JP6436701B2 - 植物配偶子の電気融合による同質および異質倍数性植物の作出 - Google Patents
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Description
(a)精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
(b)卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される1以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、を含む製造方法。
工程(b)では、工程(α)で作製した融合細胞の1つ以上を前記受精細胞に順次融合させる、[1]に記載の方法。
工程(b)において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞が前記精細胞の由来する種と同種由来である、[1]又は[2]に記載の方法。
工程(b)において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞の1以上が前記精細胞の由来する種とは異なる種由来である、[1]又は[2]に記載の方法。
(a)1つの卵細胞にx個の卵細胞を融合させて1つの融合細胞を作製する工程と、
(b)精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
(c)y個の卵細胞を、工程(b)で作製した受精細胞に融合させる工程(ただし、yは、少なくとも1以上であって、(x−5)〜(x+5))と、
(d)工程(a)で作製した前記融合細胞をさらに、工程(c)で得た卵細胞を融合させた受精細胞に融合させる工程と、を含む製造方法。
第一の態様において本発明は、(a)精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、(b)卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される1以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、を含む倍数体の植物細胞の製造方法を提供する。
<分化した倍数体植物を製造する方法>
第二の態様において、本発明は、上記の倍数体の植物細胞の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を分化させる工程を含む、植物の倍数体を製造する方法を提供する。植物細胞を分化させる工程は、植物細胞を培養して、球状様胚又はカルスを形成させることを含む。所望により、この球状様胚又はカルスをさらに、不定胚、不定芽、不定根、又は、根、茎及び葉を有する植物体に分化させてもよい。
<倍数体の植物細胞>
第三の態様において、本発明は、上記の倍数体の植物細胞の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を提供する。
実施例1:イネの卵細胞、精細胞、受精細胞の取得
(1)イネのH2B−GFP導入株の作製
イネユビキチンプロモータの下流にヒストンH2B−GFP融合タンパク質をコードするDNAを繋いだDNAコンストラクトを組み込んだバイナリーベクターを用いて、アグロバクテリウム法によってイネ(Oryza sativa L. cv Nipponbare)を形質転換することによって、H2B−GFP導入株を作製した。
(2)卵細胞と精細胞の取得
イネの穂から得た未開花の花を解体して子房と葯を採取した。3mlの6%マンニトール溶液(370mosmol/kg H2O)が入った3.5cmプラスチックシャーレの中に子房と葯を入れた。
(3)受精細胞の作製
本実施例では、図1(A)に示すように、精細胞と卵細胞を融合して受精細胞を作製し、各実験に使用した。
(4)卵細胞同士の融合細胞の作製
本実施例では、2つの卵細胞を融合して1つの融合細胞を得た。
(5)4つの卵細胞を融合させて得る四倍体の融合細胞の作製
本実施例では、4つの卵細胞を融合して1つの融合細胞を得た。
実施例2:受精細胞と卵細胞とを融合させる、三倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図1(B)に示すように、受精細胞と卵細胞を融合させて、三倍体の植物細胞を作製した。
実施例3:受精細胞と卵細胞同士を融合させた融合細胞を融合させる、四倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図1(C)に示すように、受精細胞と卵細胞同士の融合細胞とを融合させて、四倍体の植物細胞を作製した。
実施例4:受精細胞に卵細胞同士を融合させた融合細胞を2つ融合させる、六倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図1(D)に示すように、実施例3と同様にして作製した四倍体細胞と、実施例1(4)と同様にして作製した卵細胞同士の融合細胞である二倍体細胞とを融合させて、六倍体の植物細胞を作製した。
実施例5:八倍体の植物細胞の作製
本実施例では、図1(E)に示すように、実施例3と同様にして作製した四倍体細胞と、実施例1(5)と同様に、4つの卵細胞を融合させた四倍体の植物細胞とを融合させて、八倍体の植物細胞を作製した。
実施例6:融合細胞から植物体への発生
0.2mL受精細胞用培地(N6Z培地(Kumlehn J. et.al. (1998)Planta 205: 327-333)に以下の改変を加えたもの(2g/L CHU(N6) basal salt mixture (シグマアルドリッチ社製)、0.025mg/L Na2MoO4・2H2O、0.025mg/L CoCl2・6H2O、0.025mg/L CuSO4・5H2O、0.01mg/L レチノール、0.01mg/L カルシフェロール、0.01mg/Lビオチン、1mg/L チアミン・H2O、1mg/L ニコチン酸、1mg/L ピリドキシン・HCl、1mg/L 塩化コリン、1mg/L Ca-パントテン酸、0.2mg/L リボフラビン、0.2mg/L 2,4-D、0.02mg/L コバラミン、0.02mg/L p-アミノ安息香酸、0.4mg/L 葉酸、2mg/Lアスコルビン酸、40mg/L リンゴ酸、40mg/L クエン酸、40mg/L フマル酸、20mg/L Na-ピルビン酸、1,000mg/L グルタミン、及び250mg/L カゼイン加水分解物、100mg/L ミオイノシトール。浸透圧はグルコースで450mosmol/kg H2Oに調整。pH5.7。フィルター滅菌。)を、直径12mmのMillicell CMインサート(ミリポア社製)内に入れ、2mLの培地の入った3.5cmプラスチックシャーレの中に入れた。40〜60μLのイネ浮遊細胞培養物(Line Oc、理研バイオリソースセンター製)をフィーダー細胞としてシャーレに加えた。
実施例7:イネの受精細胞とコムギの卵細胞との融合
(1)コムギの精細胞及び卵細胞の取得
イネの子房及び葯から卵細胞と精細胞を取得した方法と同様の方法で、コムギ(Triticum aestivum,明治大学・川上直人博士から分与)の子房及び葯から卵細胞及び精細胞を取得した。卵細胞の直径は50〜60μmであった。
(2)イネの卵細胞とコムギの精細胞との融合(比較例)
カバーガラス上のミネラルオイル(Embryo Culture-tested Grade,シグマアルドリッチ社製、1001279270)内に1〜2μLの6%マンニトール液滴(370mosmol/kg H2O)を作製した。1つのマンニトール液滴の中にイネの卵細胞とコムギの精細胞を1つずつ入れた。
(3)イネの受精細胞とコムギの卵細胞の融合(実施例)
カバーガラス上のミネラルオイル(Embryo Culture-tested Grade,シグマアルドリッチ社製、1001279270)内に1〜2μLの6%マンニトール液滴(370mosmol/kg H2O)を作製した。1つのマンニトール液滴の中にイネの受精細胞とコムギの卵細胞を1つずつ入れた。
(4)融合細胞の培養
実施例5と同様に、(1)及び(2)で作製した融合細胞を培養した。その結果を図2に示す。イネの卵細胞とコムギの精細胞との融合細胞は、球状様胚までで発生が止まってしまった。一方、イネの受精細胞とコムギの卵細胞の融合は、カルスまで発生した。
実施例8:イネの受精細胞とミナトカモジグサの卵細胞との融合
(1)ミナトカモジグサの卵細胞の取得
イネの子房から卵細胞を取得した方法と同様の方法で、ミナトカモジグサ(Brachypodium distachyon、理研バイオリソースセンターから分与)の子房から卵細胞を取得した。この卵細胞の直径は30〜40μmであった。
(2)イネの受精細胞と、ミナトカモジグサの卵細胞の融合
カバーガラス上のミネラルオイル(Embryo Culture-tested Grade,シグマアルドリッチ社製、1001279270)内に1〜2μLの6%マンニトール液滴(370mosmol/kg H2O)を作製した。
(3)融合細胞の培養
実施例5と同様に融合細胞を培養した。融合細胞は、融合直後、融合から1.5時間後、1日後、2日後、4日後、6日後、14日後、および65日後に画像を撮影した。画像を図4に示す。融合細胞がカルスを形成し、芽及び根様の器官の形成も観察された。このことから、植物体まで発生しうる、イネとミナトカモジグサの雑種細胞の作製に成功したことがわかる。この結果は、イネの精細胞と卵細胞を融合した細胞にイネとは異種のミナトカモジグサの卵細胞を融合させることにより、植物体まで発生しうる雑種細胞を作製できることを示すものである。
Claims (11)
- 倍数体の植物細胞の製造方法であって、
(a)精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
(b)卵細胞及び卵細胞同士を融合させた融合細胞からなる群より選択される1以上の細胞を、前記受精細胞に融合させる工程と、
を含む製造方法。 - 工程(a)又は工程(b)の前に、2つの卵細胞を融合させて1つの融合細胞を作製する工程(α)をさらに有し、
工程(b)では、工程(α)で作製した融合細胞の1つ以上を前記受精細胞に順次融合させる、請求項1に記載の方法。 - 工程(a)において融合させる精細胞と卵細胞は同一の種由来であり、
工程(b)において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞が前記精細胞の由来する種と同種由来である、請求項1又は2に記載の方法。 - 工程(a)において融合させる精細胞と卵細胞は同一の種由来であり、
工程(b)において前記受精細胞に融合させる卵細胞又は卵細胞同士を融合させた融合細胞の1以上が前記精細胞の由来する種とは異なる種由来である、請求項1又は2に記載の方法。 - 倍数体の植物細胞の製造方法であって、
(a)1つの卵細胞にx個の卵細胞を融合させて1つの融合細胞を作製する工程と、
(b)精細胞と卵細胞とを融合させて受精細胞を作製する工程と、
(c)y個の卵細胞を、工程(b)で作製した受精細胞に融合させる工程(ただし、yは、少なくとも1以上であって、(x−5)〜(x+5))と、
(d)工程(a)で作製した前記融合細胞をさらに、工程(c)で得た卵細胞を融合させた受精細胞に融合させる工程と、
を含む製造方法。 - 細胞の融合を電気融合により行う、請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 精細胞と卵細胞とを融合させる際の直流電圧は12〜15kVであり、そして、卵細胞同士を融合させる際の直流電圧は、精細胞と卵細胞とを融合させる際の直流電圧の0.7〜0.8倍である、請求項6に記載の製造方法。
- 精細胞と卵細胞を電気融合する際の電極間距離は100〜200μmであり、そして、卵細胞と卵細胞を電気融合する際の電極間距離は、精細胞と卵細胞とを融合させる際の電極間距離の3〜5倍である、請求項6又は7に記載の製造方法。
- 卵細胞と卵細胞を電気融合する際の浸透圧は、370〜500mosmol/kg H2Oである、請求項6〜8のいずれか1項に記載の製造方法。
- 精細胞及び卵細胞が単子葉植物由来である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の製造方法により製造した倍数体の植物細胞を分化させる工程を含む、分化した植物の倍数体を製造する方法。
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