JP2687396B2 - 細胞質雑種植物の製造方法 - Google Patents

細胞質雑種植物の製造方法

Info

Publication number
JP2687396B2
JP2687396B2 JP63043561A JP4356188A JP2687396B2 JP 2687396 B2 JP2687396 B2 JP 2687396B2 JP 63043561 A JP63043561 A JP 63043561A JP 4356188 A JP4356188 A JP 4356188A JP 2687396 B2 JP2687396 B2 JP 2687396B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protoplasts
rapeseed
hybrid plant
radish
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP63043561A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH01218530A (ja
Inventor
隆子 酒井
順 今村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsubishi Corp
Mitsubishi Chemical Corp
Original Assignee
Mitsubishi Corp
Mitsubishi Chemical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Corp, Mitsubishi Chemical Corp filed Critical Mitsubishi Corp
Priority to JP63043561A priority Critical patent/JP2687396B2/ja
Publication of JPH01218530A publication Critical patent/JPH01218530A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2687396B2 publication Critical patent/JP2687396B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、細胞融合方法により、直接ダイコン由来の
プロトプラストからその細胞質遺伝子をナタネ等のブラ
シカ属植物由来のプロトプラストに導入し、細胞質雑種
植物を製造する方法に関するものである。
(従来の技術および発明が解決しようとする問題点) 細胞質に含まれる核外遺伝子は、農業上有効な形質を
もつことが知られており、ダイコンの細胞質雄性不稔
(Cytoplasmic Male Sterility:以下「CMS」と略す)も
その有用形質の1つである。
従来、ナタネにダイコンのもつCMS細胞質を導入する
方法が知られているが、それは戻し交配と呼ばれる方法
によるものであった。即ちダイコンを母本としてナタネ
の花粉を交配し、得られた後代を母本としてナタネ花粉
を交配する。この交配はダイコン核が消失し、ナタネ核
に置換されるまで行なわれ、最終的にダイコン細胞質と
ナタネ核をあわせもつ植物を得る方法であるが、目的と
する植物体を得るまでに長年月を必要とした。
近年、戻し交配法により得られたCMSを有するナタネ
のプロトプラストにX線を照射してその核遺伝子を消失
乃至は破壊して、通常のナタネプロトプラストと融合し
て細胞質雑種を得ることが提案されているが、目的とす
る細胞質雑種植物を得るために依然として従来の戻し交
配を行っている〔プラントセルリポーツ(Plant Cell R
eports),,98−101,1987〕。また、戻し交配法によ
り得られたCMSを有するナタネのプロトプラストにγ線
を照射し、ヨード酢酸処理された除草剤耐性(ctr)を
有するナタネのプロトプラストを融合させる方法も提案
されている〔セオレティカルアンドアプライドジェネテ
ィクス(Theor.Appl.Genet),73,809−814,1987〕。
しかしながら、未だ直接ダイコン由来のプロトプラス
トからその細胞質遺伝子をナタネ等のブラシカ属植物に
導入して、細胞質雑種植物を製造した例は本発明者らの
知る限りでは報告されていない。
(問題点を解決するための手段) 本発明者らの検討によれば、ダイコン由来のプロトプ
ラストをX線照射し、これをヨード化合物処理したブラ
シカ属植物由来のプロトプラストと融合させ、それらを
培養してコロニーを形成させ、更に不定芽を形成させる
ことにより、容易に目的とする細胞質雑種植物を得るこ
とが判った。
一方のプロトプラストにX線照射し、他方のプロトプ
ラストをヨード化合物処理し、それらを融合して非対称
体細胞雑種植物を製造する方法がブラシカ属において報
告されている〔第10回「植物組織培養シンポジウム」講
演要旨集、第166頁(1987)〕が、ダイコンとブラシカ
属植物との雑種植物については記載されていない。当該
技術分野においては、植物種が異なれば同様の処理条件
を直ちには適用し得ないものであるが、本発明者らが各
種条件について種々検討した結果、今般初めて直接ダイ
コン由来のプロトプラストから、その細胞質雑種植物を
得ることに成功したものである。
即ち本発明の要旨は、X線照射したダイコン由来のプ
ロトプラストとヨード化合物処理したブラシカ属植物由
来のプロトプラストとを融合させ、次いで、得られた融
合細胞を培養してコロニーを形成させ、該コロニーから
植物体を再生させることを特徴とする細胞質雑種植物の
製造方法に存する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用するダイコンとしてはCMS系統などが挙
げられ、特にUK−1、コセナという2系統が好適であ
る。
またブラシカ属植物としては春播きナタネ、秋播きナ
タネキャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、ハボタン
等の各栽培品種が挙げられる。
プロトプラストは常法に従い、植物体の1部を細分
し、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含
む酵素液中に25〜30℃で5〜20時間処理したのち得られ
る。
得られたプロトプラストはポリエチレングリコール
(PEG)を含む溶液中で融合するが、融合に先立ち、ダ
イコンプロトプラストにX線を30〜300kレントゲン照射
し、核遺伝子を不活化する。またブラシカ属植物のプロ
トプラストは、ヨードアセトアミド等のヨード化合物2
〜40mMで4〜35℃で5〜30分間の条件で処理し、プロト
プラストが単独で分裂できないようにしておく。
プロトプラストを融合させる溶液は6.7〜40%のPEGを
含むW5〔プラントセルリポーツ(Plant Cell Repotr
s),,196−198,1984〕を用いた〔プラントサイエン
ス(Plant Science)、43,155−162,1986。〕この溶液
中に両方のプロトプラストを1:3ないし3:1の割合で合計
1〜4×106個/mlになるように混合し、室温で融合させ
る。この時使用するPEGはベーリンガーマンハイム社の
分子量1500のPEGが適している。
上述のように融合処理した細胞は、PEGを除去したの
ち、同じシォーレに培養液たとえばKM液体培地〔プラン
タ(Planta),126,105−110,1975〕に2,4−ジクロロフ
ェノキシ酢酸(2,4−D)0.2〜3.0mg/、ナフタレン酢
酸(NAA)0.02〜0.5mg/、ベンジルアミノプリン(BA
P)0.1〜2.0mg/、0.4Mグルコースを含む培地を加えて
培養する。1週間から10日後に、この培養液に0.1Mサツ
カロース、2,4−D0.2〜3.0mg/、NAA0.02〜0.5mg/、
BAP0.1〜2.0mg/を含むKM培地を等量加え、更に培養を
続けると、3週間位で0.5〜1mm程度の直径のコロニーを
形成する。本発明においては、このコロニーを更に増殖
培地、たとえば0.2Mマンニトール、0.1Mサッカロース、
2,4−D0.2〜3.0mg/、BAP0.02〜0.5mg/を含むK3アガ
ロース培地〔ツァイトシュリフトフュアプフランツェン
フィジオロジー(Z.Pflanzenp hysiol.),78,453−45
5,1976〕または0.2Mマンニトール、0.1Mサッカロース、
2,4−D0.2〜3.0mg/、BAP0.02〜0.5mg/を含むMS修正
培地などに移して増殖させる。ここで増殖したコロニー
は次に0.1Mマンニトール、0.06Mサッカロース、インド
ール酢酸(IAA)0.02〜0.5mg/、ゼアチン0.5〜5.0ml/
、硫酸アデニン20〜100mg/、カゼイン加水分解物50
〜200mg/を含むMS修正培地で再分化させる。再分化培
地に置床したカルスは、早いもので14日めには不定芽を
形成する。ここではカルスを0.03Mサッカロース、IAA0.
2〜3.0mg/、ゼアチン0.5〜5.0mg/を含むK3アガロー
ス培地に20日〜30日後に植え継ぐことにより、10〜30%
のカルスから不定芽形成を誘導することができた。
これらの不定芽は常法に従って成育させ、バーミキュ
ライト上に移植して発根させると、目的とする細胞質雑
種植物を得ることができる。
(実施例) 以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
ダイコンからのプロトプラストの調製 ダイコンUK−1の無菌苗から葉をとり、それを0.35M
サッカロース、2,4−D0.5mg/、NAA0.1mg/、BAP0.1m
g/を含むNN67液体培地内できざみ、4℃の暗所に16時
間静置する。次いでそれを0.5%セルラーゼR−10、0.0
5%マセロザイムR10、0.01%ペクトリアーゼY−23、2
%セルラーゼRSを含む0.4サッカロース液に移して、30
℃で5時間放置する。
この酵素液をろ過して未消化物を除去し、ろ液を800
r.p.m.で10分間遠心して沈澱物を集め、それを0.6Mサッ
カロース液の上に静かにのせる。これを800r.p.m.で10
分間遠心し、プロトプラストのバンドを回収する。
X線照射 で得られたプロトプラストを106個/mlの濃度に調製
し、1400レントゲン/分の線量率で約107分照射し、計1
50kレントゲンのX線を照射した。
ナタネからの調製 春播きナタネの種子を無菌的に発芽させて4〜6日目
の下胚軸を切取り、0.3M塩化カルシウムを含む水溶液中
で細かくきざむ。水溶液を除去し、2%セルラーゼR−
10、0.01%ペリトリアーゼY−23、0.4Mシュクロースを
含むNN67培地を加え、30℃で4〜5時間酵素処理したの
ち800r.p.m.で10分間遠心して、上層のプロトプラスト
画分を回収した。
ヨードアセトアミド処理 上記で回収したプロトプラストをW5溶液中で2×10
5個/mlの濃度に懸濁し、これに100mMのヨードアセトア
ミド液を最終濃度が10mMになるよう加えた。これを室温
で10分間放置し、800r.p.m.で5分間遠心分離してプロ
トプラストを集め、W5液で3回洗ってヨードアセトアミ
ド処理プロトプラストを得た。
細胞融合 X線照射したUK−1プロトプラストと、ヨードアセト
アミド処理した春播きナタネプロトプラストを2:1の割
合で、最終濃度2×106個/mlになるよう混合し、100μ
のドロップとして6cmシャーレ上に3コ〜4コのドロ
ップを置いた。これらのドロップ内で2種の細胞が沈む
まで5分間放置した。次に40%PEGを含むW5液100μを
各ドロップに静かに加え、5分間放置した。その後PEG
液を吸いとり、13%PEGを含むW5液を100μ加え、5分
間放置した。13%PEG液を吸いとり、6.7%PEGを含むW5
液100μを加えて5分間放置した。6.7%PEGを除去し
たのち、0.4Mグルコース、2,4−D1ml/、NAA0.1mg/
、BAP0.4mg/を含むKM液体培地をシャーレに加え、2
5〜27℃、100〜200luxで培養を行なった。
融合細胞の培養 の培養液中で7日〜10日間培養したのち、0.1Mサッ
カロース、2,4−D1mg/NAA0.1mg/、BAP0.4mg/を含
むKM液体培地を等量加えさらに培養を続けたところ、3
〜4週間で0.5〜1mmのコロニーが形成された。このコロ
ニーを0.2Mマンニトール、0.1Mサッカロース、2,4−D1m
g/、BAP0.1mg/、アガロース0.5%含むMS修正培地に
移し、約1か月培養して2mm程度にまで増殖させた。こ
のカルスを0.2Mマンニトール、0.06Mサッカロース、IAA
0.1mg/、ゼアチン2mg/、硫酸アデニン80mg/、カ
ゼイン加水分解物100mg/、0.6%アガロースを含むMS
修正培地に置床し、不定芽形成を誘導した。カルスは約
1か月後に0.03Mサッカロース、IAA0.1mg/、ゼアチン
2mg/,アガロース0.8%を含む培地に植え継ぎ、不定
芽誘導を促した。
得られた不定芽は0.1mg/mlBAP、0.1Mサッカロース、
0.8%アガロースを含むB5培地で成育させ、その後0.1mg
/NAA、0.1Mサッカロース、0.8%アガロースを含むMS
培地で発根させた。植物体はバーミキュライトに移植
し、さらに培地に移して育てた。得られた植物の80%が
雄性不稔を示した。
(発明の効果) 本発明によれば、ダイコンCMS細胞質は戻し交配の手
法を経ることなく、短時間にブラシカ属植物に導入する
ことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Lasazlo Menezel,P lant Cell Reports, (6)2(1987)p.98−101

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】X線照射したダイコン由来のプロトプラス
    トとヨード化合物処理したブラシカ属植物由来のプロト
    プラストとを融合させ、次いで得られた融合細胞を培養
    してコロニーを形成させ、該コロニーから植物体を再生
    させることを特徴とする細胞質雑種植物の製造方法。
JP63043561A 1988-02-26 1988-02-26 細胞質雑種植物の製造方法 Expired - Lifetime JP2687396B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63043561A JP2687396B2 (ja) 1988-02-26 1988-02-26 細胞質雑種植物の製造方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP63043561A JP2687396B2 (ja) 1988-02-26 1988-02-26 細胞質雑種植物の製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH01218530A JPH01218530A (ja) 1989-08-31
JP2687396B2 true JP2687396B2 (ja) 1997-12-08

Family

ID=12667159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63043561A Expired - Lifetime JP2687396B2 (ja) 1988-02-26 1988-02-26 細胞質雑種植物の製造方法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2687396B2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7767886B2 (en) 2001-04-25 2010-08-03 Institut National De La Recherche Agronomique Protein involved in restoration of cytoplasmic male sterility to fertility and gene encoding the protein

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2108230C (en) * 1992-10-14 2006-01-24 Takako Sakai Methods for introducing a fertility restorer gene and for producing f1 hybrid of brassica plants thereby
NL194904C (nl) * 1993-07-14 2003-07-04 Sakata Seed Corp Mannelijke steriele plant.
WO1995009910A1 (fr) * 1993-10-01 1995-04-13 Mitsubishi Corporation Gene identifiant un cytoplasme vegetal sterile et procede pour preparer un vegetal hybride a l'aide de celui-ci
NL1003239C2 (nl) * 1996-05-31 1997-12-03 Bejo Zaden Bv Cytoplasmatisch mannelijk steriele Brassica oleracea plant, alsmede werkwijze voor het verkrijgen van een dergelijke plant.
JP4139429B2 (ja) 2005-10-26 2008-08-27 株式会社サカタのタネ 細胞質雑種Lactuca属植物およびその作出方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2530620B2 (ja) * 1986-07-31 1996-09-04 三菱商事株式会社 細胞質雑種細胞の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lasazlo Menezel,Plant Cell Reports,(6)2(1987)p.98−101

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7767886B2 (en) 2001-04-25 2010-08-03 Institut National De La Recherche Agronomique Protein involved in restoration of cytoplasmic male sterility to fertility and gene encoding the protein
US8134045B2 (en) 2001-04-25 2012-03-13 Institut National De La Recherche Agronomique Protein involved in restoration of cytoplasmic male sterility to fertility and gene encoding the protein and gene

Also Published As

Publication number Publication date
JPH01218530A (ja) 1989-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0599042B1 (en) Methods for introducing a fertility restorer gene and for producing F1 hybrids of Brassica plants thereby
Yamada et al. Plant regeneration from protoplast-derived callus of rice (Oryza sativa L.)
Menczel et al. Fusion-mediated combination of Ogura-type cytoplasmic male sterility with Brassica napus plastids using X-irradiated CMS protoplasts
JP3865264B2 (ja) 長期にわたり高度に効率的な植物再生能力を持つ改善されたゼア・メイズ・エルの遺伝子型
Nakamura et al. In vitro propagation and chromosome doubling of a Triticum crassum x Hordeum vulgare intergeneric hybrid
Li et al. High frequency generation of fertile transgenic rice plants after PEG-mediated protoplast transformation
JP2687396B2 (ja) 細胞質雑種植物の製造方法
WO2020213728A1 (ja) 生長性が改良された細胞質雄性不稔Brassica rapa植物
JPH0731307A (ja) 雄性不稔植物の育種方法及び増殖方法
Bhattacharjee et al. Transfer of wild abortive cytoplasmic male sterility through protoplast fusion in rice
EP0771523B1 (en) A cytoplasmic male sterile vegetable plant cell of the compositae family and also a method for obtaining such a plant
EP0263017A1 (en) Process for preparing gramineous hybrid plants
Sanford et al. Attempted pollen-mediated transformation using Ti-plasmids
JP3149090B2 (ja) 細胞質雑種植物の作成方法
JP3187816B2 (ja) タマネギとニンニクの雑種植物の生産方法
JP3862764B2 (ja) 稔性回復遺伝子の導入方法
JPH11512290A (ja) Polima CMS細胞質を有し、高温及び低温において雄性不稔性である細胞質雄性不稔性Brassica oleracea植物
JP2530620B2 (ja) 細胞質雑種細胞の製造方法
JP3305307B2 (ja) タマネギとニンニクの雑種植物の生産方法
TW202107981A (zh) 低溫生長性經改良之細胞質雄性不稔萵苣(Lactuca)屬植物
JPH05227857A (ja) キク科植物の培養方法
WO2002001940A2 (en) A method of generating fertile plants from isolated microspores
JPH01196239A (ja) イネのサイブリッド植物の作出方法
JP2840854B2 (ja) ワサビプロトプラストからのカルス再生法
WO2020095973A1 (ja) 植物受精卵細胞の培養方法、および当該方法で作成された再生植物体

Legal Events

Date Code Title Description
S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

R360 Written notification for declining of transfer of rights

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360

R371 Transfer withdrawn

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070822

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080822

Year of fee payment: 11

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080822

Year of fee payment: 11