JP2022076736A - 融合細胞、融合細胞の製造方法、細胞塊、植物体及び植物体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
そこで、本発明は、育成して植物体を得ることのできる、融合細胞、融合細胞の製造方法、細胞塊、植物体及び植物体の製造方法を提供することを目的とする。
[1]植物の卵細胞又はそれに由来する細胞と、植物の精細胞又はそれに由来する細胞と、を融合させて、融合細胞を得る工程を含む、融合細胞の製造方法。
[2]前記卵細胞は、互いに異なる2種類以上の植物種の卵細胞を含む、[1]に記載の製造方法。
[3]前記卵細胞の由来する植物種が属する分類群と、前記精細胞の由来する植物種が属する分類群とは、同一の科以下の分類群に属する、[1]又は[2]に記載の製造方法。
[4]前記卵細胞は、イネ科に属する植物種の卵細胞である、[1]~[3]のいずれかに記載の製造方法。
[5]前記卵細胞は、イネ科イチゴツナギ亜科、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科に属する植物種の卵細胞である、[1]~[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6][1]~[5]のいずれかに記載の製造方法で得られた融合細胞を培養して、細胞塊を得る工程を含む、細胞塊の製造方法。
[7][1]~[5]のいずれかに記載の製造方法で得られた融合細胞から、植物体を生産する工程を含む、植物体の製造方法。
[8][1]~[5]のいずれかに記載の製造方法で得られた融合細胞。
[9][1]~[5]のいずれかに記載の製造方法で得られた融合細胞から育成された植物体。
[10]植物の卵細胞又はそれに由来する細胞と、植物の精細胞又はそれに由来する細胞と、を融合させた融合細胞の核ゲノムDNAが、第1の植物種の核ゲノムDNAの全部又は一部を有し、前記融合細胞の核ゲノムDNAが、第2の植物種の核ゲノムDNAの30%以下を有し、前記第1の植物種と前記第2の植物種が異なる、融合細胞。
[11]前記融合細胞のミトコンドリアゲノムDNAが、第1の植物種のミトコンドリアゲノムDNAの一部又は全部、及び、第2の植物種のミトコンドリアゲノムDNAの一部又は全部を有する、[10]に記載の融合細胞。
[12]前記融合細胞のプラスチドゲノムDNAが、前記第1の植物種のプラスチドゲノムDNAの一部又は全部、及び、前記第2の植物種のプラスチドゲノムDNAの一部又は全部を有する、[10]又は[11]に記載の融合細胞。
[13]前記融合細胞は、植物の卵細胞又はそれに由来する細胞と、植物の精細胞又はそれに由来する細胞との融合細胞である、[10]~[12]のいずれかに記載の融合細胞。
[14]前記第1の植物種及び/又は前記第2の植物種は、イネ科に属する植物種である、[10]~[13]のいずれかに記載の融合細胞。
[15]前記第1の植物種及び/又は前記第2の植物種は、イネ科イチゴツナギ亜科、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科に属する植物種である、[10]~[14]のいずれかに記載の融合細胞。
[16]前記第1の植物種は、イネ科イチゴツナギ亜科に属する植物種であり、
前記第2の植物種は、イネ科エールハルタ亜科に属する植物種である、[10]~[15]のいずれかに記載の融合細胞。
[17][10]~[16]のいずれかに記載の融合細胞から育成された植物体。
1実施形態において、本発明は、植物の卵細胞又はそれに由来する細胞と、植物の精細胞又はそれに由来する細胞と、を融合させて、融合細胞を得る工程を含む、融合細胞の製造方法を提供する。
複数の卵細胞が融合された細胞の倍数性は特に限定されず、例えば、2倍体、3倍体、4倍体、5倍体、6倍体、7倍体、8倍体等であってもよい。これらの中でも、複数の卵細胞が融合された細胞は、2倍体、3倍体又は4倍体であることが好ましく、2倍体であることがより好ましい。
卵細胞の植物種が互いに異なる2種類以上の植物種の卵細胞を含む場合、例えば異なる細胞質の遺伝情報に由来する、新たな、優良な形質を有する融合細胞を製造することができる。
例えば、融合細胞の製造において、2個の1倍体の卵細胞を融合させる場合は、2個の1倍体の卵細胞と、1個又は2個の1倍体の精細胞とを融合することが好ましい。
イネ科の属としては、例えば、マダケ属、オオムギ属、コムギ属、イネ属、コヌカグサ属、シバ属、サトウキビ属、キビ属、ヒエ属、モロコシ属、トウモロコシ属等が挙げられる。
アブラナ科の属としては、例えば、アブラナ属、シロイヌナズナ属、ワサビ属、セイヨウワサビ属、ナズナ属、キバナスズシロ属、ダイコン属、グンバイナズナ属等が挙げられる。
アカザ科の属としては、例えば、ホウレンソウ属、フダンソウ属等が挙げられる。
マメ科の属としては、例えば、インゲン属、エンドウ属、ソラマメ属、ナタマメ属、ダイズ属、クズ属、ササゲ属、デイゴ属、フジマメ属、キマメ属、ラッカセイ属、ヒヨコマメ属、シタン属、ハギ属、ゲンゲ属、カンゾウ属、エニシダ属、クアスタマメ属、ミヤコグサ属、ルピナス属、フジ属等が挙げられる。
ナス科の属としては、例えば、ナス属、トウガラシ属、タバコ属、チョウセンアサガオ属、ホオズキ属、ペチュニア属等が挙げられる。
イネ科に属する植物種の卵細胞は、他の植物種の卵細胞と比較して大きく、卵細胞の取り扱い、融合細胞の製造等が容易であるため、より容易に融合細胞を製造することができ、得られた融合細胞を育成してより容易に植物体を製造することができる。
マメ科に属する植物種は、窒素固定細菌と共生して窒素固定が可能であるため、得られた融合細胞から、園芸及び農業分野において有用な植物体を製造できる。
卵細胞が属する植物種の分類群は、イネ科イチゴツナギ亜科の、オオムギ属、コムギ属又はライムギ属が好ましい。
あるいは、卵細胞が属する植物種の分類群は、イネ科エールハルタ亜科のイネ属が好ましい。
あるいは、卵細胞が属する植物種の分類群は、イネ科キビ亜科の、サトウキビ属、モロコシ属、トウモロコシ属、キビ属又はヒエ属が好ましい。
より具体的には、卵細胞が属する植物種としては、アジアイネ(O.sativa L.)、オリザ・ルフィポゴン(O.rufipogon sensu lato)、アフリカイネ(O.glaberrima Steud.)、野生イネ(O.rufipogon,O. barthii,O.longistaminata,O.meridionalis等)、パンコムギ(Triticum aestivum)、デュラムコムギ(Triticum durum)、トウモロコシ(Zea mays)等が挙げられる。
本実施形態に係る製造方法において、卵細胞が属する植物種の分類群と、精細胞が属する植物種の分類群とは、同一の科であることが好ましく、同一の属であることがより好ましく、同一の種であることが更に好ましい。
卵細胞が属する植物種の分類群と、精細胞が属する植物種の分類群とが、同一の亜科以下の分類群に属することにより、発生が良好となり、得られた融合細胞を育成してより容易に植物体を製造することができる。
前記C3植物の分類群としては、例えば、イネ属、コムギ属等が挙げられる。
前記C4植物の分類群としては、例えば、サトウキビ属、モロコシ属、トウモロコシ属、キビ属、ヒエ属、エノコログサ属等が挙げられる。
C3植物は、主要穀物であるため、得られた融合細胞を育成して園芸、農業において有用な植物体を製造することができる。
有用な農業作物を製造する観点から、卵細胞が属する植物は、C4植物であることが好ましい。C4植物は、高温、乾燥等の環境においても二酸化炭素を固定することができ、得られた融合細胞を育成して、園芸、農業において、ストレス耐性の高い有用な植物体を製造することができる。
また、少なくとも一組の卵細胞及び精細胞が属する植物種の分類群は、イネ科イチゴツナギ亜科が好ましく、コムギ属がより好ましい。
卵細胞が互いに異なる2種類以上の植物種の卵細胞を含む場合、当該卵細胞が属する植物種の分類群は、イネ科に属し且つイチゴツナギ亜科に属さないことが好ましく、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科であることがより好ましく、イネ科エールハルタ亜科であることがより好ましい。
卵細胞、精細胞、融合細胞は、核酸、タンパク質、ペプチド等が導入されたものであってもよい。導入する方法としては、例えば、特開2019-129705、特開2020-72645に記載された方法が挙げられる。
本実施形態にかかる製造方法は、図1に例示するように、第1の卵細胞と、第1の精細胞とを融合させて融合細胞を製造する方法である。
卵細胞の植物種は、精細胞の植物種とは異なる。
卵細胞、精細胞の属する植物種の分類群としては、上述した分類群を挙げることができる。
卵細胞の植物種及び精細胞の植物種の分類群は、イネ科であることが好ましく、イネ科イチゴツナギ亜科、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科であることがより好ましい。
精細胞は、例えば、2倍体の精細胞であってもよく、より具体的には、イネ科エールハルタ亜科に属する植物種の4倍体の植物体から得られる2倍体の精細胞であってもよい。
あるいは、精細胞の植物種は、イネ科キビ亜科に属する植物種であってもよい。
本実施形態にかかる融合細胞の製造方法は、第1の卵細胞と、第2の卵細胞と、第1の精細胞と、を融合させて融合細胞を製造する方法である。
図2中、より系統関係の近いゲノム情報を有する細胞の核同士を意図して、これらを同じハッチングを用いて示しており、以下の図3~6においても同様である。
また、本実施形態にかかる製造方法は、第2の卵細胞と、第1の精細胞とを融合させて第1の融合細胞を得る工程と、第1の融合細胞と、第1の卵細胞とを融合させる工程とを含むものであってもよい。
また、本実施形態にかかる製造方法は、図3に例示するように、第1の卵細胞と、第2の卵細胞とを融合させて第1の融合細胞を得る工程と、第1の融合細胞と、第1の精細胞とを融合させる工程とを含むものであってもよい。
第1の精細胞が属する植物種の科以下の分類群は、第1の卵細胞が属する植物種の亜科以下の分類群、又は、第2の卵細胞が属する植物種の亜科以下の分類群と同一であることが好ましい。この場合、融合細胞の初期発生が安定して進み、より確実に、融合細胞を育成して植物体を得ることができる。
第1の卵細胞が属する植物種の分類群は、第2の卵細胞が属する植物種の分類群とは異なることが好ましい。この場合、得られる融合細胞の遺伝情報は、第1の卵細胞の遺伝情報及び第2の卵細胞の遺伝情報を併せ持つものであり、多様な形質を有する融合細胞を得ることができる。
卵細胞、精細胞の属する植物種の分類群としては、上述した分類群を挙げることができる。
第1の精細胞の属する植物種の分類群は、イネ科であることが好ましく、イネ科イチゴツナギ亜科であることがより好ましい。
第1の精細胞が属する植物種及び第1の卵細胞が属する植物種の分類群が、イネ科イチゴツナギ亜科である場合、第2の卵細胞が属する植物種の分類群は特に限定されないが、イネ科であることが好ましく、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科であることがより好ましく、イネ科エールハルタ亜科であることがより好ましい。
本実施形態にかかる製造方法は、第1の卵細胞と、第2の卵細胞と、第1の精細胞と、第2の精細胞と、を融合させて融合細胞を製造する方法である。
本実施形態における製造方法において、2個の卵細胞のうちの少なくとも1個の卵細胞は、2個の精細胞のうちの少なくとも1個の精細胞とは異なる植物種のものである。
また、本実施形態にかかる製造方法は、図5に例示するように、第1の卵細胞と、第1の精細胞とを融合させて第1の融合細胞を得る工程と、第2の卵細胞と、第2の精細胞とを融合させて第2の融合細胞を得る工程と、第1の融合細胞と、第2の融合細胞とを融合させる工程とを含むものであってもよい。
また、本実施形態にかかる製造方法は、図6に例示するように、第1の卵細胞と、第2の卵細胞とを融合させて第1の融合細胞を得る工程と、第1の融合細胞と、第1の精細胞とを融合させて第2の融合細胞を得る工程と、第2の融合細胞と、第2の精細胞とを融合させる工程とを含むものであってもよい。
第1の卵細胞が属する植物種の分類群は、第2の卵細胞が属する植物種の分類群とは異なることが好ましい。この場合、得られる融合細胞の遺伝情報は、第1の卵細胞の遺伝情報及び第2の卵細胞の遺伝情報を併せ持つものであり、多様な形質を有する融合細胞を得ることができる。
卵細胞、精細胞の属する植物種の分類群としては、上述した分類群を挙げることができる。
卵細胞のうちの少なくとも1個の卵細胞が属する植物種の分類群は、イネ科イチゴツナギ亜科であることがより好ましい。
精細胞のうちの少なくとも1個の精細胞が属する植物種は、イネ科イチゴツナギ亜科であることがより好ましい。
卵細胞及び精細胞が属する植物種の分類群は、イネ科イチゴツナギ亜科、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科であることが更に好ましい。
本実施形態にかかる製造方法は、2種類以上の植物種の卵細胞又はそれに由来する細胞と、1種類又は2種類以上の植物種の精細胞とを融合させる方法である。本実施形態において、材料となる1倍体の卵細胞の個数及び1倍体の精細胞の個数の総数は、5個以上であり、1倍体の卵細胞の個数は3個以上である。
卵細胞のうちの少なくとも1個の卵細胞が属する植物種は、イネ科であることが好ましい。
卵細胞のうちの少なくとも1個の卵細胞が属する植物種の分類群は、イネ科イチゴツナギ亜科であることがより好ましい。
精細胞のうちの少なくとも1個の精細胞が属する植物種の分類群は、イネ科イチゴツナギ亜科であることが好ましい。
本明細書において、「細胞を融合させる」とは、同種あるいは異種の2個以上の細胞の細胞質を融合させることをいい、人為的に融合させることが好ましい。人為的に融合させることとして、in vitroで融合させることを例示できる。本明細書において「融合細胞」とは、同種又は異種の2個以上の細胞を融合させることによって形成された細胞を意味し、同種又は異種の2個以上の、細胞質を有する細胞を融合させることによって形成された細胞を意味することが好ましい。細胞を融合する方法は特に限定されないが、電気融合により行うことが好ましい。
電気融合の条件としては特に限定されないが、例えば、以下のような条件が挙げられる(例えば、特許第6436701号を参照)。
植物細胞を電気融合させる際の直流電圧は、5~30kv/cmであることが好ましく、8~20kv/cmであることがより好ましく、12~15kv/cmであることが更に好ましい。
植物細胞を電気融合させる際の溶液の浸透圧は、下限を380mosmol/kg H2O以上とすることが好ましく、390mosmol/kg H2O以上とすることがより好ましく、400mosmol/kg H2O以上とすることがさらに好ましい。また、上限を470mosmol/kg H2O以下とすることが好ましく、460mosmol/kg H2O以下とすることがより好ましく、450mosmol/kg H2O以下とすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
1実施形態において、本発明は、上述の製造方法で得られた融合細胞を培養して、細胞塊を得る工程を含む、細胞塊の製造方法を提供する。本実施形態において、細胞塊とは、例えば、球状様胚、胚様体、カルス等が挙げられる。
まず、融合細胞を、培地に入れて振とう培養する。培地としては、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸等のオーキシンを添加した、液体のMS培地(T. Murashige et al., Physiol. Plant., 15, 473 (1962))、B5培地(O.L.Gamborg et al, Experimental Cell Research, 50, 151-158 (1968))、N6培地(Chu et al., Sci. Sinica, 18, 659-668(1975))等が挙げられる。振とう速度は30~50rpmであってもよく、培養の温度は24~28℃であってもよい。培養は暗下で行うことが好ましい。培地へのオーキシンの添加濃度は、0.1~0.3mg/Lであってもよい。培地にはフィーダー細胞を加えるのが好ましい。培養期間は、4~7日であってもよい。
振とう培養して得られた直径50~200μm程度の球状様胚を、フィーダー細胞を加えていない上記の培地に移し、さらに10~20日程度培養し、細胞コロニーを得る。
その後、オーキシン及び/又はカイネチンを含む任意の培地、例えばN6培地に入れて培養しカルスを形成させる。この際、培養は光を照射して行うことが好ましく、光は、例えば、50~400μmol photons m-2 sec-1がより好ましい。カルス形成用の培地には支持体が含まれることが好ましく、支持体としては、例えば寒天やゲランガム、ゲルライト等を使用することができる。
1実施形態において、本発明は、上述の製造方法で得られた融合細胞から、植物体を生産する工程を含む、植物体の製造方法を提供する。
本実施形態により得られる植物体は、稔性を有し、種子を生産可能である。そのため、種子を栽培することにより、容易に植物体の後代を大量に育成することが可能である。
あるいは、第1世代の植物株の後代の植物株は、第1世代の植物株を脱分化させた後、脱分化させた細胞を再分化させ、再分化した細胞を育成して後代の植物株を得てもよい。脱分化及び再分化の方法は、当業者が適宜選択することができる。
1実施形態において、本発明は、上述の実施形態の融合細胞の製造方法で得られた融合細胞を提供する。
本実施形態において、融合細胞は、上述の実施形態の融合細胞の製造方法で得られた融合細胞から培養された細胞、及び、上述の実施形態の融合細胞の製造方法で得られた融合細胞から育成された植物体を構成する細胞も包含する。
融合細胞を培養する方法、融合細胞を育成する方法としては、例えば上述の方法を挙げることができる。
前記卵細胞が属する植物種の分類群と、前記精細胞が属する植物種の分類群が、同一の亜科以下(好ましくは同一の属以下、より好ましくは同一の種以下)に属する分類群である場合には、当該卵細胞及び/又は精細胞の植物種を第1の植物種として例示できる。
第2の植物種は、第1の植物種と互いに異なる種以上の分類群に属していてもよいし、互いに異なる属以上の分類群に属していてもよいし、互いに異なる亜科以上の分類群に属していてもよいし、互いに異なる科以上の分類群に属していてもよい。
ここで、基準となる“第1の植物種の核ゲノムDNA由来の配列”とは、融合細胞の作出の原料として融合に用いられる第1の植物種の有する配列である。基準の配列は、植物種の野生型や、登録品種の有するゲノムDNAの配列を参照すればよい。融合細胞において、基準の配列の重複が認められる場合には、重複分の配列は割合に含めないものとする。
なお、後述のミトコンドリアゲノム及びプラスチドゲノムに係る割合についても、上記核ゲノムを、それぞれミトコンドリアゲノム又はプラスチドゲノムと読みかえることができる。
本実施形態の融合細胞は、第2の植物種の核ゲノムDNAの半分超を喪失する。本実施形態の融合細胞の核ゲノムDNAは、第2の植物種の核ゲノムDNAの0%超20%以下を含んでもよく、0%超15%以下を含んでもよく、0%超10%以下を含んでもよい。
融合細胞の形質を多様なものにする観点から、融合細胞の核ゲノムDNAは、第2の植物種の核ゲノムDNAの1%以上を含むことが好ましく、3%以上を含むことがより好ましく、5%以上を含むことがさらに好ましく、10%以上を含むことが特に好ましい。
本実施形態に係る融合細胞は、上述の植物の融合細胞を製造する方法により得られるものであってもよい。
本実施形態に係る融合細胞は、卵細胞の植物種は特に限定されず、1種類であってもよいし、2種類以上であってもよい。また、精細胞の植物種は、1種類であってもよいし、2種類以上であってもよい。卵細胞及び精細胞の植物種としては、融合細胞の製造方法において上述した植物種を例示することができる。
本実施形態に係る融合細胞の核ゲノムDNAにおいて、第1の植物種に由来する核ゲノムDNAの一部、第2の植物種に由来する核ゲノムDNAの一部は重複していてもよい。
更に、公知の塩基配列解析ソフトウェアを用いることにより、本実施形態に係る融合細胞の核ゲノムDNAの配列に対して、第1の植物種の核ゲノムDNAの配列、第2の植物種の核ゲノムDNAの配列をマッピングすることができる。
本実施形態に係る融合細胞のミトコンドリアゲノムDNAにおいて、第1の植物種に由来するミトコンドリアゲノムDNAの一部、第2の植物種に由来するミトコンドリアゲノムDNAの一部は重複していてもよい。
融合細胞のミトコンドリアゲノムDNAは、第2の植物種のミトコンドリアゲノムDNAの5%以上100%以下を含むことが好ましく、20%以上100%以下を含むことがより好ましく、40%以上100%以下を含むことが更に好ましい。
融合細胞のミトコンドリアゲノムDNAの配列(100%)のうち、第1の植物種のミトコンドリアゲノムDNA由来の配列は、50%以上95%以下であることが好ましく、50%以上80%以下であることがより好ましい。
融合細胞のミトコンドリアゲノムDNAの配列(100%)のうち、第2の植物種のミトコンドリアゲノムDNA由来の配列は、5%以上50%以下であることが好ましく、10%以上50%以下であることがより好ましい。
更に、公知の塩基配列解析ソフトウェアを用いることにより、本実施形態に係る融合細胞のミトコンドリアゲノムDNAの配列に対して、第1の植物種のミトコンドリアゲノムDNAの配列、第1の植物種のミトコンドリアゲノムDNAの配列をマッピングすることができる。
本実施形態に係る融合細胞のプラスチドゲノムDNAにおいて、第1の植物種に由来するプラスチドゲノムDNAの一部、第2の植物種に由来するプラスチドゲノムDNAの一部は重複していてもよい。
融合細胞のプラスチドゲノムDNAは、第2の植物種のプラスチドゲノムDNAの3%以上100%以下を含むことが好ましく、5%以上100%以下を含むことが好ましく、10%以上100%以下を含むことがより好ましく、20%以上100%以下を含むことが更に好ましい。
融合細胞のプラスチドゲノムDNAの配列(100%)のうち、第1の植物種のプラスチドゲノムDNA由来の配列は、50%以上98%以下であることが好ましく、50%以上95%以下であることがより好ましい。
融合細胞のプラスチドゲノムDNAの配列(100%)のうち、第2の植物種のプラスチドゲノムDNA由来の配列は、2%以上50%以下であることが好ましく、5%以上50%以下であることがより好ましい。
更に、公知の塩基配列解析ソフトウェアを用いることにより、本実施形態に係る融合細胞のプラスチドゲノムDNAの配列に対して、第1の植物種のプラスチドゲノムDNAの配列、第1の植物種のプラスチドゲノムDNAの配列をマッピングすることができる。
第1の植物種及び/又は第2の植物種の分類群としては、融合細胞の製造方法において上述した分類群を挙げることができる。
第1の植物種及び/又は第2の植物種は、イネ科に属する植物種であることが好ましい。
第1の植物種及び/又は第2の植物種は、イネ科イチゴツナギ亜科、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科に属する植物種であることがより好ましい。
この場合、融合細胞は、イネ科イチゴツナギ亜科に属する植物種の卵細胞、イネ科エールハルタ亜科に属する植物種の卵細胞、及び、イネ科イチゴツナギ亜科に属する植物種の精細胞の融合細胞であることが好ましい。
この場合、融合細胞の核ゲノムDNAは、第1の植物種の核ゲノムDNAの70%以上を含むことが好ましく、80%以上を含むことがより好ましく、90%以上を含むことが更に好ましい。融合細胞を育成した植物体の核ゲノムDNAは、第2の植物種の核ゲノムDNAの3%以上を含むことが好ましく、5%以上を含むことがより好ましく、10%以上を含むことが更に好ましい。
1実施形態において、本発明は、上述の実施形態の融合細胞の製造方法で得られた融合細胞から育成された植物体を提供する。
融合細胞から植物体を育成する方法としては、特に限定されず、上述の植物体の育成方法であってもよい。
上述の一実施形態の融合細胞の製造方法によれば、互いに異なる2種類以上の植物種の卵細胞に含まれるミトコンドリアゲノムDNA、プラスチドゲノムDNA等の細胞質のゲノム情報を含むことにより、環境ストレス耐性の向上、収穫量の向上等の優良な形質を有する雑種植物を容易に得ることができる。
上述の一実施形態の融合細胞の製造方法により、遺伝子組み換えでない、既存の植物種の細胞を融合して製造された融合細胞及び植物体は、遺伝子組み換え植物には該当しないため、安全性評価試験等を受けることなく、容易に栽培可能である。
従来の、異なる植物種のプロトプラストを融合する雑種細胞作製方法では、アブラナ科、ナス科等の限られた植物種にのみ適用可能であった。これに対し、本発明の一実施に係る植物の融合細胞の製造方法は、多くの植物種に適用可能である。
電気融合による細胞融合の技術を用いることにより、異なる植物種の卵細胞、精細胞を容易に受精させて、雑種細胞を得ることができる。
(イネ卵細胞及びイネ精細胞の単離)
イネ卵細胞及びイネ精細胞の単離は、文献(Toda E et al. (2016) Electro-fusion of Gametes and Subsequent Culture of Zygotes in Rice. Bio-protocol. Vol 6, Iss 24, December 20, 2016.)に従って行った。
実験において用いたイネの種類は、Oryza sativa L.cv Nipponbareであった。
シリコン処理したカバーガラス上に0.3mLのミネラルオイルを滴下し、そのミネラルオイル中で、マイクロガラスキャピラリーを用いて数個の1~2μLのマンニトール水溶液(370mosmol/kg H2O)の液滴を作製した。
マンニトール水溶液(370mosmol/kg H2O)中で、開花前の花から子房を取り出し、マンニトール水溶液(370mosmol/kg H2O)中で、剃刀を用いて子房を切断した。続いて、ガラスニードルを用いて、イネ卵細胞を子房から放出させた。
得られたイネ卵細胞を、マイクロガラスキャピラリーを用いて、上述のカバーグラス上の液滴中へ移動させた。この卵細胞は、単離後6時間以内に各実験に使用した。また、当日に卵細胞を使わない場合は、4℃で一晩保存して、翌日、実験に使用した。
開花前の花から花粉を取り出し、花粉をマンニトール水溶液(370mosmol/kg H2O)中で破裂させて、精細胞を得た。
実験において用いたコムギの種類は、Triticum aestivum L.cv.Fieldersであった。
上述のイネ卵細胞及びイネ精細胞の単離方法と同様にして、コムギ卵細胞及びコムギ精細胞を単離した。
実験において用いたトウモロコシの種類は、トウモロコシ(B73又はA188)であった。
上述のイネ卵細胞及びイネ精細胞の単離方法と同様にして、トウモロコシ精細胞を単離した。
卵細胞及び精細胞を、上述のカバーグラス上の液滴に入れて、AC電流場(1MHz,5Vrms)において、電極に卵細胞を接着させた後、その卵細胞に精細胞を接着させた。
0.5~1μLのマンニトール水溶液(520mosmol/kg H2O)を液滴に加えた後、直流パルス(50μs、12~15kV/cm)をかけて細胞融合し、得られた融合細胞を回収した。
電気融合により得られた融合細胞を、マンニトール水溶液(450mosmol/kg H2O)で洗浄した。
続いて、Millicell-CMインサートに、0.2mLの受精卵培養用改変N6Z培地、融合細胞を入れ、融合細胞が入ったミリセルを、40~60μLのコムギ培養細胞(フィーダー細胞)を含む培地中で、26℃、一晩、暗所で培養した。
続いて、30rpmで振盪させながら、更に7日間培養した。
フィーダー細胞を除去した後、培養した融合細胞が入ったミリセルを、2mLの受精卵培養用培地に入れて、20日間、培養を続けた。
得られたカルスを、再分化および発根培地(Ishida, Y., Tsunashima, M., Hiei, Y., Komari, T. (2015) Wheat (Triticum aestivum L.) transformation using immature embryos. Methods Mol. Biol. 1223: 189-98.)で13時間/11時間の明/暗サイクルで、28℃でそれぞれ11~20日培養し、植物体を得た。
融合細胞のカルスを再分化させて得られた植物体の葉から、ゲノムDNAを分離した。得られたゲノムDNAを、Nextera DNA Flex Library Prep Kit(イルミナ)を用いてシークエンスライブラリーを作製した。得られたライブラリーについて、イルミナHiSeqX_Ten;Paired End 150bpでシークエンシングを行った。
シークエンシングにより得られたリードを、HomeoRoq(Akama et al., Genome-wide quantification of homeolog expression ratio revealed nonstochastic gene regulation in synthetic allopolyploid Arabidopsis. Nucleic Acids Research 42: e46 (2014))を用いてマッピングを行った。
単離したコムギ精細胞とイネ卵細胞とを、電気融合させて、第1の融合細胞を作出した。
続いて、得られた第1の融合細胞と、コムギ卵細胞とを、電気融合させて、第2の融合細胞を作出した。
得られた第2の融合細胞を培養してカルスを得た。得られたカルスを培養および栽培した結果、植物体が得られた。5個の第2の融合細胞のうち、3個が植物体を形成した。図7に得られた植物体の一例を示す。図7は、第2の融合細胞を作出時点から、119日後の植物体である。
この植物体からは、種子が得られた。この種子を発芽させて、栽培した結果、種子が得られた。
単離したイネ精細胞とイネ卵細胞とを、電気融合させて、第1の融合細胞を作出した。
単離したコムギ精細胞とコムギ卵細胞を、電気融合させて、第2の融合細胞を作出した。
続いて、得られた第1の融合細胞と、得られた第2の融合細胞とを、電気融合させて、第3の融合細胞を作出した。
得られた第3の融合細胞を培養してカルスを得た。得られたカルスを培養および栽培した結果、植物体が得られた。7個の第3の融合細胞のうち、5個が植物体を形成した。図8に得られた植物体の一例を示す。図8は、第3の融合細胞を作出時点から、121日後の植物体(図8の左)、120日後の植物体(図8の中央)、117日後の植物体(図8の右)である。
これらの植物体からは、種子が得られた。この種子を発芽させて、栽培した結果、種子が得られた。
4倍体のイネから単離したイネ精細胞と、コムギ卵細胞とを、電気融合させて、融合細胞を作出した。
得られた融合細胞を培養してカルスを得た。得られたカルスを培養および栽培した結果、植物体が得られた。10個の融合細胞のうち、3個が植物体を形成した。図9に得られた植物体の一例を示す。
この植物体からは、種子が得られた。
トウモロコシから単離した精細胞と、コムギ卵細胞とを、電気融合させて、融合細胞を作出した。
得られた融合細胞を培養してカルスを得た。得られたカルスを培養および栽培した結果、植物体が得られた。7個の融合細胞のうち、5個が植物体を形成した。図10に得られた植物体の成長過程を示す。図10中、DAFは、融合細胞の作出時点から経過した日数を示す。
コムギ卵細胞と、イネ卵細胞と、コムギ精細胞とを融合させて得られた受精細胞を培養し、植物体を得た。得られた植物体の葉から、ゲノムDNAを分離し、ゲノムDNAの配列を解析し、マッピングを行った。
上述の葉の核ゲノムDNAは、6倍体のコムギの核ゲノムDNAの95%以上と、2倍体のイネの核ゲノムDNAの3~10%を有していることが明らかになった。
上述の葉のミトコンドリアゲノムDNAは、コムギミトコンドリアゲノムDNAのほぼ全てと、イネミトコンドリアゲノムDNAの半分程度を有していた。
上述の葉のプラスチドゲノムDNAは、コムギプラスチドゲノムDNAのほぼ全てと、イネプラスチドゲノムDNAの10%程度を有していた。
6倍体のコムギの核ゲノムDNAのサイズは、2倍体のイネの核ゲノムDNAのサイズの約40倍である。
コムギのミトコンドリアゲノムDNAのサイズは、イネのミトコンドリアゲノムDNAのサイズとほぼ同じである。
コムギのプラスチドゲノムDNAのサイズは、イネのプラスチドゲノムDNAのサイズとほぼ同じである。
上述の葉の核ゲノムDNAの約99.8%がコムギの核ゲノムDNA由来であり、葉の核ゲノムDNAの約0.2%がイネの核ゲノムDNA由来であった。
上述の葉のミトコンドリアゲノムDNAの約65%がコムギのミトコンドリアゲノムDNA由来であり、葉のミトコンドリアゲノムDNAの約35%がイネのミトコンドリアゲノムDNA由来であった。
上述の葉のプラスチドゲノムDNAの約95%がコムギのプラスチドゲノムDNA由来であり、葉のプラスチドゲノムDNAの約5%がイネのプラスチドゲノムDNA由来であった。
図12中、ミトコンドリアゲノムDNAのグラフは、葉のミトコンドリアゲノムDNAの全体の配列数に対する、イネ由来のミトコンドリアゲノムDNAの配列数の割合、コムギ由来のミトコンドリアゲノムDNAの配列数の割合を示す。また、プラスチドゲノムDNAのグラフは、葉のプラスチドゲノムDNAの全体の配列数に対する、イネ由来のプラスチドゲノムDNAの配列数の割合、及び、コムギ由来のプラスチドゲノムDNAの配列数の割合を示す。
図12に示すように、上述の葉のプラスチドゲノムDNAの約75~95%がコムギのプラスチドゲノムDNA由来であり、葉のプラスチドゲノムDNAの約5~25%がイネのプラスチドゲノムDNA由来であった。
Cybrid植物(Cybrid-1~Cybrid-3)において、ミトコンドリアゲノムDNAは、コムギミトコンドリアゲノムDNAのほぼ全てと、イネミトコンドリアゲノムDNAの12~65%を有していた。
なお、コムギのミトコンドリアゲノムDNAのサイズは、イネのミトコンドリアゲノムDNAのサイズとほぼ同じである。
なお、コムギのプラスチドゲノムDNAのサイズは、イネのプラスチドゲノムDNAのサイズとほぼ同じである。
この融合細胞、融合細胞の製造方法、細胞塊、植物体及び植物体の製造方法は、農業、園芸において有用である。
Claims (17)
- 植物の卵細胞又はそれに由来する細胞と、植物の精細胞又はそれに由来する細胞と、を融合させて、融合細胞を得る工程を含む、融合細胞の製造方法。
- 前記卵細胞は、互いに異なる2種類以上の植物種の卵細胞を含む、請求項1に記載の製造方法。
- 前記卵細胞の由来する植物種が属する分類群と、前記精細胞の由来する植物種が属する分類群とは、同一の亜科以下の分類群に属する、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記卵細胞は、イネ科に属する植物種の卵細胞である、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記卵細胞は、イネ科イチゴツナギ亜科、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科に属する植物種の卵細胞である、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法で得られた融合細胞を培養して、細胞塊を得る工程を含む、細胞塊の製造方法。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法で得られた融合細胞から、植物体を生産する工程を含む、植物体の製造方法。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法で得られた融合細胞。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法で得られた融合細胞から育成された植物体。
- 植物の卵細胞又はそれに由来する細胞と、植物の精細胞又はそれに由来する細胞と、を融合させた細胞の核ゲノムDNAが、第1の植物種の核ゲノムDNAの全部又は一部を有し、
前記融合細胞の核ゲノムDNAが、第2の植物種の核ゲノムDNAの30%以下を有し、
前記第1の植物種と前記第2の植物種が異なる、融合細胞。 - 前記融合細胞のミトコンドリアゲノムDNAが、第1の植物種のミトコンドリアゲノムDNAの一部又は全部、及び、第2の植物種のミトコンドリアゲノムDNAの一部又は全部を有する、請求項10に記載の融合細胞。
- 前記融合細胞のプラスチドゲノムDNAが、前記第1の植物種のプラスチドゲノムDNAの一部又は全部、及び、前記第2の植物種のプラスチドゲノムDNAの一部又は全部を有する、請求項10又は11に記載の融合細胞。
- 前記融合細胞は、植物の卵細胞又はそれに由来する細胞と、植物の精細胞又はそれに由来する細胞との融合細胞である、請求項10~12のいずれか一項に記載の融合細胞。
- 前記第1の植物種及び/又は前記第2の植物種は、イネ科に属する植物種である、請求項10~13のいずれか一項に記載の融合細胞。
- 前記第1の植物種及び/又は前記第2の植物種は、イネ科イチゴツナギ亜科、イネ科エールハルタ亜科又はイネ科キビ亜科に属する植物種である、請求項10~14のいずれか一項に記載の融合細胞。
- 前記第1の植物種は、イネ科イチゴツナギ亜科に属する植物種であり、
前記第2の植物種は、イネ科エールハルタ亜科に属する植物種である、請求項10~15のいずれか一項に記載の融合細胞。 - 請求項10~16のいずれか一項に記載の融合細胞から育成された植物体。
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