WO2007049730A1 - 細胞質雑種Lactuca属植物およびその作出方法 - Google Patents

細胞質雑種Lactuca属植物およびその作出方法 Download PDF

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cytoplasmic
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lactuca
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Shingo Horiuchi
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated

Definitions

  • Cytoplasmic hybrid ctuca 'genus plant and its production method
  • F1 varieties are prevalent in major crops.
  • F1 varieties have great advantages such as high growth speed due to hybrid growth (heterosis) and high growth rate; In addition, it can be expected to improve pest resistance and environmental adaptability such as cold and heat resistance.
  • the F1 varieties have the same genotype, although they are heterozygous, and the phenotype shows extremely high uniformity, increasing the marketability of the product.
  • it is easy to accumulate useful traits controlled by dominant genes, and rapid breeding becomes possible.
  • the next generation and subsequent generations cannot maintain uniformity of quality due to the separation of traits, it is necessary to produce F1 seeds every year, and it is a great advantage that the rights of breeders are protected.
  • F1 varieties have become the mainstream of cultivars in major crops.
  • commercial mass production of F1 seeds requires a method for easy male removal without cost.
  • many seeds can be obtained by a single mating, such as fruit vegetables tomato, melon, kiyu !, force bochiya, flower petunia, eustoma, etc.
  • Economical F1 seed production is possible.
  • the male characteristics of male sterility can be used and seeding with male sterile plants as seed parents can save labor and costly male removal.
  • the development of seeding methods using male sterility is very important. It is important.
  • Patent Literature 4 Male sterility has been found in many plant species. In addition, methods for producing male sterile plants using cell fusion technology have been established for many useful crops (Patent Literature 4, Patent Literature 5, Patent Literature 6, Patent Literature 7, Patent Literature 8, Patent Literature). 9, Patent Literature 10, Patent Literature 11, Patent Literature 12, Patent Literature 13, Patent Literature 14, Patent Literature 15, Patent Literature 16, Patent Literature 17, Patent Literature 18, Patent Literature 19, and Patent Literature 19).
  • the mechanisms of male sterility are diverse, but can be broadly divided into two categories: nuclear male sterility (Genetic Male Sterility) and cytoplasmic male sterility (Cytoplasmic Male Sterility). Nuclear genotype male sterility is caused by male sterility due to nuclear genes. Cytoplasmic male sterility, on the other hand, expresses male silkworms due to the interaction between cytoplasmic genetic factors and nuclear genes.
  • Non-patent document 1 and Non-patent document 2 describe the expression of hybrid stress in lettuce.
  • F1 plants were created using nuclear genotype male sterile lettuce, and the expression of hybrid stress was investigated by comparing with conventional fixed species, and as a result, F1 plants may show remarkable hybrid stress. It has been reported. Therefore, there has been a strong demand for the establishment of efficient seeding technology for F1 seeds using the male sterility of lettuce, but it has not yet been established.
  • Non-Patent Document 3 clarifies the inheritance pattern of the nuclear genotype male sterility of lettuce, but because male sterility is unstable and damage appears in females (non-patent Reference 7), practical problems remained. Similar reports have been made in Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5 by the same author. In fact, F1 varieties have been commercialized using nuclear genotype male sterility, but male sterility is unstable and has not yet been replaced by conventional fixed species ( Non-patent document 6).
  • Non-patent Document 7 Non-patent Document 7
  • 'Male sterile plants with homozygous recessive genes cannot self-reproduce themselves, so to maintain and propagate male sterile lines, male sterile genes must be heterozygous (heterozygosis).
  • An individual with a male sterility gene must be selected from a progeny. In the progeny of hybrids, fertile plants and sterile plants are separated into 1: 1, so about 50% of the hybrid progenies are male sterile plants.
  • lettuce has a small flower vase, so it is not easy to distinguish between a sterile plant individual and a fertile plant individual, and a lot of flowers are attached to a thin flower stem, which makes the extraction work more complicated. ''
  • flowering time is different for each individual, it is very laborious to completely extract the delicate individuals based on the appearance of the flowers. The problem arises that the quality of the product deteriorates.
  • F1 seed production using cytoplasmic male sterility has long been put to practical use in sunflower, sugar beet, potato, rice, wheat, carrot, onion, leek, etc., and a commercial production system has been established. Yes.
  • F1 varieties using self-incompatibility have been widely used, but in recent years, higher quality seeds have been required.
  • the production of F1 seeds using fine male sterility is expanding.
  • the cytoplasmic male sterility plant with stable male sterility can be produced, the cytoplasmic male sterility is introduced into many excellent lines by continuous backcrossing, and seeds for creating F1 varieties are obtained.
  • Cytoplasmic male sterility is inherited cytoplasmically, so all progeny plants show male sterility. Cytoplasmic male sterile lines are easy to maintain and proliferate by mating with a maintenance line that has the same nuclear genome and normal cytoplasm. Unlike the case of using the male sterility of the nuclear genotype mentioned above, it is efficient because there is no need to extract the seed parent's fertile individuals in the seeding field. Disappear.
  • Non-Patent Documents 9 to 13 and the like As an example of the production of cytoplasmic male sterile plants of asteraceae vegetables, it is known that cytoplasmic male sterile chicory can be produced by cell fusion of sunflower and chicory. Such techniques are disclosed in, for example, Patent Document 2, Patent Document 3, and Non-Patent Document 14 to Non-Patent Document 17.
  • Non-patent document 14 is the first report of the production of cytoplasmic male sterile chicory, and it was clarified that cytoplasmic male sterile chicory can be produced by introducing the cytoplasm of the sunflower into chicory by cell fusion technology. Non-patent document 14 also reports that the mitochondrial genome in the cytoplasmic male sterile chicory produced was a recombination of the chicory mitochondrial genome and the castor mitochondrial genome. is doing. Furthermore, 'Non-patent document 16 and Non-patent document 17- report the expression of cytoplasmic male sterility and the analysis result of mitochondrial DNA structure in the progeny of the cytoplasmic male sterility chicory.
  • Patent document * 2 describes a cytoplasmic male sterile plant of the family Asteraceae and a method for producing the same.
  • the only cytoplasmic male sterile plant that has been shown to be actually produced in Patent Document 2 is the same cytoplasmic male sterile chicory as in Non-Patent Document 14.
  • Patent Document 2 mentions cytoplasmic male sterile lettuce, it only mentions the protoplast culture method and the fusion treatment method in the present form of the text. Methods and experimental results for producing cytoplasmic male sterile lettuce are not described.
  • the protoplast isolation and fusion process can be performed relatively easily. For example, it is even possible to isolate and fuse animal and plant cell prototypes, respectively.
  • Patent Document 2 does not disclose a technique that is important for the production of lettuce cytoplasmic male sterile plants.
  • Patent Document 3 discloses a method for producing a cytoplasmic male sterile chili by introducing orf522, which is a causative gene for the cytoplasmic male sterility of castor, into a chicory genus plant by asymmetric cell fusion.
  • Non-patent document 15 is an example of the production of cytoplasmic male sterile chicory by a new research group, and research has been continued in recent years with the aim of producing practical cytoplasmic male sterile chicory.
  • Another possible method is to introduce a cytoplasmic male sterility gene into chicory by obtaining a cytoplasmic male sterility gene from castor and then crossing the chicory with lettuce to introduce cytoplasmic male sterility into lettuce. Because lettuce and chicory are related to each other in different genus, sexual crossing is difficult, and attempts to produce cytoplasmic male sterile lettuce by this method have not been successful.
  • cytoplasmic male sterile lettuce As described above, the technical difficulty of producing cytoplasmic male sterile lettuce is very high, and there is no successful example yet. However, the benefits of lettuce F1 breeding using cytoplasmic male sterile lettuce are significant. Therefore, the production of cytoplasmic male sterile lettuce has been strongly desired.
  • Patent Document 1 JP 2005-110623 A
  • Patent Document 2 European Patent No. 0771523
  • Patent Document 3 International Publication W097 / 45548
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-232324
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 63-79548
  • Patent Document 6 JP-A-2-303426
  • Patent Document 7 JP-A 63-36776
  • Patent Document 8 Japanese Patent Application Laid-Open No. 64-20041 —
  • Patent Document 9 Japanese Patent Laid-Open No. 1-218530
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-052185
  • Patent Document 1 U.S. Pat.No. 5,254,802
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-108676 '' Patent Document 1 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-108677
  • Patent Document 1 JP 2001-145497 A
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 02-138927,
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 01-206931
  • Patent document 1 International publication W099 / 55143 pamphlet
  • Patent Document 1 International Publication W095 / 09910 Panfred
  • Patent Document 1 9 International Publication W097 / 09873 Pamphlet
  • Patent Document 2 0 Japanese Patent No. 3635036
  • Non-patent literature 1 Katsuya Takada, Masatake Fujino (1987) Study on seeding of F1 seeds of lettuce (1st report) F1 hybrid strength in male sterile line Abstract 208-209
  • Non-Patent Document 2 T. Takada, Masatake Nono (1986) Development of utilization technology for male sterility of lettuce (1) About the expression of hybrid stress in F1 combination, Annual report of the Morioka branch of Vegetable & Tea Experiment Station No. 1. 87- 93.
  • Non-Patent Document 3 Edwrd J. Ryder (1967) A recessive male sterility gene in Lettuce (Lactica sativa L.) Pro. Am. Soc. Hortic. Sci. 91, 36b- 368
  • Non-Patent Document 5 Ryder, E, J Science 1989 vol. 114 (1) 129-133 Studies of three new genes, linkage, and epistasis in Lettuce
  • Non-Patent Document 6 Variety Registration Application Document “Fine” Kaneko Seedling No. 1745
  • Non-Patent Document 7 Hiroaki Serizawa Journal of Horticultural Society No. 73 Supplement 2 p 566 Recessive recessive male sterility gene
  • Non-Patent Document 8 Matsumoto, E Plant cell reports 1991.vol9 (10) Interspecific somatic hybridization between lettuce (Lactica sativa) and wild species L. virosa
  • Non-patent literature 9 L. H, Rieseberg, C. Van Fossen, D. Arias, and RL Carter The journal of heredityl994: 85 (3) 233-238 Cytpplasmic male sterility in Sum lower: origin, Inheritance, and Frequency in Natural Populations
  • Non-Patent Document 1 0 R. Horn Theor Appl Genet (2002) 104: 562— 570 Molecular diversity of male sterility inducing and male-fertile cytoplasms in the genus Helianthus
  • Non-patent literature 1 2 R. Horn W. Friedt Plant Breeding 116 (1997) 317-322 Fertility restoration of new CMS sources in sunflower (Helianthus annuus L.)
  • Non-Patent Document 1 4 C. Rambaud, J .. Dubois, J. Vasseur (1993) Male-sterile chicory cybrids obtained by intergeneric protoplast 'fusion, Theor Ap l Genet 87: 347-352
  • Non-Patent Literature 1 5 S. Varotto, E. Nenz, M. Lucchin, P. Parrini (2001) Production of asymmetric somatic hybrid plants between Cichorium intybus L. and Helianthus annuus and Theor Appl Genet 102: 950-956
  • Non-Patent Document 1 6 C. Rambaud, A. Bellamy, A. Dubreucq, J. -C. Bourquin and J. Vasseur (1997) Molecular analysis of the fourth progeny of plants derived from a cytoplasmic male sterile chicory cybrid, Plant Breeding 116 : 481-486
  • Non-Patent Document 1 7 A. Dubreucq Theor Appl Genet (1999): 1094-1105 Analyzes of mitochondrial DNA structure and expression in three cytoplasmic male-sterile chicories originating from somatic hyvridisation between fertile chicoly and CMS sunflower protoplasts
  • Non-patent literature 1 8 Takayuki Mizutani Bull. Fac.Agr., Saga Univ 67: 109-118 (1989) Lettuce and * Plant regeneration and cell fusion from Japanese wild relative protoplasts Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a cytoplasmic hybrid Lactuca plant lettuce useful for production of lettuce F1 seeds and a method for producing the same, in view of the above-described problems of the prior art.
  • cytoplasmic male sterile lettuce is obtained by a technique of culturing a hybrid cell of sunflower and lettuce and a method of regenerating a cytoplasmic hybrid plant. Using this, lettuce F1 seeds can be efficiently obtained: and the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a rice cyst characterized by cell fusion of a protoplast derived from a Helianthus genus plant and a protoplast derived from a Lactuca genus plant, then culturing the fused cell, and regenerating the plant from the cultured fused cell. Production method of genus Lactuca genus.
  • Helianthus genus plant has cytoplasmic male sterility, any of (1) to (3) The method of crab. '
  • Cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant produced by the method according to any one of (1) to (6), its progeny, or a part of the plant body.
  • Cytoplasmic hybrid A part of the Lactuca genus plant or a progeny plant thereof contains the cell or cytoplasm of the plant body. (7) The cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant or a progeny plant plant according to (7) Department. 1
  • Cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant according to any one of (9) to (12), a progeny thereof, or a part of the plant body, having cytoplasmic male sterility.
  • Cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant or a part of its plant The cytoplasmic hybrid according to any one of (9) to (13), or a part of a plant of a progeny thereof.
  • Cytoplasmic hybrid Lactuca plant or a part of its progeny plant contains cells or cytoplasm of the plant body
  • Cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant or a part of its progeny plant contains cells or cytoplasm of the plant body
  • Cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant or a part of its progeny plant contains a cell or cytoplasm of the plant body, (17) Cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant or its progeny plant Part of.
  • the cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant or its progeny produced by the method described in (6) is used as a seed parent, and a Lactuca genus plant that can be crossed with the plant is crossed as a pollen parent.
  • a method for producing a hybrid first-generation seed including seeding a first seed of a hybrid ⁇ .
  • the cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant described in (1 3) or a progeny thereof is used as a seed parent, a Lactuca genus plant that can be crossed with the plant is crossed as a pollen parent, and the hybrid seed first seed from the seed parent after the crossing
  • the cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant described in (15) or a progeny thereof is used as a seed parent, and a Lactuca genus plant that can be crossed with the plant is crossed as a pollen parent.
  • the cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant described in (17) or a progeny thereof is used as a seed parent, and a Lactuca genus plant that can be crossed with the plant is crossed as a pollen parent.
  • Figure 1 shows the DNA extracted from two cytoplasmic male sterile castor lines and one male fertile castor line, 13 cultivated loro q species of lettuce, which are specific for the castor mitochondria gene orf522. It is an electrophoretogram showing the results of PCR using primers (top) and primers specific to orf873 (bottom). ,
  • FIG. 2 is an electrophoretic photograph showing an example of “results of assaying a cytoplasmic hybrid plant using a primer specific for the castor limit condomria gene orf522 and orf873”. .
  • Fig. 3 shows two cytoplasmic male sterile castor lines and one male fertile castor line used in the test material, lettuce cultivars 13, and DNA extracted from the cultivars and using primers specific for the chloroplast gene rbcL. This is an electrophoresis photograph showing the PCR-RFLP pattern when PCR is performed and the amplified product is cleaved with Taql.
  • Figure 4 shows the flower morphology of the lettuce cultivar 'Thermiichi' (A: Inflorescence, B: Head flower, C: Center of head flower (double X 20), D: Pistil and rod (Magnification X 64)).
  • FIG. 5 shows the morphology of cytoplasmic male sterile lettuce flowers (A: inflorescence, B: head flower, C: center of head flower (magnification X 20), P: pistil with pollen attached. And soot tube (magnification X 64)).
  • FIG. 6 shows the results of observation of cytoplasmic male sterile lettuce chromosomes.
  • FIG. 7 shows that progeny seeds can be obtained by mating male fertile lettuce pollen with cytoplasmic male sterile lettuce.
  • Fig. 8 is an electrophoretogram showing the results of extracting DNA from leaves of 14 BC3 generations of cytoplasmic male sterile lettuce and performing PCR using primers specific for the human limit condomria gene orf873. .
  • Figure 9 A is an electrical showing cytoplasmic extracts male sterility lettuce DNA from BC3 generation 14 individual leaves of mitochondrial genes at P 6, cox II, the results PCR was one row using primers specific to the cob It is an electrophoretic photograph. Mitochondrial gene at P 6, cox II, in the case of cob, is the result of PCR-RFLP was further digested with restriction enzyme PCR amplification products.
  • Figure 9B shows the results of DNA extraction from the leaves of 14 BC3 generations of cytoplasmic male sterile lettuce and PCR using primers specific for the mitochondrial genes rps 3, trnN and trnY, trnS, and trnP.
  • Figure 10 shows the extraction of DNA from the leaves of 14 BC3 generations of cytoplasmic male sterile lettuce, PCR using primers specific for the chloroplast gene rbcL, and the amplified product was cleaved with Taq I. It is the electrophoresis photograph which shows the PCR-RFLP pattern of time.
  • Fig. 11 shows the morphology of the plant's flower organs and female pods of cytoplasmic male sterile lettuce '1216-2- ⁇ X' Thermiichi '.
  • Figure 12 shows the morphology of the flower organs and female wings of the F1 plant of cytoplasmic male sterile lettuce '1216-2- ⁇ X' Steady.
  • Fig. 13 is a diagram showing the morphology of the vase and female wing of the F1 plant of cytoplasmic male sterile lettuce '1216-2- ⁇ X' mouth, Gic '. '
  • Fig. 14 shows the morphology of the vase and pistil of the F1 plant of cytoplasmic male sterile lettuce '1216-2-Tl, X' Meyer.
  • Fig. 15 shows the morphology of the plant body, flower vase, and female pod of a hybrid of cytoplasmic male sterile lettuce '1216-2- ⁇ and lettuce wild species L. serriola. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the fused hybrid cells and cytoplasmic hybrid plants according to the present invention can be prepared by a method comprising the following means. , '
  • Protoplast preparation (i) Isolation of protoplasts from plants of the genus Lactuca
  • Lactuca plants used for the preparation of protoplasts are Lactuca sat iva and L. L. georgica, L. dregeana ⁇ . Altaica ⁇ L. sal igna ⁇ L. virosa, L. tatarica N L. indica, or L. debi lis, or their interspecific hybrid plants, However, lettuce cultivar L. sat ive L. is preferred.
  • L. sat ive is var. Angustana (including Asparat lettuce, lettuce, etc.), var. Longifol ia. (Including kos, mouth main lettuce, standing lettuce, etc.), var. Cri spa (leaf lettuce (leaf) Etc.) ', var.
  • Capitata (including head lettuce, ball lettuce, butter head, sardana, crisp head, cabbage type lettuce, etc.) These are all varieties within the same ecologically differentiated species. Any variant belonging to L. sative L. can be preferably used in the present invention. Endives and chicory have similar characteristics to lettuce, but are not included in lettuce because they do not belong to the genus Lactuca (Vegetable Gardening Encyclopedia 7 Lettuce 1 Cell 8 1 9 April 9 Issue 1st 30th Issuing Agency Rural Mountain Fish Village Agriculture Association P 87).
  • mesophyll tissue with high yield and high mitotic activity as the cell tissue used to obtain protoplasts, but other tissues such as hypocotyl stems and callus may also be used as materials. Good. .
  • the method for isolating the protoplast is not particularly limited, and may be a commonly used method (Non-patent Documents 8 and 18).
  • protoplasts are isolated by chopping lettuce cell tissue and treating them with enzymes.
  • an enzyme solution for protoplast isolation is used.
  • This solution is mainly an inorganic salt buffer containing cell wall degrading enzymes and osmotic pressure regulators.
  • the cell wall degrading enzyme is not particularly limited as long as it can be used for decomposing plant cell walls, and examples thereof include cellulase, hemicellulase, and pectinase.
  • a combination of mecelase and macerozyme R-10 is preferred.
  • the osmotic pressure adjusting agent general sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, glucose and the like can be used, and mannitol is preferable, and 0.3M
  • a concentration of ⁇ 0.7M mannitol is particularly preferred.
  • the enzyme solution contains a prototype.
  • an inorganic salt For example, a CPW salt (Cocking and Peberdy, 1974) having the composition shown in Table 1 is preferably added.
  • the enzyme treatment is preferably performed at 25-30 ° C for 8-20 hours.
  • the protoplasts isolated by enzyme treatment are filtered through a 30-100 / m pore size nylon mesh, and centrifuged to collect the protoplasts and remove the enzyme solution. Next, suspend the protoplasts in the wash solution and wash the protoplasts.
  • a CPW salt solution used in general and sugar alcohols added as an osmotic pressure adjusting agent can be used, but the following composition is used at the time of fusion with a protoplast derived from the genus Helianthus that is isolated later. Since it is desirable to use solution S (reference: Lenee P, Chupeau Y, Plant Sci. 43: 69-75 (1986)), it is preferable to use solution S having the composition shown in Table 2 as the cleaning solution. '
  • Inactivation treatment can be performed by suspending the protoplast in a CPW salt solution in which a iodide compound such as odoacetic acid or odoacetamide is dissolved.
  • a CPW salt solution in which a iodide compound such as odoacetic acid or odoacetamide is dissolved.
  • a CPW solution adjusted to a concentration of 5 mM to 30 mM and carry out the treatment for 5 to 20 minutes.
  • Protoplasts are purified by density gradient centrifugation, etc., because the suspension of the protocol * also contains ducts and cell fragments.
  • Reagents used for purification include sugars, synthetic colloids, etc., but in the present invention, use of sucrose solution is preferred, and use of 15% to 20% sucrose solution is particularly preferred.
  • After purification of the protoplast measure the cell density with a hemocytometer and adjust the volume with S solution so that the cell density is suitable for cell fusion.
  • the cell density of the protoplast is preferably 1 x 10 5 to 1 x 10 7 cells / ml, and the use of solution S is preferred for adjusting the volume.
  • a plant belonging to the genus Helianthus can be used as the cytoplasm-providing material of the present invention.
  • Hel ianthus annuus L. merle, H. pet iolari s H. argophy ⁇ ⁇ us, H. debi ⁇ is, H. decapetalus, H. Itida from giganteus, H. rigidus, H. sal ic i fol ius, H. anomalus ⁇ H. bolanderi, H. exi lis, H. maximi l iani, H. neglectus, H. praecox, or H. tuberosus
  • the cytoplasmic replacement line of H. annuus L. with cytoplasm is preferred.
  • the Helianthus plant used in the present invention is preferably a cytoplasmic male sterile line.
  • cytoplasmic male sterile lines have been created. It is known that they can be obtained from natural mutations of cultivated species and various interspecific hybrid progenies. Specifically, natural mutants of H. annuus or cytoplasmic male sterile lines bred from the above-mentioned various cytoplasmic replacement lines of H. annuus L. are known. Diversity has also been reported (Non-Patent Document 10). That is, in H. annuus L., many cytoplasmic replacement lines having cytoplasmic male sterility have already been bred. In the present invention, various cytoplasmic substitution lines of Helianthus genus plants can be used as a cytoplasm-providing material.
  • cytoplasmic male sterile cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant in order to obtain a cytoplasmic male sterile cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant, it is preferable to use a Helianthus genus plant having a cytoplasmic male sterility gene as a cytoplasm-providing material, but is not limited thereto. . Helianthus spp. Cytoplasmic male sterility is expressed as a result of the recombination and rearrangement of mitochondrial genomes in both plants when cell fusion is performed between a conventional protoplast and a protoplast derived from a Lactuca genus plant A system may be obtained. The sonoplastic male sterile hybrid Lactuca genus plant thus produced is also encompassed by the present invention.
  • plant cells belonging to the genus Helianthus used for cell fusion can be those obtained by inactivating the nuclear genome by radiation treatment.
  • the cell fusion of Helianthus plant cells and Lactuca plant cells can be performed without affecting the nuclear genome of Helianthus plants. Due to the ability of the nuclear genome to redifferentiate, it is possible to regenerate plants of the genus Lactuca that have cytoplasmic genes from the genus Helianthus.
  • cytoplasm-providing cells As described above, in the present invention, it is possible to select various materials of Helianthus plants as cytoplasm-providing cells, and it is possible to produce cytoplasmic hybrid Lactuca plants having various genetic backgrounds.
  • the protoplast is isolated by chopping the cell tissue of the plant belonging to the genus Helianthus and immersing it in an enzyme solution for protoplast isolation.
  • the cell tissue to be used since the yield is high and the cell membrane is strong, it is preferable to test the hypocotyl, but other tissues such as leaves and stems may be used as the material.
  • the cell wall degrading enzyme is not particularly limited as long as it can be used for degrading plant cell walls. However, in the present invention, the cell wall degrading enzyme is used in combination with dricerase and macerozyme R-10. preferable. Also,
  • Protoplasts isolated from the hypocotyl of Helianthus spp. Have a low specific gravity, so the cell wall degrading enzyme is a solution with adjusted osmotic pressure mainly composed of inorganic salts such as KC1 and NaCl.
  • the S solution is used in the present invention. Is preferred.
  • the enzyme treatment is preferably performed at 25-30 ° C for 8-20 hours.
  • the isolated protoplast is inactivated by irradiation of the nuclear gene.
  • radiation to be irradiated include X-rays, ⁇ -rays, and ultraviolet rays, but are not particularly limited as long as the nuclear gene can be inactivated.
  • the irradiation dose should be within the range that can inactivate nuclei and should be as low as possible. Good. For example, in the case of soft X-ray irradiation in the present invention, an irradiation dose of 0.1 lGy to 0.6 Gy is preferable.
  • Fusion methods include known electrofusion methods (Planta, 151, 26-32, 1981), PEG methods (Planta, 120, 215-227, 1974), dextran methods (Jap. J. Genet., 50, 235, 1975) and the like. Although not particularly limited, it is preferable to use a method obtained by modifying the PEG method in the present invention. ,
  • the fused cells are preferably cultured in a medium suitable for culturing protoplasts derived from Lactuca plants.
  • a medium suitable for culturing protoplasts derived from Lactuca plants Various methods are known for culturing Lactuca plant-derived protoplus koji, and any method can be suitably used in the present invention.
  • a method obtained by improving the method (Ni shio, T., et al., Japanese journal of breeding, 38, 165-171) is preferable.
  • This method by Nishio et al. Is excellent as an efficient method for culturing protoplasts of the genus Lactuca.
  • the method of Nishio et al. Cannot be applied directly to the present invention.
  • Nishio et al. The protoplast of the genus Lactuca alone that does not undergo fusion treatment has little damage to the cell membrane and can be cultured in a solid medium containing gellan gum from the beginning of the culture. Since the cell membrane of the cells after the fusion treatment cultured in the present invention is easily broken by the stress of the treatment, when the fusion cells are mixed with gellan gum in the method of Nishio et al. This is because it is difficult to perform culture. Therefore, in the present invention, it is preferable that the cells after the fusion treatment are initially cultured in a liquid medium not containing gellan gum, and after promoting cell membrane regeneration, gellan gum is added to the medium 3 to 7 days after the culture. By adding such improvements to the method of Nishio et al., It is possible to efficiently culture the fused cells. Since the fused cells repeat division and form microcallus, it is preferable to subculture to a new medium with reduced osmotic pressure.
  • the regeneration medium has a reaction force S that varies depending on the conditions of the Lactuca genus plant and the microcallus used as the material, for example, MS medium containing 0.3 to 1.0 mg / l BA (Murasige, T. & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)) and the like are suitable.
  • the regenerated shout is transplanted to a rooting medium, for example, a half-concentrated MS medium, and rooted to regenerate the plant body.
  • the regenerated plant will be acclimatized and planted in the greenhouse. '
  • DNA is extracted from the plants regenerated by the above procedure and the leaves of Helianthus and Lactuca plants used as materials.
  • genes specific for mitochondrial of H. annuus L. include, for example, 0 rf522, orf708, orf873.
  • PCR is performed by designing primers that specifically amplify the target gene.
  • electrophoresis is performed to confirm the expected size band. In this way, individuals having the mitochondrial DNA of Helianthus plant introduced into the Lactuca plant can be selected.
  • PCR-RFLP method Tsumura, Y., Yoshimura, K. Toraaru, N. et al., Theor. Appl. Genet. 91, 1222-1236, 1995
  • DNA can be detected by distinguishing it from mitocon and doria DNA derived from plants of the genus Lactuca.
  • PCR-RFLP method it is also desirable to use the PCR-RFLP method to confirm that the chloroplasts of cytoplasmic hybrid plants selected by PCR analysis are derived from Lactuca plants.
  • chloroplast genes used in the PCR-RFLP method include rbcL and matK, but there is no particular limitation as long as polymorphism can be detected between Helianthus and Lactuca plants.
  • PCR is performed by designing primers that specifically amplify the target chloroplast gene region. Treat PCR amplification products with restriction enzymes and detect RFLPs due to differences in restriction enzyme sites to confirm the origin of chloroplasts. It is desirable to select individuals with chloroplasts derived from plants of the genus Lactuca from the viewpoint of affinity with nuclear genes.
  • the above DNA confirmation can be carried out in an acclimatized plant, but it may also be carried out at the callus stage. In addition, it is desirable to conduct ploidy tests by observing flow cytometry and chromosomes. (6) Selection of excellent lines
  • cytoplasmic hybrid plants From the obtained cytoplasmic hybrid plants, a line having male sterility and no other morphological abnormality is selected. It is important to select lines with high female fertility, especially when there is a disorder in the reproductive organs, such as male sterility, and female fertility, that is, the fruiting of seeds tends to decrease. More efficient selection is possible by analyzing the mitochondrial genome of cytoplasmic hybrid plants by PCR-RFLP analysis and using that data as the basis for selection. For example, an individual in which most of the mitochondrial genes are identical to the Lactuca genus plant even though the male sterility trait has been expressed due to the introduction of part of the mitochondrial gene of the genus Helianthus.
  • cytoplasmic hybrid Lactuca plants that are candidates for selection.
  • the cytoplasm of the excellent lineage plant is further improved to obtain a more desirable excellent lineage.
  • the technique to obtain is also effective. Either method can be used to select the best line, or the two methods can be combined.
  • Cytoplasmic male sterile cytoplasmic hybrid As a preferred method for further improving the cytoplasm of Lactuca plant, cytoplasmic male sterile cytoplasmic hybrid using Lactuca genus plant as a cytoplasm-providing material, And performing asymmetric cell fusion.
  • asymmetric cell fusion for example, recombination or genome rearrangement is caused in the mitochondrial genome, it retains cytoplasmic male sterility and has a cytoplasm with higher affinity for the lettuce nuclear gene. The possibility of selecting a system increases.
  • the cytoplasmic hybrid Lactuca plant produced and selected by the above procedure has a gene derived from the cytoplasm of Helianthus plant, preferably mitochondria, in the cytoplasm.
  • the cytoplasmic hybrid Lactuca plant has the nuclear genome of the Lactuca plant and is preferred. In addition, it has the chloroplast genome of plants belonging to the genus Lactuca.
  • the present invention also relates to the cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant, its progeny, or a part of the plant body.
  • a cytoplasmic hybrid Lactuca plant refers to the next generation obtained by crossing the pollen of a Lactuca plant that can be crossed with a cytoplasmic hybrid Lactuca plant, and the cytoplasm inherited by cytoplasmic inheritance. This refers to the Lactuc'a genus plant from the next generation onwards.
  • a cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant or a part of a plant of its progeny includes one or more cells of the plant body or a cytoplasm from one or more cells. Refers to organs or tissues such as flowers, leaves, stems, roots, etc., or cells (including protoplasts prepared from cells) or cytoplasm from these organs or tissues, or a collection of said cells or cytoplasm .
  • Cytoplasmic male rodent cytoplasmic hybrids produced by the method of the present invention are continuously backcrossed with Lactuca spp.
  • an excellent line having cytoplasm and male sterility can be obtained as a progeny.
  • the resulting superior line with cytoplasmic male sterility can be used as a seed parent to obtain F1 seeds. .
  • asymmetric cell fusion with any lettuce is performed for a short period of time. It is possible to grow seed parents with cytoplasmic male sterility. By carrying out such asymmetric cell fusion, for example, recombination into the mitochondrial genome will cause rearrangement of the genome, retain cytoplasmic male sterility, and have a cytoplasm with higher affinity for lettuce nuclear genes. Can be selected.
  • the cytoplasm of a cytoplasmic male sterile cytoplasmic hybrid Lactuca plant produced according to the present invention can be introduced into other species of the genus Lactuca.
  • About 100 wild species are known for the Lactuca genus plant, and lettuce cultivar L. sat iva is nine wild 3 ⁇ 4 of Lactuca bars.
  • cytoplasmic male sterility is produced by the present invention. It is possible to introduce the cytoplasm of Lactuca plants into many Lactuca wild species and their hybrids. At this time, a cytoplasmic male sterile cytoplasmic hybrid produced according to the present invention is irradiated with radiation or the like to inactivate the nucleus, and a cytoplasmic donor cell is used to perform asymmetric cell fusion, thereby introducing the cytoplasm. Can be performed more efficiently.
  • the cytoplasm of the cytoplasmic male sterile 'cytoplasmic hybrid Lactuca genus plant produced by the present invention is introduced into many Lactuca genus plants. Is possible. It is useful because it is possible to introduce cytoplasmic male sterility into lettuce interspecific hybrid plants that have introduced useful genes of wild species. '
  • the method of mating is not particularly limited as long as pollen of the pollen parent line is pollinated by the seed parent's pistil.
  • pollination by an air medium or insect medium for example, Patent Document 20
  • Usual methods such as artificial mating to attach pollen to the seed pods can be applied.
  • lettuce cultivar 'Thermiichi' (Sakata Seed) was used was shown.
  • the sterilized seeds were placed in MS medium supplemented with 10 g / l sucrose and 8 g agar agar, and cultured at 20 ° C for 16 hours under illumination for 16 months. Collect about 1 lg of unfolded true leaves and chop them into pieces of about 2 mm, then immerse them in 10 ml of CPW salt solution containing 0.4% Mecellase, 0.08% Macerozyme R-10, and mannitol. It was allowed to stand at 25 ° C for 16 hours.
  • the suspension of protoplasts was filtered through a 92 ⁇ NaiNon mesh. After centrifuging the protoplast suspension at 500 rpm for 3 minutes, the supernatant was removed, 2 ml of S solution containing 15 mM odoacetamide was added and suspended, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C for 5 minutes. The protoplast that had been treated with the door cetoamide was centrifuged at 300 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed and suspended in 10 ml of S solution and washed. Washing with solution S was repeated three times.
  • the purified protoplasts float in the upper S solution layer, they were sucked up with a Pasteur pipette and placed in a centrifuge tube, and 2 ml of S solution was added to suspend the protoplasts. A small amount of the suspension was taken and the cell density of the protoplasts was determined using a hemocytometer, and S solution was added to prepare 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the cultivar of cut flower castor 'Nozomi (Sakata Seed) (having castor seed specific or f522, orf873 gene) and cut flower castor breeding line' IB5 '(castor seed specific orf 873 gene) With or but not with orf522) did.
  • the sterilized seeds were placed on MS medium supplemented with 10 g of sucrose and 8 g of agar and cultured for 7 days in the dark at 25 ° C.
  • the hypocotyl extended around 50 cm was cut into 1 cm length and further divided into two in the direction of hypocotyl extension.
  • CPW salt solution containing 17% sucrose was added to make 9.5 ml.
  • 0.5 ml of S solution was overlaid and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes.
  • NAAO Lmg / 1, BA 0.3 mg / l, 1.0% sucrose, and 0.8% agar containing MS medium (pH 5.8).
  • Cytoplasmic hybrids were acclimatized by transplanting to vermiculites and cultivated in a greenhouse. ,
  • Primers specific to the orf522 and orf873 genes were designed from Bank registry numbers Z23237 and X62592) (Table 3). The extracted whole genomic DNA was used as a saddle, and PCR was performed using each combination of primers orf522-F and orf522-R and primers orf873_F and orf873_R. PCR was repeated 35 cycles of heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 60 ° C for 2 minutes, and extension reaction at 72 ° C for 2 minutes.
  • PCR products were electrophoresed on a 1.8% agarose gel, immersed in ethibromide solution, photographed under UV irradiation, and the expected size (209 bp, The presence or absence of the band (798 bp) was confirmed.
  • Figure 1 shows the results of DNA extraction from 13 varieties and PCR using primers specific for the castor mitochondrial genes orf522 and orf873.
  • Fig. 1 shows two cytoplasmic male sterile casts (lanes 1 and 2) used for the test material and male fertile casts.
  • 2 M: Molecular weight marker
  • 1 Nozomi
  • 2-7 Cytoplasmic hybrid plant created by testing 'Nozomi' as a material for providing cytoplasm
  • 8 IB5, 9-14: Tested for 'IB5' as a material for providing cytoplasm Cell produced. Hybrid plant).
  • a primer specific to the rbcL gene of sunflower chloroplasts was designed from (Gene Bank registration number L13929) (Table 3).
  • the extracted whole genomic DNA was converted into a saddle shape, and PCR was performed using a combination of primer rbcL-F: primer rbcL-R.
  • PCR was repeated 35 cycles of heat denaturation 94 ° C for 1 minute, annealing 60 ° C for 2 minutes, and extension reaction 72 ° C for 2 minutes.
  • the PCR product was digested with the restriction enzyme Taql, electrophoresed on a 1.8% agarose gel, immersed in ethimubu mouth-mide solution, and photographed under UV irradiation to confirm the cleavage of the band.
  • the rbcL gene has high homology between sunflower and lettuce, and a band of the same size is amplified, so the PCR product is digested with the restriction enzyme Taql and the origin is identified by detecting RFLP due to the difference in restriction enzyme sites. It became possible to do.
  • Figure 3 shows two cytoplasmic male sterile castor lines (lanes 1 and 2), one male fertile castor line (lane 3), and 13 lettuce cultivars (lanes 4 to 16).
  • Fig. 4 is an electrophoresis photograph showing the PCR-RFLP pattern when DNA was extracted, PCR was performed using primers specific to the chloroplast gene rbcL, and the amplified product was cleaved with Taql.
  • M Molecular weight marker
  • 1 Nozomi
  • 2 IB5
  • 3 0S06
  • 4 Thermi
  • 5 Steady
  • 6 Logic
  • 7 Meyer
  • 8 V lettuce
  • 9 Santanas
  • Cytoplasmic hybrid plants were excluded because many individuals showed morphological abnormalities due to the incompatibility of lettuce-derived nuclear genes and introduced coconut-derived mitochondrial genes. Since midchondria recombined with high frequency due to cell fusion, rearrangement of the genome occurred, and changes in morphology were observed for each individual to be regenerated. In particular, in flower organs, morphological abnormalities are likely to occur due to incompatibility. Therefore, a large number of cytoplasmic hybrid plants were produced, and excellent strains having male sterility and other morphologies were selected. In general, lettuce pollinates when the pods are matured and the female pods extend in the canopy. Therefore, as shown in Fig.
  • the most promising cytoplasmic male sterility line (hereinafter referred to as' 1216-2) (derived from castor 'IB5') has no pollen grains attached to the female pod as shown in Fig. 5.
  • the existence of pollen grains was not observed in the canteen.
  • 2n 18, which was the same as normal lettuce (Fig. 6).
  • FIG. 8 shows the results of PCR using Imah. (Explanation of symbols in Fig. 8: M: molecular weight marker, S: IB5, L: Thelmi, 1-14: Cytoplasmic male sterility) Lettuce BC3 14 individuals (1216-2-T1-1 to 14)). All individuals had orf873, and it was clarified that the mitochondria gene of sunflower was stably inherited in lettuce.
  • trnN-trnY the intergenic region of trnN and trnY
  • trnS-trnP intergenic region of trnS and trnP
  • Fig. 9 shows an electrophoretogram of the PCR and PCR-RFLP methods (Explanation of symbols in Fig. 9: M: molecular weight marker, S: IB5, L: Termini,:! ⁇ 14): Cytoplasmic male sterile lettuce 14 PC3 individuals (1216-2-T1-1 to 14)). The summary of the results is shown in Table 5.
  • FIG. 10 shows the extraction of DNA from 14 BC3 generation leaves of cytoplasmic male sterile lettuce, PCR using primers specific to the chloroplast gene rbcL, and the PCR amplification product was further digested with restriction enzymes. Electrophoresis photographs showing the results of PCR-RFLP (Explanation of symbols in Fig. 10: M: Molecular weight marker, S: IB5, L: Terminium, 1 ⁇ : I4: Cytoplasmic male sterile lettuce BC3 14 individuals (1216-2- Tl-l-14)). From the results of PCR-RFLP shown in Fig.
  • cytoplasmic male sterile lettuce can be produced by introducing DNA.
  • the results of cytoplasm analysis so far lead to integration of mitochondrial genes that cause male sterility, recombination of mitochondrial genes that induce male sterility, and rearrangement of the mitochondrial genome. This was thought to have caused male sterility.
  • the cytoplasmic hybrid lettuce grown according to the present invention has a cytoplasmic male sterile trait due to modification of the mitochondria genome, and has a mitochondria genome with high affinity for the lettuce nuclear genome. It was revealed that the genome is a highly recombined cytoplasmic male sterile lettuce. '' (7) Utilization of cytoplasmic male sterile plants and production of F1 seeds
  • the produced cytoplasmic male sterile lettuce, for example, '1216-2' was crossed with 'Thelmi,' and the progeny, '1216-2- ⁇ , was released as a pollen parent.
  • Sakata Seeds 'Steady' (Tsuruta Seedling Co., Ltd.), 'Logic' (Yokohama Ueki Co., Ltd.), 'Meyer' (Suika Agricultural Materials Co., Ltd.), 'V Lettuce' (Kaneko Seed Seed Co., Ltd.) F1 seeds were collected.
  • cytoplasmic male sterile cytoplasmic hybrid '50125-3' Created.
  • the '50125-3' flower had no pollen grains on the pistil, and no pollen grains were found in the pods.
  • 'V lettuce ' there was no clear difference in the shape of the vase.
  • Normal cytoplasmic lettuce pollen was crossed to the selected cytoplasmic male sterile line '50125-3', and seeds were obtained, confirming that the female fertility was maintained. did.
  • male sterility was caused by cytoplasm, and cytoplasmic inheritance was observed. I confirmed that
  • results in Table 7 show an example of the analysis results of individuals expressing cytoplasmic male sterility, and the cytoplasmic male sterility lettuce does not necessarily show only such a band pattern.
  • the present invention provides a cytoplasmic hybrid lettuce having a cytoplasm derived from sunflower.
  • the cytoplasmic hybrid lettuce according to the present invention is a cytoplasmic male sterile lettuce
  • the use of this lettuce as a seed parent is different from the case of using a nuclear genotype male sterile plant for commercial F 1 seed production. This makes it possible to seed F1 seeds with high purity.

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Abstract

　本発明はレタスのF1品種作成に有用な細胞質雄性不稔レタス及びその作出方法を提供することを目的とする。　本発明は、Helianthus属植物の細胞質に由来する遺伝子を細胞質内に有する、好ましくは細胞質雄性不稔性である細胞質雑種Lactuca属植物、その後代、またはそれらの植物体の一部に関する。本発明はまた、この細胞質雑種Lactuca 属植物の作出方法に関する。

Description

細胞質雑種 Lactuca 属植物およびその作出方法
技術分野
細胞質雑種 ctuca '属植物およびその作出方法に関する。
背景技術
明
従来から植物品種には、 固定品'種と雑種第一代 （以下、 F1 と記す） 品種がある が、 主要作物においては F1 品種が普及し田ている。 F1 品種は、 雑種強勢 （ヘテロ シス） によって、 生育が旺盛になることにより、 生育速度が速く； 収量性が i¾ま るなど大きな利点がある。 加えて、 病害虫への耐性や、 耐寒 ·耐暑性などの環境 適応性の向上も期待できる。また F1品種の遺伝子型はへテロ性でありながら同一 の遺伝子型であるため、 表現型は極めて高い均一性を示すため生産物の市場性が 高まる。 さらに優性遺伝子に支配されている有用形質を集積しやすく、 迅速な育 種が可能となる。 また、 次世代以降は形質の分離が起こることで品質の均一性を 保てないため、 F1種子を毎年生産する必要があり、 品種育成者の権利が保護され ることも大きな利点である。
以上のような理由から、 F1品種は、 主要作物において栽培品種の主流を占める ようになった。 しかし、 F1種子を商業的に大量生産するためには、 コストをかけ ずに容易に除雄する方法を必要とする。 果菜類のトマト、 メロン、 キユウ ! ·、 力 ボチヤ、 花卉類のペチュニア、 トルコギキヨウなどのように、 1回の交配により 多くの種子が得られる場合には、 人手による除雄、 交配を行うことにより、 経済 的な F1種子の生産が可能である。 しかし、 花の構造上、 除雄を効率的に行うこと が極めて困難な作物や、 1回の交配により得られる種子が少ないため、 人手によ る交配では大量に交雑種子を得ることが難しく、経済的に F1種子の生産が行えな い作物も多い。 このような作物では、 雄性不稔性の遺伝的特性を利用し、 雄性不 稔植物を種子親とする採種によって、 多大な労力とコストを要する除雄の作業を 省力化することができるため、 雄性不稔性を利用した採種方法の開発は非常に重 要である。
雄性不稔性は、 多くの植物種で発見されている。 また、 細胞融合技術を使用し た雄性不稔植物の作出方法が多くの有用作物で確立されている （特許文献 4、 特 許文献 5、 特許文献 6、 特許文献 7、 特許文献 8、 特許文献 9、 特許文献 10、 特許 文献 11、 特許文献 12、 特許文献 13、 特許文献 14、 特許文献 15、 特許文献 16、 特 許文献 17、 特許文献 18、 特許文献 19)。 雄性不稔性の機構は多種多様であるが、 核遺伝子型雄性不稔性（Genetic Male Steri l ity) と細胞質雄性不稔性 (Cytoplasmic Male Steril ity)の 2つに大別できる。 核遺伝子型雄性不稔性は、 核内遺伝子によって雄性不稔性が引き起こされる。 一方、 細胞質雄性不稔性は、 細胞質遺伝要因と核遺伝子の相互作用により雄 ί生 稔を発現する。
レタスは世界各国で生産され、 市場規模の非常に大きな野菜であり、 F1品種化 が強く望まれている。 また、 非特許文献 1.，非特許文献 2には、 レタスにおける雑 種強勢の発現について記載されている。核遺伝子型雄性不稔レタスを利用して F1 植物を作出し、 従来の固定種と比較することで雑種強勢の発現を調査しており、 その結果、 F1植物が顕著な雑種強勢を示すことが報告されている。 そこで、 レタ スの雄性不稔性を利用した F1 種子の効率的な採種技術の確立が強く要望されて きたが、 未だ確立されていないのが現状である。 例えば、 非特許文献 3は、 レタ スの核遺伝子型雄性不稔性の遺伝様式を明らかにしたものであるが、 雄性不稔性 が不安定であり、 雌性にも障害が現れるため （非特許文献 7)、 実用的な利用には 課題が残っていた。 同じ著者によって非特許文献 4と非特許文献 5に同様の報告 がなされている。 また実際、 核遺伝子型雄性不稔性を利用した、 F1品種の商品化 がなされているが、 雄性不稔性が不安定であり、 従来の固定種に取って代わるま でには至っていない （非特許文献 6)。
さらに近年になって、 新しいタイプのレタスの核遺伝子型雄性不稔系統が見出 されている。 例えば、 特許文献 1、 非特許文献 1に記載されている系統 'MS1024' は、 病害抵抗性選抜後代の中から見つけ出されたものであるが、 花粉粒をまった く生じさせない雄性不稔性である点や、 採種量が高い点で非特許文献 3などに記 載された核遺伝子型雄性不稔植物よりも優れている。
しかしながら、核遺伝子型雄性不稔植物を商業的な F1種子の生産に利用するに は、 採種コス トの'点で問題を生じる。 これまでに発見されたレタスの核遺伝子型 雄性不稔性は、劣性遺伝子がホモ接合（homozygous)していることに,よる雄性不稔 性である （非特許文献 7)。'劣性遺伝子がホモ接合（homozygosi s)した雄性不稔植 物はそれ自身では自殖できないため、 雄性不稔系統を維持 ·增殖するためには、 雄性不稔遺伝子をへテ口接合（heterozygosis)に持つ個体を交配し、後代から雄性 不稔遺伝子をホモ接合にもつ個体を選択しなければならない。 交雑後代において 可稔植物個体と不稔植物個体は 1 ： 1 に分離するため、 その交雑後代の約 50%が 雄性不稔植物個体である。 そのため、 商業的な F1種子の生産 ためには、 採種圃 場において何らかの方法で可稔植物個体を選別し、 抜き取る必要がある。 特にレ タスは花器が小さいため、不稔植物個体と可稔植物個体との判別が容易ではなく、 細い花茎に多数の花をつけるため、 抜き取り作業がより煩雑となる。 ' また、 開花時期は'個体ごとにずれるため、 花の外見を基準にして可稔個体の完 全な抜き取りを行うことは大変な労力を要するうえ、抜き取りミスによる F1種子 の純度の低下により種子の品質が悪化するという問題ち生じる。
さらに育種面においても、 雄性不稔遺伝子を持つ個体が開花期以外は視覚的に 区別できないため、 育種効率が悪く、 長い育種年限を要する。 可稔性植物と不稔 性植物との判別を容易にするに ί'ま、 種子または生育初期に形態と連鎖した遺伝子 を見出し利用するか、 雄性不稔遺伝子に連鎖する DNAマーカーを開発して雄性不 稔植物のみを選択するような工夫が必要である。 現在レタスにおいてその研究が なされているが、 その技術は未だ確立されていない。
上述のようにレタスの核遺伝子型雄性不稔性の遺伝様式が明らかになつてから、 長い年月が経過しているにもかかわらず、 核遺伝子型雄性不稔レタスを利用した F1品種の開発には多くの課題が残されており、 市場性の高い F1 品種の開発は未 だ困難である。
一方、 細胞質雄性不稔性を利用した F1種子の生産は、 ヒマヮリ、 テンサイ、 ジ ャガイモ、 イネ、 コムギ、 ニンジン、 タマネギ、 ネギなどでは古くから実用化さ れ、 商業的な生産システムが確立している。 また、 アブラナ科植物のキャベツ、 ブロッコリ一、ダイコン、 ハクサイなどでは、 自家不和合性を利用した F1品種の 採種が広く用いられていたが、 近年になり、 より高品質な種子が求められるよう になったことから、 細^質雄性不稔性を利用した F1種子の生産が拡大している。 一般に、 安定的な雄性不稔性を持つ細胞質雄性不稔植物を作出できれば、 連続 戻し交雑を行うことにより、 その細胞質雄性不稔性を多くの優良系統に導入し、 F1 品種作成のための種子親を育成することが可能となる。 細胞質雄性不稔性は、 細胞質遺伝するため、 後代植物はすべて雄性不稔性を示す。 細胞質雄性不稔系統 は、 当該系統と核ゲノムが同一であって細胞質が正常である維持系統との交配に より、 維持 ·増殖が容易である。 上述の核遺伝子型雄性不稔性を利用する場合の ように、 採種圃場において種子親の可稔個体を抜き取る作業が必要ないため効率 的であり、 抜き取りミスによる F1種子の純度の低下の問題もなくなる。
以上のような背景から、 細胞質雄性不稔植物も利用した F1種子の採種方法は、 核遺伝子型雄性不稔性を利用した場合と比較して経済的，商業的実用性が極めて ¾レ、と る。 ·
上記のように高い有用性が期待されるにもかかわらず、 レタスにおいては、 細 胞質雄性不稔レタスを用いた F1種子の採種法は開発されていない。 これは、 レタ スについて、 レタスの細胞質に導入されて細胞質雄性不稔性を引き起こすことが 可能な細胞質を有する、 交雑可能な近縁の素材が同種または同属内に存在しない からである。
一方、 キク科のヒマヮリ属のヒマヮリ栽培種（Helianthus annuus L. )において は、 種間交雑により、 数多くの細胞質雄性不稔植物が見出されており、 F1品種が 実用化されている。 これらのことは非特許文献 9〜13等に報告されている。 キク 科野菜の細胞質雄性不稔植物の作出例としては、 ヒマヮリとチコリの細胞融合に より、 細胞質雄性不稔チコリが作出できることが知られている。 このような技術 は例えば、 特許文献 2、 特許文献 3、 非特許文献 14から非特許文献 17に開示さ れている。
非特許文献 14は、細胞質雄性不稔チコリ作出の最初の報告であり、 ヒマヮリの 細胞質を細胞融合技術によって、 チコリに導入することにより細胞質雄性不稔チ コリが作出できることを明らかにした。非特許文献 14はまた、作出された細胞質 雄性不稔チコリにおけるミ トコンドリアゲノムが、 チコリのミ トコンドリアゲノ ムとヒマヮリのミ トコンドリアゲノムとが組み換えられたものであることを報告 している。 さらに'非特許文献 16、 非特許文献 17では—、 前記細胞質雄性不稳チコ リの後代での細胞質雄性不稔性の発現とミ トコンドリア DNA構造の分析結果を報 告している。
特許文^ *2にはキク科植物の細胞質雄性不稔植物及びその作出方法が記載され ている。 この特許文献 2で実際に作成されたことが示されている細胞質雄性不稔 植物は、非特許文献 14と同じ細胞質雄性不稔チコリのみである。特許文献 2には、 細胞質雄性不稔レタスについての言及はあるものの、 プロ トプラス トの培養方法 と融合処理の方法が現在形の文章で言及されているに過ぎず、.実際に細胞質雑種 レタスまたは細胞質雄性不稔レタスを作成するための方法及び実験結果は記載さ れていない。 細胞融合技術においては、 プロ トプラス トの単離 '融合の工程まで は、 比較的容易に行うことができる。 例えば、 動物細胞と植物細胞のプロ トプラ ストをそれぞれ単離し融合させることさえも可能で.ある。 しカゝし、 系統学的に遠 縁間での融合細胞を培養して分裂させ、 さらに植物体を再生させる工程は技術的 困難性が非常に高い これは、 融合処理のス トレスが融合細胞の分裂を阻害した り、 異種の核と細胞質の間での相互の遺伝的不親和性などが技術的困難性を高め る原因となるためである。 この困難性を克服して植物体を再生するためには、 融 合細胞の細胞膜を傷めなレ、ような融合方法の開発、 新しいゲノムの組合せを有す る融合細胞においても分裂や植物体の再生が可能となるような培養方法の開発が 必要となる。 すなわち、 融合細胞の培養技術とそれに続く融合細胞からの植物体 の再生技術は、 細胞融合技術の中核となる技術である。'さらに、 雄性不稔性を発 現させるためには、 系統学的に適度な遠縁関係にある異種間のミ トコンドリアゲ ノムの組換えや再編成を生じさせることが必要となる。 すなわち、 遠縁間の細胞 質雑種植物が作出可能となっても、 雄性不稔性を発現する植物を作出できるかど うかは予測できないため、 実際に細胞質雑種植物を作出し、 雄性不稔性を有する 個体を選抜する工程が不可欠である。 従って、 特許文献 2には、 レタスの細胞質 雄性不稔植物作出のために重要となる技術の開示が行なわれていない。 これらの 理由から、 細胞質雄性不稔レタスの作出方法の開発は従来から強く望まれていた にもかかわらず、 特許文献 2の開示後もレタスの細胞質雄性不稔植物作出の成功 に関する報告例は存在しない。 特許文献 3ではヒマヮリの細胞質雄性不稔性の原因遺伝子とされる orf522を、 非対称細胞融合によりチコリ属植物に導入し、 細胞質雄性不稔チユリを作出する 方法について開示されている。
非特許文献 15 は新たな研究グループによる細胞質雄性不稔チコリの作出例で あり、 近年においても実用的な細胞質雄性不稔チコリの作出を目的に研究が続け られている。
以上のように、 ヒマヮリのミ トコンドリア DNAの一部を、 細胞融合により導入 した細胞質雄性不稔チコリの作出例は数多く報告されている。. しかしながら、 レ タスはチコリと同じキク科に属するにもかかわらず、 細胞質雄性不稔レタスの作 出例は報告されていない。 細胞質雄性不稔ヒマヮリ'を用いた細胞質雄性不稔レタ スの作出が困難であるのは、 レタスの核ゲノムは、 チコリの核ゲノムと比べて、 ヒマヮリのミ トコンドリアゲノムと遺伝的親和性が低いことが原因であると思わ れる。
また、 ヒマヮリの細胞質雄性不稳遺伝子をチコリに導入して細胞質雄性不稔チ コリを得た後、 該チコリとレタスを交雑して細胞質雄性不稔性をレタスに導入す る方法も考えられるが、 レタスとチコリは属が異なる瑋縁関係にあるため、 有性 的な交雑は困難であり、 このような手法によって、 細胞質雄性不稔レタスを作出 する試みは成功例が知られていない。
以上のように、 細胞質雄性不稔レタスの作出の技術的困難性は非常に高く、 未 だ成功例はない。 しかしながら、 細胞質雄性不稔レタスを利用したレタスの F1 品種化のメリッ トは大きい。 そこで、 細胞質雄性不稔レタスの作出が強く望まれ ていた。
特許文献 1 特開 2005-110623号公報
特許文献 2 欧州特許第 0771523号明細書
特許文献 3 国際公開 W097/45548号パンフレツト
特許文献 4 特開昭 62-232324号公報
特許文献 5 特開昭 63-79548号公報
特許文献 6 特開平 2-303426号公報
特許文献 7 特開昭 63-36776号公報 特許文献 8 特開昭 64-20041号公報 —
特許文献 9 特開平' 1-218530号公報
特許文献 1 0 特開平 10-052185号公報
特許文献 1 1 米国特許第 5254802号明細書
特許文献 1 2 特開平 10- 108676号公報 ' 特許文献 1 3 特開平 10-108677号公報
特許文献 1 4 特開 2001-145497号公報
特許文献 1 5 特開平 02- 138927号公報 ，
特許文献 1 6 特開平 01-206931号公報
特許文献 1 7 国際公開 W099/55143号パンフ ッ ト
特許文献 1 8 国際公開 W095/09910号パンフレッ ド
特許文献 1 9 国際公開 W097/09873号パンフレッ ト
特許文献 2 0 特許第 3635036号公報
非特許文献 1 高田勝也，藤野雅丈（1987)レタスの F1種子の採種に関する研 究 （ 第 1 報 ） 雄性不稔系を親とした F1 の雑種強勢について， 園学学会 昭和 62年度春季大会 研究発表要旨 208 - 209
非特許文献 2 高田 也， 野雅丈（1986)レタスの雄性不稔性利用技術の開 発（1)F1 組み合わせにおける雑種強勢発現について， 野菜 ·茶業試験場盛岡支場 研究年報 No.1. 87-93.
非特許文献 3 Edwrd J. Ryder (1967) A recessive male sterility gene in Lettuce (Lactica sativa L. ) Pro. Am. Soc. Hortic. Sci. 91， 36b- 368
非特言午文献 4 Ryder, E, J Proceeding of the American society for horticultural Science 1963 Vol.83585 - 589 An epistatically controlled pollen sterile in Lettuce (Lactica sativa L)
非特許文献 5 Ryder, E, J Science 1989vol.114(1) 129-133 Studies of three new genes, linkage, and epistasis in Lettuce
非特許文献 6 品種登録出願書類 「ファイン」 カネコ種苗 第 1745号 非特許文献 7 芹沢 啓明 園芸学会雑誌第 73卷 別冊 2 p 566 レタス の劣性雄性不稔遺伝子 , 非特許文献 8 Matsumoto, E Plant cell reports 1991. vol9 (10) Interspecific somatic hybridization between lettuce (Lactica sativa) and wild species L. virosa
非特許,文献 9 L. H, Rieseberg, C. Van Fossen, D. Arias, and R. L. Carter The journal of heredityl994:85 (3) 233 - 238 Cytpplasmic male sterility in Sum lower： origin, Inheritance, and Frequency in Natural Populations
非特許文献 1 0 R.Horn Theor Appl Genet (2002) 104:562— 570 Molecular diversity of male sterility inducing and male-fertile cytoplasms in the genus Helianthus
非 特許 文 献 1 l S. Sukno, J. Ruso 'Euphytica (1999) 106:69-78 Interspecinc hybridization between sunflower and wild perennial Herianthus species via embryo rescue
非特許文献 1 2 R.Horn W. Friedt Plant Breeding 116(1997)317-322 Fertility restoration of new CMS sources in sunflower (Helianthus annuus L. ) 非特許文献 1 3 Horn, R Plant molecular biology ;an international journal on fundamental research and genetic engineering July 1991 vl7 (1) 29-36 A mitochondrial 16kDaprotein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower.
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非特許文献 1 6 C. Rambaud, A. Bellamy, A. Dubreucq, J. -C. Bourquin and J. Vasseur (1997) Molecular analysis of the fourth progeny of plants derived from a cytoplasmic male sterile chicory cybrid, Plant Breeding 116:481-486 非特許文献 1 7 A. Dubreucq Theor Appl Genet (1999) : 1094-1105 Analyses of mitochondrial DNA structure and expression in three cytoplasmic male-sterile chicories originating from somatic hyvridisation between fertile chicoly and CMS sunflower protoplasts
非特許文献 1 8 水谷 高幸 Bull. Fac.Agr., Saga Univ 67： 109-118 (1989) レタス及び *日本産近縁野生種のプロ トプラストからの植物体再生及ぴ細胞融合 発明の開示
本発明は上記のような従来技術の問題点に鑑みて、レタスの F1種子の生産に有 用な細胞質雑種 Lactuca属植物レタス及びその作出方法を提供することを目的と する。
本発明者は、 上記の課題を解決するため鋭意検討''を行った結果、 ヒマヮリとレ タスの融合雑種細胞の培養方法、 細胞質雑種植物の再生方法の技術により、 安定 した細胞質雄性不稔レタスを作出し、これを利用してレタスの F1種子が効率的に 得られる：；とを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の発明を包含する。
( 1 ) Helianthus 属植物由来のプロ トプラストと Lactuca 属植物由来のプロ ト プラストを細胞融合し、 次いで融合細胞を培養し、 培養された融合細胞から植物 体を再生することを特徴とする ΐ田胞質雑種 Lactuca 属植物の作出方法。
, (2) Helianthus 属植物由来のプロ トプラストが H. annuus L.に由来するプロ トプラストである力、、 または H. petiolaris、 H. argophyllus, H. debilis、 H. decapetalus 、 H. giganteus 、 H. rigidus、 H. salici*fol ius、 H. anomalus、 H. bolanderi ^ H. exilis、 H. maximiliani、 H. neglectus、 H. praecox、 もしくは H. tuberosus由来の細胞質を有する Η· annuus L.の細胞質置換系統に由来するプ ロ トプラストである （1 ) 記載の方法。
( 3 ) Lactuca 属植物由来のプロ 卜プラス卜力 s Lactuca sativa L.、 L. serriola, L. acu丄 eate、 L. scarioloides、 L. azerbai janica^ L. georgica、 L. dregeana^ L. altaica、し saligna^ L. virosa、し tatarica^ L. indica、もしくは L. debilis、 またはそれらの種間交雑植物に由来するプロ トプラストである （1 ) または （2) 記載の方法。
(4) Helianthus 属植物が細胞質雄性不稔性を有する、 （1 ) 〜 （3) のいずれ かに記載の方法。'
(5) Helianthus 属植物がミ トコンドリアに雄性不稔遺伝子を有する、 （4) 記 載の方法。
(6) 細胞質雑種 Lactuca 属植物が細胞質雄性不稔性を有する、 （1 ) 〜 （5) のいずれかに記載の方法。 '
( 7) ( 1 )〜（6)のいずれかに記載の方法により作出された細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体の一部。
(8) 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部が、 該植物体の 細胞または細胞質を含むものである、 （7) 記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物ま たはその後代の植物体の一部。 1
(9) Helianthus 属植物のミ トコンドリアに由来する遺伝子を細胞質内に有する 細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 .またはそれらの植物体の一部。
( 1 0) Helianthus 属植物力 H. amniusしで ¾>る力、 また ίΐΗ. petiolaris, H. argophyllus^ H. debilis、 H. decapetalus 、 H. giganteus 、 H. rigidus、 H. salicifolius、H. anomalusxH. bolanderi^H. exilis、H. maxirailiani^H. neglectus H. praecox, もしくは H. tuberosus 由来の細胞質を有する H. annuus L.の細胞 質置換系統である （9) f己載の細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそ れらの植物体の一部。
( 1 1 ) 細月包質雑種 Lactuca 属植.物力 S Lactuca sativa し.、 し serriola, L.
Figure imgf000011_0001
L. altaica^ L. saligna、 L. virosa、 し tatarica^ L. indica、 もし <はし debilis、 またはそれらの種間交雑植物に由来するものである （9) または （1 0) 記載の 細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体の一部。
( 1 2) Helianthus 属植物のミ トコンドリアに由来する遺伝子が雄性不稔遺伝子 である （9) 〜 （1 1 ) のいずれかに記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後 代、 またはそれらの植物体の一部。
( 1 3) 細胞質雄性不稔性を有する、 （9) 〜 （1 2) のいずれかに記載の細胞質 雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体の一部。
( 1 4) 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部が、 該植物体 の細胞または細胞質を含むものである、 （9) 〜 （1 3) のいずれかに記載の細胞 質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部。
( 1 5) 受託番号 FERM BP- 10421である細胞質雑種 Lactuca 属植物の種子、 該種 子から生育させた細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体 の一部。
( 1 6) 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部が、 該植物体 の細胞または細胞質を含むものである （1 5) 記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物 またはその後代の植物体の一部。 .
( 1 7) 受託番号 FERMBP-10647である細胞質雑種 Lactuca 属植物の種子、 該種 子から生育させた細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体 の一部。 ， ，
( 1 8) 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部が、 該植物体 の細胞ま は細胞質を含むものである、 （1 7) 記載の細胞質雑種 Lactuca 属植 物またはその後代の植物体の一部。
( 1 9) (6) 記載の方法により作出された細胞質雑種 Lactuca 属植物またはそ の後代を種子親とし、該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交配し、 交配後の種子親から雑種筚一代種子を採種することを含む、 雑種第一代種子の作 出方法。
(2 0) ( 1 3)記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代を種子親とし、 該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から 雑種第一代種子を採種することを含む、 雑種第一代種子の作出方法。
(2 1 ) ( 1 5)記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代を種子親とし、 該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から 雑種第一代種子を採種することを含む、 雑種第一代種子の作出方法。
(2 2) ( 1 7)記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代を種子親とし、 該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交配し、交配後の種子親から 雑種第一代種子を採種することを含む、 雑種第一代種子の作出方法。
(2 3) ( 1 9) 〜 （2 2) のいずれかに記載の方法により作出された雑種第一代 種子または該種子から生育させた雑種第一代植物。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005- 311598号の明細書 および または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単 説明
図 1は、 供試材料に用いた細胞質雄性不稔ヒマヮリ 2系統と雄性可稔ヒマヮリ 1系統、 レタスの栽培ロロ q種 13品種から DNAを抽出し、 ヒマヮリ ミ トコンドリア遺 伝子 orf522 に特異的なプライマー（上図）及び orf873 に特異的なプライマー（下 図）を用いて PCRを行った結果を示す電気泳動写真である。 ，
図 2は、 ヒマヮリ ミ トコンドリァ遺伝子 orf522及び orf873に特異的なプライ マーを用いて、 細胞質雑種植物の検定を行つた結果''の一例を示す電気泳動写真で ある。 .
図 3は、 供試材料に用いた細胞質雄性不稔ヒマヮリ 2系統と雄性可稔ヒマヮリ 1系統、 レタスの栽培品種 13、品種から DNAを抽出し、 葉緑体遺伝子 rbcLに特異 的なプライマーを用いて PCR を行い、 その増幅産物を Taql で切断したときの PCR- RFLPパターンを示す電気泳動写真である。
図 4は、 レタス栽培品種 'テルミ一' の花の形態を示した図である （A：花序、 B：頭花、 C：頭花の中心部 （倍 X 20)、 D :雌蕊と葯筒 （倍率 X 64) )。
. 図 5は、 細胞質雄性不稔レタスの花の形態を示した図である （A :花序、 B :頭 花、 C :頭花の中心部 （倍率 X 20)、 P：花粉の付着した雌蕊と葯筒 （倍率 X 64) )。 図 6は、 細胞質雄性不稔レタスの染色体の観察結果を示す図である。
図 7は、 細胞質雄性不稔レタスに、 雄性可稔レタスの花粉を交配することによ つて後代種子が得られることを示した図である。
図 8は、細胞質雄性不稔レタスの BC3世代 14個体の葉から DNAを抽出し、 ヒマ ヮリ ミ トコンドリァ遺伝子 orf873に特異的なプライマーを用いて PCRを行った結 果を示す電気泳動写真である。
図 9 Aは、細胞質雄性不稔レタスの BC3世代 14個体の葉から DNAを抽出し、 ミ トコンドリア遺伝子 atP6、 cox II、 cobに特異的なプライマーを用いて PCRを行 つた結果を示す電気泳動写真である。 ミ トコンドリア遺伝子 atP6、 cox II、 cob の場合は、 PCR増幅産物をさらに制限酵素で消化した PCR-RFLPの結果である。 図 9 Bは、細胞質雄性不稔レタスの BC3世代 14個体の葉から DNAを抽出し、 ミ トコンドリア遺伝子 rps3、 trnNと trnY、 trnSと， trnPに特異的なプライマーを用 いて PCRを行った結果を示す電気泳動写真である。
図 1 0は'、 細胞質雄性不稔レタスの BC3世代 14個体の葉から DNAを抽出し、 葉緑体遺伝子 rbcLに特異的なプライマーを用いて PCR を行い、 その増幅産物を Taq Iで切断したときの PCR- RFLPパターンを示す電気泳動写真である。
図 1 1は、 細胞質雄性不稔レタス ' 1216- 2- Τ X 'テルミ一' の ^植物の花 器と雌蕊の形態を示した図である。
図 1 2は、 細胞質雄性不稔レタス ' 1216-2- ΤΓ X 'ステディー， の F1植物の 花器と雌蕊の形態を示した図である。
図 1 3は、 細胞質雄性不稔レタス ' 1216-2- ΤΓ X '口,ジック' .の F1植物の花 器と雌蕊の形態を示した図である。 '
図 1 4は、 細胞質雄性不稔レタス ' 1216- 2- Tl， X 'マイヤ一， の F1植物の花 器と雌蕊の形態を示した図である。
図 1 5は、 細胞質雄性不稔レタス ' 1216- 2-ΤΓ とレタス野生種 L. serriola との交雑種の植物体、 花器、 雌蕊の形態を示した図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明による融合雑種細胞及び細胞質雑種植物は、 下記の手段からなる方法に より作成することができる。 ， '
( 1) プロ トプラス トの調製
(2) プロ トプラストの融合処理
(3) 融合雑種細胞の培養
(4) マイクロカルスからの植物体の再生
"(5) 細胞質雑種植物の選抜
(6) 優良系統の選抜
(7) 細胞質雄性不稔植物の利用と F1種子の生産
各工程の詳細は下記の通りである。
( 1) プロ トプラス トの調製 ( i ) Lactuca 属植物由来のプロ トプラストの単離
プロ トプラス トの調製に用いる Lactuca 属植物は、 Lactuca sat iva し、 L.
Figure imgf000015_0001
L. georgica、 L. dregeana^ . altaica^ L. sal igna^ L. virosa、 L. tataricaN L. indica, もし くは L. debi l i s、またはそれらの種間交雑植物であることが好ましく、なかでも、 レタスの栽培種である L. sat ive L. が好ま しい。 L. sat ive し は、 var. angustana (ァスパラレタス、 レタス等を含む。 ；)， var. longifol ia . (コス、 口 メインレタス、 立レタス等を含む。） ， var. cri spa (葉レタス （リーフレタス、 ルースリーフレタス） 等を含む。）'、 var. capitata (ヘッ ドレタス、 玉レタス、 バ ターへッド、 サラダナ、 クリスプへッド、 キャベツタイプレタス等を含む。 ）など に類別されており、これらはいずれも生態的に分化した同一種内での変種である。 本発明には L. sative L.に属するいずれの変種も好適に用いることができる。 な お、エンダイブやチコリ一などはレタスに類似した特性も認められるが、 Lactuca 属には属さないため、 レタスには含められていない（野菜園芸大百科 7 レタス ' セルリー 1 9 8 9年 4月 30日第 1刷発行 発行所 社団法人 農山魚村文化協 会 P 87)。
プロ トプラストを得るために使用する細胞組織としては、 収量性が高く、 分裂 活性が高い葉肉組織を供試することが望ましいが、 胚軸ゃ茎、 カルスなどの他の 組織も材料として用いてもよい。 .
プロ トプラストを単離する方法は通常用いられる方法 （非特許文献 8、 18) な どで良く、 特に制限されない。 まず、 レタスの細胞組織を細切し、 酵素処理する ことによってプロ トプラストを単離する。 ここでは、 プロ トプラスト単離用酵素 溶液を使用する。 この溶液は主に細胞壁分解酵素、 浸透圧調整剤を含む無機塩緩 衝液である。 細胞壁分解酵素としては、 植物の細胞壁の分解に使用できるもので あれば特に制限されないが、 セルラーゼ、 へミセルラーゼ、 ぺクチナーゼ等が挙 げられる。本発明では、 メイセラーゼとマセロザィム R-10の組み合わせが好まし い。 浸透圧調整剤としては、 一般的な糖アルコール類、 例えばマンニ トール、 ソ ルビトール、 グルコース等を用いることができ、 マンニトールが好ましく、 0. 3M
〜0. 7Mの濃度のマンニトールが特に好ましい。 さらに、 酵素溶液には、 プロ トプ ラス トの膜の安定化のために、 無機塩を添加することが望ましく、 例えば表 1記 載の組成の CPW 塩（Cocking and Peberdy, 1974)を添加すると好適である。 酵素 処理は、 25〜30°Cで 8〜20時間静置処理すると好適である。
表 1 ·
CPW塩溶液の組成
Figure imgf000016_0001
酵素処理により単離したプロ トプラストを 30〜100 / m の孔径のナイ口ンメッ シュで濾過し、 遠心分離してプロ トプラストを集めて酵素液を除く。 次にプロ ト プラス トを洗浄液に懸濁し、 プロ トプラス トを洗浄する。 洗浄液としては、 一般 的に用いられる CPW塩溶液に浸透圧調整剤として糖アルコール類を添加したもの を用いることもできるが、 後に単離する Hel ianthus 属植物由来プロ トプラスト との融合時に下記組成の S 液 （文献 ： Lenee P, Chupeau Y, Plant Sci. 43： 69-75 (1986)参照） を用いることが望ましいため、 ここでは洗浄液として表 2記載 の組成を有する S液を用いるのが好ましい。 '
表 2
S液の組成
Figure imgf000016_0002
次に、 Lactuca 属植物プロ トプラストの単独での分裂を防ぐために不活化処理 を行うことが望ましい。 不活化処理は、 ョード酢酸、 ョードアセトアミ ド等のョ 一ド化合物を溶解した CPW塩溶液などにプロ トプラストを懸濁させることで行え る。 本発明ではョードアセトアミ ドを 5mM〜30mMの濃度に調整した CPW溶液に懸 濁し 5〜20分間処理を行うと好適である。
次に遠心分離を利用して S液での洗浄操作を 1〜3回繰り返すことが好ましレ、。 プロ トプラ *ス トの懸濁液には、 導管や細胞の断片も混入するため、 さらに密度勾 配遠心分離法等により、 プロ トプラストを精製する。 精製に用いる試薬にほ、 糖 類、 合成コロイ ド等が挙げられるが、 本発明ではショ糖液の利用が好適であり、 15%〜20%のショ糖液の利用が特に好適である。 プロ トプラストの精製後、血球計 算盤によって細胞密度を計測し、 細胞融合に適した細胞密度になるように S液に よって液量を調整する。 プロ トプラス トの細胞密度は、 1 X 105〜1 X 107細胞/ ml が好ましく、 液量の調整には S液の利用が好ましい
( i i) Hel ianthus 属植物由来のプロ トプラストの単離 . '
本発明の細胞質提供材料として利用できるのは、 Hel ianthus 属植物である。 Hel ianthus 属植物のな力 でち、ヒマヮジの栽培品種である Hel ianthus annuus L. めるレヽ ί 、 H. pet iolari s H. argophy丄丄 us、 H. debi丄 is、 H. decapetalus 、 H. giganteus 、 H. rigidus、H. sal ic i fol ius、H. anomalus^ H. bolanderi、 H. exi l i s、 H. maximi l iani、 H. neglectus、 H. praecox、 ちしくは H. tuberosus由来の糸田胞 質を有する H. annuus L.の細胞'質置換系統が好ましい。
. 本発明に用いられる Hel ianthus 属植物は細胞質雄性不稔系統であることが好 ましい。 従来 annuus L.においては、 多数の細胞質雄性不稔系統が作出されて いる。 それらは栽培種の自然突然変異や種々の種間交雑後代から得られることが 知られている。 具体的には、 H. annuus しの自然突然変異体あるいは、 上述の H. annuus L. の各種細胞質置換系統から育成された細胞質雄性不稔系統が知られて おり、 分子生物学的手法によりその多様性も報告されている （非特許文献 10)。 すなわち H. annuus L.においては、 すでに多くの細胞質雄性不稔性を有する細胞 質置換系統が育成されている。本発明においては、 Hel ianthus 属植物の種々の細 胞質置換系統を細胞質提供材料として使用することができる。
本発明において細胞質雄性不稔性の細胞質雑種 Lactuca 属植物を得るために は、 細胞質提供材料として細胞質雄性不稔遺伝子を有する Hel ianthus 属植物を 用いるのが好ましいが、 これらに限定されるものではない。 Hel ianthus 属植物由 来のプロ トプラストと、 Lactuca 属植物由来のプロ トプラストとを細胞融合する 際に両植物中のミ トコンドリアゲノム間でゲノムの組換えや再編成が引き起こさ れた結果、 細胞質雄性不稔性を発現する系統が得られる場合もある。 こうして作 出される細砲質雄性不稔性の雑種 Lactuca 属植物もまた本発明に包含される。 また細胞融合に用いられる Hel ianthus 属植物細胞は放射線処理により核ゲノ ムを不活化したものを用いることができる。 Hel ianthus 属植物細胞の核ゲノムを 不活化することにより、 Hel ianthus 属植物細胞と Lactuca 属植物細胞の細胞融 合後、 Hel ianthus 属植物の核ゲノムに影響を受けることなく、. Lactuca 属植物の 核ゲノムが有する再分化能力により Hel ianthus 属植物由来の細胞質遺伝子を有 する Lactuca 属植物の植物体の再生が可能である .
以上の通り本発明においては、 Hel ianthus 属植物の様々な素材を細胞質提供細 胞として選択することが可能であり、 多様な遺伝的背景を持った細胞質雑種 Lactuca 属植物の作出が可能である。
Hel ianthus 属植物由来のプロ トプラストを調製するには、まず、 Hel ianthus 属 植物の細胞組織を細切し、 プロ トプラスト単離用酵素溶液に浸漬することによつ てプロ トプラストを単離する。 使用する細胞組織としては、 収量性が高く細胞膜 が丈夫であるため、 胚軸を供試十ることが好ましいが、 葉や茎などの他の組織を 材料としてもよい。 細胞壁分解酵素は、 Lactuca 属植物の場合と同様に、 植物の 細胞壁の分解に使用できるものであれば特に制限されないが、 本発明では、 ドリ セラ一ゼとマセロザィム R-10 の組み合わせで用いるのが好ましい。 また、
Hel ianthus 属植物の胚軸から分離したプロ トプラストは比重が軽いため、細胞壁 分解酵素は KC1や NaClなどの無機塩を主体として浸透圧を調整した溶液、^えば 本発明では S液を用いるのが好適である。 酵素処理は、 25〜30°Cで 8〜20時間静 置処理すると好適である。 酵素処理により単離したプロ トプラス トを、 30〜100
/z mの孔径のナイロンメッシュで濾過する。 Hel ianthus 属植物由来プロ トプラス トの核遺伝子は不要であるため、 単離したプロ トプラストは放射線の照射により 核遺伝子を不活化させることが望ましい。照射する放射線としては、 X線、 γ線、 紫外線等が挙げられるが、 核遺伝子を不活化できれば、 特に限定されるものでは ない。 照射線量は核を不活化できる範囲で、 できる限り低照射量で行うことが好 ましい。例えば、本発明での軟 X線の照射の場合 0. lGy〜0. 6Gyの照射量が好まし い。
(2) プロ トプラストの融合処理
次に以上めように不活化処理した両種のプロ トプラス トの細胞融合を行う。 融 合方法と しては、 公知の電気融合法（Planta, 151, 26 - 32, 1981) .、 PEG 法 (Planta, 120， 215-227， 1974)、デキストラン法（Jap. J. Genet. , 50, 235， 1975)などが 挙げられ特に限定されないが、 本発明では PEG法を改変した方法を用いるのが好 ましい。 ，
(3) 融合雑種細胞の培養
融合処理した細胞は、 Lactuca 属植物由来のプロ'トプラス トの培養に好適な培 地で培養することが好ましい。 Lactuca 属植物由来のプロ トプラス卜の培養方法 としては様々な方法が知られており、 本発明にはいずれの方法も好適に用いるこ とができるが、 本発明に用い、るには、 公知の方法（Ni shio, T. , et al. , Japanese journal of breeding, 38, 165-171)に改良を加えた方法が好ましい。 この Ni shio らの方法は、 Lactuca 属植物のプロ トプラストの効率的な培養方法として優れて いる。 しかしながら Ni shioらの方法は本発明に直接適用することはできない。 な ； ぜなら、 Nishioらの報告において培養する、 融合処理を行わない Lactuca属植物 単独のプロ トプラストは細胞膜の損傷が少なく、 培養初期からゲランガムを含む 固体培地での培養が可能であるのに対し 、 本発明において培養する融合処理後 の細胞は、 処理のストレスにより細胞膜が壊れやすくなっているため、 Nishioら の方法では融合細胞をゲランガムと混合する際に、 融合細胞が破裂して効率的な 培養を行うことが困難であるからである。 そのため本発明においては、 融合処理 後の細胞をゲランガムを含まない液体培地で初期培養し、 細胞膜の再生を促した 後、 培養 3〜7 日後に培地にゲランガムを添加すると好適である。 Ni shio らの方 法にこのような改良を加えることによって、 融合細胞を効率的に培養することが 可能となる。 融合細胞は分裂を繰り返し、 マイクロカルスを形成するので浸透圧 を低減した新しい培地に継代すると好適である。
(4) マイクロカルスからの植物体の再生
マイクロカルスが数 mmにまで生長した段階で、再分化培地に移植し再分化させ る。 再分化培地は、 材料とする Lactuca 属植物やマイクロカルスの状態により反 応の差はある力 S、例えば 0. 3〜1. 0mg/lの BAを含.む MS培地（Murasige, T. & Skoog, Physiol. Plant. , 15, 473-497 ( 1962) ) などを用いると好適である。再生したシユー トは発根培她、例えば 1/2濃度の MS培地などに移植して発根させ、植物体を再生 させる。 再生した植物体は、 順化して温室内へ植え出す。 '
(5) 細胞質雑種植物の選抜
上記の手順で再生した植物体、 ならびに材料に使用した Hel ianthus.属植物お よび Lactuca 属植物の葉から DNAを抽出する。 例えば H. annuus L.のミ トコンド リアに特異的な遺伝子としては、 例えば 0rf522, orf708, orf873などが挙げられ るが、 これらの遺伝子をマーカーとして PCR法によって検出することによって、 H. annuus L.のミ トコンドリア遺伝子が導入された細胞質雑種植物を判別するこ とができる。 まず、 標的とする遺伝子を特異的に増幅するプライマーを設計して PCR を行う。 次に電気泳動を行って予想されるサイズのバンドを確認する。 この ようにして、 Lactuca 属植物の植物体に Hel ianthus 属植物のミ トコンドリア DNA が導入されている個体を選抜できる。また、 PCR-RFLP法 （Tsumura, Y.， Yoshimura, K. Toraaru, N. et al . , Theor. Appl. Genet. 91， 1222-1236, 1995)を用いて、 Hel ianthus属植物由来のミ トコンドリア DNAを、 Lactuca 属植物由来のミ トコン ,ドリア DNAと識別して検出してもよレ、。
また、 PCR 分析により選抜した細胞質雑種植物の葉緑体が、 Lactuca 属植物由 来であることを PCR- RFLP法を用いて確認することが望ましい。 PCR-RFLP法に利 用される葉緑体遺伝子としては rbcL， matKなどが挙げられるが、 Hel ianthus 属 植物と Lactuca 属植物の間で多型を検出できるものであれば特に限定されない。 標的の葉緑体遺伝子領域を特異的に増幅するプライマーを設計して PCRを行う。 PCRの増幅産物を制限酵素処理し、制限酵素サイ トの違いによる RFLPを検出して、 葉緑体の由来を確認する。核遺伝子との親和性の点から Lactuca 属植物由来の葉 緑体を有する個体を選抜することが望ましい。
以上の DNAでの確認は、 順化した植物体で行うことができるが、 カルスの段階 で行ってもよい。 また更にフローサイ トメ トリーや染色体の観察などにより、 倍 数性の検定も行っておくことが望ましい。 (6) 優良系統の選抜
得られた細胞質雑種植物の中から、 雄性不稔形質を有し、 その他の器官が形態 的な異常を伴わない系統を選抜する。 特に雄性不稔性のように生殖器官に障害が あると、 雌性稔性すなわち種子の結実性も低下することが多い傾向にあるので、 雌性稔性の高い系統を選抜することが重要である。 PCR-RFLP分析などにより、 細 胞質雑種植物のミ トコンドリアゲノムを分析し、 そのデータを選抜の判断材料と するとより効率的な選抜が可能である。例えば、 Hel ianthus 属植物のミ トコンド リァ遺伝子の一部が導入されたことにより、 雄性不稔形質が発現しているにもか かわらず、 ミ トコンドリア遺伝子の多くが Lactuca 属植物と同一である個体は、 Lactuca 属植物の核との親和性が高く、 雄性不稔性'以外の形質が正常である可能 性が高い。 . ' ' 更に、 選抜した雄性不稔個体に、 正常細胞質のレタスの花粉を交配し、 交雑後 代において雄性不稔性が細胞質遺伝していることを確認する。 また、 多数の交雑 後代を様々な環境下で栽培し、 雄性不稔性が安定しているか確認する。
優良系統を選抜できる可能性を高めるには、 選抜の候補となる細胞質雑種 Lactuca 属植物の数を多くする手法が有効である。 また、 比較的少数の候補とな る細胞質雑種 Lactuca属植物の中から細胞質雄性不稔性を有する優良系統植物を 一次選抜した後、 当該優良系統植物の細胞質をさらに改良してより望ましい優良 系統を得る手法も有効である。 どちらの手法を採用しても優良系統を選抜するこ とができるし、 2つの手法を組み合わせてもよい。 細胞質雄性不稔性の細胞質雑 種 Lactuca属植物の細胞質をさらに改良するための好ましい方法としては、 細胞 質雄性不稔性の細胞質雑種 Lactuca属植物を細胞質提供素材として用いて、 任意 のレタスとの非対称細胞融合を行うことなどが挙げられる。 このような非対称細 胞融合を行なうことにより、 例えばミ トコンドリアゲノムに組み換えやゲノムの 再編成が引き起こされ、 細胞質雄性不稔性を保持し、 レタスの核遺伝子との親和 性がより高い細胞質を有する系統を選抜できる可能性が高まる。
上記手順により作出され選抜された細胞質雑種 Lactuca 属植物は Hel ianthus 属植物の細胞質、 好ましくはミ トコンドリア、 に由来する遺伝子を細胞質内に有 する。 当該細胞質雑種 Lactuca 属植物は Lactuca 属植物の核ゲノムを有し、好ま しくは更に Lactuca 属植物の葉緑体ゲノムを有する。本発明はまた当該細胞質雑 種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体の一部に関す.る。 本発明に おいて 「細胞質雑種 Lactuca 属植物の後代」 とは、 細胞質雑種 Lactuca 属植物に 交配可能な' Lactuca 属植物の花粉を交配することによって得られる、 当該細胞質 を細胞質遺伝により引き継ぐ次世代及び次世代以降の細胞質雑種 Lactuc'a 属植 物を意味する。 本発明において 「細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植 物体の一部」 とは、 当該植物体の 1個以上の細胞または 1個以上の細胞からの細 胞質を含むものであり、具体的には花、葉、茎、根等の器官または組織、 或いは、 これらの器官または組織からの細胞（細胞から調製されたプロ トプラストを含む） もしくは細胞質、 或いは前記細胞もしくは細胞質の集合体を意味する。
(7) 細胞質雄性不稔植物の利用と F1 '種子の生産 ' 本発明の方法で作出した細胞質雄性不棒性の細胞質雑種 Lactuca 属植物に、優 良な Lactuca 属植物の系統を連続戻し交雑することにより、 後代として、 細胞質 雄性不稔性を有する優良系統を得ることができる。 こうして得られた細胞質雄性 不稔性を有する優良系統は F1 種子を得るための種子親として利用することがで さる。 .
また、 より好ましい方法として、 本発明により作出した細胞質雄性不稔性の細 胞質雑種 Lactuca 属植物を細胞質提供素材として用いて、任意のレタスとの非対 称細胞融合を行うことにより、 短期間のうちに細胞質雄性不稔性を有する種子親 を育成できる。 このような非対称細胞融合を行なうことにより、 例えばミ トコン ドリァゲノムに組み換えゃゲノムの再編成が引き起こされ、 細胞質雄性不稔性を 保持し、 レタスの核遺伝子との親和性がより高い細胞質を有する系統を選抜でき る。
さらに、本発明により作出した細胞質雄性不稔性の細胞質雑種 Lactuca 属植物 の細胞質は、 Lactuca 属のほかの種にも導入することが可能である。 Lactuca 属 植物には、 約 100 種の野生種が知られており、 レタス栽培品種 L. sat iva は、 Lactuca小節の 9つ野生 ¾であるし. serriola^ L. aculeate^ L. scarioloides、 L. azerbai janica^ L. georgica、し. dregeana、し. altaica^ L. sai igna、し. virosa、 と交雑可能である （特許文献 17)。 交雑が可能であれば、'従来育種技術の連続戻し交雑法により、 細胞質と核を入 れ換えて、 新たな細胞質と核の組み合わせを作り出すこと （核置換） が容易に行 える。 すなわち、 これら野生種または、 これらの種間雑種は、 本発明により作出 した細胞質'雄性不稔性の細胞質雑種 Lactuca 属植物との交雑により細胞質雄性 不稔性を発現する細胞質を容易に導入することができる。 また、 胚 '胚珠培養に より適用範囲を広げることも可能である。 さらに、 Lactuca 属においては、 野生 種の有用形質を導入する目的で、 細胞融合により野生種との体細胞雑種が多数育 成されている （例えば、 特許文献 17、 Plant cel l reports 9, ： 531-534 (1991)、 非特許文献 18)。 そのような野生種としては、 例えばし tatarica, L. virosa, L. indica, L. deb i l i sなどが挙げられ、 これらの細胞 ¾合技術を用いることにより、 本発明により作出した細胞質雄性不稔性の細胞質雑種 Lactuca 属植物の細胞質 を多くの Lactuca 虞野生種やそれらの種間雑種に導入することが可能である。 こ のとき、本発明により作出した細胞質雄性不稔性の細胞質雑種 Lactuca 属植物に 放射線等を照射して核を不活化させ、 細胞質提供細胞 して非対称細胞融合を行 うことにより、 細胞質の導入をより効率的に行うことができる。 従って、 これら 連続戻し交雑法や細胞融合などの従来技術を利用することによって、 本発明によ り作出し 細胞質雄性不稔性の'細胞質雑種 Lactuca 属植物の細胞質を、 多くの Lactuca 属植物に導入することが可能である。 野生種の有用遺伝子を導入したレ タスの種間雑種植物などにも細胞質雄性不稔性を導入することが可能となり有用 である。 '
以上のことから、 本発明によ り作出した細胞質雄性不稔性の細胞質雑種 Lactuca 属植物または該植物から上記の手順で育成または作出された後代を種子 親とし、 該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交配し、 交配後の種 子親から雑種第一代種子を採種することにより、 Lactuca 属植物の効率的な F1 種子の生産が可能となる。 交配方法は、 花粉親系統の花粉が、 種子親の雌蕊に受 粉されればよく特に限定されないが、 例えば風媒、 虫媒 （例えば特許文献 20) に よる受粉や、 人手によって花粉親系統の花粉を種子親の雌蕊に付着させる人工交 配などの通常の方法が適用できる。 採種を行う地域、 施設に適合した経済的な手 法を選択することが好ましい。 上記の手順でレタスを Fl品種化することにより、優良形質を付与したレタス品 種の迅速な育種が可能となり、 生産物の均一性や環境適応性などに優れた市場性 の高いレタス品種の作出が可能となる。
以下の実'施例によつて本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。 ' 実施例 1
( 1) プロ トプラス トの調製
(i) レタスプロ トプラス トの単離 ,
本実施例では、レタス品種'テルミ一' （サカタのタネ）を供試した例を示した。 滅菌した種子をショ糖 10g/l、 寒天 8g八を添加'しだ MS培地に置床し、 20°C、 16 時間照明下で 1か月間培養した。展開した本葉を約 lg採取し、約' 2mmの大きさに 細切した後に、 0. 4%メイセラーゼ， 0. 08%マセロザィム R-10, マンニトールを含 む CPW塩溶液 10mlに浸漬.し、 25°C、 16時間静置した。
プロ トプラストの懸濁液を 92 μ ηιのナイ口ンメッシュで濾過した。 プロ トプラ スト懸濁液を 500rpmで 3分間遠心分離した後、 上澄みを除去して 15mMのョード ァセトアミ ドを含む S液 2mlを加えて懸濁し、 25°Cで 5分間静置した。 ョードア セトアミ ド処理したプロ トプラストを 300rpmで 3分間遠心分離した後、上澄みを 除去して S液 10mlに懸濁し洗浄した。 S液による洗浄は、 3回操り返した。 300rpm で 3分間遠心分離して上澄みを除去し、 20%のショ糖を含んだ CPW塩溶液を加え て、 9. 5mlにして懸濁し、 その上に S液 0. 5mlを重ね 1000rpm、 5分間遠心分離 した。
精製されたプロ トプラストが、 上層の S液層中に浮上するのでパスツールピぺ ットで吸い取り遠心管に入れて、 2mlの S液を加えてプロ トプラストを懸濁した。 懸濁液を少量取り血球計算板を用いてプロ トプラストの細胞密度を求め、 S 液を 加えて 1 X 106個/ mlに調製した。
(i i) ヒマヮリのプロ トプラス トの単離
本実施例では、 切花ヒマヮリの栽培品種 'のぞみ， （サカタのタネ） （ヒマヮ リ特異的な orf522, orf873遺伝子を有する） と切花ヒマヮリ育種系統 ' IB5 ' (ヒ マヮリ特異的な orf 873遺伝子を有するが orf522は有しない） を供試した例を示 した。滅菌した種子をショ糖 10g八、寒天 8g八を添加した MS培地に置床し、 25°C 暗所において 7 日間培養した。 50讓前後に伸張した胚軸を長さ 1cm.に切断し、 さ らに胚軸の伸長方向に 2分割した。 切断した胚軸約 10本分を 0. 5%セルラーゼォ ノズカ R- 1G、0. 1%マセロザィム R-10を含む S液 10mlに浸漬し、 16時間静置した。 プロ トプラストの懸濁液を 92 μ πιのナイ口ンメッシュで濾過した。遠心管に 17% のショ糖を含んだ CPW塩溶液 2mlを入れ、その上にプロ トプラスト懸濁液を重ね、 1200rpmで 5分間遠心分離した。 精製されたプロ トプラストがバンド状に集まる ので、 プロ トプラストを吸わないように上層の液を除去し、 17%のショ糖を含んだ CPW塩溶液を加えて、 9. 5mlにしてプロ トプラストを懸濁した。その上に S液 0. 5ml を重ね、 1200rpmで 5分間遠心分離した。 、
プロ トプラストが浮上し、 上層の S液層中へ移動するので、 パスツールピぺッ トで吸い取り、 プラスチックシャーレに移して軟 X線を 0. 5Gy照射した。 軟 X線 を照射したプロ トプラスト懸濁液を遠心管に移し、 17%のショ糖を含んだ CPW塩溶 液を加えて、 9. 5mlにした。 その上に S液 0. 5mlを重ねて 1200rpmで 5分間遠心 分離した。 S液層中に移ったプロ トプラストを遠心管に移し、 S液を加えて 10ml にして懸濁した。 懸濁液を少量取り血球計算板を用いてプロ トプラス卜の細胞密 度を求め、 S液を加えて 3 X 106 ½/mlに調製した。
. (2) プロ トプラストの融合処理'
ョ一ドアセトアミ ド処理したレタスプロ トプラス ト懸濁液と軟 X線照射したヒ マヮリプロ トプラスト懸濁液を等量混合し、 9cm シャーレの底面中央に混合液を 2ml滴下した。 30分間静置後、 PEG溶液 (PEG3350 300g/l, CaCl2 · 2H20 1， 500mg/l, KH2P04 lOOmg/1 , pH 5. 5) 3mlをプロ トプラスト混合液の周辺に滴下した。
1分後 CPW塩溶液 3. 5ml をプロ トプラスト混合液の周辺に滴下した。 さらに 2 分後 CPW塩溶液 3. 5mlをプロ トプラス ト混合液の周辺に滴下した。 5分後シヤー レの縁から、 滴下した液を静かに吸い上げて除去し、 CPW塩溶液 20mlをシャーレ の縁から加えた。 この CPW塩溶液での洗浄の操作を 5分間隔で 3回繰り返した。 (3) 融合雑種細胞の培養 . 洗浄液を除去後、 コハク酸ニナトリウム六水和物 2. 7g ， カザミノ酸 l. Og八，
NAA 1. Orag/1, BA 0. 3mg/l, 0. 3M ショ糖を含み、 NH4N03を 200mg/l に低減させた 1/2濃度の MS培地（以下、 レタスプロ トプラスト培養用培地という） 10ml (pH5. 8) を添加し、 25°C暗所において培養した。
培養開始から 3 日後、 4倍濃度のレタスプロ トプラスト培養用培地 （0. 3Mショ 糖濃度） 5ml と 0. 6%ゲランガムを含む 0. 3Mショ糖溶液 5ml (pH5. 8)を混合するこ とにより、 半固体化状態のゲル培地中で培養を継続した。 ' 培養開始 10 日後に、ショ糖濃度を 0. 15Mに改変したレタスプロ トプラスト培養 用培地 10ml中に、 融合雑種細胞の含まれた培地 10mlをゲルとともに移した。 培 養開始 20 日後には、 マイクロカルスが肉眼で確認できるようになるので、 1. 0% ショ糖、 0. 3%ゲランガムを含んだレタスプロ トプラス ト培養用培地 （固体培 地， pH5. 8) に移植した。 .
(4) マイクロカルスからの植物体の再生 ' 1 培養開始 30 日後、 マイクロカルスが 2mm 程度の大きさになったときに、
NAAO. lmg/1, BA 0. 3mg/l, 1. 0%ショ糖， 0. 8%寒天を含む MS培地 (pH5. 8)に移植し た。
'培養開始 40〜60 日後、 カルスから再分化したシュートを、 1. 0%ショ糖， 0. 8% 寒天を含む 1/2MS培地（pH5. 8)へ移植することにより発根し、細胞質雑種植物を再 生した。 · '
, 細胞質雑種植物は、 バーミキユライ トに移植して順化を行い、 温室内で栽培を 行った。 ，
(5) ヒマヮリに特異的なミ トコンドリア遺伝子を有する細胞質雑種植物の選抜 細胞質雑種植物の葉よ り 公知の方法（Jhingan, A. K. (1992)， Methods in molecular and cel lularbiology 3 : 15- 22)に従って全 DNAを抽出した。
PCR法によりヒマヮリ特異的な DNAを検出するため、公知の塩基配列情報（Gene
Bank 登録番号 Z23237, X62592) より orf522, orf873遺伝子に特異的なプライマ 一を設計した（表 3 )。 抽出した全ゲノム DNAを鍀型とし、 プライマー orf522-Fと orf522-R, プライマー orf873_Fと orf873_Rの各組み合わせを用いて PCRを行つ た。 PCRは、 熱変性 94°C 1分、 ァニーリング 60°C 2分、 伸長反応 72°C 2分を 35 サイクル繰り返した。 PCR 産物は、 1. 8%ァガロースゲルで電気泳動し、 ェチジゥ ムブロマイ ド溶液に浸漬後、 UV照射下で写真撮影を行い予想されるサイズ（209bp, 798bp)のバンドの'有無を確認した。
表 3 本発明で使用したプライマ一とその塩基配列
Figure imgf000027_0001
目的 DNA断片の特異的な増幅を確認するため、 細胞質雄性不稔ヒマヮリ 2系統 と雄性可稔ヒマヮリ 1系統 （育種系統. ' 0S06，）、 表 4に示したレタスの栽培品種
13品種から DNAを抽出し、 ヒマヮリ ミ トコンドリァ遺伝子 orf522及び orf873に 特異的なプライマーを用いて PCRを行った結果を図 1に示した。 図 1は、 供試材 料に用いた細胞質雄性不稔ヒマヮリ 2系統 （レーン 1， 2 ) と雄性可稔ヒマヮリ
1系統 （レーン 3 )、 レタスの栽培品種 13品種 （レーン 4〜16) から DNAを抽出 し、 ヒマヮリ ミ トコンドリァ遺伝子 orf522 に特異的なプライマー（上図）及び orf873に特異的なプライマー（下図）を用いて PCRを行つた結果を示す電気泳動写 真である （図 1中の符号の説明 ： M :分子量マーカー、 1 ： のぞみ、 2 ： IB5、
3 ： 0S06、 4 ：テルミ一、 5 ： ステディー、 6 ： ロジック、 7 ：マイヤー、 8 ：
Vレタス、 9 ： サンタナス、 1 0 : シリ ウス、 1 1 : ァスレ、 1 2 : ブノレータス 7号、 1 3 :スパ ク、. 1 4 :サントス 2号、 1 5 :デジエロ、 1 6 ：サゥザ一）。 図 1から明らかなように、ヒマヮリ栽培品種'のぞみ'の場合には、 orf522 (209bp) と orf 873 (798bp) のバン ドが検出され、 ヒ マ ヮ リ 育種系統' IB5， では orf873 (798'bp)のバンドが検出された。 一方、 供試したレタス 13品種全てにおい て、 いずれのバンドも検出されなかった。 この結果から、 orf522に特異的なプラ イマ一と orf873に特異的なプライマーを用いて、レタス DNAを铸型に PCRを行つ た場合、 特異的な DNAが増幅されないことを確認した。 この結果から、.非対称細 胞融合により得られた植物体の DNAを抽出し、 PCRを行うことにより、 ヒマヮリ に特異的なミ トコンドリア遺伝子'を有している細胞質雑種植物を選抜することが 可能となった。 - 図 2には、本実施例で得られた細胞質雑種植物を検定した結果の一例を示した。 図 2はヒマヮリ ミ トコンドリァ遺伝子 orf 522及び orf 873に特異的なプライマー を用いて、 細胞質雑種植物の検定を行った結果の一例を示す電気泳動写真である (図 2中の符号の説明 ： M：分子量マ一カー、 1 ： のぞみ、 2〜 7 :細胞質提供 材料として 'のぞみ' を供試して作出した細胞質雑種植物、 8 ： IB5、 9〜 1 4 ： 細胞質提供材料として ' IB5 ' を供試して作出した細胞.質雑種植物）。 ヒマヮリと して 'のぞみ' と ' IB5 ' の 2種類の細胞質を供試したが、 どちらのヒマヮリ品種 からも細胞質雑種植物を作出することが可能であった。
図 2のレーン 3、 5において、 orf522が導入されているにもかかわらず、 orf873 のバンドが欠失している個体が検出され、 これらはミ トコンドリアの組換えが生 じた結果であると考えられた。
表 4
プライマーの特異性検定に使用した可稔レタス品種
Figure imgf000029_0001
次に、 PCR-RFLP 法により葉緑体の由 を特定するため、 公知の塩基配列情報
(Gene Bank 登録番号 L13929) よりヒマヮリ葉緑体の rbcL遺伝子に特異的なプ ライマ一を設計した（表 3 )。抽出した全ゲノム DNAを铸型とし、プライマー rbcL - F: プライマー rbcL-Rの組み合わせを用いて PCR を行った。 PCRは、 熱変性 94°C 1 分、 アニーリング 60°C 2分、 伸長反応 72°C 2分を 35サイクル繰り返した。 PCR 産物を制限酵素 Taqlで消化し、 1. 8%ァガロースゲルで電気泳動後、ェチジゥムブ 口マイ ド溶液に浸漬し、 UV照射下で写真撮影を行って、 バンドの切断状況を確認 した。 rbcL遺伝子は、 ヒマヮリとレタスで相同性が高く、 同じサイズのバンドが 増幅されるため、 PCR産物を制限酵素 Taqlで消化し、 制限酵素サイ トの違いによ る RFLPを検出して由来を特定することが可能となった。 図 3は、供試材料に用い た細胞質雄性不稔ヒマヮリ 2系統（レーン 1， 2 ) と雄性可稔ヒマヮリ 1系統（レ ーン 3 )、 レタスの栽培品種 13品種 （レーン 4〜16) から DNAを抽出し、 葉緑体 遺伝子 rbcLに特異的なプライマーを用いて PCRを行い、 その増幅産物を Taqlで 切断したときの PCR-RFLPパターンを示す電気泳動写真である（図 3中の符号の説 明： M：分子量マーカー、 1 ：のぞみ、 2 ： IB5、 3 ： 0S06、 4 ：テルミ一、 5 ： ステディー、 6 ： ロジック、 7 ： マイヤー、 8 ： Vレタス、 9 ： サンタナス、 1
0 : シリ ウス、 1 1 : ァスレ、 1 2 : プル一タス 7号、 1 3 : スパーク、 1 4 ： サントス 2号、 1 5 :デジエロ、 1 6 ：サゥザ一）。 図 3に示したように、 レタス では Taqlの制限酵素サイ トが存在しないため、 1096bpのサイズのバンドが 1本 検出されるが、 ヒマヮリでは Taql の制限酵素サイ トが存在するため、 311bp と 785bpの 2本のバンドが検出され、 容易に由来を識別することが可能であった。 この結果から、 非対称細胞融合により得られた植物体の DNAを抽出し、 PCR-RFLP を行うことにより、 レタス葉緑体を有する細胞質雑種植物を選抜する.ことが可能 となった。
(6) 細胞質雄性不稔植物の選抜
細胞質雑種植物は、 レタス由来の核遺伝子と導入されたヒアヮリ由来のミ トコ ンドリア遺伝子の不親和性によって、 形態異常を示す個体が多く現れるため、 そ のような個体は排除した。 ミ ドコンドリアは、 細^融合によって高頻度で組み換 えゃゲノムの再編成が起こるため、 再生する個体毎に形態の変化が観察され'た。 特に花器においては、 不親和性により形態異常を引き起こしやすいため、 多数の 細胞質雑種植物を作出し、 雄性不稔形質を有し、 且つその他の形態が正常な優良 系統を選抜した。 一般的に、 レタスは、 雄蕊先熟で雌蕊が葯筒の中を伸長する過 程で受粉するため、 開花時には図 4に示すように雌蕊に花粉が多量に付着する。 このためレタスでは自殖率が非常に高い。 本発明において選抜した最も有望と思 われる細胞質雄性不稔系統 （以下 ' 1216 - 2 ' と記す （ヒマヮリ ' IB5' 由来）） は、 図 5に示すように雌蕊に花粉粒の付着が全く見られず、 葯筒の中にも花粉粒の存 在は全く認められなかった。 また、 花器やその他器官の形態に明確な差は認めら れなかった。 また、 染色体数を調査した結果、 2n=18 であり通常のレタスと同じ であった （図 6)。
選抜した細胞質雄性不稔系統 ' 1216-2 ' に、 正常細胞質のレタスの花粉を交配 することによって、 図 7に示すように正常に結実し、 種子が得られたことから、 雌性稔性が維持されていることを確認した。
さらに、 ' 1216-2 ' に雄性可稔のレタスの花粉を交配して得た後代の植物がすべ て雄性不稔性を示したことから、 雄性不稔性が細胞質に起因し、 細胞質遺伝して いることを確認した。
' 1216-2 ' に 'テルミ一' を 2回戻し交雑した BC3世代 （1216-2- Tl-l〜14) 14 個体を供試して、ヒマヮリ ミ トコンドリア遺伝子 orf873を特異的に増幅するブラ イマ一を用いて PCRを行った場合の結果を図 8に示した （図 8中の符号の説明 ： M：分子量マーカー、 S ： IB5、 L ： テルミ一、 1〜 1 4 ：細胞質雄性不稔レタス BC3 14個体 （1216-2-T1- 1〜14) )。 いずれの個体も orf873 を有しており、 この 結果からレタスにおいてヒマヮリのミ トコンドリア遺伝子が安定的に遺伝するこ とが明らかとなった。 ' また、 公知のヒマヮリ、 レタスのミ トコンドリア遺伝子の塩基配列情報 （Gene Bank 登録番号 X82387, X62341, X98362, AF319170, X73425, X87209). に基づい て、 表 3に示すプライマーを設計し、 その他のミ トコンドリア遺伝子についても PCR及び PCR-RFLP法を用いて分析を行った。 ミ トコンドリァ遺伝子 rps3、 trnN と trnYの遺伝子間領域 （以下、 trnN- trnYと記十）、' trnSと trnPの遺伝子間領域 (以下、 trnS- trnPと記す） は、 PCR増幅産物のサイズの違いから'、 ミ トコン'ドリ ァ遺伝子 atP6、 cox II、 cobは PCR-RFLP法により、 すなわち PCR増幅産物を制限 酵素で消化し、 切断パターンの違いで遺伝子型を識別し分析を行った。 さらに葉 緑体遺伝子 rbcLについても PCR-RFLP法での分析を行った。 PCR及び PCR- RFLP法 による電気泳動写真を図 9に示した（図 9中の符号の説明： M :分子量マーカー、 S : IB5、 L：テルミ一、：！〜 1 4：細胞質雄性不稔レタス PC3 14個体（1216-2- T1-1 〜14) )。 また、 結果のまとめを表 5に示した。
表 5
PCR法および PCR-RFLP法による細胞質雄性不稔レタス ' 1216-2' の後代 BC3の細胞質分析
Figure imgf000032_0001
Sun : ヒマヮリ型 Let : レタス型
この結果から、 atp6のミ トコンドリア遺伝子がヒマヮリ型を示したが、 その他 の分析したミ トコンドリァ遺伝子がいずれもレタス型を示すことが明らかとなつ た。 図 10は、 細胞質雄性不稔レタスの BC3世代 14個体の葉から DNAを抽出し、 葉緑体遺伝子 rbcLに特異的なプライマーを用いて PCRを行い、その PCR増幅産物 をさらに制限酵素で消化した PCR-RFLP の結果を示す電気泳動写真である （図 10 中の符号の説明： M：分子量マーカー、 S ： IB5、 L ： テルミ一、 1〜： I 4 ：細胞 質雄性不稔レタス BC3 14個体 （1216-2- Tl-l〜14) )。 図 10 に示した PCR-RFLP の結果から、 葉緑体遺伝子 rbcLもすベてレタス型を示した。 すなわち、 本発明に おいて作出した細胞質雄性不稔レタスにヒマヮリのミ トコンドリア遺伝子の一部 のみが組み込まれ、 葉緑体はレタスに由来することが明らかとなった。 また、 供 試した後代 14個体において、いずれも同じバンドパターンを示したことから、 ミ トコンドリアゲノムが安定していると考えられた。 ただし、 図 9、 図 10及び表 5 の結果は細胞質雄性不稔性を発現する個体の分析結果の一例を示したものであり、 細胞質雄性不稔レタスが必ずしもこのようなバンドパターンのみを示すとは限ら ない。 '
以上の結果より、 非対称細胞融合によって、 ヒマヮリの一部のミ トコンドリア
DNA を導入することにより、 細胞質雄性不稔レタスを作出できることが明らかと なった。 これまでの細胞質の分析の結果から、 雄性不稔性の原因となるミ トコン ドリァ遺伝子の組み込みや、 雄性不稔性を誘発するミ トコンドリァ遺伝子め組換 え、 ミ トコンドリアゲノムの再編成などが引き起こされることによって、 雄性不 稔性が引き起こされたと考えられた。 ，
すなわち、 本発明により育成された細胞質雑種レタスは、 ミ トコンドリアゲノ ムの改変による細胞質雄性不稔形質を有し、 尚且つレタスの核ゲノムとの親和性 の高いミ トコンドリアゲノムを有するという、 ミ コンドリアゲノムが高度に組 み換えられた細胞質雄性不稔レタスであることが明らかとなった。' ' (7) 細胞質雄性不稔植物の利用と F1種子の生産
作出した細胞質雄性不稔レタス、 例えば ' 1216-2 ' に 'テルミ一， を交配して 得た後代の ' 1216- 2-ΤΓ に、花粉親として市販のレタス固定種 5品種 'テルミ一' (サカタのタネ）、 'ステディー' （ツルタ種苗株式会社）、 'ロジック' （横浜植木 株式会社）、 'マイヤー' （住化農業資材株式会社）、 ' Vレタス' （カネコ種苗株式 会社） を交配し、 F1種子を採種した。
F1種子をプラグトレーに播種して育苗した後、 温室内で 10号鉢に定植し、 通 常の栽培を行い特性の調査を行った。， 1系統，品種あたり 3株を供試した。 いず れの系統 ·品種も正常に生育した。 各系統 ·品種の雄性不稔の調査は、 1 株当た り 10花を供試し、 実体顕微鏡を用いて詳細な観察を行った。 また、 花弁の色、 花 器の形態についても開花中に順次観察し、 開花後の自殖種子の有無も調査した。 その調査結果を表 6に示した。 ' 1216-2-T1 ' と上記固定種 5品種との F1系統は、 全個体において 100%の雄性不稔性を示した。また、図 11〜14に示したように、 'テ ルミ一' 以外のレタス栽培品種を交配した場合にも、 自殖による雌蕊への花粉粒 の付着は全く観察されず、葯の中にも花粉粒の存在は認められなかった。さらに、 図 15に示したようにレタス野生種し serriolaの花粉を交配した交雑後代におい ても自殖による雌蕊への花粉粒の付着は全く観察されず、 同様に葯の中にも花粉 粒の存在は認められなかった。 この結果から、 '核遺伝子が 'テルミ一' 以外の遺伝子型に変化しても花粉が生 成されず、 雄性不稔性が維持されていたことから、 細胞質に起因して雄性不稔性 が発現することが裏付けられた。よって本発明により作出した細胞質雑種植物は、 安定的な糸》胞質雄性不稔性を示すことが明らかとなった。
また、 雌性稔性を調査するため、 花粉を生成しない細胞質雄性不稔系統につい ては、 F1 を採種したときと同じ品種の花粉を交配した。 1株あたり 10花を調査 し、 1花あたり 10粒以上の種子を形成する能力を有する系統 · 品種を.雌性稔性' 有' とした。 表 6に示したように、 細胞質雄性不稔系統は、 遺伝子型の違いに関 わらず、 いずれも雌性稔性を有していたことから、 本発明により作出した細胞質 雄性不稔レタスは、 効率的な F1種子の生産に利用可能であることを確認した。
表 6 ' レタス供試品種と細胞質雄性不稔レタス BC3 Ί 216-2-ΤΓ との Π植物の花器の特性調査
Figure imgf000034_0001
' 1216-2 ' に 'テルミ一' を交配して得た後代の ' 1216-2- T1 ' の種子は 2005 年 9月 29 日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城 県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6) に国際寄託されている （寄託者が付した 識別のための表示 SSC- LET- 05- 001、 受託番号 FERM BP- 10421)。 実施例 2
' 1216-2-T1 ' を細胞質提供素材として用いて、 'V レタス' （カネコ種苗株式 会社） との非対称細胞融合を行い、 細胞質雄性不稔性の細胞質雑種 ' 50125- 3 ' を 作出した。 '50125-3' の花は、 雌蕊に花粉粒の付着が全く見られず、 葯の中にも 花粉粒の存在は全く認められなかった。 また、 'V レタス， と比較して、 花器など の形態に明確な差は認められなかった。 選抜した細胞質雄性不稔系統 '50125-3' に、 正常細胞質のレタスの花粉を交配することによって、 正常に結実し、 種子が 得られたことから、雌性稔性が維持されていることを確認した。さらに、' 501 - 3' に雄性可稔のレ.タスの花粉を交配して得た後代の植物がすべて雄性不稔性を示し たことから、雄性不稔性が細胞質に起因し、細胞質遺伝していることを確認した。
'50125-3， に 'V レタス' を交配して得た後代の '50125- 3 VI- 1〜10' 10個体 における、 PCR及び PCR- RFLP法に'よる、 ミ トコンドリア遺伝子の分析結果を表 7 に示した。 細胞質提供素材と して用いた '1216 - 2-Τ に比較して、 例えば '50125 - 3-V1- 1〜10' は、 ヒマヮリ型とレタス型の両方の, atp6遺伝子を保持して いる点に違いがみられた。
ただし、 表 7の結果は細胞質雄性不稔性を発現する個体の分析結果の一例を示 したものであり、 細胞質雄性不稔レタスが必ずしもこのようなバンドパターンの みを示すとは限らない。
'50125-3， に 'V レタス' を交配して得た後代の '50125- 3-V1' の種子は 2006 年 7月 31 日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城 県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第, 6) に国際寄託されている （寄託者が付した 識別のための.表示 SSC- LET- 06- 001、 受託番号 FERM BP-10647)。
表 7
PCR法及び PCR-RFLP による細胞質 レ ス '50125- 3-V1 'の後代 BC2の 質分析
Figure imgf000036_0001
産業上の利用可能性 ' 本発明によりヒマヮリ由来の細胞質を有する細胞質雑種レタスが提供される。 本発明による細胞質雑種レタスが細胞質雄性不稔レタスである場合、 本レタス を種子親として用いることにより、 核遺伝子型雄性不稔植物を商業的な F 1 種子 の生産に用いた場合と異なり、 効率的で純度の高い F1種子の採種が可能となる。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1. Helianthus 属植物由来のプロ トプラストと Lactuca 属植物由来のプロ トプラスト 'を細胞融合し、 次いで融合細胞を培養し、 培養された融合細胞から植 物体を再生することを特徴とする細胞質雑種 Lactuca 属植物の作出方法。 '
2. Helianthus 属植物由来のプロ トプラストが H. annuus しに由来するプ 口 トプラストである力、、 または H. petiolaris、 H. argophyllus, H. debilis、 H. decapetalus 、 H. giganteus 、 H. rigidus、 H. salicifolius、 H. anoma丄 us、 H. bolanderi、 H. exilis、 H. maxirailiani^ H. neglectus、 H. praecox もしく は H. tuberosus 由来の細胞質を有する H. annuus L.の細胞質置換系統に由来す るプロ トプラストである請求項 1記載の方法。 ·
3. Lactuca 属植物由来のブロ 卜プラス卜力 Lactuca sativa Lユ. serriola, L. aculeate^ し scarioloides^ L. azerbai janica^ L. georgicax し. dregeana、 L. altaicaN L. saligna^ L. virosa、し tatarica^ L. indipa、もしくは L debilis、 またはそれらの種間交雑植物に由来するプロ トプラス トである請求項 1または 2 記載の方法。 .
4. Helianthus 属植物が細胞質雄性不稔性を有する、請求項 1〜 3のいずれ か 1項記載の方法。
5. Helianthus 属植物がミ トコンドリアに雄性不稔遺伝子を有する、請求項 4記載の方法。 '
6. 細胞質雑種 Lactuca 属植物が細胞質雄性不稔性を有する、 請求項 1〜 5 のいずれか 1項記載の方法。
7. 請求項 1〜6のいずれか 1項記載の方法により作出された細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体の一部。
8. 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部が、 該植物体 の細胞または細胞質を含むものである、請求項 7記載の細胞質雑種 Lactuca 属植 物またはその後代の植物体の一部。
9. Helianthus 属植物のミ トコンドリアに由来する遺伝子を細胞質内に有す る細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体の一部。
1 0. Heliarithus 属植物力 S H. annuus L.である力 、 また H. petiolaris, H. argophyllus H. debilis、 H. decapetalus ,、 H. giganteus 、 H. rigidus、 H. salicifolius、 H. anomalus、 H. bolanderi、 H. exilis、 H. maximiliani、 H. neglectus、H. praecox、もしくは H. tuberosus由来の細胞質を有する H. annuus L.の細胞質置換系統である請求項 9記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物、そめ後代、 またはそれらの植物体の一部。 .
1 1. 細胞質雑種 Lactuca 属植物力 S Lactuca sativa L.、 L. serriola、 L. aculeate^ L. scarioloides、 L. azerbai janica^ L. georgica、 L. dregeana^ L. altaica、 L. saligna、 L. virosa、 L. tataricaN L. indica、 しく {まし. debilis、 またはそれらの種間交雑植物に由来するものである'請求項 9または 1 0記載の細 胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体の一部。
1 2. Helianthus 属植物のミ トコンドリアに由来する遺伝子が雄性不稔遺伝 子である W求項 9〜1 1のいずれか 1項記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物、その 後代、 またはそれらの植物体の一部。
1 3. 細胞質雄性不稔性を有する、 請求項 9〜1 2のいずれか 1項記載の細 胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物体の一部。
1 4. 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部が、 該植物 体の細胞または細胞質を含むものである、 請求項 9〜1 3のいずれか 1項記載の 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部。
1 5. 受託番号 FERM BP- 10421である細胞質雑種 Lactuca 属植物の種子、 該 種子から生育させた細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物 体の一部。
1 6. 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部が、 該植物 体の細胞または細胞質を含むものである、 請求項 1 5項記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部。
1 7. 受託番号 FERMBP-10647である細胞質雑種 Lactuca 属植物の種子、 該 種子から生育させた細胞質雑種 Lactuca 属植物、 その後代、 またはそれらの植物 体の一部。
1 8. 細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部が、 該植物 体の細胞または細胞質を含むものである、 請求項 1 7項記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代の植物体の一部。，
1 9 . 請求項 6記載の方法により作出された細胞質雑種 Lactuca 属植物また はその後代を種子親とし、該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交 配し、 交配後の種子親から雑種第一代種子を採種することを含む、 雑種第一代種 子の作出方法。 ·
2 0 . 請求項 1 3記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代を種子親 とし、 該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交配し、 交配後の種子 親から雑種第一代種子を採種することを含む、'雑種第一代種子の作出方法。
2 1 . 請求項 1 5記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代を種子親 とし、 該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交配し、 交配後の種子 親から雑種第一代種子を採種することを む、 雑種第一代種子の作出方法。
2 2 . 請求項 1 7記載の細胞質雑種 Lactuca 属植物またはその後代を種子親 とし、 該植物と交配可能な Lactuca 属植物を花粉親として交配し、 交配後の種子 親から雑種第一代種子を採種することを含む、 雑種第一代種子の作出方法。
2 3 . 請求項 1 9〜2 2のいずれか 1項記載の方法により作出された雑種第 一代種子または該種子から生育 せた雑種第一代植物。
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