JPS6265631A - プロトプラスト融合による細胞質性雄性不稔維持ラインの調製法 - Google Patents
プロトプラスト融合による細胞質性雄性不稔維持ラインの調製法Info
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- JPS6265631A JPS6265631A JP61209382A JP20938286A JPS6265631A JP S6265631 A JPS6265631 A JP S6265631A JP 61209382 A JP61209382 A JP 61209382A JP 20938286 A JP20938286 A JP 20938286A JP S6265631 A JPS6265631 A JP S6265631A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業−■−の利用分野
本発明は、細胞資性雄性不稔維持ライン（系統または株
） Ｙ ？５る方法、さらに詳しくは、プロトプラスト
（原形質体）融合によって維持ライン（ｍａｉｎｔａｉ
ｎｅｒ １ｉｎｅ ） ｆ製造する方法に関する。
） Ｙ ？５る方法、さらに詳しくは、プロトプラスト
（原形質体）融合によって維持ライン（ｍａｉｎｔａｉ
ｎｅｒ １ｉｎｅ ） ｆ製造する方法に関する。
従来技ｆ・ト■
植物栽培家達は、長い間、食物として用いるか、あるい
は、飼料、繊維または医薬に加Ｔする上でよ０市要な農
作物の生産性を高めるために、特に望ましい性質を有す
る栽培種（ｃａｌｔｉｖａｒｓ ） （栽培のための度
神）を開発するよう努力をしてきた。
は、飼料、繊維または医薬に加Ｔする上でよ０市要な農
作物の生産性を高めるために、特に望ましい性質を有す
る栽培種（ｃａｌｔｉｖａｒｓ ） （栽培のための度
神）を開発するよう努力をしてきた。
この目的をしばしば痒成し得た方法の１つは、既存の栽
培種に望ましい特徴を融合させ、例外的な特質を有する
ハイブリッドが形成され得る様にして、優れた植物系統
を得る方法である。一般に、Ｆｌ ハイブリッドがいず
れの親株よりも優れているということは、様々なタイプ
の農作物に広くあてはまる状況である。この卓越性は、
丈、成長速度、葉部面積やｌ？期開花の増７１１１並び
に全体的な収率の向１ユとして現われる。
培種に望ましい特徴を融合させ、例外的な特質を有する
ハイブリッドが形成され得る様にして、優れた植物系統
を得る方法である。一般に、Ｆｌ ハイブリッドがいず
れの親株よりも優れているということは、様々なタイプ
の農作物に広くあてはまる状況である。この卓越性は、
丈、成長速度、葉部面積やｌ？期開花の増７１１１並び
に全体的な収率の向１ユとして現われる。
従来の優秀な植物ラインの牛ｌ’ｒ’＆痒成し得たｌｉ
法は、竪しい数の交配授粉を１−作Ｙ、で行い、Ｉ！ｔ
＋′？＜のＦｌ ハイブリッド’ｓ’ ？：＋る方法で
ある。一般に、これらの交配は、既存の栽培作物神と、
該栽培種に対して、栽培室が導入したいと願っている１
またはそれ以上の特徴ヲ持った未改良の、あるいは「野
生型」の遺伝子供与体との間で行われる。ト。
法は、竪しい数の交配授粉を１−作Ｙ、で行い、Ｉ！ｔ
＋′？＜のＦｌ ハイブリッド’ｓ’ ？：＋る方法で
ある。一般に、これらの交配は、既存の栽培作物神と、
該栽培種に対して、栽培室が導入したいと願っている１
またはそれ以上の特徴ヲ持った未改良の、あるいは「野
生型」の遺伝子供与体との間で行われる。ト。
の生産が達１戎されたならば、次には、栽培種の全特？
Ｉ！ｖ含むと共に、「野生型」植物から導入された新ら
しい、望ましい性τ↓ケも保持している植物を最終的に
得るために、仄し交配と選択とを繰り返して行う必要が
ある。容易に理解しつるように、この選択工程は障めて
煩雑であり、時間のかかることだが、この方法は、その
困怖さにも拘らず、現在最も広範に行われている植物栽
培法の１つである。
Ｉ！ｖ含むと共に、「野生型」植物から導入された新ら
しい、望ましい性τ↓ケも保持している植物を最終的に
得るために、仄し交配と選択とを繰り返して行う必要が
ある。容易に理解しつるように、この選択工程は障めて
煩雑であり、時間のかかることだが、この方法は、その
困怖さにも拘らず、現在最も広範に行われている植物栽
培法の１つである。
この方法に含まれる問題点の故に、Ｎ′１ハイブリッド
をより効率良く製造するために数多くの他の手段が追求
されてきたし、今日も求められている。最も含欲に追求
され、努力が払われている分野は、雑種形成（ハイブリ
ダイゼーション）の望まれている種々の農作物植物で、
雄性の不稔性ラインな組立てることに関する。雄性不稔
性ラインの開発の背後にある原理は、ハイブリッド種子
をより経済的に生産する上で、花形前、とりわけ完全孔
による、強制的な、制御下における交雑−授粉に対する
制限を克服しなければならない、という点にある。この
目的のためには、雌性親株が自己授粉、あるいは系統内
授粉することを妨げる必要がある。自己授粉を排斥する
には、例えば、植物が、生長し得る花粉を産生じ得なく
することにより、雄性株の不稔化を図る必要がある。こ
うして雄性不稔性ラインが得られたならば、農作物変種
と、事実−Ｌ全での、所望の性質を有する遺伝子供４体
との雑種形成を容易に行うことができ、面倒な手作業の
授粉を行う必要がなくなる。
をより効率良く製造するために数多くの他の手段が追求
されてきたし、今日も求められている。最も含欲に追求
され、努力が払われている分野は、雑種形成（ハイブリ
ダイゼーション）の望まれている種々の農作物植物で、
雄性の不稔性ラインな組立てることに関する。雄性不稔
性ラインの開発の背後にある原理は、ハイブリッド種子
をより経済的に生産する上で、花形前、とりわけ完全孔
による、強制的な、制御下における交雑−授粉に対する
制限を克服しなければならない、という点にある。この
目的のためには、雌性親株が自己授粉、あるいは系統内
授粉することを妨げる必要がある。自己授粉を排斥する
には、例えば、植物が、生長し得る花粉を産生じ得なく
することにより、雄性株の不稔化を図る必要がある。こ
うして雄性不稔性ラインが得られたならば、農作物変種
と、事実−Ｌ全での、所望の性質を有する遺伝子供４体
との雑種形成を容易に行うことができ、面倒な手作業の
授粉を行う必要がなくなる。
雄性不稔株は、様々な方法で確立され得る。手による去
勢は、ある系統を不稔化することのできる】方法である
。例えば、雑種とうもろこしの大規模生産は、雌性植物
のふさ状７Ｌ序を除去することにより行うことができる
か、完全花ヲ七する種における大規模な去勢は、経済的
に実行李ｉ’ｉＪ能であることが普通である。
勢は、ある系統を不稔化することのできる】方法である
。例えば、雑種とうもろこしの大規模生産は、雌性植物
のふさ状７Ｌ序を除去することにより行うことができる
か、完全花ヲ七する種における大規模な去勢は、経済的
に実行李ｉ’ｉＪ能であることが普通である。
遺伝的な雄性不稔は、通常、様々なタイプの植物におい
て、劣性の一遺伝子性特性として遺伝される特徴である
ことも知られている。この性＠を利用し、大麦、トマト
、コシヨウ、マリーゴールド、ヒャクニチソウ、その他
の雑種種子の生産が行われている。しかしながら、この
方法の使用には基本的な欠点（即ち、遺伝的な不稔性雄
性植物を１００％得ることが困難である）がある。この
困難を克服するには、より功妙な遺伝操作を用いる相当
複雑な王権が要求される。従って、今日、この方法の使
用は、細胞質性雄性不稔が児出されていない栽培植物、
あるいは、雄性不稔性原形質型が耕種掌上劣性の性質を
示す様な栽培植物について、雑種神子を生産する場合に
限定されている。
て、劣性の一遺伝子性特性として遺伝される特徴である
ことも知られている。この性＠を利用し、大麦、トマト
、コシヨウ、マリーゴールド、ヒャクニチソウ、その他
の雑種種子の生産が行われている。しかしながら、この
方法の使用には基本的な欠点（即ち、遺伝的な不稔性雄
性植物を１００％得ることが困難である）がある。この
困難を克服するには、より功妙な遺伝操作を用いる相当
複雑な王権が要求される。従って、今日、この方法の使
用は、細胞質性雄性不稔が児出されていない栽培植物、
あるいは、雄性不稔性原形質型が耕種掌上劣性の性質を
示す様な栽培植物について、雑種神子を生産する場合に
限定されている。
細胞質性雄性不稔により、雑種形成に用いられる所望の
系統を得る、別の機構が４太られる。この状況において
、雄性不稔ヲコントロールする遺伝的な因子は細胞質内
に見出される。通常、この特徴はミトコンドリア巾の遺
伝トに随伴していると考えられている。細胞質性雄性不
稔ラインの用途として、雑種種子の生産における応用は
、早くに見出された。この特徴に括つく広範な生産は、
サトウモロコシ、テンサイ、オニオンおよびメロン等の
重要な栽培植物な高収率で得ることに関連しているが、
トウモロコシに関して最も好首尾である。この方法は、
広（人気があるにもかかわらず、一度得られた雄性不稔
ラインの水続性に関連する多くの困難ヲ温存している。
系統を得る、別の機構が４太られる。この状況において
、雄性不稔ヲコントロールする遺伝的な因子は細胞質内
に見出される。通常、この特徴はミトコンドリア巾の遺
伝トに随伴していると考えられている。細胞質性雄性不
稔ラインの用途として、雑種種子の生産における応用は
、早くに見出された。この特徴に括つく広範な生産は、
サトウモロコシ、テンサイ、オニオンおよびメロン等の
重要な栽培植物な高収率で得ることに関連しているが、
トウモロコシに関して最も好首尾である。この方法は、
広（人気があるにもかかわらず、一度得られた雄性不稔
ラインの水続性に関連する多くの困難ヲ温存している。
一般に、一度細胞質性雄性不稔（ｃＭＳ）ラインが生産
されれば、それを、一連の戻し交雑により維持させる必
要かある。言うまでもなく、これは非常に時間のかかる
困難な王稈であるが、更に、同一の核を持つ雄性不稔ラ
インが得られなければ、ＣＭＳラインの核遺伝子の完全
さを保ＳＩＦすることはできないという問題もある。こ
の様に、雑種種子の製造におけるＣ Ｍ Ｓラインの使
用は極めて有用かつ一般的であるか、この方法を最も効
率良く利用するには、得られたＣ Ｍ Ｓラインを維持
するためのより簡単な方法が９（まれることは明らかで
ある。
されれば、それを、一連の戻し交雑により維持させる必
要かある。言うまでもなく、これは非常に時間のかかる
困難な王稈であるが、更に、同一の核を持つ雄性不稔ラ
インが得られなければ、ＣＭＳラインの核遺伝子の完全
さを保ＳＩＦすることはできないという問題もある。こ
の様に、雑種種子の製造におけるＣ Ｍ Ｓラインの使
用は極めて有用かつ一般的であるか、この方法を最も効
率良く利用するには、得られたＣ Ｍ Ｓラインを維持
するためのより簡単な方法が９（まれることは明らかで
ある。
近年、雑種神子の生産におけるＣＭＳ特性の重要性の故
に、該特性の関１ｊする機構、並ひにそれをコントロー
ルしているオルガ不う（細胞小器官）の分布パターンに
関して多大の研究かなされてきた。例えば、フリック（
Ｆｌｉｃｋ ）らは、タ／マコ属（Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ
）の異種間プロトプラスト融合によるサイプ１１ツド
（細胞雑種）の生産に関して記載しており、サイブリッ
ド融合ｆ１ｒ物からｉｒｆ生された植物中でのオルガ不
う特性（その内、ＣＭＳ特性は唯一つ）の分離パターン
を観察したと述べている〔バイオテクノロジ４ （Ｒｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ） ３：５５５−５５９（１
９８５）３゜同様に、アビブ（Ａｖｉｖ ）らも、Ｘ′
ｍ照射細胞を用いてタバコ属の異種間プロトプラスト融
合を行って、オルガ不うと関連した特性の種間における
転移の可能性を決定することを試みた〔セオレット・了
プル・ジエ不テ（−１１１ｅｏｒｅｔ、 Ａ１１ｌｌｌ
、 Ｇｅｎｅｔ、）５８ ： １２１−１２７．１９８
０〕。 その他、数多くの著者により、ＣＭＳ特性の転
移のための、様々な植物の異なった種間における体細胞
ノ１イブリダイゼーションが報告されている。しかしな
がら、オルガ不う特性の分離パターンに関する知識の著
しい増加の下においてさえ、新らしい情報に対する考察
は、極めて理論的なレベルにあり、実用面での応用や、
植物栽培におけるＣＭＳ特性の営業上の利用ケより動量
的なものとするのに有用な、営業用変種の生産もなされ
ていない。
に、該特性の関１ｊする機構、並ひにそれをコントロー
ルしているオルガ不う（細胞小器官）の分布パターンに
関して多大の研究かなされてきた。例えば、フリック（
Ｆｌｉｃｋ ）らは、タ／マコ属（Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ
）の異種間プロトプラスト融合によるサイプ１１ツド
（細胞雑種）の生産に関して記載しており、サイブリッ
ド融合ｆ１ｒ物からｉｒｆ生された植物中でのオルガ不
う特性（その内、ＣＭＳ特性は唯一つ）の分離パターン
を観察したと述べている〔バイオテクノロジ４ （Ｒｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ） ３：５５５−５５９（１
９８５）３゜同様に、アビブ（Ａｖｉｖ ）らも、Ｘ′
ｍ照射細胞を用いてタバコ属の異種間プロトプラスト融
合を行って、オルガ不うと関連した特性の種間における
転移の可能性を決定することを試みた〔セオレット・了
プル・ジエ不テ（−１１１ｅｏｒｅｔ、 Ａ１１ｌｌｌ
、 Ｇｅｎｅｔ、）５８ ： １２１−１２７．１９８
０〕。 その他、数多くの著者により、ＣＭＳ特性の転
移のための、様々な植物の異なった種間における体細胞
ノ１イブリダイゼーションが報告されている。しかしな
がら、オルガ不う特性の分離パターンに関する知識の著
しい増加の下においてさえ、新らしい情報に対する考察
は、極めて理論的なレベルにあり、実用面での応用や、
植物栽培におけるＣＭＳ特性の営業上の利用ケより動量
的なものとするのに有用な、営業用変種の生産もなされ
ていない。
徹底したもどし交雑を行なうことなく細胞質性雄性不稔
維持ラインを作成し得ることが見い出された。事実、本
発明は、実質的に１工程で維持ラインを作成する方法を
提供するものである。これは、雄性不稔性ラインからの
プロトプラストの細胞質としてＣＭＳラインのプロトプ
ラストからの核ケ結合させることからなるプロトプラス
ト融合法によって達成される。得られた細胞質／Ａイブ
リッド、即ちサイブリッド（細胞質雑種）は、所望の雄
性不稔性ラインの核ゲノムケ持っているのが生殖能も有
する。この融合産物を成熟植物に入れて再生させること
により作成したこの新規な卸性不捻「維持」ラインは、
雌親として働く雄性不稔体と交雑してもよい：細胞質の
ｆ″Ｊ性遺伝の故に、生じる後代は全て雄性不稔となろ
う。従って、もどし交雑を行なうことなく、そしてまた
、ＣＭＳラインの望ましい核の特色の完全さを失なう危
険を伴なうことなく、雄性不稔性ラインケ容易に増殖さ
せることができる。従って、この方法は、細胞質性雄性
不稔植物ラインを維持するための公知の方法ヲ芹しく改
善したものである。
維持ラインを作成し得ることが見い出された。事実、本
発明は、実質的に１工程で維持ラインを作成する方法を
提供するものである。これは、雄性不稔性ラインからの
プロトプラストの細胞質としてＣＭＳラインのプロトプ
ラストからの核ケ結合させることからなるプロトプラス
ト融合法によって達成される。得られた細胞質／Ａイブ
リッド、即ちサイブリッド（細胞質雑種）は、所望の雄
性不稔性ラインの核ゲノムケ持っているのが生殖能も有
する。この融合産物を成熟植物に入れて再生させること
により作成したこの新規な卸性不捻「維持」ラインは、
雌親として働く雄性不稔体と交雑してもよい：細胞質の
ｆ″Ｊ性遺伝の故に、生じる後代は全て雄性不稔となろ
う。従って、もどし交雑を行なうことなく、そしてまた
、ＣＭＳラインの望ましい核の特色の完全さを失なう危
険を伴なうことなく、雄性不稔性ラインケ容易に増殖さ
せることができる。従って、この方法は、細胞質性雄性
不稔植物ラインを維持するための公知の方法ヲ芹しく改
善したものである。
本発明は、再生し得る種の細胞質性雄性不稔ラインの増
殖方法であって、細胞宵性雄性不槍ラインのプロトプラ
スト由来の核と雄性生殖ラインの細胞質をプロトプラス
ト融合により結合させて雄性生殖サイブリッドを生成せ
しめ、該サイブリッドを雄性生殖成熟植物に入れて再生
し、該雄性生殖植物を細胞質性雄性不稔ラインからの植
物と交雑させて細胞質性雄性不稔後代ケ１１）ることが
らなる方法に関するものである。本発明はまた、増殖に
使用される維持ラインケ作成するための上記プロトプラ
スト融合法に関するものである。本発明はまた、この様
にして作成された維持ライン、および交雑によって作成
された雄性不稔後代に関するものである。
殖方法であって、細胞宵性雄性不槍ラインのプロトプラ
スト由来の核と雄性生殖ラインの細胞質をプロトプラス
ト融合により結合させて雄性生殖サイブリッドを生成せ
しめ、該サイブリッドを雄性生殖成熟植物に入れて再生
し、該雄性生殖植物を細胞質性雄性不稔ラインからの植
物と交雑させて細胞質性雄性不稔後代ケ１１）ることが
らなる方法に関するものである。本発明はまた、増殖に
使用される維持ラインケ作成するための上記プロトプラ
スト融合法に関するものである。本発明はまた、この様
にして作成された維持ライン、および交雑によって作成
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既述した様に、細胞質性雄性不稔ラインは、存在する所
望の特色が１代以−Ｌ水続するためには、生殖維持ライ
ンかより多くのＣＭＳラインを生産インを、雄性不稔性
子孫を産出するＣＭＳラインと交雑させることにより達
１戊されて来た。本発明の維持ラインは、本質的には同
様に作用するが、雄性不稔ラインと同質遺伝子であるラ
インを達成する必要性のないものである。
望の特色が１代以−Ｌ水続するためには、生殖維持ライ
ンかより多くのＣＭＳラインを生産インを、雄性不稔性
子孫を産出するＣＭＳラインと交雑させることにより達
１戊されて来た。本発明の維持ラインは、本質的には同
様に作用するが、雄性不稔ラインと同質遺伝子であるラ
インを達成する必要性のないものである。
この維持ラインは、細胞質性雄性不稔核を雄性生殖ライ
ンの細胞質と結合させるプロトプラスト融合法により生
産される。この方法では、プロトプラスト、細胞壁を除
去した植物細胞をまず得なければならない。プロトプラ
ストの分離は、多くの既知の方法で行なうことかできる
。通常これは、各種の植物門ｆｉｇ酵素処理してプロト
プラストを作成することにより行なわれる。通常使用さ
れる酵素にはセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチ
ナーゼがある。使用される酵素（類）は、使者の知ると
ころで釣る。プロトプラストの分離および培養に関する
多数の技イホｆが科学文献によく記載されている。これ
らの多くの公知の方法は、ハンドブック・オブ・プラン
ト・セル・カルチャー［（ｌ１ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
ｌ’１ａｎｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅ ）
、第１巻、４章、表４および７．１９８３年、エバンス
（Ｅｖａｎｓ ）らにより編集〕にまとめられている。
ンの細胞質と結合させるプロトプラスト融合法により生
産される。この方法では、プロトプラスト、細胞壁を除
去した植物細胞をまず得なければならない。プロトプラ
ストの分離は、多くの既知の方法で行なうことかできる
。通常これは、各種の植物門ｆｉｇ酵素処理してプロト
プラストを作成することにより行なわれる。通常使用さ
れる酵素にはセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチ
ナーゼがある。使用される酵素（類）は、使者の知ると
ころで釣る。プロトプラストの分離および培養に関する
多数の技イホｆが科学文献によく記載されている。これ
らの多くの公知の方法は、ハンドブック・オブ・プラン
ト・セル・カルチャー［（ｌ１ａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
ｌ’１ａｎｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅ ）
、第１巻、４章、表４および７．１９８３年、エバンス
（Ｅｖａｎｓ ）らにより編集〕にまとめられている。
まれに分離したプロトプラストが自然に融合することが
ある。しかし、プロトプラスト融合を所望レベルで誘導
するには化学的処置が必要であるのが普通である。融合
ケ行なわせるのに最も普通の方法はプロトプラスト混合
物にポリエチレング（］２） リコール（ＰＥＧ）を添加することである。ＰＥＧで処
理するとプロトプラストが凝集し、これが、カルシウム
の存在下かつ高いｐＨ、好ましくは少なくともｌＯｌに
おいで、溶出する間に融合する。
ある。しかし、プロトプラスト融合を所望レベルで誘導
するには化学的処置が必要であるのが普通である。融合
ケ行なわせるのに最も普通の方法はプロトプラスト混合
物にポリエチレング（］２） リコール（ＰＥＧ）を添加することである。ＰＥＧで処
理するとプロトプラストが凝集し、これが、カルシウム
の存在下かつ高いｐＨ、好ましくは少なくともｌＯｌに
おいで、溶出する間に融合する。
分子ｉｌｌ ５４０のＰ Ｅ Ｇが使用されることが多
いが、これは広い範囲内で変えることができる。プロト
プラスト融合法に必要な典型的な溶液の例は、表１に記
載されている。ＰＥＧｙ使用する融合法は、それが唯一
の有用な方法であるという訳ではないが、特に好ましい
方法である。というのは、この方法は非特異的であり、
種円および種間ハイブリッドの両者を作成するのに都合
よく使用されて来た方法であるからである。カオ（Ｋａ
ｏ）およびミカイラツク（Ｍｉｃｈａｙｌ ｕｋ ）に
よって記載されテイル方法［７’ ラン９ （Ｐｌａｎ
ｔａ ）、１１５；３５５−３６７．１９７４年］に従
ってプロトプラスト融合を行なう典型的なプロトコール
を表２に示す。
いが、これは広い範囲内で変えることができる。プロト
プラスト融合法に必要な典型的な溶液の例は、表１に記
載されている。ＰＥＧｙ使用する融合法は、それが唯一
の有用な方法であるという訳ではないが、特に好ましい
方法である。というのは、この方法は非特異的であり、
種円および種間ハイブリッドの両者を作成するのに都合
よく使用されて来た方法であるからである。カオ（Ｋａ
ｏ）およびミカイラツク（Ｍｉｃｈａｙｌ ｕｋ ）に
よって記載されテイル方法［７’ ラン９ （Ｐｌａｎ
ｔａ ）、１１５；３５５−３６７．１９７４年］に従
ってプロトプラスト融合を行なう典型的なプロトコール
を表２に示す。
既述した様に、ポリビニルアルコールおよび各種のＰＥ
Ｃ，誘導体の様なその他の化学薬品もプロトプラスト融
合を誘導するのに有用であることが知られているが、Ｐ
ＥＧを使用した時に最も良い結果が得られる。
Ｃ，誘導体の様なその他の化学薬品もプロトプラスト融
合を誘導するのに有用であることが知られているが、Ｐ
ＥＧを使用した時に最も良い結果が得られる。
上記の方法により、多数の可能な融合生成物が得られる
。１つの可能性は、２つの別々のラインの核が融合し、
体細胞７％イブリッドを形成することである。本発明に
於いては、多くの場合、この様なことは望ましくない。
。１つの可能性は、２つの別々のラインの核が融合し、
体細胞７％イブリッドを形成することである。本発明に
於いては、多くの場合、この様なことは望ましくない。
というのは、それは、ＣＭＳゲノムの完全さを維持する
望ましい結果を挫折させるからである。従って、本発明
の目的に照らして好ましい産物は、サイブリッド、核の
融合が起っていない融合産物である。得られたプロトプ
ラストの中で、どれが実際の融合産物であるか、更に、
どれがノ）イブリッドでなくてサイブリッドであるかを
肉眼で区別することは、少なくとも表面的には無理であ
るので、ある種のマーカー系をその方法に導入すること
が望ましい。融合産物を親プロトプラストから分離する
ことは、やっかいではあるが、形態学的にはつきりした
親プロトプラスｌ−使って比較的容易に行なうことがで
きる。例えばクロロフィル含有プロトプラストを△ と融合させると、容易に同定し得る融合産物が得られる
。しかし、融合産物の同定はサイブリッドの同定はど厳
格なものではない。これは、核の融合が起ったプロトプ
ラス）４同定して除去するために遺伝的＋ｎ補性の存在
を利用することによって最も容易に行なうことができる
。例えば、多くの植物種は、単独で存在している時、植
物をアルピノにする、核に基つくクロロフィル欠損を示
す。
望ましい結果を挫折させるからである。従って、本発明
の目的に照らして好ましい産物は、サイブリッド、核の
融合が起っていない融合産物である。得られたプロトプ
ラストの中で、どれが実際の融合産物であるか、更に、
どれがノ）イブリッドでなくてサイブリッドであるかを
肉眼で区別することは、少なくとも表面的には無理であ
るので、ある種のマーカー系をその方法に導入すること
が望ましい。融合産物を親プロトプラストから分離する
ことは、やっかいではあるが、形態学的にはつきりした
親プロトプラスｌ−使って比較的容易に行なうことがで
きる。例えばクロロフィル含有プロトプラストを△ と融合させると、容易に同定し得る融合産物が得られる
。しかし、融合産物の同定はサイブリッドの同定はど厳
格なものではない。これは、核の融合が起ったプロトプ
ラス）４同定して除去するために遺伝的＋ｎ補性の存在
を利用することによって最も容易に行なうことができる
。例えば、多くの植物種は、単独で存在している時、植
物をアルピノにする、核に基つくクロロフィル欠損を示
す。
しかし、この特徴が、正常な青色の遺伝情報と共に存在
していると、得られた植物は正常より明るい緑となるこ
とが多いので、核の融合が起ったプロトプラスト由来の
これらの植物を容易に同定することができる。同様に、
ある種の抗生物質、例えばリンコマイシンまたはストレ
プトマイシンに耐性を有する突然変異植物を使用するこ
ともできる。種々の植物種には、この様な広範囲の特徴
が存在しているので（表３参照）、ＣＭＳ親の遺伝構成
が与えられれば、どの様な特徴ヲマーカーとして有用に
使用し得るかは、当業者の技術的範囲にある。もう１つ
重要なこととして、雄性生殖細胞質とＣＭＳプロトプラ
ストとの融合は、得られた再生植物が雄性生殖体である
か雄性不稔体であるかを観察することにより簡単に証明
することができる。再生植物が不稔であることが観察さ
れたら、選択された核マーカー特色の外観と合せて、ｃ
Ｎｉｓ核と生殖細胞質の所望の融合が起ったプロトプラ
スト由来の植物を直ちに同定する。これらの成熟植物が
、所望の維持ラインである。これらの植物を、もとのＣ
ＭＳ植物ラインとの交雑に於ける雄親として使用するこ
とができ、細胞質の厳格な母性遺伝の故に、全て細胞質
性雄性不稔である後代を生産することができる。
していると、得られた植物は正常より明るい緑となるこ
とが多いので、核の融合が起ったプロトプラスト由来の
これらの植物を容易に同定することができる。同様に、
ある種の抗生物質、例えばリンコマイシンまたはストレ
プトマイシンに耐性を有する突然変異植物を使用するこ
ともできる。種々の植物種には、この様な広範囲の特徴
が存在しているので（表３参照）、ＣＭＳ親の遺伝構成
が与えられれば、どの様な特徴ヲマーカーとして有用に
使用し得るかは、当業者の技術的範囲にある。もう１つ
重要なこととして、雄性生殖細胞質とＣＭＳプロトプラ
ストとの融合は、得られた再生植物が雄性生殖体である
か雄性不稔体であるかを観察することにより簡単に証明
することができる。再生植物が不稔であることが観察さ
れたら、選択された核マーカー特色の外観と合せて、ｃ
Ｎｉｓ核と生殖細胞質の所望の融合が起ったプロトプラ
スト由来の植物を直ちに同定する。これらの成熟植物が
、所望の維持ラインである。これらの植物を、もとのＣ
ＭＳ植物ラインとの交雑に於ける雄親として使用するこ
とができ、細胞質の厳格な母性遺伝の故に、全て細胞質
性雄性不稔である後代を生産することができる。
上記の方法は、広範囲の植物について、都合よく適用す
ることができる。２つの種からのプロトプラス）ｆ融合
することができ、事実、多くの生存力のある膜間融合産
物さえ知られている。一般的に言えば、使用する植物の
タイプに関係なく、融合法は工程を制限するプロセスで
はない。この方法を適用する上の第１の制限は、融合し
たプロドプラストが成熟植物に於いて再生できなければ
ならないことである。多くの状況下に於いて、２個のセ
ルラインが関係の深い種どうしである場合に再生の成功
率が高いことが観察されている。このことから、細胞質
供与体の可能な選択についてはある程度制限があり、Ｃ
ＭＳ植物と同じ属のものであることが好ましい。
ることができる。２つの種からのプロトプラス）ｆ融合
することができ、事実、多くの生存力のある膜間融合産
物さえ知られている。一般的に言えば、使用する植物の
タイプに関係なく、融合法は工程を制限するプロセスで
はない。この方法を適用する上の第１の制限は、融合し
たプロドプラストが成熟植物に於いて再生できなければ
ならないことである。多くの状況下に於いて、２個のセ
ルラインが関係の深い種どうしである場合に再生の成功
率が高いことが観察されている。このことから、細胞質
供与体の可能な選択についてはある程度制限があり、Ｃ
ＭＳ植物と同じ属のものであることが好ましい。
本発明方法は、ソラナケア（５ｏｌａｎａｃｅａｅ ）
科の植物（トマト、じゃがいも、こしよう、ナスおよび
タバコの様な重要な作物が含才れる〕に特に好適に用い
られる。この植物群は、プロトプラストから再生する成
功率が最も高いことがわかった。
科の植物（トマト、じゃがいも、こしよう、ナスおよび
タバコの様な重要な作物が含才れる〕に特に好適に用い
られる。この植物群は、プロトプラストから再生する成
功率が最も高いことがわかった。
現在までのところ、この科の少なくとも４０種が培養プ
ロトプラストから再生されている。細胞培養技術とは、
ニコチアナ（Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ ）属が特によく適し
ている。しかし、再生は決してこの科に制限されるもの
ではない。事実、各種の非ソラナケア種、例えばニンジ
ン、キャベツおよびアスパラガスなどがプロトプラスト
からの再生に成功している。プロトプラスト培養からの
カルスの回収−これは再生の高い可能性を示している−
も重要挿、例えばカブラ、大豆、コーヒおよび米に観察
されている。再生が達成された種のリストの一部を表４
に示す。本発明方法は、再生が知られているこれらの神
についてのみ適用し得るのではなく、再生法が最終的に
開発される全ての種に適用できるものである。
ロトプラストから再生されている。細胞培養技術とは、
ニコチアナ（Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ ）属が特によく適し
ている。しかし、再生は決してこの科に制限されるもの
ではない。事実、各種の非ソラナケア種、例えばニンジ
ン、キャベツおよびアスパラガスなどがプロトプラスト
からの再生に成功している。プロトプラスト培養からの
カルスの回収−これは再生の高い可能性を示している−
も重要挿、例えばカブラ、大豆、コーヒおよび米に観察
されている。再生が達成された種のリストの一部を表４
に示す。本発明方法は、再生が知られているこれらの神
についてのみ適用し得るのではなく、再生法が最終的に
開発される全ての種に適用できるものである。
再生方法の詳細は、使用する植物種に応じて変わる。一
般に、融合産物プロトプラストは、まず、細胞壁を再生
し、細胞分裂させるために培養しなければならない。通
常、プロトプラストの培養に必要なものは、既知の植物
細胞培養の簡単な改良である。最も普通に使用される増
殖培地は＃′Ｓ５およびＭＳ培地である。しかし、最適
の増殖が得られる様に、炭素源および栄養源を変更して
もよい。
般に、融合産物プロトプラストは、まず、細胞壁を再生
し、細胞分裂させるために培養しなければならない。通
常、プロトプラストの培養に必要なものは、既知の植物
細胞培養の簡単な改良である。最も普通に使用される増
殖培地は＃′Ｓ５およびＭＳ培地である。しかし、最適
の増殖が得られる様に、炭素源および栄養源を変更して
もよい。
細胞外袋ヲ促進させるために、培養培地に増殖調節剤１
： 添７１０ ｔ、でもよい。必ずという訳ではないか
一般に、オーキシンおよびサイトキニンの両者を初期の
培養培地に用いるが、このホルモンの１度は使用する植
物種に応じて変わる。実際の培養を行なうには、ドロッ
プレット培養、寒天培養、懸滴培養などの各種の方ｚｋ
がある。各神タイプの植物のプロトプラストの培養に関
する技＋Ｎは、科学文献に報告されており、その既知の
技術ケ所望の目的に適する様に改良するのは当業者の技
イホｉ的範囲内にある。
： 添７１０ ｔ、でもよい。必ずという訳ではないか
一般に、オーキシンおよびサイトキニンの両者を初期の
培養培地に用いるが、このホルモンの１度は使用する植
物種に応じて変わる。実際の培養を行なうには、ドロッ
プレット培養、寒天培養、懸滴培養などの各種の方ｚｋ
がある。各神タイプの植物のプロトプラストの培養に関
する技＋Ｎは、科学文献に報告されており、その既知の
技術ケ所望の目的に適する様に改良するのは当業者の技
イホｉ的範囲内にある。
プロトプラスト培養で急激に増殖するカルスが確立され
たら、培養培地からカルスを回収し、再生培地に移す。
たら、培養培地からカルスを回収し、再生培地に移す。
再生培地は非常に種特異的であり、通常、用いた特定の
神のカルスから植物の再生を達成するのに必要な条件に
括づく。通常、温度は臨界的ではないが、最適光要求量
は神によって著しく異なる。しかし、各種の神に必要な
条件は広く報告されており当業者はそれケ容易に利用す
ることができる。既知の再生プロトコール、謬考文献な
どについてのまとめの一部が、例えばエバンス（Ｆ、ｖ
＋ムｎｓ ）らのハンドブック・オブ・プラント・セル
−ｊｊルチャ−（１ｌａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌ
ａｎｔ ＣＣ１１Ｃｕ口ｕｒｅ ）、第１巻、第４章
、表７、ｐ１４６−１５４．１９８３年にＪ己載されて
いる。
神のカルスから植物の再生を達成するのに必要な条件に
括づく。通常、温度は臨界的ではないが、最適光要求量
は神によって著しく異なる。しかし、各種の神に必要な
条件は広く報告されており当業者はそれケ容易に利用す
ることができる。既知の再生プロトコール、謬考文献な
どについてのまとめの一部が、例えばエバンス（Ｆ、ｖ
＋ムｎｓ ）らのハンドブック・オブ・プラント・セル
−ｊｊルチャ−（１ｌａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌ
ａｎｔ ＣＣ１１Ｃｕ口ｕｒｅ ）、第１巻、第４章
、表７、ｐ１４６−１５４．１９８３年にＪ己載されて
いる。
再生が成功すると所〒の維持ラインが生産される。既述
した様に、ＣＭＳ核と不［３ｆ４Ｈ胞τｆの所１？４の
鉗合せであるプロトプラスト１１１来の植物は、この系
に導入された、雄不稔性と結合したマーカー特性の存在
によって容易に同定される。７Ｂ＞られた植物を、確立
されたＣＭＳライノと共に通常の交配プログラムに使用
し、所望のＣＭＳ後代を生産することかできる。
した様に、ＣＭＳ核と不［３ｆ４Ｈ胞τｆの所１？４の
鉗合せであるプロトプラスト１１１来の植物は、この系
に導入された、雄不稔性と結合したマーカー特性の存在
によって容易に同定される。７Ｂ＞られた植物を、確立
されたＣＭＳライノと共に通常の交配プログラムに使用
し、所望のＣＭＳ後代を生産することかできる。
上に、維持ラインヶ確立するための一般的な手法、およ
び確立された利！胞質雄性不稔ラインの増殖に於けるそ
の使用について概観した。以Ｆに実施例ケ挙げて史に本
発明の詳細な説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。
び確立された利！胞質雄性不稔ラインの増殖に於けるそ
の使用について概観した。以Ｆに実施例ケ挙げて史に本
発明の詳細な説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。
実施例］
この実施例では、戻し交雑（交配）を繰返すことにより
得られた細胞質性雄性不稔の、ニコチ了ナータハクム（
Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、タバコ）、こ
の系統は、Ｎ、タバコの核とＮ、レパンダ（Ｎ。
得られた細胞質性雄性不稔の、ニコチ了ナータハクム（
Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ、タバコ）、こ
の系統は、Ｎ、タバコの核とＮ、レパンダ（Ｎ。
ｒｅｐａｎｄａ ）の細胞質を持っている、を用いてプ
ロトプラストを単離する方法を示す。雄性捻性細胞質の
供４体として、半優性の同型接合体アルピノ（白子）で
あるへ、タバコＳ ｕ ７ Ｓ ｕ突然変異体を用いた
。
ロトプラストを単離する方法を示す。雄性捻性細胞質の
供４体として、半優性の同型接合体アルピノ（白子）で
あるへ、タバコＳ ｕ ７ Ｓ ｕ突然変異体を用いた
。
ＣＭＳ植物からプロトプラストを単離するために、まず
、使用植物を暗所に２４時間置く。開花前の植物を用い
ることが好ましい。完全に開いた最も若い葉を８％クロ
ロクス（ｃ１ｏｒｏｘ ）中で１゜分間滅菌した後、滅
菌蒸留水で３回修正する。この滅菌後の葉を無菌条件下
で風乾する。
、使用植物を暗所に２４時間置く。開花前の植物を用い
ることが好ましい。完全に開いた最も若い葉を８％クロ
ロクス（ｃ１ｏｒｏｘ ）中で１゜分間滅菌した後、滅
菌蒸留水で３回修正する。この滅菌後の葉を無菌条件下
で風乾する。
乾燥後、細い解剖用ピンセット〔ラッド・インスツルメ
ント・コーポレーション（ＬａｄｄＩｎｓＬｒｕｎｅｎ
ｔ Ｃｏｒｐ、） ］ ｆ用い、葉の下側の表皮をは
ぎ取る。次いで、はぎ取られた葉を切片に切り、約０５
ｇの葉組織を、そのはぎ取られた側を下にして下記の酵
素混合物を含む６０Ｘ１５朋のペトリ皿に移す。
ント・コーポレーション（ＬａｄｄＩｎｓＬｒｕｎｅｎ
ｔ Ｃｏｒｐ、） ］ ｆ用い、葉の下側の表皮をは
ぎ取る。次いで、はぎ取られた葉を切片に切り、約０５
ｇの葉組織を、そのはぎ取られた側を下にして下記の酵
素混合物を含む６０Ｘ１５朋のペトリ皿に移す。
セルラーゼ（ｃｅ１ｌｕｌａｓｅ ） ０．５％
マセラーゼ（Ｍａｃｅｒａｓｅ ） ０．５％ド
リセラーゼ（Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ ） ０．１２５
５％ＫＭ培地８Ｐに溶かしてｐＨを５．５〜５．８に調
（２（υ 節。
マセラーゼ（Ｍａｃｅｒａｓｅ ） ０．５％ド
リセラーゼ（Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ ） ０．１２５
５％ＫＭ培地８Ｐに溶かしてｐＨを５．５〜５．８に調
（２（υ 節。
酵素溶液中のはぎ取られた葉を、プロトプラストが遊離
するまで、暗所において、時々振盪しながら４〜５時間
インキュベートする。得られた溶液中には、プロトプラ
スト、並ひにａ胞片、および未消化の葉物質が含まれて
いる。次いで、この混合物を精製し、プロトプラストラ
単層する。
するまで、暗所において、時々振盪しながら４〜５時間
インキュベートする。得られた溶液中には、プロトプラ
スト、並ひにａ胞片、および未消化の葉物質が含まれて
いる。次いで、この混合物を精製し、プロトプラストラ
単層する。
同様にして、Ｓ ｕ ／ Ｓ ｕ突然変異体からもプロ
トプラストラ得る。ただし、この場合には、迅速に増殖
している培養懸濁物中から細胞をとる。その様な細胞懸
濁液）￥４，５ｕＭの２．４−Ｄ’％含んだＭＳ培地中
で、３〜４日毎に継続培養することにより維持し、以下
の組成の酵素混合物を含む６０×】５ＩＩＭのペトリ皿
にこの培養物２．０ ｍｌ ｋ加える。
トプラストラ得る。ただし、この場合には、迅速に増殖
している培養懸濁物中から細胞をとる。その様な細胞懸
濁液）￥４，５ｕＭの２．４−Ｄ’％含んだＭＳ培地中
で、３〜４日毎に継続培養することにより維持し、以下
の組成の酵素混合物を含む６０×】５ＩＩＭのペトリ皿
にこの培養物２．０ ｍｌ ｋ加える。
セルラーゼ ２゜Ｏ係
マセラーゼ １．０％
ドリセラーゼ １．０％
０．７Ｍグルコース、３． Ｑ ｍＭＭＥ Ｓ、 ６
．０ ｍＭＣａＣ７７２・■１２０および０．７ ｍＭ
Ｎａ１１２１’ｏ４−Ｈ２０ｐ）１５．５〜５．８
を含んだ酵素単離溶液（ＥＩＳ）に溶かす。
．０ ｍＭＣａＣ７７２・■１２０および０．７ ｍＭ
Ｎａ１１２１’ｏ４−Ｈ２０ｐ）１５．５〜５．８
を含んだ酵素単離溶液（ＥＩＳ）に溶かす。
この混合物ケ、振盪下（３［］〜５０ ｒｐｍ ）、暗
所で５時間インキュベートする。得られた混合物は幾ら
かの未消化細胞物質ケ含有しており、以後の使用に先ヴ
ち、精製しておく。
所で５時間インキュベートする。得られた混合物は幾ら
かの未消化細胞物質ケ含有しており、以後の使用に先ヴ
ち、精製しておく。
各々の場合におけるプロトプラストの精製は下を己の々
［１＜にして行われる。
［１＜にして行われる。
プロトプラスト−酵素混合物ケ、孔経（穴のサイズ）６
７聞１のステンレス鋼製の網に通し、未消化細胞からプ
ロトプラス１分離する。次いで、滅菌したコニカル試験
管中、４０Ｘｇ において遠・しすることによりプロト
プラストから酵素を洗い去る。
７聞１のステンレス鋼製の網に通し、未消化細胞からプ
ロトプラス１分離する。次いで、滅菌したコニカル試験
管中、４０Ｘｇ において遠・しすることによりプロト
プラストから酵素を洗い去る。
−１−清をデカントし、滅菌したパスツールピペ″ント
を用いて捨てる。ペレット化したプロトプラストを８１
）培地４．０１木再）靜濁する〔カオ（Ｋａｏ）オヨｒ
） ミ２１ イルク（Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ ）、プラン
タ（Ｐｌ＋ｔｎＬｌｌ ）］ ２６ ： １ （］５−
１１０．１９７５にＪ己載の如く〕。遠心およびデカン
トラ繰返す。次Ｌ・で、洗浄したプロトプラスト’ｖｓ
ｐ培地（プロドプラスト０．５ ｍｌにつき培地２．
（ｌ ｍｌ ）に再懸濁する。
を用いて捨てる。ペレット化したプロトプラストを８１
）培地４．０１木再）靜濁する〔カオ（Ｋａｏ）オヨｒ
） ミ２１ イルク（Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ ）、プラン
タ（Ｐｌ＋ｔｎＬｌｌ ）］ ２６ ： １ （］５−
１１０．１９７５にＪ己載の如く〕。遠心およびデカン
トラ繰返す。次Ｌ・で、洗浄したプロトプラスト’ｖｓ
ｐ培地（プロドプラスト０．５ ｍｌにつき培地２．
（ｌ ｍｌ ）に再懸濁する。
このプロトプラストヲ、表２に示すプロトコールに従っ
て行われるプロトプラスト融合に用いる。
て行われるプロトプラスト融合に用いる。
実施例２
この実施例では、融合したプロトプラスト’１培養し、
再生させる方ｆＪ：について示す。
再生させる方ｆＪ：について示す。
プロトプラストの分裂は２〜５日以内に始まる。
急速に増殖するカルスが認められるまで、１〜２週間毎
に新らしい８１．培地を滴下する。次いで、５、Ｑｕｋ
ｉの６−ベンジルγデニンｆｉＨＡｉ含んだＭ Ｓ培地
〔ムラシゲ（λｌｕｒａｓｈｉｇｅ ）およびスクーグ
（Ｓｋｏｏｇ ）、フィジオロ・プラント（Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ 。
に新らしい８１．培地を滴下する。次いで、５、Ｑｕｋ
ｉの６−ベンジルγデニンｆｉＨＡｉ含んだＭ Ｓ培地
〔ムラシゲ（λｌｕｒａｓｈｉｇｅ ）およびスクーグ
（Ｓｋｏｏｇ ）、フィジオロ・プラント（Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ 。
Ｐｌａｎｔ ） １５ ； ４７３−４９７．１９６２
］’＆、２週間々隔てプロトプラストから導かれた懸濁
液に加えることにより、カルスから茎（若枝）を再生さ
せる。一般に、６週間以内に茎が再生される。
］’＆、２週間々隔てプロトプラストから導かれた懸濁
液に加えることにより、カルスから茎（若枝）を再生さ
せる。一般に、６週間以内に茎が再生される。
再生された茎Ｙ０．１１ｕＭの３−了ミノビリジンを含
んだ寒天ケ含む１／２＠度のＭＳに移すことにより根付
かせる。広範囲にわたって根糸が形成されたら、再生し
た茎を高４！度下、泥炭性のぺレッドに移し、更に成長
させる。再生植物が成熟するにつれて、該ｊｆ＋生植物
を温室条件下に移す前に、ＮｊＷを徐々に減じると共に
、照度を徐々に上げる。
んだ寒天ケ含む１／２＠度のＭＳに移すことにより根付
かせる。広範囲にわたって根糸が形成されたら、再生し
た茎を高４！度下、泥炭性のぺレッドに移し、更に成長
させる。再生植物が成熟するにつれて、該ｊｆ＋生植物
を温室条件下に移す前に、ＮｊＷを徐々に減じると共に
、照度を徐々に上げる。
実施例３
次いで、実施例２に記載の方法に従って再生された植物
を検査し、どれが維持ラインとして適当であるかを決定
する。再生植物の葉の色を観察することにより核遺伝子
の運命を追跡する。Ｓ ｕ／ Ｓ ｕの親は半優性のホ
モ接合体白子であるので、核融合が起きていれば葉の色
は淡緑色となるであろう。
を検査し、どれが維持ラインとして適当であるかを決定
する。再生植物の葉の色を観察することにより核遺伝子
の運命を追跡する。Ｓ ｕ／ Ｓ ｕの親は半優性のホ
モ接合体白子であるので、核融合が起きていれば葉の色
は淡緑色となるであろう。
この一連の実験において再生された植物全てが暗緑色を
呈するということは、核融合が起こらなかったことを示
唆するものである。不−稔の親と同様に、全ての植物が
４８（２Ｎ）染色体を有することも証明された。
呈するということは、核融合が起こらなかったことを示
唆するものである。不−稔の親と同様に、全ての植物が
４８（２Ｎ）染色体を有することも証明された。
再生植物の花が雄性稔性であったか、または、雄性不稔
性であったかを観察することにより細胞質性転移を追跡
する。実際、両タイプのものが再生植物中に回収された
。暗緑色で雄性稔性の植物（２ｎ−４８）において細胞
質性転移が起きていた。これらの植物は、それぞれ、雄
性不稔性の親の核と、雄性稔性の親の細胞質とを有して
おり、適切なＣＭＳ維持ラインを構成している。
性であったかを観察することにより細胞質性転移を追跡
する。実際、両タイプのものが再生植物中に回収された
。暗緑色で雄性稔性の植物（２ｎ−４８）において細胞
質性転移が起きていた。これらの植物は、それぞれ、雄
性不稔性の親の核と、雄性稔性の親の細胞質とを有して
おり、適切なＣＭＳ維持ラインを構成している。
元のＣＭＳラインと維持ＣＭＳラインとを温室条件下、
成熟するまで成長させる。成熟した時点で、稔性維持ラ
インによって産生きれた花粉を用いてＣＭＳ植物を稔性
にする。ＣＭＳ植物に授粉を行ったならば、この授粉さ
れた花を被い、それらに他の花粉が接触するのを阻Ｉト
する。授粉から１週間以内に種子を採ることができる。
成熟するまで成長させる。成熟した時点で、稔性維持ラ
インによって産生きれた花粉を用いてＣＭＳ植物を稔性
にする。ＣＭＳ植物に授粉を行ったならば、この授粉さ
れた花を被い、それらに他の花粉が接触するのを阻Ｉト
する。授粉から１週間以内に種子を採ることができる。
ＣＭＳラインから得た種子全てがＣＭＳの子孫を生産す
る。
る。
酵素洗浄液
０．５Ｍンルビトール ９．】ｇ
５、Ｑ ｍＭＣａＣＪ 、２０２０７５ＷＩｇこれ
らを溶解し、最終容量７１００＋／とする（ｐＨ＝５．
８）。
らを溶解し、最終容量７１００＋／とする（ｐＨ＝５．
８）。
０．２Ｍグルコース １．８ｇ
１ Ｑ ｍＭ ＣａＣ／ ・２Ｈ２０７３，５＃０、
７ ｒｎＭ Ｋ ［１２Ｐ ０４４．７６ ”ｆ／これ
らを溶解し、最終容量を５０＋／とする。次に、この５
０＋／にＰ Ｅ Ｇ ２５ ｇを加えて溶かす（ｐＨ＝
５．８ ）。
７ ｒｎＭ Ｋ ［１２Ｐ ０４４．７６ ”ｆ／これ
らを溶解し、最終容量を５０＋／とする。次に、この５
０＋／にＰ Ｅ Ｇ ２５ ｇを加えて溶かす（ｐＨ＝
５．８ ）。
５０ｍＭグリシン３７５ＩＩＩ１
０、３ Ｍグルコース ５．４ｇ５０ ｍ
Ｍ ＣａＣｘ２・２Ｈ２０７３５”＆これらケ溶解し、
最終容量を１００ｍ／とする（溶液のｐＨを、粒状Ｎ
ａ Ｏｌｌを用いて１０．５に調節する）。
Ｍ ＣａＣｘ２・２Ｈ２０７３５”＆これらケ溶解し、
最終容量を１００ｍ／とする（溶液のｐＨを、粒状Ｎ
ａ Ｏｌｌを用いて１０．５に調節する）。
別法として、この溶液を２溶液として調製し、融合に際
して一緒にしてもよい。
して一緒にしてもよい。
（Ａ） １００ ｍＭグリシン ７５０１１１１０
．３Ｍ グルコース ５．４ｇ終容量’４１００
ｍ／とじ、粒状ＮａＯロチＰＨ’！ａ：’１０５とする
。
．３Ｍ グルコース ５．４ｇ終容量’４１００
ｍ／とじ、粒状ＮａＯロチＰＨ’！ａ：’１０５とする
。
（Ｂ）１００ｍＭＣａＣ１・２Ｈ２０１４７０Ｊ＃０．
３Ｍグルコース ５．４ｇ容量を１０（］
＋／とする。
３Ｍグルコース ５．４ｇ容量を１０（］
＋／とする。
これらの２溶液を用いた場合、観察”Ｊ能な沈殿の析出
なしに保存できる。融合に際して、（Ａ）と０３）とを
１＝１の割合で混合する。
なしに保存できる。融合に際して、（Ａ）と０３）とを
１＝１の割合で混合する。
１．２＠の供給源から得たプロトプラスト０５ｍ１ｋ混
合し、酵素洗浄液（表６）８ｍｌで希釈する。
合し、酵素洗浄液（表６）８ｍｌで希釈する。
この混合物を１００ｇで４分間遠・ｂする。
２、過剰の酵素溶液をデカントし、プロトプラスト混合
物を酵素洗浄液に再懸濁する。下杵】および２を１回繰
返す。２回目のデカンテーションの後、沈殿したプロト
プラストラ酵素洗浄液１．０ｍｌに再懸濁する。
物を酵素洗浄液に再懸濁する。下杵】および２を１回繰
返す。２回目のデカンテーションの後、沈殿したプロト
プラストラ酵素洗浄液１．０ｍｌに再懸濁する。
３、 ファ／ｌ／：］ ：／ （Ｆａｌｃｏｎ ）（］
００７ ）ヘト１１皿（６０ｘ１５）内にシリコン溶
液〔シグマ（Ｓｉｇｒｎリケミカル・カンパニー３１滴
を入れる。このシリコン滴の上から２２ｍ２２ｇｇのカ
バーグラスをかける。
００７ ）ヘト１１皿（６０ｘ１５）内にシリコン溶
液〔シグマ（Ｓｉｇｒｎリケミカル・カンパニー３１滴
を入れる。このシリコン滴の上から２２ｍ２２ｇｇのカ
バーグラスをかける。
４、 カバーグラスの−Ｌに、プロトプラスト混合物０
．１５ｍ／をピペットヲ用いて置く。プロトプラスｌカ
バーグラス上に約５分間静置することでプロトプラスト
の薄い層を形成させる。
．１５ｍ／をピペットヲ用いて置く。プロトプラスｌカ
バーグラス上に約５分間静置することでプロトプラスト
の薄い層を形成させる。
５、プロトプラスト混合物にＰＥＧ溶液（表６）０．４
５ｍ１を注意深く加える。カバーグラスに付着した、プ
ロトプラストの均一な単一層を形成させるために、ＰＥ
Ｇ’４プロトプラスト滴の一側に加える必要がある。
５ｍ１を注意深く加える。カバーグラスに付着した、プ
ロトプラストの均一な単一層を形成させるために、ＰＥ
Ｇ’４プロトプラスト滴の一側に加える必要がある。
６、プロトプラスト４ＰＥＧ溶液中で室温において１５
〜２０分間インキュベートする。
〜２０分間インキュベートする。
７、 この混合物にＰＥＧ溶離液０．９冨ｌを加える。
１０分後、この混合物にさらに０．９ ｍｌ ｋ追加す
る。
る。
８、第２回目の溶ｌａ、処置の後、ＰＥＧと溶離液を除
去するために、プロトプラストにプロトプラスト培養培
地を加える。
去するために、プロトプラストにプロトプラスト培養培
地を加える。
９、混合物に培養培地０．５ｍｌを加える。１０分後、
さらに０．５ ｍｌを加える。
さらに０．５ ｍｌを加える。
１０ 最終的な洗浄の後には、プロトプラストは１〜
２ｍｌの培養培地中に存在しているべきである。
２ｍｌの培養培地中に存在しているべきである。
ペトリ皿を２重層のパラフィルムでシールし、倒立顕微
鏡で観察することにより、融合の頻度を確認することが
できる。
鏡で観察することにより、融合の頻度を確認することが
できる。
表４：プロトプラストからの再生に成功したソの一部
神 プロトプラスト
アンティリナム・マジャス 葉肉
キゴマノハグサ）
アルペンシス・タリ了す 懸濁液
シロイヌナズナ）
アスパラガス・オフィシナリス 茎状葉（Ａｓｐａ
ｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ 。
ｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ 。
アスパラガス）
ブラシカΦナプス
（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ 、
葉肉セイヨウアブラナ） ブラシカ・ナプス、半数体 葉肉 チコリラム・エンディバ 茎頂または、（ｃｉｃ
ｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖａ ） 葉肉チ
コリラム・インティバス （ｃ，１ｎｔｙｂｕｓ 、キクニガナ）ガイラルデイγ
・グランディフローラ へりアンサス・アヌス ヒマワリ） ニゲラ・アルペンシス セネシオ伊ジャコベ了 サヮギク） セ不シオ・シルノくティカス （Ｓ、５ｉｌｖａｔｉｃｕｓ ） セ不シオ・ビスコサス （Ｓ、 ｖｉｓｃｏｓｕｓ ） ダウカス・力ロタ 懸濁物（Ｄａｕｃ
ａｓ ｃａｒｏｔａ＋ｉ、ノラニンジン） ダウカス・力ロタ 根ダウカスｅカロ
タ カルスダウカス・力ロタ
懸濁物−前胚凝集物 ジギタリス・ランタナ 葉肉パルカン産ジ
ギタリス） ジギタリス・バーブレア 懸濁物（Ｉ）、ｐ
ｕｒｐｕｒｅａ 、ジギタリス）不メシア・ストルモー
サ 葉肉ブラシカ働ナプス
根ブラシカφオレラセ了 （Ｂ、０１ｅｒａ（ｅａ、 キャベツ）ブラシカ・ナ
プス、半数体 葉肉ブラシカ・ナプス、半数体
茎胚子ブロムス・イ不ルミス
１％［物コスズメノチャヒキ〕 チトルス・シネンシス 胚珠カルス（ｃ
ｉｔｒｕｓ ５ｉｎｅｎｓｉｓ ）ヘメロカリス種
懸濁物マニコット・エスキュレンタ
葉肉メデイカゴ・サテイバ 葉肉 ムラサキウマゴヤンン メデイカがサテイバ 葉肉パニカム・マ
キシマム 懸濁物（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａ
ｘｉｍｕｍ ）ベラルゴニウム種 葉肉
テンジクアオイ〕 ペニセタムｅアメリカナム ＭｌｌＴｈ（Ｐｅ
ｎｎｉｓｅｔｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）ラナンキ
ュラス・セレラタス 葉肉タガラシ〕 セ不シオｅブルガリス 葉肉、カルス（Ｓｅｎ
ｅｃｉｏ ｖｕｌｇａｒｉ ｓ 、ノボロギク）トリ
フオリラム・レペンス 懸濁物特許出願人
ディー・エヌ・エイ・プラント・テクノロジーｅコーポ
レイション 代理 人 弁理士 青 山 葆（外１名）手続補正書 昭和６１年１（）月 り１１１
葉肉セイヨウアブラナ） ブラシカ・ナプス、半数体 葉肉 チコリラム・エンディバ 茎頂または、（ｃｉｃ
ｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖａ ） 葉肉チ
コリラム・インティバス （ｃ，１ｎｔｙｂｕｓ 、キクニガナ）ガイラルデイγ
・グランディフローラ へりアンサス・アヌス ヒマワリ） ニゲラ・アルペンシス セネシオ伊ジャコベ了 サヮギク） セ不シオ・シルノくティカス （Ｓ、５ｉｌｖａｔｉｃｕｓ ） セ不シオ・ビスコサス （Ｓ、 ｖｉｓｃｏｓｕｓ ） ダウカス・力ロタ 懸濁物（Ｄａｕｃ
ａｓ ｃａｒｏｔａ＋ｉ、ノラニンジン） ダウカス・力ロタ 根ダウカスｅカロ
タ カルスダウカス・力ロタ
懸濁物−前胚凝集物 ジギタリス・ランタナ 葉肉パルカン産ジ
ギタリス） ジギタリス・バーブレア 懸濁物（Ｉ）、ｐ
ｕｒｐｕｒｅａ 、ジギタリス）不メシア・ストルモー
サ 葉肉ブラシカ働ナプス
根ブラシカφオレラセ了 （Ｂ、０１ｅｒａ（ｅａ、 キャベツ）ブラシカ・ナ
プス、半数体 葉肉ブラシカ・ナプス、半数体
茎胚子ブロムス・イ不ルミス
１％［物コスズメノチャヒキ〕 チトルス・シネンシス 胚珠カルス（ｃ
ｉｔｒｕｓ ５ｉｎｅｎｓｉｓ ）ヘメロカリス種
懸濁物マニコット・エスキュレンタ
葉肉メデイカゴ・サテイバ 葉肉 ムラサキウマゴヤンン メデイカがサテイバ 葉肉パニカム・マ
キシマム 懸濁物（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａ
ｘｉｍｕｍ ）ベラルゴニウム種 葉肉
テンジクアオイ〕 ペニセタムｅアメリカナム ＭｌｌＴｈ（Ｐｅ
ｎｎｉｓｅｔｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）ラナンキ
ュラス・セレラタス 葉肉タガラシ〕 セ不シオｅブルガリス 葉肉、カルス（Ｓｅｎ
ｅｃｉｏ ｖｕｌｇａｒｉ ｓ 、ノボロギク）トリ
フオリラム・レペンス 懸濁物特許出願人
ディー・エヌ・エイ・プラント・テクノロジーｅコーポ
レイション 代理 人 弁理士 青 山 葆（外１名）手続補正書 昭和６１年１（）月 り１１１
Claims (10)
- （１）再生可能な植物種の細胞質性雄性不稔ラインを永
続させる方法であつて、（ａ）細胞質性雄性不稔ライン
由来のプロトプラストからの核を、プロトプラスト融合
条件下で雄性生殖ライン由来のプロトプラストの細胞質
と結合させて雄性生殖サイブリツドを形成させ、（ｂ）
培養および再生条件下で該サイブリツドを培養、再生せ
しめて雄性生殖成熟植物を調製し、（ｃ）該雄性生殖植
物を細胞質性雄性不稔ラインの植物と交雑させて細胞質
性雄性不稔後代を産生せしめることからなる方法。 - （２）植物種がソラナケアの植物である第（１）項に記
載の方法。 - （３）植物種が、タバコ属の植物である第（１）項また
は第（２）項に記載の方法。 - （４）植物種がニコチアナ・タバクムである第（１）項
〜第（３）項のいずれかに記載の方法。 - （５）プロトプラスト融合を、カルシウムの存在下、少
なくとも１０のｐＨで、ＰＥＧによつて誘導する第（１
）項〜第（４）項のいずれかに記載の方法。 - （６）雄性不稔ラインに生殖性を回復させることにより
雄性生殖ラインを作成することからなる再生可能な植物
種の細胞質性雄性不稔植物ラインの維持ラインを調製す
る方法であつて、プロトプラスト融合条件下で雄性不稔
ライン由来のプロトプラストからの核を雄性生殖ライン
のプロトプラスト由来の細胞質と結合させて雄性生殖サ
イブリツドを調製し、該サイブリツドから成熟雄性生殖
維持植物を再生させることを特徴とする方法。 - （７）植物種がソラナケアの植物である第（６）項に記
載の方法。 - （８）植物種が、タバコ属の植物である第（６）項また
は第（７）項に記載の方法。 - （９）植物種がニコチアナ・タバクムである第（６）項
〜第（８）項のいずれかに記載の方法。 - （１０）第（１）〜第（９）項のいずれかの方法で生産
された細胞質性雄性不稔植物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77231485A | 1985-09-04 | 1985-09-04 | |
| US772314 | 1985-09-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6265631A true JPS6265631A (ja) | 1987-03-24 |
Family
ID=25094649
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61209382A Pending JPS6265631A (ja) | 1985-09-04 | 1986-09-04 | プロトプラスト融合による細胞質性雄性不稔維持ラインの調製法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0214601A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6265631A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007049730A1 (ja) * | 2005-10-26 | 2007-05-03 | Sakata Seed Corporation | 細胞質雑種Lactuca属植物およびその作出方法 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU204561B (en) * | 1987-12-17 | 1992-01-28 | Zaadunie Bv | Process for producing hybrid brassicaceae with citoplasmic male sterility |
| US5254802A (en) * | 1987-12-17 | 1993-10-19 | Sietske Hoekstra | Male sterile brassica plants |
| FR2695798B1 (fr) * | 1987-12-17 | 1996-04-12 | Sandoz Sa | Nouvelles lignees parentales de brassica oleracea et procede de preparation de ces lignees parentales. |
| JPH01196239A (ja) * | 1988-02-02 | 1989-08-08 | Mitsui Toatsu Chem Inc | イネのサイブリッド植物の作出方法 |
| JP2824841B2 (ja) * | 1988-10-08 | 1998-11-18 | 株式会社ニチレイ | 雄性不稔トマト植物の簡易作出法 |
| FR2654579B1 (fr) * | 1989-11-20 | 1992-03-13 | Tabacs & Allumettes Ind | Variete hybride male sterile de tabac noir "itb1000" destinee a la production industrielle de feuilles de tabac. |
| FR2657746B1 (fr) * | 1990-02-07 | 1992-05-07 | Tabacs & Allumettes Ind | Variete hybride f1 male-sterile de tabac de type burley "itb 2201" destinee a la production industrielle de feuilles de tabac. |
| FR2672465B1 (fr) * | 1991-02-12 | 1993-04-30 | Tabacs & Allumettes Ind | Variete hybride f1 male-sterile de tabac de type burley "itb 2001" destinee a la production industrielle de feuilles de tabac. |
| CA2108230C (en) * | 1992-10-14 | 2006-01-24 | Takako Sakai | Methods for introducing a fertility restorer gene and for producing f1 hybrid of brassica plants thereby |
| DE10136378C2 (de) * | 2001-07-26 | 2003-07-31 | Norddeutsche Pflanzenzucht Han | Männliche Sterilität in Gräsern der Gattung Lolium |
| CN103444513A (zh) * | 2013-08-14 | 2013-12-18 | 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 | 一种高配合力籼型水稻三系不育系的育种方法 |
| CN110881407A (zh) * | 2019-11-10 | 2020-03-17 | 华中农业大学 | 一种万寿菊再生体系的构建方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3710511A (en) * | 1971-04-21 | 1973-01-16 | Univ Illinois | Procedures for use of genic male sterility in production of commercial hybrid maize |
| US4351130A (en) * | 1981-06-16 | 1982-09-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Recessive tall--a fourth genetic element to facilitate hybrid cereal production |
| CA1220733A (en) * | 1982-12-27 | 1987-04-21 | Shigeru Takahashi | Method for promoting fusion of plant protoplast |
-
1986
- 1986-09-02 EP EP86112124A patent/EP0214601A3/en not_active Withdrawn
- 1986-09-04 JP JP61209382A patent/JPS6265631A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007049730A1 (ja) * | 2005-10-26 | 2007-05-03 | Sakata Seed Corporation | 細胞質雑種Lactuca属植物およびその作出方法 |
| US8058505B2 (en) | 2005-10-26 | 2011-11-15 | Sakata Seed Corporation | Cybrid plant of the genus Lactuca and method for producing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0214601A3 (en) | 1988-08-31 |
| EP0214601A2 (en) | 1987-03-18 |
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