にはフィーダー細胞を加えるのが好ましい。この培養期間は、４〜７日が好ましく、５〜６日がより好ましい。
培養開始から４〜７日後、直径５０〜２００μｍ程度の球状様胚が形成される。その球状様胚を、フィーダー細胞を加えていない上記の培地に移し、さらに１０〜１４日程度培養する。その後、オーキシンを添加しない任意の培地、例えばＭＳ培地に入れて培養し植物体を形成させる。この際、培養は光を照射して行うことが好ましく、光は、例えば、５０〜１８０μmol/m2・secが好ましく、７０〜１５０μmol/m2・secがより好ましい。植物体形成用の培地には支持体が含まれることが好ましく、支持体としては、例えば寒天やゲランガム、ゲルライト等を使用することができる。
＜倍数体の植物細胞＞
第三の態様において、本発明は、上記の倍数体の植物細胞の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を提供する。
＜倍数体の植物細胞＞
第三の態様において、本発明は、上記の倍数体の植物細胞の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を提供する。
本発明に係る倍数体の植物細胞は、上記の倍数体の植物細胞の製造方法により容易に製造することができる。
従来の方法では、６倍体以上の倍数体の植物細胞を製造することは困難であったが、本発明に係る倍数体の植物細胞の製造方法によれば、６倍体以上の倍数体の植物細胞を作製することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１：イネの卵細胞、精細胞、受精細胞の取得
（１）イネのＨ２Ｂ−ＧＦＰ導入株の作製
イネユビキチンプロモータの下流にヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするＤＮＡを繋いだＤＮＡコンストラクトを組み込んだバイナリーベクターを用いて、アグロバクテリウム法によってイネ（Oryza sativa L. cv Nipponbare）を形質転換することによって、Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ導入株を作製した。
（２）卵細胞と精細胞の取得
イネの穂から得た未開花の花を解体して子房と葯を採取した。３ｍｌの６％マンニトール溶液（３７０mosmol/kg H2O）が入った３.５ｃｍプラスチックシャーレの中に子房と葯を入れた。
実施例１：イネの卵細胞、精細胞、受精細胞の取得
（１）イネのＨ２Ｂ−ＧＦＰ導入株の作製
イネユビキチンプロモータの下流にヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするＤＮＡを繋いだＤＮＡコンストラクトを組み込んだバイナリーベクターを用いて、アグロバクテリウム法によってイネ（Oryza sativa L. cv Nipponbare）を形質転換することによって、Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ導入株を作製した。
（２）卵細胞と精細胞の取得
イネの穂から得た未開花の花を解体して子房と葯を採取した。３ｍｌの６％マンニトール溶液（３７０mosmol/kg H2O）が入った３.５ｃｍプラスチックシャーレの中に子房と葯を入れた。
新しい３．５ｃｍプラスチックシャーレ中の３ｍＬの６％マンニトール溶液（３７０mosmol/kg H2O）に柱頭を除去した子房を沈めて、シャーレの底でレーザーブレード（フェザー安全カミソリ（株）、ＦＡ−１０）により子房の下部を切断した。顕微鏡観察により切断部から出てくる卵細胞を確認し、ミクロキャピラリーで卵細胞を単離した。３０〜４０個の子房からおよそ１０〜１５個の卵細胞が得られた。各卵細胞の直径は４０〜５０μｍであった。なお、各実験では、細胞の直径の測定は、顕微鏡で細胞の外周長が最も大きい位置にピントを合わせて画像を撮影し、画像処理ソフト（Ｐｉｘｅｌａ社製、ＩｎＳｔｕｄｉｏ）を使用して測定した。
マイクロインジェクター（ＳＴサイエンス社製, ＵＪＩ−Ｂ）に接続したミクロキャピラリーで１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作った。同ミクロキャピラリーを用いて、単離した卵細胞をこの液滴中に入れた。この卵細胞は、単離後８時間以内に各実験に使用した。また、当日に卵細胞を使わない場合は、４℃で一晩保存して、翌日、実験に使用した。卵細胞の直径は４０〜５０μｍであった。
６％マンニトール溶液（３７０mosmol/kg H2O）中において葯をピンセットで開裂させて、花粉粒を溶液に曝露した。溶液中で花粉粒が破裂し、精細胞を含む花粉内容物が放出された。精細胞は、花粉粒を破裂させてから１時間以内に各実験に使用した。各精細胞の直径は８〜１０μｍであった。
（３）受精細胞の作製
本実施例では、図１（Ａ）に示すように、精細胞と卵細胞を融合して受精細胞を作製し、各実験に使用した。
（３）受精細胞の作製
本実施例では、図１（Ａ）に示すように、精細胞と卵細胞を融合して受精細胞を作製し、各実験に使用した。
以下の細胞の電気融合には、融合用装置（ネッパジーン社製、ＥＣＦＧ２１）を使用した。ダブルピペットホルダー（ナリシゲ社製、ＨＤ−２１）を装着したマニピュレーター（ＵＭＭＴ−３ＦＣ、成茂科学器械研究所製）を用いた。チタン電極（ネッパジーン社製,CUY5100Ti100）をピペットホルダーに固定した。
カバーガラスの周囲を、５％ジクロロメチルシランを含む1,1,1-トリクロロエタン溶液に浸し、乾燥させた。このカバーガラス中央部分に０．２〜０．３ｍＬのミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）を載せた。このミネラルオイル内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作り、この液滴の中に１つの卵細胞と１つの精細胞を入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極に卵細胞を接着させ、この卵細胞に精細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。電極間距離は、１００〜２００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール液滴の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。精細胞が楕円形状に変形し、また、卵細胞が電極に付着しやすくなった。
直流パルス（５０μｓ、１２〜１５ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、得られた融合細胞を回収した。この融合細胞（受精細胞）の直径は４０〜５０μｍであった。
受精細胞は、直流パルスをかけてから２０分以内に以下の各実験に使用した。
（４）卵細胞同士の融合細胞の作製
本実施例では、２つの卵細胞を融合して１つの融合細胞を得た。
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つの液滴の中に卵細胞を２つ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極に１つの卵細胞を接着させ、この卵細胞にもう一つの卵細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、３００〜５００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール液滴の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、９〜１１ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。この融合細胞の直径は５０〜６０μｍであった。
卵細胞同士の融合細胞は、融合させてから４時間以内に以下の各実験に使用した。
（５）４つの卵細胞を融合させて得る四倍体の融合細胞の作製
本実施例では、４つの卵細胞を融合して１つの融合細胞を得た。
（５）４つの卵細胞を融合させて得る四倍体の融合細胞の作製
本実施例では、４つの卵細胞を融合して１つの融合細胞を得た。
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つの液滴の中に上記（４）と同様にして得た卵細胞同士の融合細胞を２つ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極に１つの融合細胞を接着させ、この融合細胞にもう一つの融合細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、３５０〜６００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール液滴の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、９〜１１ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。この融合細胞の直径は６０〜７０μｍであった。
融合細胞は、融合させてから４時間以内に以下の各実験に使用した。
実施例２：受精細胞と卵細胞とを融合させる、三倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図１（Ｂ）に示すように、受精細胞と卵細胞を融合させて、三倍体の植物細胞を作製した。
実施例２：受精細胞と卵細胞とを融合させる、三倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図１（Ｂ）に示すように、受精細胞と卵細胞を融合させて、三倍体の植物細胞を作製した。
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つのマンニトール液滴の中に、受精細胞及び卵細胞を１つずつ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極に受精細胞を接着させ、この受精細胞に卵細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、３００〜５００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール液滴の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、９〜１１ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。
実施例３：受精細胞と卵細胞同士を融合させた融合細胞を融合させる、四倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図１（Ｃ）に示すように、受精細胞と卵細胞同士の融合細胞とを融合させて、四倍体の植物細胞を作製した。
実施例３：受精細胞と卵細胞同士を融合させた融合細胞を融合させる、四倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図１（Ｃ）に示すように、受精細胞と卵細胞同士の融合細胞とを融合させて、四倍体の植物細胞を作製した。
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つの液滴の中に受精細胞と卵細胞同士の融合細胞を１つずつ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極に受精細胞を接着させ、この受精細胞に融合細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、３５０〜６００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール液滴の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、９〜１１ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。
実施例４：受精細胞に卵細胞同士を融合させた融合細胞を２つ融合させる、六倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図１（Ｄ）に示すように、実施例３と同様にして作製した四倍体細胞と、実施例１（４）と同様にして作製した卵細胞同士の融合細胞である二倍体細胞とを融合させて、六倍体の植物細胞を作製した。
実施例４：受精細胞に卵細胞同士を融合させた融合細胞を２つ融合させる、六倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図１（Ｄ）に示すように、実施例３と同様にして作製した四倍体細胞と、実施例１（４）と同様にして作製した卵細胞同士の融合細胞である二倍体細胞とを融合させて、六倍体の植物細胞を作製した。
まず、受精細胞と卵細胞同士の融合細胞を実施例３と同様に融合させた。この融合細胞の直径は６０〜７０μｍであった。この融合細胞を６％マンニトール溶液（３７０mosmol/kg H2O）に移した。
次に、カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つのマンニトール液滴の中に、四倍体の融合細胞と、卵細胞同士の融合細胞を１つずつ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極に四倍体の融合細胞を接着させ、この四倍体の融合細胞に卵細胞同士の融合細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、４００〜６５０μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール溶液の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、９〜１１ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。
実施例５：八倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図１（Ｅ）に示すように、実施例３と同様にして作製した四倍体細胞と、実施例１（５）と同様に、４つの卵細胞を融合させた四倍体の植物細胞とを融合させて、八倍体の植物細胞を作製した。
実施例５：八倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図１（Ｅ）に示すように、実施例３と同様にして作製した四倍体細胞と、実施例１（５）と同様に、４つの卵細胞を融合させた四倍体の植物細胞とを融合させて、八倍体の植物細胞を作製した。
まず、四倍体の融合細胞を実施例３と同様に融合させた。この融合細胞を６％マンニトール溶液（３７０mosmol/kg H2O）に移した。次に、４つの卵細胞を融合させた四倍体の融合細胞を６％マンニトール溶液（３７０mosmol/kg H2O）に移した。
次に、カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つのマンニトール液滴の中に、四倍体の融合細胞と、４つの卵細胞を融合させて得た四倍体の融合細胞を１つずつ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極に六倍体の融合細胞を接着させ、この六倍体の融合細胞に卵細胞同士の融合細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、５００〜７００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール溶液の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、９〜１１ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。
実施例６：融合細胞から植物体への発生
０．２ｍＬ受精細胞用培地（Ｎ６Ｚ培地（Kumlehn J. et.al. (1998)Planta 205: 327-333）に以下の改変を加えたもの（2g/L CHU(N6) basal salt mixture （シグマアルドリッチ社製）、0.025mg/L Na2MoO4・2H2O、0.025mg/L CoCl2・6H2O、0.025mg/L CuSO4・5H2O、0.01mg/L レチノール、0.01mg/L カルシフェロール、0.01mg/Lビオチン、1mg/L チアミン・H2O、1mg/L ニコチン酸、1mg/L ピリドキシン・HCl、1mg/L 塩化コリン、1mg/L Ca-パントテン酸、0.2mg/L リボフラビン、0.2mg/L 2,4-D、0.02mg/L コバラミン、0.02mg/L p-アミノ安息香酸、0.4mg/L 葉酸、2mg/Lアスコルビン酸、40mg/L リンゴ酸、40mg/L クエン酸、40mg/L フマル酸、20mg/L Na-ピルビン酸、1,000mg/L グルタミン、及び250mg/L カゼイン加水分解物、100mg/L ミオイノシトール。浸透圧はグルコースで450mosmol/kg H2Oに調整。pH5.7。フィルター滅菌。）を、直径１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＣＭインサート（ミリポア社製）内に入れ、２ｍＬの培地の入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に入れた。４０〜６０μＬのイネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）をフィーダー細胞としてシャーレに加えた。
実施例６：融合細胞から植物体への発生
０．２ｍＬ受精細胞用培地（Ｎ６Ｚ培地（Kumlehn J. et.al. (1998)Planta 205: 327-333）に以下の改変を加えたもの（2g/L CHU(N6) basal salt mixture （シグマアルドリッチ社製）、0.025mg/L Na2MoO4・2H2O、0.025mg/L CoCl2・6H2O、0.025mg/L CuSO4・5H2O、0.01mg/L レチノール、0.01mg/L カルシフェロール、0.01mg/Lビオチン、1mg/L チアミン・H2O、1mg/L ニコチン酸、1mg/L ピリドキシン・HCl、1mg/L 塩化コリン、1mg/L Ca-パントテン酸、0.2mg/L リボフラビン、0.2mg/L 2,4-D、0.02mg/L コバラミン、0.02mg/L p-アミノ安息香酸、0.4mg/L 葉酸、2mg/Lアスコルビン酸、40mg/L リンゴ酸、40mg/L クエン酸、40mg/L フマル酸、20mg/L Na-ピルビン酸、1,000mg/L グルタミン、及び250mg/L カゼイン加水分解物、100mg/L ミオイノシトール。浸透圧はグルコースで450mosmol/kg H2Oに調整。pH5.7。フィルター滅菌。）を、直径１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＣＭインサート（ミリポア社製）内に入れ、２ｍＬの培地の入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に入れた。４０〜６０μＬのイネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）をフィーダー細胞としてシャーレに加えた。
無水エタノールと滅菌水でミクロキャピラリーを洗浄して滅菌した後、実施例２〜４で得られた融合細胞を新鮮な７％マンニトール液滴（４５０mosmol/kg H2O）中に投入し、その後、受精細胞用培地の入ったＣＭインサート内のメンブレン上に移した。
融合細胞は、暗所に２６℃で一晩静置して培養した。細胞融合から１２−１６時間後に、融合細胞を蛍光顕微鏡で観察し、核が融合している個体数を数えた。結果を表１に示す。その後、４０ｒｐｍの速度で穏やかに振とう培養した。
そして、細胞融合から１日後に細胞分裂をしている個体数、細胞融合から５日後に球状様胚を形成した個体数を数えた。結果を表１に示す。
融合後５日目に、胚の入ったＣＭインサートを、２ｍＬの受精細胞用培地の入った新しい３５ｍｍ直径シャーレの中に移し、上記の培養を続けた。
１８日間の培養後、細胞コロニーを、再分化培地（改変したＭＳ培地の固体培地。ＭＳ塩、ＭＳビタミン、100mg/L myoinositol、2g/L casamino acid、30g/L sucrose、30 g/L sorbitol、0.2 mg/L l-naphthaleneacetic acid(NAA)、1 mg/L kinetin及び0.3 % Gelrite）に移して培養した。３０℃で１２〜３０日間持続的に光で照らして培養した。そして、細胞融合から３０日後に観察し、カルスを形成した個体数を数えた。結果を表１に示す。
カルス中に芽が分化してきたら、それを発根用培地（キネチン及びＮＡＡを含めないこと以外は再分化培地と同じ）に移し、１３時間／１１時間の明／暗サイクルで、２８℃で１１〜１３日培養した。そして、細胞融合から４３〜４５日後に植物体を形成した個体数を数えた。結果を表１に示す。
表１に示すように、融合した細胞から高い確率で植物体が形成された。この結果は、受精細胞に卵細胞を融合させることにより、植物体まで発生する倍数体の細胞を作製することができることを示すものである。
実施例７：イネの受精細胞とコムギの卵細胞との融合
（１）コムギの精細胞及び卵細胞の取得
イネの子房及び葯から卵細胞と精細胞を取得した方法と同様の方法で、コムギ（Triticum aestivum，明治大学・川上直人博士から分与）の子房及び葯から卵細胞及び精細胞を取得した。卵細胞の直径は５０〜６０μｍであった。
（２）イネの卵細胞とコムギの精細胞との融合（比較例）
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つのマンニトール液滴の中にイネの卵細胞とコムギの精細胞を１つずつ入れた。
実施例７：イネの受精細胞とコムギの卵細胞との融合
（１）コムギの精細胞及び卵細胞の取得
イネの子房及び葯から卵細胞と精細胞を取得した方法と同様の方法で、コムギ（Triticum aestivum，明治大学・川上直人博士から分与）の子房及び葯から卵細胞及び精細胞を取得した。卵細胞の直径は５０〜６０μｍであった。
（２）イネの卵細胞とコムギの精細胞との融合（比較例）
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つのマンニトール液滴の中にイネの卵細胞とコムギの精細胞を１つずつ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極にイネの卵細胞を接着させ、この卵細胞にコムギの精細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、１００〜２００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール溶液の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、１２〜１５ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。
（３）イネの受精細胞とコムギの卵細胞の融合（実施例）
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つのマンニトール液滴の中にイネの受精細胞とコムギの卵細胞を１つずつ入れた。
（３）イネの受精細胞とコムギの卵細胞の融合（実施例）
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。１つのマンニトール液滴の中にイネの受精細胞とコムギの卵細胞を１つずつ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極に受精細胞を接着させ、この受精細胞に卵細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、３００〜５００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール溶液の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、９〜１１ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。
（４）融合細胞の培養
実施例５と同様に、（１）及び（２）で作製した融合細胞を培養した。その結果を図２に示す。イネの卵細胞とコムギの精細胞との融合細胞は、球状様胚までで発生が止まってしまった。一方、イネの受精細胞とコムギの卵細胞の融合は、カルスまで発生した。
（４）融合細胞の培養
実施例５と同様に、（１）及び（２）で作製した融合細胞を培養した。その結果を図２に示す。イネの卵細胞とコムギの精細胞との融合細胞は、球状様胚までで発生が止まってしまった。一方、イネの受精細胞とコムギの卵細胞の融合は、カルスまで発生した。
イネの受精細胞とコムギの卵細胞を融合させて作成した融合細胞は、細胞融合から３分後、１８時間後、１日後、５日後、７日後、１１日後、３９日後、４１日後、５０日後、６０日後、及び７４日後に画像を撮影した。画像を図３に示す。
融合細胞がカルスを形成したことから、植物体まで発生しうる、イネとコムギの雑種細胞の作製に成功したことがわかる。この結果は、イネの精細胞と卵細胞を融合した細胞にイネとは異種のコムギの卵細胞を融合させることにより、植物体まで発生しうる雑種細胞を作製できることを示すものである。
実施例８：イネの受精細胞とミナトカモジグサの卵細胞との融合
（１）ミナトカモジグサの卵細胞の取得
イネの子房から卵細胞を取得した方法と同様の方法で、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon、理研バイオリソースセンターから分与）の子房から卵細胞を取得した。この卵細胞の直径は３０〜４０μｍであった。
（２）イネの受精細胞と、ミナトカモジグサの卵細胞の融合
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。
実施例８：イネの受精細胞とミナトカモジグサの卵細胞との融合
（１）ミナトカモジグサの卵細胞の取得
イネの子房から卵細胞を取得した方法と同様の方法で、ミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon、理研バイオリソースセンターから分与）の子房から卵細胞を取得した。この卵細胞の直径は３０〜４０μｍであった。
（２）イネの受精細胞と、ミナトカモジグサの卵細胞の融合
カバーガラス上のミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ-ｔｅｓｔｅｄ Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、1001279270）内に１〜２μＬの６％マンニトール液滴（３７０mosmol/kg H2O）を作製した。
１つのマンニトール液滴の中にイネの受精細胞とミナトカモジグサの卵細胞を１つずつ入れた。
このミネラルオイル内において、交流電流（ＡＣ）フィールド（１ＭＨｚ,０．４ｋＶ/ｃｍ）下で、一つの電極にイネの受精細胞を電極に接着させ、このイネの受精細胞にミナトカモジグサの卵細胞を接着させた。そして、この電極に他方の電極を近づけた。２つの電極の距離は、３００〜５００μｍに調整した。
ガラスキャピラリーを用いて、０．５〜１μＬの８％マンニトール溶液（５２０mosmol/kg H2O）を液滴に穏やかに加えた。これにより、マンニトール溶液の浸透圧を４００〜４５０mosmol/kg H2Oにした。そして直流パルス（５０μｓ、９〜１１ｋＶ／ｃｍ）をかけて細胞融合し、融合細胞を回収した。
（３）融合細胞の培養
実施例５と同様に融合細胞を培養した。融合細胞は、融合直後、融合から１．５時間後、１日後、２日後、４日後、６日後、１４日後、および６５日後に画像を撮影した。画像を図４に示す。融合細胞がカルスを形成し、芽及び根様の器官の形成も観察された。このことから、植物体まで発生しうる、イネとミナトカモジグサの雑種細胞の作製に成功したことがわかる。この結果は、イネの精細胞と卵細胞を融合した細胞にイネとは異種のミナトカモジグサの卵細胞を融合させることにより、植物体まで発生しうる雑種細胞を作製できることを示すものである。
（３）融合細胞の培養
実施例５と同様に融合細胞を培養した。融合細胞は、融合直後、融合から１．５時間後、１日後、２日後、４日後、６日後、１４日後、および６５日後に画像を撮影した。画像を図４に示す。融合細胞がカルスを形成し、芽及び根様の器官の形成も観察された。このことから、植物体まで発生しうる、イネとミナトカモジグサの雑種細胞の作製に成功したことがわかる。この結果は、イネの精細胞と卵細胞を融合した細胞にイネとは異種のミナトカモジグサの卵細胞を融合させることにより、植物体まで発生しうる雑種細胞を作製できることを示すものである。
本発明の倍数体の製造方法は、受精細胞に卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞を融合させることによって、倍数体の植物細胞及び交雑植物を効率良く製造することができるものである。本発明の倍数体の製造方法は、大きな果実や花を形成させる倍数体の植物体や異種の植物体が得られるため、農業及び園芸の分野での利用が期待できる。
Claims (12)
- 倍数体の植物細胞の製造方法であって、
（ａ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
（ｂ）卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される１以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、
を含む製造方法。 - 工程（ａ）又は工程（ｂ）の前に、２つの卵細胞を融合させて１つの融合細胞を作製する工程（α）をさらに有し、
工程（ｂ）では、工程（α）で作製した融合細胞の１つ以上を前記受精細胞に順次融合させる、請求項１に記載の方法。 - 工程（ａ）において融合させる精細胞と卵細胞は同一の種由来であり、
工程（ｂ）において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞が前記精細胞の由来する種と同種由来である、請求項１又は２に記載の方法。 - 工程（ａ）において融合させる精細胞と卵細胞は同一の種由来であり、
工程（ｂ）において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞の１以上が前記精細胞の由来する種とは異なる種由来である、請求項１又は２に記載の方法。 - 倍数体の植物細胞の製造方法であって、
（ａ）１つの卵細胞にｘ個の卵細胞を融合させて１つの融合細胞を作製する工程と、
（ｂ）精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
（ｃ）ｙ個の卵細胞を、工程（ｂ）で作製した受精細胞に融合させる工程（ただし、ｙは、少なくとも１以上であって、（ｘ−５）〜（ｘ＋５））と、
（ｄ）工程（ａ）で作製した前記融合細胞をさらに、工程（ｃ）で得た卵細胞を融合させた受精細胞に融合させる工程と、
を含む製造方法。 - 細胞の融合を電気融合により行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
- 精細胞と卵細胞とを融合させる際の直流電圧は１２〜１５ｋＶであり、そして、卵細胞同士を融合させる際の直流電圧は、精細胞と卵細胞とを融合させる際の直流電圧の０．７〜０．８倍である、請求項６に記載の製造方法。
- 精細胞と卵細胞を電気融合する際の電極間距離は１００〜２００μｍであり、そして、卵細胞と卵細胞を電気融合する際の電極間距離は、精細胞と卵細胞とを融合させる際の電極間距離の３〜５倍である、請求項６又は７に記載の製造方法。
- 卵細胞と卵細胞を電気融合する際の浸透圧は、３７０〜５００mosmol/kg H2Oである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
- 精細胞及び卵細胞が単子葉植物由来である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を分化させる工程を含む、分化した植物の倍数体を製造する方法。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の倍数体の植物細胞の製造方法により製造した、倍数体の植物細胞。
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