WO2020095973A1 - 植物受精卵細胞の培養方法、および当該方法で作成された再生植物体 - Google Patents

植物受精卵細胞の培養方法、および当該方法で作成された再生植物体 Download PDF

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WO2020095973A1
WO2020095973A1 PCT/JP2019/043576 JP2019043576W WO2020095973A1 WO 2020095973 A1 WO2020095973 A1 WO 2020095973A1 JP 2019043576 W JP2019043576 W JP 2019043576W WO 2020095973 A1 WO2020095973 A1 WO 2020095973A1
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WO
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plant
fertilized egg
cell
culturing
medium
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Application number
PCT/JP2019/043576
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Inventor
雅子 市川
Original Assignee
日本たばこ産業株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing plant fertilized egg cells.
  • the present invention further relates to a method for producing a regenerated plant from a fertilized egg cell of a plant.
  • Fertilized eggs are originally cells that possess the ability to grow into plants, and are therefore expected not to be affected by the culture efficiency caused by the differences between species and varieties.
  • Methods for acquiring fertilized eggs from plants include the method of isolating fertilized eggs from a plant that has been naturally or artificially crossed, or the method of fusing egg cells and sperm cells for fertilization. Methods such as obtaining eggs are being used.
  • the ears are treated with a solution containing 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) to promote ovarian hypertrophy. , Attempts have been made to facilitate the isolation of fertilized eggs (Kovacs et al., (1994)).
  • Cell cluster formation step This is a step in which the obtained plant fertilized egg cell survives, divides, and proliferates into a cell cluster. In this step, the selection of solution, medium, nurse cell, etc. has an important influence on the survival, division and cell mass formation of plant fertilized egg cells.
  • Culturing fertilized egg cells of plants requires a source of nutrients necessary for survival and division of fertilized eggs.
  • a method of returning the isolated fertilized egg to the ovule or a method of using a nurse cell can be mentioned.
  • Kumlehn et al. (1997) regenerates plants using a method of returning isolated fertilized wheat egg cells to ovules.
  • a method using a microspore culture (Kumlehn et al., (1998), Holm et al., (1994), Leduc et al., (1996), Kranz et al. (1999). ), A method using suspension cultured cells (Kranz et al., (1993)), and a method using anther culture (Leduc et al., (1996)).
  • Regeneration step In this step, the plant body is regenerated from the cell mass.
  • the medium used in this step has different inorganic salts and sugars depending on the plant species, but corn (Leduc, 1996), rice (Zhang, 1999), wheat (Kumlehn, 1998), barley (Holm, 1994, 2000). ) Have in common that none of them contain plant growth regulators.
  • a plant fertilized egg cell is treated as a plant material for genome editing or gene recombination, it is necessary to introduce DNA, RNA, and protein into the fertilized egg, rather than simply culturing the plant fertilized egg cell. Fertilized egg cells become more difficult to survive, divide, and regenerate. Therefore, a stronger culture method and a method for producing a regenerated plant are required, and more diverse improvements are required.
  • the object of the present invention is to provide a method for culturing a fertilized egg cell of a plant, and a plant regenerated by the method of the present invention.
  • the present invention includes, but is not limited to, the following aspects.
  • a method for culturing plant fertilized egg cells which comprises culturing the plant fertilized egg cells in a solid medium.
  • a method for regenerating a plant from a plant fertilized egg cell The method, which comprises culturing the plant fertilized egg cell in a solid medium in a part of the step of culturing the plant fertilized egg cell.
  • Aspect 3 The plant regeneration method according to aspect 2, which comprises culturing in a solid medium after the plant fertilized egg cells become a cell mass.
  • [Mode 4] A method for regenerating a plant from a plant fertilized egg cell, (1) Culturing plant fertilized egg cells to obtain a cultured cell mass, in which part of the step, the plant fertilized egg cells are cultured in a solid medium; (2) Regenerating the cultured cell mass, The method comprising: [Aspect 5] A method for regenerating a plant from a plant fertilized egg cell, (1) (i) culturing a plant fertilized egg cell to obtain a cultured cell mass; (1) (ii) culturing the cultured cell mass in a solid medium; (2) Regenerating the cultured cell mass, The method comprising: [Aspect 6] The method according to aspect 4 or 5, further comprising: (0) obtaining fertilized egg cells of the plant.
  • the solid medium comprises a plant growth regulator.
  • the plant growth regulator is an auxin.
  • the auxin is a plant hormone selected from the group consisting of 2,4-D, picloram and dicamba.
  • the concentration of the plant growth regulator in the solid medium is 0.05 mg / L or more and 10 mg / L or less.
  • the concentration of the plant growth regulator in the solid medium is 0.01 mg / L or more and 10 mg / L or less.
  • fertilized egg cells develop into the embryo within the plant.
  • the fertilized egg cell or embryo is covered with a solid environment such as endosperm or maternal tissue on the outside.
  • fertilized egg cells isolated from a plant or a cell mass enlarged therefrom are often cultured in a liquid medium, which is significantly different from the environment in the plant, so that the fertilized egg cells are The problem was that it did not lead to body regeneration.
  • the present inventors in addition to the conventional plant fertilized egg culturing / plant regeneration method, by placing the cell mass in an environment close to the plant body before plant regeneration, the cell mass is stably stabilized. We have found a method to obtain regenerated plants efficiently.
  • FIG. 1 shows a case in which a plant was placed on a modified N6Z solid medium before regenerating a plant in a medium for regeneration regeneration modified LSD medium (test section, left), and on the same day with a modified N6Z liquid medium instead of being placed on the modified N6Z solid medium. It is a figure showing the number of days (days) required for the cell mass to regenerate into a plant in the case of several cultures (control, right).
  • the present invention relates to a method for culturing plant fertilized egg cells.
  • the culture method of the present invention includes culturing a plant fertilized egg cell in a solid medium.
  • Plant The type of plant is not particularly limited. Both dicotyledonous plants and monocotyledonous plants may be used, and monocotyledonous plants are preferred. More preferred are wheat, corn, barley, rice, sorghum, rye, sugar cane, and the like, and most preferred are corn, wheat, and rice. Dicotyledons include, but are not limited to, tobacco, soybeans, potatoes, sunflowers, and others. Soybean and tobacco are preferable.
  • the method for culturing plant fertilized egg cells is not particularly limited, but in particular, it can be used for plants or varieties that are "hardly cultured". "Difficult culture" is difficult to culture, specifically, for example, it is difficult to culture cells or tissues isolated from the plant body, callus formation by treatment such as dedifferentiation, or plant body from callus It is difficult to re-differentiate into.
  • Difficult-to-cultivate plants include, for example, soybeans, kidney beans, capsicum and the like.
  • "Difficult-cultivation cultivar” means a cultivar that is difficult to culture as compared with general research cultivars of the same species (such as Fielder for wheat and A188 for corn), for example, an elite variety of wheat (for example, AC. Barrie, TAM, etc.), corn elite varieties having B73 and B73 derived from corn, barley varieties other than GoldenPromise and Igri, sorghum 296B, C401, SA281, P898012, Pioneer 8505, varieties other than Tx430.
  • Fertilized egg cell means a cell in which a sperm cell and an egg cell are fused.
  • the "plant fertilized egg cell” is a fertilized egg cell isolated from a tissue containing a plant embryo sac, that is, a fertilized egg cell that has been pollinated and fertilized at the stage of the plant body and isolated from the plant body, Good.
  • an egg cell and a sperm cell may be isolated from a plant before pollination / fertilization, and then fused to produce and obtain a fertilized egg cell.
  • Fertilized eggs may be created and obtained by electrical fusion. It may also be a fertilized egg cell obtained by fusing egg cells and sperm cells of different plants.
  • the “egg cell” means a female gamete formed in the pistil by meiosis of an embryo sac cell.
  • the method for isolating the egg cell is not limited, but for example, the ovary can be cut in a solution having an appropriate osmotic pressure, and the egg cell emerging from the cut surface can be isolated under a microscope using a glass capillary.
  • the “sperm cell” means a male gamete formed in the anther of the stamen by meiosis of the pollen mother cell.
  • the method for isolating sperm cells is not limited, but, for example, when pollen collected from anthers is immersed in a solution having an appropriate osmotic pressure, pollen contents containing sperm cells are released from the pollen into the solution after a few minutes. Therefore, sperm cells can be isolated using a glass capillary under a microscope.
  • the plant fertilized egg cell may be produced in the plant by the natural fertilization method, and the produced fertilized egg cell may be obtained from the plant.
  • a method for obtaining a fertilized egg cell using the natural fertilization method is, for example, a method in which a stigma is exposed, pollen is attached and pollinated, and then a fertilized egg is isolated from a tissue containing an embryo sac.
  • To isolate fertilized egg cells from a plant take out the ovary immediately after fertilization from the plant after pollination, cut the ovary in an appropriate osmotic pressure solution, and remove the fertilized egg emerging from the cut surface.
  • a tissue such as a pearl heart can be dissected and excised and isolated under a microscope using a glass needle or the like.
  • Fertilized eggs may be produced by fusing plant egg cells and sperm cells in vitro. That is, it is possible to first isolate an egg cell and a sperm cell from a plant and to produce a fertilized egg cell in vitro by a known method such as an electrofusion method (also referred to as gamete fusion).
  • the electrofusion method is a method in which two or more types of cells are fused in vitro by electrical stimulation. Specifically, an electric pulse is applied to the isolated egg cells and sperm cells in a solution having an appropriate osmotic pressure to cause cell fusion.
  • cell fusion methods such as calcium fusion method and PEG fusion method may be used for cell fusion of egg cells and sperm cells.
  • the "calcium fusion method” utilizes the property of the cell membrane that cell membrane fusion easily occurs in a calcium concentration-dependent manner.
  • the “PEG fusion method” utilizes that cells are fused by treating cells with polyethylene glycol (PEG) to bind the cell membrane, and removing PEG.
  • PEG polyethylene glycol
  • the fertilized egg cell of the plant is obtained by isolating the egg cell from the tissue containing the egg cell of the plant and then fusing the sperm cell.
  • the plant fertilized egg cell is a plant fertilized egg cell into which a substance has been introduced.
  • the culture method of the present invention includes culturing plant fertilized egg cells in a solid medium.
  • culturing the plant fertilized egg cell in a solid medium is performed in the step of redifferentiating the plant from the plant fertilized egg cell.
  • culturing the plant fertilized egg cell in a solid medium is performed before the culturing step in the redifferentiation medium.
  • culturing the plant fertilized egg cell in a solid medium comprises culturing a cell mass formed from the plant fertilized egg cell before the culturing step in the redifferentiation medium.
  • the term “plant fertilized egg cell” may be used to include a state in which a fertilized egg has been cultured to a cell mass.
  • Medium It may be one that is usually used for culturing plant cells, and examples thereof include MS medium, LS medium, N6 medium, B5 medium, R2 medium, and CC medium. These culture media may be either concentrated or diluted from the basic concentration. The amount is preferably 1/10 to 2 times, more preferably 1/5 to 1 time.
  • the medium used in this step may have the same composition as the medium used in the step of obtaining the cell mass.
  • a solid medium is a liquid medium solidified with a solidifying agent such as agar.
  • the solidification of the medium can be performed by adding a solidifying agent known in the art, and examples of such solidifying agents include agarose, agar, gellan gum, gellite, phytagel and the like.
  • concentration of the solidifying agent varies depending on the type of the solidifying agent, for example, in the case of gellite, 0.3-4.0 g / L is preferable, and 0.5-3.0 g / L is more preferable.
  • the solid medium in this step may be a semi-solid medium.
  • “Semi-solid” is a substance that has both liquid and solid properties, is defined as a semi-fluid that is closer to a solid than a liquid, and is characterized by its viscous and freely deformable, so-called gel-like substance.
  • the “semi-solid medium” can be prepared, for example, by adding the concentration of the solidifying agent added to the liquid medium at a concentration lower than the concentration at which a complete solid medium is produced. Created by adding the concentration of the solidifying agent at a concentration lower than the concentration at which a solid medium is generated, for example, 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less%. it can.
  • the concentration of the solidifying agent may be made by adding at a concentration at which a solid medium is produced, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more.
  • concentration at which a solid medium is produced 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more.
  • the solid medium may include a plant growth regulator.
  • the plant growth regulators are auxins. Specifically, for example, auxins such as indole-3-acetic acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), picloram, dicamba, naphthaleneacetic acid, naphthoxyacetic acid, phenylacetic acid, 2,4,5 -Trichlorophenoxyacetic acid or other auxins can be added.
  • the auxins are plant hormones selected from the group consisting of 2,4-D, picloram, and dicamba.
  • other plant growth regulators such as kinetin and cytokinins such as 4PU can be added. These plant growth regulators may be used alone or as a mixture of two or more at different concentrations.
  • the concentration of the plant growth regulator added to the solid medium can be appropriately set by those skilled in the art according to the plant.
  • Non-limiting examples include 0.05 mg / L or more and 10.0 mg / L or less, or 0.01 mg / L or more and 10.0 mg / L or less.
  • 0.1 mg / L or more and 5.0 mg / L or less are preferable, and 0.15 mg / L or more and 2.0 mg / L or less are more preferable.
  • 0.015 mg / L or more and 5.0 mg / L or less are preferable, and 0.02 mg / L or more and 2.0 mg / L or less are more preferable. ..
  • a plant fertilized egg cell more preferably a cell mass obtained from the plant fertilized egg cell, is placed on a solidified medium and grown at an appropriate temperature, light and dark conditions and a period.
  • the culturing temperature can be appropriately selected, and is preferably 18 ° C.-35 ° C., more preferably 20-28 ° C., and most preferably 23-26 ° C.
  • the culture in this step is preferably performed in a dark place or a dim place, but is not limited thereto.
  • the culture period can also be appropriately selected, and is preferably 1 to 35 days, 1 to 30 days, more preferably 2 to 28 days, and 2 to 14 days.
  • the fertilized egg cells of the plant are cultured in a solid medium until they are in a state suitable for the redifferentiation step.
  • first, fertilized egg cells of a plant are cultured in a liquid medium to obtain a cultured cell mass, and then the cultured cell mass is cultured in a solid medium.
  • the “cell mass” and the “cultured cell mass” will be described in detail in the section “2. Plant regeneration method”.
  • the present invention relates to a method for regenerating a plant from a fertilized egg cell of a plant.
  • the plant regeneration method from plant fertilized egg cells, Part of the step of culturing the plant fertilized egg cell includes culturing the plant fertilized egg cell in a solid medium.
  • the method for regenerating a plant from a fertilized egg cell includes culturing in a solid medium after the plant fertilized egg cell becomes a cell mass.
  • the plant regeneration method from plant fertilized egg cells (1) Culturing plant fertilized egg cells to obtain a cultured cell mass, in which part of the step, the plant fertilized egg cells are cultured in a solid medium; (2) Regenerating the cultured cell mass, Including that.
  • the plant regeneration method from plant fertilized egg cells (1) (i) culturing a plant fertilized egg cell to obtain a cultured cell mass; (1) (ii) culturing the cultured cell mass in a solid medium; (2) Regenerating the cultured cell mass, Including that.
  • the method for plant regeneration from plant fertilized egg cells may further include the step of (0) obtaining plant fertilized egg cells before the step of culturing the plant fertilized egg cells.
  • Part of the step of culturing plant fertilized egg cells means a part of the step of culturing plant fertilized egg cells before the step of regenerating the plant body in the plant regeneration method.
  • a part of the step of culturing the plant fertilized egg cell means after culturing the plant fertilized egg cell to obtain a cultured cell mass.
  • a method of regenerating a plant from a fertilized egg cell of a plant includes a step of acquiring a cultured cell mass from a fertilized egg cell of the plant.
  • a known method can be used for the step of forming a cultured cell mass from plant fertilized egg cells.
  • Cell mass refers to a mass of plant fertilized eggs that have undergone numerous divisions.
  • the term “plant fertilized egg cell” may be used to include a cultured cell mass obtained by culturing a fertilized egg to a cell mass.
  • the “cell mass” may be an embryoid body, a globular embryo, a callus or the like.
  • the process of inducing fertilized egg cells to divide and proliferate them to form embryoid bodies, globular embryos, callus, etc. is not particularly limited because optimum conditions differ depending on the plant, but nurses containing feeder cells or plant explants
  • the culture method is preferred. For example, it can be performed as follows.
  • Culturing until obtaining a cell mass from a fertilized egg cell of a plant means transferring the fertilized egg cell to a liquid medium and culturing.
  • the temperature of the culture is preferably 23-28 ° C, 24-28 ° C, 24-27 ° C, or 25 ° C-27 ° C.
  • feeder cells it is preferable to culture in the dark. At this time, it is preferable to add feeder cells to the medium and perform co-culture (nurse culture method).
  • the co-culture period may be until the end of the culture in the liquid medium, or the feeder cells may be removed during the process. Moreover, you may shake gently during culture.
  • the shaking speed is preferably 30 to 50 rpm, more preferably 35 to 45 rpm.
  • a known medium usually used for culturing plant fertilized egg cells may be used, and for example, liquid MS medium, B5 medium, N6 medium and modified medium thereof can be used.
  • the medium contains plant hormones, especially indole-3-acetic acid, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), picloram, dicamba, naphthaleneacetic acid, naphthoxyacetic acid, phenylacetic acid, 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid. It is preferred that auxins such as The addition concentration can be appropriately set by those skilled in the art according to the plant.
  • Non-limiting examples include 0.1 to 10.0 mg / L, preferably 0.1 to 5.0 mg / L, and more preferably 0.15 to 2.00 mg / L.
  • Non-limiting examples include 0.01 to 10.0 mg / L, preferably 0.15 to 5.0 mg / L, and more preferably 0.02 to 2.00 mg / L.
  • Feeder cells It is possible to use known feeder cells or plant explants.
  • feeder cells include rice floating cell culture (Line Oc, manufactured by Riken BioResource Center), maize nurse cells (Kranz et al. 1993), and microspore culture (Bakos et al., 2003). Be done.
  • plant explants include ovaries (Kumlehn et al. (1998)).
  • -A step of newly replacing the liquid medium may be included in the "culture” step until the cell mass is obtained from the fertilized egg cells of the plant.
  • the cell mass to start culturing in the solid medium it is preferable to cultivate the cells to a state capable of redifferentiation.
  • the culture conditions, time, etc. required for culturing to a cell mass in this state vary depending on the type and variety of plant, and can be appropriately set by those skilled in the art. For example, about 21 to 48 days after the culture is started, a cell mass having a diameter of about 1.0 to 3.0 mm is formed.
  • the cell mass obtained by liquid culture for 7 days, preferably 14 days, and more preferably 20 days after the fertilized egg is obtained.
  • the cell mass has a diameter of 0.3 mm or more, preferably 0.5 mm or more, more preferably 1 mm or more, and most preferably 2 mm or more, the cell mass is transferred to a solid medium and the culture is started. be able to.
  • One aspect of the present invention includes culturing plant fertilized egg cells in a cell mass state having a diameter of 0.3 mm or more in a solid medium.
  • One aspect of the present invention includes culturing plant fertilized egg cells in a cell mass state having a diameter of 1 mm or more in a solid medium.
  • the “diameter of the cell mass” means the length of the longest part of the cell mass.
  • the “cell mass diameter” means the longest axial length of the spheroid.
  • the plant fertilized egg cells are cultured in a solid medium in a part of the step of culturing the plant fertilized egg cells.
  • Part of the step of culturing plant fertilized egg cells means a part of the step of culturing plant fertilized egg cells before the plant regeneration step in the plant regeneration method.
  • a part of the step of culturing the plant fertilized egg cell means after culturing the plant fertilized egg cell to obtain a cultured cell mass.
  • the plant fertilized egg cells are cultured to obtain a cultured cell mass, and in the part of the step, the plant fertilized egg cells are cultured in a solid medium.
  • Part of the step of culturing plant fertilized egg cells to obtain a cultured cell mass means a part of the step of culturing plant fertilized egg cells before the plant body regeneration step in the plant regeneration method.
  • a part of the step of culturing plant fertilized egg cells to obtain a cultured cell mass means after culturing plant fertilized egg cells to obtain a cultured cell mass.
  • solid medium and “culture in solid medium” are as described in “1. Method for culturing plant fertilized egg cell”.
  • a method for regenerating a plant from fertilized egg cells of a plant includes, in one aspect, regenerating a cultured cell mass.
  • the regeneration step can be performed according to a known regeneration step. For example, as an example, it can be performed as follows.
  • the cultured cell mass is transferred to an arbitrary medium, for example, a solid or liquid regeneration medium composed of MS medium, and cultured.
  • the culture is preferably performed by irradiating light, without limitation, optical, for example, preferably 50 ⁇ 180 ⁇ mol / m 2 ⁇ sec, more preferably 70 ⁇ 150 ⁇ mol / m 2 ⁇ sec.
  • optical for example, preferably 20 ⁇ 180 ⁇ mol / m 2 ⁇ sec, more preferably 50 ⁇ 150 ⁇ mol / m 2 ⁇ sec.
  • Regeneration medium For example, MS medium, B5 medium, N6 medium, and may be a liquid medium containing no solid medium using a solidifying material such as agarose, agar, gellan gum, and gellite.
  • a plant growth regulator containing auxin and cytokinin may be added to the regeneration medium.
  • Replanted plants can be obtained by transplanting the plants whose roots, shoots, etc. have been re-differentiated by this process and growing them in a pot containing soil.
  • the present invention further relates to a plant (regenerated plant) regenerated by the method for regenerating a plant fertilized egg cell of the present invention.
  • the regenerated plant is cultivated fertilized egg cell, a plant regenerated by redifferentiation, cells, tissues, etc. obtained from the plant, and the "T0 generation” which is the redifferentiated generation obtained by the method of the present invention. It includes progeny plants such as "T1 generation” which are self-fertilized seeds of T0 generation plants, and hybrid plants and progeny plants obtained by crossing them with one parent.
  • the method for culturing plant fertilized egg cells and the method for plant regeneration according to the present invention it has become possible to stably and efficiently obtain a regenerated plant from a cell mass obtained by culturing plant fertilized egg cells.
  • Culture method of the present invention in the step of the regeneration method, fertilized egg cells, egg cells, spermatids, fertilized egg cells that have started division, by introducing the substance into any of the cell mass, to stabilize the regenerated plant introduced with the substance Can be obtained efficiently.
  • a transforming agent is introduced into fertilized egg cells.
  • the plant fertilized egg cell in the culture method and plant regeneration method of the present invention is a plant fertilized egg cell into which a substance has been introduced.
  • the substance to be introduced is selected from the group consisting of, but not limited to, nucleic acids, proteins and peptides.
  • the nucleic acid is not particularly limited, and may be RNA, DNA, a combination of both, or a mixture.
  • Preferred are circular DNA such as vector, linear DNA, circular RNA or linear RNA. Any length depending on the transformation method used can be used.
  • the length of the nucleic acid is preferably 100 kb or less, more preferably 50 kb or less. It is more preferably 30 kb or less, particularly preferably 20 kb or less, and most preferably 10 kb or less.
  • Nucleases such as Cas9 nuclease for genome editing proteins such as modifying enzymes and antibodies can be introduced.
  • the size of the protein is, without limitation, preferably a molecular weight of 300 kDa or less, more preferably 200 kDa or less, still more preferably 150 kDa or less.
  • Peptide is a generic term for molecules in which various amino acids are linked in amide bonds (also called “peptide bonds") in a fixed order, and is generally shorter than proteins.
  • amide bonds also called “peptide bonds”
  • nucleic acid may be two or more kinds of DNA or RNA, or a combination of DNA and RNA. Substances of different species such as nucleic acid and protein may be introduced.
  • the method of introducing the substance into the plant is not particularly limited as long as it is a known method capable of introducing the desired substance into the plant, and can be appropriately selected according to the type of the plant.
  • a physicochemical method such as a polyethylene glycol method (PEG method), an electroporation method, a particle gun method, a microinjection method, a whisker method, or a biological method such as an Agrobacterium method ( Indirect introduction method of DNA) can be preferably used.
  • the substance can be introduced into a plant by, for example, the method described in International Publication WO2017 / 171092 and International Publication WO2018 / 143480.
  • Example 1 Isolation of Fertilized Eggs of Wheat Isolation and culture of fertilized eggs are described by Kumlehn et al. (1997).
  • the wheat cultivar Fielder was emasculated 1-3 days before flowering. Four to six days later, artificial mating was performed by contacting the stigmas of the emasculated florets with anthers of the same variety. After 3-4 hours of mating, the ears were sterilized by immersing them in 1-2% sodium hypochlorite for 6 minutes and then washing 3 times with sterile distilled water. The florets were disassembled aseptically, and the ovaries were collected on a 3.5 cm plastic petri dish containing 4 mL of 0.55 M mannitol solution.
  • the lower part of the ovary was cut using a scalpel at the bottom of the plastic petri dish.
  • the ovule slice was taken out from the ovary, and the ovule slice was fixed on one of the two glass needles, and on the other hand, the fertilized egg was taken out by gently pressing the tissue in the region where the fertilized egg is supposed to be present.
  • the region was estimated by using one of the two existing auxiliary cells as the marker because the one invading the pollen tube was denatured and turned dark brown.
  • Example 2 Effect of solid medium on plant regeneration efficiency of fertilized wheat eggs Culture of fertilized eggs was performed according to the method of Kumlehn et al. (2016). A 12 mm diameter Millicell-CM insert (manufactured by Millipore) was placed in a 3.5 mL plastic petri dish, and the modified N6Z liquid medium (2,4-D concentration was changed to 0.02 mg / L inside the Millicell-CM insert ( Kumlehn et al., 2016) 0.2 mL, the above-mentioned modified N6Z medium 2 mL and Fieder cells were added to the outside. Fertilized eggs isolated as in Example 1 were transferred onto the membrane of Millicell-CM insert using a microcapillary. Fertilized eggs were cultured in the dark at 25 ° C. for 2 weeks, and after the above-mentioned modified N6Z liquid medium was exchanged, they were further cultured for 2 weeks.
  • the cell mass having a diameter of 2 mm or more was placed on the above-mentioned modified N6Z solid medium (medium obtained by mixing equal amounts of the above-mentioned modified N6Z liquid medium having a double concentration and a 1.6% gellite solution) and solidified at 25 ° C. 2-4 days in the dark.
  • the cell mass was washed with Ishida et al. (2015) Regeneration medium
  • the modified LSD medium in which the composition of the LSD medium was changed (8 g / L agar was changed to 3 g / L gellite except for carbenicillin and cefotaxime) was plated and cultured in the light at 25 ° C.
  • the shoot-differentiated cell mass was placed in a modified LSF medium (IBA was changed to 0.5 mg / L) in which the composition of the Ishida (2015) seedling medium LSF medium was changed, and the cells were cultured at 25 ° C in the light. ..
  • Example 3 Effect of solid medium on plant regeneration rate of fertilized wheat eggs
  • fertilized egg cells were isolated from the wheat variety Fieldder to regenerate plants.
  • Reference Example 1 In order to confirm the culture characteristics of wheat variety Fielder and Norin 61, which were tested for immature embryo culture of wheat variety Norin 61 and culture of regenerated plant fertilized egg cells of plant, Ishida et al. With reference to the method of (2015), immature embryos of each variety were cultured to obtain regenerated plants.
  • Immature embryos were aseptically isolated from the ears 14 days after flowering and collected in WLS-liq medium.
  • the immature embryos were centrifuged at 15,000 rpm (20,000 xg) for 10 minutes, and then placed in modified WLS medium-1 (2.2 mg / L picloram was replaced with 2.5 mg / L dicamba, and carbenicillin was removed).
  • the cells were cultured at 25 ° C in the dark for 2 days.
  • the plate was placed on a modified WLS medium-1 and further cultured for 5 days.
  • the enlarged immature embryo was placed on the modified medium WLS medium-2 (removing carbenicillin) and cultured at 25 ° C. in the dark for 2 weeks.
  • Example 4 Effect of solid medium on plant regeneration efficiency of fertilized eggs of poorly cultured wheat cultivar
  • fertilized egg cells were isolated from the wheat variety Norin 61, and the plants were regenerated before plant regeneration. The plant regeneration efficiency was compared between the case where the cell mass was cultured on a solid medium (test group) and the case where the cell mass was cultured on a liquid medium for the same number of days instead of being placed on the solid medium (control group).
  • Example 5 Effect of Solid Medium on Plant Regeneration Rate of Fertilized Maize Egg Silk of ears of maize (cultivar: A188) at a suitable mating time was cut at a length of 10 cm, and from the ear of the same cultivar at the tip thereof. The collected pollen was pollinated and cultured in a culture room at 25 ° C. and a photoperiod of 12 hours. From the ovule of the ears 16 hours after mating, the pearl sac containing the embryo sac was excised and placed in 1 mL of a 650 mOsmol / kg mannitol solution in a 3.5 cm plastic petri dish.
  • the fertilized egg was taken out by fixing the ovule slice on one of the two glass needles and gently pressing the tissue in the region where the fertilized egg was supposed to be present on the other.
  • the region was estimated by using one of the two existing auxiliary cells as the marker because the one invading the pollen tube was denatured and turned dark brown.
  • a 12 mm diameter Millicell-CM insert (manufactured by Millipore) was placed in a 3.5 mL plastic petri dish, and inside the Millicell-CM insert, 2,4-D concentration was 0.2 mg / L and osmotic pressure was 650 mOsmol /. kg H 2 O, 0.2 mL of modified MSO medium (Kranz E. et al., (1993)) in which the pH was changed to 5.7, 2 mL of the above-mentioned modified MSO medium on the outside and Oc cultured cells (RIKEN BioResource Center ) was added.
  • the isolated fertilized egg culture was transferred onto a membrane of Millicell-CM insert using a microcapillary.
  • Fertilized eggs were cultured for 2 days in the dark at 25 ° C., and the above-mentioned modified MSO liquid medium was replaced with Oc culture cells, and then further cultured for 1 week. After exchanging the modified MSO medium in which the osmotic pressure was changed to 450 mOsmol / kg H 2 O with the Oc cultured cells, the cells were further cultured for 5 weeks.
  • One cell aggregate having a diameter of 2 mm or more was prepared at a double concentration by replacing the glucose of the modified MSO solid medium (the modified MSO medium changed to 450 mOsmol / kg H 2 O described above with 20 g / L sucrose).
  • the obtained liquid medium and a 1.6% gellite solution were mixed in equal amounts and solidified) and placed in a dark place at 25 ° C. for 1 week.
  • RMS1 medium Rost al. (1999)

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Abstract

本発明は、植物受精卵細胞の培養方法に関する。本発明はまた、植物受精卵細胞からの植物再生方法に関する。　本発明の培養方法及び植物再生方法は、植物受精卵細胞を固形培地で培養することを含む。

Description

植物受精卵細胞の培養方法、および当該方法で作成された再生植物体
　本発明は、植物受精卵細胞を培養する方法に関する。本発明は、さらに植物受精卵細胞から再生植物体を作成する方法に関する。
　トウモロコシ（Ｌｅｄｕｃ，１９９６）、イネ（Ｚｈａｎｇ，１９９９）、コムギ（Ｋｕｍｌｅｈｎ，１９９８）、オオムギ（Ｈｏｌｍ，１９９４，２０００）、タバコ（Ｙｕｃｈｉ，２００４）などの種においては、受精後の胚嚢から受精卵を単離・培養し、植物体を再生した例が報告されている。受精卵は本来、植物体へと成長する能力を保有した細胞であり、それゆえ、種、品種間差によって生じる培養効率の影響を受けないことが期待される。
　植物の受精卵細胞を再生させる方法に関連する技術としては、以下のようなものが知られている。
　１）植物受精卵細胞の獲得
　植物から受精卵を獲得する方法には、自然に、または人工的に交配を行った植物体から受精卵を単離する方法や、卵細胞と精細胞を融合させて受精卵を得る方法などが行われている。前者の方法においては、コムギの子房から受精卵を単離する際、穂を２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）を含む溶液で処理することによって子房の肥大を促進し、受精卵の単離を容易にする工夫が試みられている（Ｋｏｖａｃｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４））。また、後者の方法においては、電気的融合（Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）、Ｕｃｈｉｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，（２００７））、カルシウムイオンによる融合（Ｆａｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４））、ポリエチレングリコール融合（Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９５）、Ｔｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７））の３種の方法が報告されている。
　２）細胞塊形成工程
　獲得した植物受精卵細胞を生存、分裂させ、細胞塊に増殖させる工程である。
　この工程では、溶液や培地、ナースセルなどの選択が、植物受精卵細胞の生存、分裂、細胞塊形成に重要な影響を与える。
　植物の受精卵細胞を培養する溶液や培地を選択するにあたり最も重要なことは、使用する溶液や培地の浸透圧を適切にすることであると言われている。適した浸透圧は植物種によって異なるため、種々の糖類を用いて浸透圧が調整されている。また、培地の植物ホルモンについても検討されている。例えば、オオムギ受精卵の植物体再生効率を、２，４－Ｄを含む液体培地と含まない培地で比較したところ、２，４－Ｄを含む液体培地で培養する方が、再生効率が高いことが示されている（Ｈｏｌｍ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４））。さらに、トウモロコシでは、２，４－Ｄに加えてＢＡＰを液体培地に添加することも行われている（Ｌｅｄｕｃ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６））。
　植物の受精卵細胞の培養には、受精卵の生存や分裂に必要な栄養の供給源が必要である。例えば、単離した受精卵を胚珠に戻す方法や、ナースセルを使用する方法が挙げられる。Ｋｕｍｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）は、単離したコムギ受精卵細胞を胚珠に戻す方法を使って、植物体の再生を行っている。ナースセルを使用する方法では、小胞子培養物を用いた方法（Ｋｕｍｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９８），Ｈｏｌｍ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４），Ｌｅｄｕｃ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６），Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９））、懸濁培養細胞を使った方法（Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３））、葯培養物を使った方法（Ｌｅｄｕｃ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６））が報告されている。
　３）再生工程
　細胞塊から植物体を再生させる工程である。この工程で使用されている培地は、無機塩や糖類などは植物種によって異なるが、トウモロコシ（Ｌｅｄｕｃ，　１９９６）、イネ（Ｚｈａｎｇ，　１９９９）、コムギ（Ｋｕｍｌｅｈｎ，　１９９８）、オオムギ（Ｈｏｌｍ，　１９９４，　２０００）に共通している点は、いずれも植物成長調節物質を含まないということである。
　以上のように、植物受精卵細胞の培養方法、および再生植物体の作成方法は、さまざまな改良が行われてきた。しかしながら、受精卵細胞は、葉、培養細胞、カルスなどと異なり、作出や単離に手間がかかる、受精直前の卵細胞や精細胞は電気処理やカルシウム溶液添加など融合処理をしなければ分化を開始しない、などの問題がある。これまでに植物体の再生に成功している品種は限定的であり、安定して再生植物体を得るには材料植物の状態から培地やナースセルの条件なども最適化し、それを厳格に再現できなければ、再生植物体を得ることは困難である。また、ゲノム編集や遺伝子組換えなどのための植物材料として植物受精卵細胞を扱う場合には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を受精卵に導入する必要があり、単に植物受精卵細胞を培養するよりも、植物受精卵細胞の生存、分裂、再生の難易度が高くなる。そのため、より強固な培養方法、再生植物体作出方法が求められており、より多角的な改良を行う必要がある。
特開２０１６－６３７８５ 国際公開ＷＯ２０１７／１７１０９２ 国際公開ＷＯ２０１８／１４３４８０
Ｌｅｄｕｃ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１７７：１９０－２０３ Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９），Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９：１２８－１３２ Ｋｕｍｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９８），Ｐｌａｎｔａ　２０５：３２７－３３３ Ｈｏｌｍ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４），Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　６：５３１－５４３ Ｈｏｌｍ　ｅｔ　ａｌ．，（２０００），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　９：２１－３２ Ｙｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，（２００４），Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　４９：８１０－８１４． Ｋｏｖａｃｓ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４），Ｓｅｘ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｐｒｏｄ　７：３１１－３１２ Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３），Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　５：７３９－７４６ Ｕｃｈｉｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，（２００７），Ｐｌａｎｔａ　２２６：５８１－５８９ Ｆａｕｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９４），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：１５９８－１６００ Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９５），Ａｃｔａ　Ｂｏｔ　Ｓｉｎ　３６：４８９－４９３ Ｔｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７），Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　１６：６５７－６６１ Ｋｕｍｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７），Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１２（６）１４７３－１４７９ Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ　１１１，２５９－２６７ Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１５），Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．１２２３，１８９－９８
　本発明は、植物受精卵細胞を培養する方法、本発明の方法によって再生した植物体を提供することを目的とする。
　限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
　［態様１］
　植物受精卵細胞を固形培地で培養することを含む、植物受精卵細胞の培養方法。
　［態様２］
　植物受精卵細胞からの植物再生方法であって、
　植物受精卵細胞を培養する工程の一部において、植物受精卵細胞を固形培地において培養することを含む、前記方法。
　［態様３］
　植物受精卵細胞が細胞塊になった後に固形培地において培養することを含む、態様２に記載の植物再生方法。
　［態様４］
　植物受精卵細胞からの植物再生方法であって、
　（１）植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得し、ここにおいて、当該工程の一部において、植物受精卵細胞を固形培地において培養する；
　（２）前記培養細胞塊を再生する、
ことを含む、前記方法。
　［態様５］
　植物受精卵細胞からの植物再生方法であって、
　（１）（ｉ）植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得し；
　（１）（ｉｉ）該培養細胞塊を、固体培地において培養し；
　（２）前記培養細胞塊を再生する、
ことを含む、前記方法。
　［態様６］
　さらに、（０）植物受精卵細胞を取得する、ことを含む、態様４または５に記載の方法。
　［態様７］
　直径が０．３ｍｍ以上の細胞塊の状態の植物受精卵細胞を固体培地において培養する、ことを含む、態様１－６のいずれか１項に記載の方法。
　［態様８］
　直径が１ｍｍ以上の細胞塊の状態の植物受精卵細胞を固体培地において培養する、ことを含む、態様１－６のいずれか１項に記載の方法。
　［態様９］
　植物が、単子葉植物である、態様１－８のいずれか１項に記載の方法。
　［態様１０］
　植物が、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム及びライムギからなる群から選択される、態様１－９のいずれか１項に記載の方法。
　［態様１１］
　固形培地が、植物成長調整物質を含む、態様１－１０のいずれか１項に記載の方法。
　［態様１２］
　植物成長調整物質が、オーキシン類である、態様１１に記載の方法。
　［態様１３］
　オーキシン類が、２，４－Ｄ、ピクローラム、ダイカンバからなる群より選択される植物ホルモンである、態様１２に記載の方法。
　［態様１４］
　植物成長調整物質の固体培地中の濃度が、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下である、態様１２または１３に記載の方法。
　［態様１５］
　植物成長調整物質の固体培地中の濃度が、０．０１ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下である、態様１２または１３に記載の方法。
　［態様１６］
　植物受精卵細胞が、卵細胞を、植物の卵細胞を含む組織から単離した後に、精細胞を融合させることによって得られるものである、態様１－１５のいずれか１項に記載の方法。
　［態様１７］
　植物受精卵細胞が、物質が導入された植物受精卵細胞である、態様１－１５のいずれか１項に記載の方法。
　本発明により、植物受精卵細胞を培養することによって得た細胞塊から、安定して効率よく再生植物体を得ることが可能になった。
　植物受精卵細胞は、植物体内で胚へ発生する。通常、受精卵細胞や胚は、その外部を胚乳や母体組織などの固形状の環境で覆われている。一方、植物体から単離された受精卵細胞やそこから肥大した細胞塊は、多くの場合、液体状の培地で培養されており、植物体内での環境下とは大きく異なるため、受精卵細胞が植物体再生に至らないことが問題であった。本発明者らは鋭意検討の結果、従来の植物受精卵を培養・植物体再生方法に加えて、植物体再生前に植物体内に近い環境に細胞塊を置くことによって、細胞塊から安定して効率よく再生植物体を得る方法を見出した。
図１は、再分化用培地改変ＬＳＤ培地で植物体を再生させる前に改変Ｎ６Ｚ固形培地に置床した場合（試験区、左）と、改変Ｎ６Ｚ固形培地に置床する替わりに改変Ｎ６Ｚ液体培地で同日数培養した場合（対照区、右）の、細胞塊が植物体に再生するのに要した日数（日）を示した図である。
　１．植物受精卵細胞の培養方法
　本発明は、植物受精卵細胞の培養方法に関する。
　本発明の培養方法は、植物受精卵細胞を固形培地で培養することを含む。
　植物
　植物の種類は特に限定されるものではない。双子葉植物および単子葉植物のいずれでもよく、好ましくは単子葉植物である。さらに好ましくは、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライムギ、サトウキビ等であり、最も好ましくは、トウモロコシ、コムギ、イネである。双子葉植物にはタバコ、大豆、ジャガイモ、ヒマワリ、その他が含まれるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、大豆、タバコである。　植物受精卵細胞の培養方法は、限定されるわけではないが、特に、「難培養」とされる植物あるいは品種に用いることが可能である。「難培養」とは、培養が困難、具体的には、例えば、植物体から単離された細胞や組織等の培養が困難、脱分化等の処理によるカルスの形成や、カルスからの植物体への再分化が困難である、ことを意味する。
　一般的に双子葉植物よりも単子葉植物の方が培養困難だが、「難培養」の植物は、例えば、大豆、インゲンマメ、トウガラシ等を含む。「難培養品種」とは、同じ種の一般的な研究用品種（コムギならＦｉｅｌｄｅｒなど、トウモロコシならＡ１８８など）と比べ、培養が困難である品種を意味する、例えば、コムギのエリート品種（例えばＡＣ　ＢａｒｒｉｅやＴＡＭなど）、トウモロコシのＢ７３およびＢ７３を由来に持つトウモロコシエリート品種、オオムギのＧｏｌｄｅｎＰｒｏｍｉｓｅとＩｇｒｉ以外の品種、ソルガムの２９６Ｂ、Ｃ４０１、ＳＡ２８１、Ｐ８９８０１２、Ｐｉｏｎｅｅｒ　８５０５、Ｔｘ４３０以外の品種などが挙げられる。
　受精卵細胞
　本明細書において、「受精卵細胞」とは、精細胞と卵細胞とが融合した細胞を意味する。
　「植物受精卵細胞」とは、植物の胚嚢を含む組織から単離される受精した卵細胞である、即ち、植物体の段階で受粉・受精させ、該植物体から単離した受精卵細胞、であってもよい。あるいは、受粉・受精前の植物体から卵細胞および精細胞を単離したのち、それらを融合させて受精卵細胞を作出および取得してもよい。なお、電気的な融合により受精卵を作成および取得してもよい。また、異種の植物同士の卵細胞と精細胞の融合により得られた受精卵細胞、であってもよい。
　本明細書において「卵細胞」とは、雌ずいの中において、胚嚢母細胞の減数分裂により形成される雌性配偶子を意味する。卵細胞の単離方法は限定されないが、例えば、適切な浸透圧の溶液中において子房を切断し、その切断面から出てきた卵細胞を顕微鏡下においてガラスキャピラリーを用いて単離することができる。
　本明細書において「精細胞」とは、雄ずいの葯の中において、花粉母細胞の減数分裂により形成される雄性配偶子を意味する。精細胞の単離方法は限定されないが、例えば、適切な浸透圧の溶液に葯から採取した花粉を浸すと、数分後には、花粉から精細胞を含む花粉内容物が溶液中に放出されるので、顕微鏡下においてガラスキャピラリーを用いて精細胞を単離することができる。
　受精卵細胞の取得方法
　植物受精卵細胞の培養方法において、植物受精卵細胞は、自然受精法により植物体内で作出し、作成された受精卵細胞を植物体から取得してもよい。自然受精法を用いた受精卵細胞の取得方法は、例えば、柱頭を露出させ、花粉を付着させ受粉させたのち、胚嚢を含む組織から受精卵を単離する方法である。植物体からの受精卵細胞の単離は、受粉後の植物体から受精直後の子房を取り出し、適切な浸透圧の溶液中においてその子房を切断し、その切断面から出て来た受精卵を顕微鏡下においてガラスキャピラリー等を用いて単離することができる。あるいは、酵素溶液で子房又は胚珠を一定時間処理した後に、例えば、ガラス針等を用いて顕微鏡下において珠心等の組織を解剖し摘出、単離することもできる。
　植物の卵細胞と精細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで融合して受精卵を作出してもよい。即ち、植物体より先ず卵細胞と精細胞を単離し、電気融合法等の公知の方法により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで受精卵細胞を作出することが可能である（配偶子融合ともいう）。電気融合法は、電気刺激により２種又は２種以上の細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで融合する方法である。具体的には、適切な浸透圧の溶液中において単離した卵細胞及び精細胞に、電気パルスを加えることで細胞融合を引き起こす。
　電気融合により細胞融合を行う場合、電圧、電極間距離等の条件は、植物の種類又は細胞の大きさ等に応じて当業者が適宜決めることができる。例えば、特開２０１６－６３７８５（特許文献１）や国際公開ＷＯ２０１７／１７１０９２（特許文献２）に記載の条件を適用することができる。
　あるいは、卵細胞と精細胞の細胞融合には、カルシウム融合法、ＰＥＧ融合法等の他の公知の細胞融合方法を用いてもよい。「カルシウム融合法」は、カルシウム濃度依存的に細胞膜の融合が生じやすくなる、という細胞膜の性質を利用するものである。「ＰＥＧ融合法」は、細胞をポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）で処理することによって細胞膜が結合し、ＰＥＧを取り除くと細胞が融合することを利用するものである。
　一態様において、植物受精卵細胞は、卵細胞を、植物の卵細胞を含む組織から単離した後に、精細胞を融合させることによって得られるものである。
　一態様において、植物受精卵細胞は、物質が導入された植物受精卵細胞である。
　固体培地
　本発明の培養方法は、植物受精卵細胞を固形培地で培養することを含む。
　非限定的に、植物受精卵細胞を固形培地で培養は、植物受精卵細胞から植物を再分化する工程において行う。一態様において、植物受精卵細胞を固形培地で培養することは、再分化培地における培養工程の前に行う。一態様において、植物受精卵細胞を固形培地で培養は、植物受精卵細胞から形成された細胞塊を、再分化培地における培養工程の前に培養すること、を含む。本明細書において、「植物受精卵細胞」は、受精卵が細胞塊まで培養された状態を含む意味で使用する場合がある。
　以下、非限定的に、本発明の培養方法を説明する。
　培地：植物細胞を通常培養するために通常使用されるものでもよく、例えばＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｎ６培地、Ｂ５培地、Ｒ２培地、ＣＣ培地を基本とする培地等が挙げられる。これらの培地は、基本の濃度から高濃度にされたものでも、希釈されたものであってもよい。好ましくは、１／１０倍から２倍量、より好ましくは、１／５倍から１倍量である。なお、本工程における培地は、細胞塊の取得工程に使用した培地と同組成であってもよい。
　固体培地は、液体培地を例えば、寒天等の固化剤により固めたものである。培地固化は、当該技術分野において公知の固化剤を添加することにより行うことができ、そのような固化剤としては、例えばアガロース、寒天やゲランガム、ゲルライト、ファイタゲル等である。固化剤の濃度は固化剤の種類によって異なるが、例えば、ゲルライトの場合、０．３－４．０ｇ／Ｌが好ましく、０．５－３．０ｇ／Ｌがより好ましい。
　本工程における固形培地は、半固形培地であってもよい。「半固体」とは、液体と固体の両方の属性を持つ物質で、液体より固体に近い半流動体として定義され、粘性があり自由に変形することを特徴とする、いわゆるゲル状のものをいう。「半固体培地」は、例えば、液体培地に添加する固化剤の濃度を、完全な固体培地が生成される濃度より低い濃度で加えることにより作成できる。固化剤の濃度を、固体培地が生成される濃度より低い濃度、例えば、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下％の濃度で加えることにより作成できる。一態様において、固化剤の濃度を、固体培地が生成される濃度、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上濃度で加えることにより作成してもよい。当業者は、「固体培地（含む、半固体培地）」と「液体培地」を明確に判別可能である。
　一態様において、固体培地は、植物成長調整物質を含んでもよい。一態様において、植物成長調整物質は、オーキシン類である。具体的には、例えば、オーキシン類として特にインドール－３－酢酸、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、ピクローラム、ダイカンバ、ナフタレン酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸または他のオーキシン類を添加することができる。一態様において、オーキシン類は、２，４－Ｄ、ピクローラム、ダイカンバからなる群より選択される植物ホルモンである。あるいは、カイネチンや４ＰＵのようなサイトカイニンなど、他の植物成長調節物質を添加することもできる。これらの植物成長調節物質は、単独でも複数を異なる濃度で混合させてもよい。
　固体培地に添加する植物成長調整物質の濃度は、その植物に合わせて当業者が適宜設定することができる。非限定的に、例えば、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０．０ｍｇ／Ｌ以下、あるいは、０．０１ｍｇ／Ｌ以上１０．０ｍｇ／Ｌ以下、が挙げられる。非限定的に、０．１ｍｇ／Ｌ以上５．０ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、０．１５ｍｇ／Ｌ以上２．０ｍｇ／Ｌ以下がより好ましい。非限定的に、０．０１５ｍｇ／Ｌ以上５．０ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、０．０２ｍｇ／Ｌ以上２．０ｍｇ／Ｌ以下がより好ましい。　
　培養：固化した培地に、植物受精卵細胞、より好ましくは、植物受精卵細胞から得られた細胞塊を置床し、適切な温度、明暗条件および期間で生育させる。培養温度は、適宜選択可能であり、好ましくは１８℃－３５℃、さらに好ましくは２０－２８℃、最も好ましくは２３－２６℃で行われる。また、この工程の培養は好ましくは暗所、もしくは薄暗い所で行われるが、これに限定されない。培養期間もまた適宜選択可能であり、好ましくは１日から３５日、１日から３０日、より好ましくは、２日から２８日、２日から１４日である。一態様において、植物受精卵細胞が再分化工程に供するのに適した状態になるまで固体培地で培養する。
　一態様において、植物受精卵細胞を固形培地で培養は、先ず、植物受精卵細胞を液体培地で培養してから行うことが望ましい。一態様において、先ず、植物受精卵細胞を液体培地で培養し培養細胞塊を取得してから、培養細胞塊を固体培地で培養する。「細胞塊」、「培養細胞塊」については、「２．植物再生方法」の項目において詳述する。
　２．植物再生方法
　本発明は、植物受精卵細胞からの植物再生方法に関する。
　一態様において、植物受精卵細胞からの植物再生方法は、
　植物受精卵細胞を培養する工程の一部において、植物受精卵細胞を固形培地において培養することを含む。
　一態様において、植物受精卵細胞からの植物再生方法は、植物受精卵細胞が細胞塊になった後に固形培地において培養することを含む。
　一態様において、植物受精卵細胞からの植物再生方法は、
　（１）植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得し、ここにおいて、当該工程の一部において、植物受精卵細胞を固形培地において培養する；
　（２）前記培養細胞塊を再生する、
ことを含む。
　一態様において、植物受精卵細胞からの植物再生方法は、
　（１）（ｉ）植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得し；
　（１）（ｉｉ）該培養細胞塊を、固体培地において培養し；
　（２）前記培養細胞塊を再生する、
ことを含む。
　植物受精卵細胞からの植物再生方法は、植物受精卵細胞を培養する工程の前に、さらに、（０）植物受精卵細胞を取得する、工程を含んでもよい。
　「植物」、「植物受精卵細胞」、「固形培地」の意義は、「１．植物受精卵細胞の培養方法」に記載した通りである。
　「植物受精卵細胞を培養する工程の一部」とは、植物再生方法における、植物体再生工程の前の、植物受精卵細胞を培養する工程における、一部分を意味する。一態様において、「植物受精卵細胞を培養する工程の一部」は、植物受精卵細胞を培養して、培養細胞塊を取得した後を意味する。
　培養細胞塊の取得
　植物受精卵細胞からの植物再生方法は、一態様において、植物受精卵細胞から、培養細胞塊を取得する工程を含む。植物受精卵細胞から培養細胞塊を形成する工程は、公知の方法を利用することが可能である。
　細胞塊とは、無数に分裂を繰り返した植物受精卵の塊を示す。本明細書において、「植物受精卵細胞」は、受精卵が細胞塊まで培養された培養細胞塊を含む意味で使用する場合がある。本発明において「細胞塊」は、胚様体、球状様胚、カルスなどであってもよい。受精卵細胞を分裂誘導し細胞増殖させ、胚様体、球状様胚、カルスなどを形成させる工程は、植物によって最適条件が異なるため特に限定されないが、フィーダー細胞や植物外植片を加えた、ナースカルチャー法が好ましい。例えば、次のように行うことができる。
　培養：植物受精卵細胞から細胞塊を取得するまでの「培養」とは、液体培地に受精卵細胞を移し、培養することをいう。非限定的に、培養の温度は、好ましくは、２３～２８℃、２４～２８℃、２４～２７℃、又は２５℃～２７℃である。
　培養は暗下で行うことが好ましい。この時、培地にはフィーダー細胞を加え共培養（ナースカルチャー法）を行うことが好ましい。共培養期間は、液体培地での培養終了まででもよく、途中でフィーダー細胞を取り除いてもよい。また、培養中は、穏やかに振とうさせてもよい。振とう速度は、３０～５０ｒｐｍが好ましく、３５～４５ｒｐｍがより好ましい。
　培地：植物の受精卵細胞を培養するために通常使用される公知の培地であればよく、例えば液体のＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地およびそれらの改変培地等を使用することができる。
　培地には植物ホルモン、特にインドール－３－酢酸、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、ピクローラム、ダイカンバ、ナフタレン酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸等のオーキシン類が添加されることが好ましい。添加濃度は、その植物に合わせて当業者が適宜設定することができる。非限定的に、例えば、０．１～１０．０ｍｇ／Ｌが挙げられるが、０．１～５．０ｍｇ／Ｌが好ましく、０．１５～２．００ｍｇ／Ｌがより好ましい。非限定的に、例えば、０．０１～１０．０ｍｇ／Ｌが挙げられるが、０．１５～５．０ｍｇ／Ｌが好ましく、０．０２～２．００ｍｇ／Ｌがより好ましい。
　フィーダー細胞：公知のフィーダー細胞や植物外植片を用いることが可能である。例えば、フィーダー細胞としては、イネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ　Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）や、トウモロコシのナース細胞（Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．１９９３）、小胞子培養物（Ｂａｋｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，２００３）などが挙げられる。植物外植片としては、子房（Ｋｕｍｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８））などが挙げられる。
　植物受精卵細胞から細胞塊を取得するまでの「培養」工程の途中で、液体培地を新しく交換する工程を含めてもよい。
　固形培地における培養を始める細胞塊としては、再分化能を有する状態にまで培養させたものが好ましい。当該状態の細胞塊にまで培養するために必要な培養条件、時間等は植物の種類や品種によって異なるため、当業者が適宜設定することができる。例えば、培養開からおおよそ２１－４８日後、直径１．０～３．０ｍｍ程度の細胞塊が形成される。
　例えば、コムギを用いた場合において、受精卵の取得から７日、好ましくは１４日、さらに好ましくは２０日間、液体培養を行い得られた細胞塊を用いることが好ましい。また、例えば、該細胞塊が直径０．３ｍｍ以上、好ましくは０．５ｍｍ以上、さらに好ましくは１ｍｍ以上、最も好ましくは２ｍｍ以上の大きさになったときに、固形培地に移し、培養を開始することができる。本発明の一態様において、直径が０．３ｍｍ以上の細胞塊の状態の植物受精卵細胞を固体培地において培養する、ことを含む。本発明の一態様において、直径が１ｍｍ以上の細胞塊の状態の植物受精卵細胞を固体培地において培養する、ことを含む。本明細書において、「細胞塊の直径」は、細胞塊の最も長い箇所の長さを意味する。例えば、回転楕円形のような形状を有する細胞塊において、「細胞塊の直径」とは、回転楕円形の最も長い軸方向の長さを意味する。
　固形培地での細胞塊の培養
　植物受精卵細胞からの植物再生方法の一態様において、植物受精卵細胞を培養する工程の一部において、植物受精卵細胞を固形培地において培養する。植物受精卵細胞を培養する工程の一部」とは、植物再生方法における、植物体再生工程の前の、植物受精卵細胞を培養する工程における、一部分を意味する。一態様において、「植物受精卵細胞を培養する工程の一部」は、植物受精卵細胞を培養して、培養細胞塊を取得した後を意味する。
　植物受精卵細胞からの植物再生方法の一態様において、植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得し、ここにおいて、当該工程の一部において、植物受精卵細胞を固形培地において培養する。「植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得する工程の一部」とは、植物再生方法における、植物体再生工程の前の、植物受精卵細胞を培養する工程における、一部分を意味する。一態様において、植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得する工程の一部」とは、植物受精卵細胞を培養して、培養細胞塊を取得した後を意味する。
　植物受精卵細胞からの植物再生方法の一態様において、（ｉ）植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得し、（ｉｉ）該培養細胞塊を、固体培地において培養する、ことを含む。
　「固体培地」、「固体培地における培養」の意義は、「１．植物受精卵細胞の培養方法」に記載した通りである。
　再分化と再生植物体の取得
　植物受精卵細胞からの植物再生方法は、一態様において、培養細胞塊を再生する、ことを含む。再分化工程は、公知の再分化工程に従い実施することができる。例えば、一例として、以下のように行うことが可能である。
　培養：培養細胞塊を、任意の培地、例えばＭＳ培地からなる固形または液体再分化培地に移し、培養する。この際、培養は光を照射して行うことが好ましく、非限定的に、光は、例えば、５０～１８０μｍｏｌ／ｍ２・秒が好ましく、７０～１５０μｍｏｌ／ｍ２・秒がより好ましい。非限定的に、光は、例えば、２０～１８０μｍｏｌ／ｍ２・秒が好ましく、５０～１５０μｍｏｌ／ｍ２・秒がより好ましい。
　再分化培地：例えばＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地であり、アガロース、寒天やゲランガム、ゲルライト等固化材を使用した固体培地を含まない液体培地であってもよい。該再分化培地には、オーキシン、サイトカイニンを含む植物成長調節物質を添加してもよい。
　この工程によって根、シュートなどが再分化した個体を、土が入ったポットなどに移植して生育させることで、再生した植物個体を得ることができる。
　３．再生植物
　本発明は、さらに、本発明の植物受精卵細胞からの植物再生方法によって再生された植物（再生植物体）に関する。
　再生された植物とは、受精卵細胞の培養、再分化により再生された植物、該植物から得られた細胞、組織等や、本発明の方法により得られた再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の自殖種子である「Ｔ１世代」などの後代植物、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物を含む。
　本発明以前は、特に「難培養」とされる植物や品種について、効率よく培養することができず、再生された植物を得ることは困難或いは不可能であった。本発明により、このような植物、品種についても簡便な方法で効率よく培養、再生植物体を得ることが可能になった。
　４．植物への物質の導入
　植物、特に単子葉植物の遺伝子組換え技術は、１９９０年代にアグロバクテリウムを利用した方法がイネ、トウモロコシで開発されたことを契機に急速に利用が普及した。現在までに様々な形質転換方法が開発されてきている。しかしながら、それらの多くは、植物組織の脱分化と再分化を経由することが必要であるが故に、種や品種間で形質転換の効率が大きく異なることが知られている。種や品種によっては形質転換の効率が低く、再現性をもって形質転換植物を得ることができない。例えば、トウモロコシにおいて育種上非常に重要な系統であるＢ７３では、再現性を持った形質転換法はいまだ開発されていない。
　また、近年効率的にゲノム編集を行うことが可能になりつつあるが、これも作物種、品種ごとに組織培養の容易性が異なる点が、ゲノム編集効率に大きな影響を与えるため、実用化の妨げとなっている。
　本発明の、植物受精卵細胞の培養方法、植物再生方法により、植物受精卵細胞を培養することによって得た細胞塊から、安定して効率よく再生植物体を得ることが可能になった。本発明の培養方法、再生方法の工程における、受精卵細胞、卵細胞、精細胞、分裂を開始した受精卵細胞、細胞塊のいずれかに物質を導入することにより、物質が導入された再生植物を安定して効率よく取得することができる。一態様において、受精卵細胞に形質転換物質を導入する。
　一態様において、本発明の培養方法、植物再生方法における、植物受精卵細胞は、物質が導入された植物受精卵細胞である。
　導入する物質は、非限定的に、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される。核酸は特に限定されず、ＲＮＡ、ＤＮＡ、両者の結合体、混合物であってもよい。好ましくはベクターのような環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＲＮＡ又は直鎖ＲＮＡである。使用される形質転換方法に応じた任意の長さのものを使用可能である。例えば、ＰＥＧ法を用いる場合、核酸の長さは、好ましくは１００ｋｂ以下、より好ましくは、５０ｋｂ以下である。さらに好ましくは３０ｋｂ以下、特に好ましくは２０ｋｂ以下、もっとも好ましくは１０ｋｂ以下である。
　ゲノム編集のためのＣａｓ９ヌクレアーゼ等ヌクレアーゼや、修飾酵素、抗体等のタンパク質も導入しうる。タンパク質の大きさは、非限定的に、好ましくは分子量３００ｋＤａ以下、より好ましくは２００ｋＤａ以下、さらに好ましくは１５０ｋＤａ以下である。
　ペプチドは、決まった順番で様々なアミノ酸が、アミド結合（「ペプチド結合」ともいう）つながった分子の総称で、一般にタンパク質よりも長さが短い。好ましくは、１００ａ．ａ．以下、より好ましくは、５０ａ．ａ．以下である。
　２種類以上の核酸、タンパク質及びペプチドを導入してもよい。核酸は、２種類以上のＤＮＡ又はＲＮＡでも、ＤＮＡとＲＮＡの組み合わせでもよい。核酸とタンパク質など異なる種の物質を導入してもよい。
　物質を植物に導入する方法は、植物に所望の物質を導入することのできる公知の方法ならば特に限定されず、植物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）あるいはアグロバクテリウム法などの生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）を好ましく用いることができる。
　植物への物質の導入は、例えば、国際公開ＷＯ２０１７／１７１０９２、国際公開ＷＯ２０１８／１４３４８０に記載の方法によって行うことができる。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　実施例１：コムギ受精卵の単離
　受精卵の単離および培養は、Ｋｕｍｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）に従って行った。開花１－３日前に、コムギ品種Ｆｉｅｌｄｅｒを除雄した。４－６日後、除雄した小花の柱頭に、同品種の葯を接触させることによって人工的に交配をした。交配３－４時間後に、穂を１－２％次亜塩素酸ナトリウムで６分間に浸し、さらに滅菌蒸留水で３回洗浄することによって殺菌した。無菌的に小花を解体し、４ｍＬの０．５５Ｍ　マンニトール溶液が入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの上に子房を採取した。子房を沈めながら、プラスチックシャーレの底でメスを使って、子房の下部を切断した。子房から胚珠切片を取り出し、２本のガラス針のうち一方で胚珠切片を固定し、もう一方で受精卵が存在すると推測される領域の組織を軽く押すことにより受精卵を取り出した。領域の推定は、受精が行われると、２個存在する助細胞のうち花粉管が侵入した方が変性し、暗褐変化するのでそれを目印とした。
　実施例２：コムギ受精卵の植物体再生効率における固形培地の効果
　受精卵の培養は、Ｋｕｍｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ．（２０１６）を参照して行った。３．５ｍＬプラスチックシャーレの中に直径１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＣＭインサート（ミリポア社製）を入れ、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＣＭインサートの内側に２，４－Ｄ濃度を０．０２ｍｇ／Ｌに変更した改変Ｎ６Ｚ液体培地（Ｋｕｍｌｅｈｎ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６）を０．２ｍＬ、外側に上述の改変Ｎ６Ｚ培地を２ｍＬとＦｉｅｄｅｒ細胞を添加した。実施例１の通り単離した受精卵を、ミクロキャピラリーを用いてＭｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＣＭインサートのメンブレン上に移した。受精卵は、２５℃の暗所で２週間培養し、上述の改変Ｎ６Ｚ液体培地を交換後、さらに２週間培養した。
　直径２ｍｍ以上になった細胞塊を、上述の改変Ｎ６Ｚ固形培地（２倍濃度の上述の改変Ｎ６Ｚ液体培地と１．６％ゲルライト溶液を等量混合して固めた培地）に置床し、２５℃の暗所で２－４日間培養した。次に、細胞塊を、Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１５）の再生用培地ＬＳＤ培地の組成を変更した改変ＬＳＤ培地（カルベニシリンとセフォタキシムを除き、８ｇ／Ｌ　アガーを３ｇ／Ｌ　ゲルライトに変更）に置床し、２５℃の明所で培養した。シュートが分化した細胞塊をＩｓｈｉｄａ（２０１５）の苗化用培地ＬＳＦ培地の組成を変更した改変ＬＳＦ培地（ＩＢＡを０．５　ｍｇ／Ｌに変更）し置床し、２５℃の明所で培養した。
　改変ＬＳＤ培地で植物体を再生させる前に細胞塊を改変Ｎ６Ｚ固形培地に置床した場合（試験区）と、改変Ｎ６Ｚ固形培地に置床する替わりに細胞塊を改変Ｎ６Ｚ液体培地で同日数培養した場合（対照区）で比較した。その結果、対照区の植物体再生効率は７２％であったのに対し、試験区は１００％であった。これによって、受精卵から得られた細胞塊は、植物体再生させる前に固形培地で培養することによって、再生効率が高まることが示された。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例３：コムギ受精卵の植物体再生速度における固形培地の効果
　実施例２と同様にコムギ品種Ｆｉｅｌｄｅｒから受精卵細胞を単離し、植物体の再生を行った。
　細胞塊が植物体に再生する期間を、再分化用培地改変ＬＳＤ培地で植物体を再生させる前に改変Ｎ６Ｚ固形培地に置床した場合（試験区）と、改変Ｎ６Ｚ固形培地に置床する替わりに改変Ｎ６Ｚ液体培地で同日数培養した場合（対照区）で比較した。試験区、対照区それぞれにつき、植物体が再生した細胞塊７個の植物体再生に要した日数（具体的には再生用改変ＬＳＤ培地に置床してから土に移植ができるまでの日数）を比較したところ、試験区の方が対照区より平均４．７日早く植物体が再生した。これにより、再生工程前に細胞塊を固形培地に置床する工程を経た細胞塊の方が、この工程を含めない細胞塊よりも、早く植物体の再生が促されることがわかった。結果を表２及び図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　参考例１：コムギ品種農林６１号の未熟胚培養および植物体の再生
　植物受精卵細胞の培養に供試したコムギ品種Ｆｉｅｌｄｅｒと農林６１号の培養特性を確認するため、Ｉｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．（２０１５）の方法を参考にして、それぞれの品種の未熟胚を培養し、再生植物体を得た。
　開花１４日後の穂から無菌的に未熟胚を単離し、ＷＬＳ－ｌｉｑ培地に採取した。未熟胚を１５，０００ｒｐｍ（２０，０００×ｇ）で１０分間遠心した後、改変ＷＬＳ培地－１（２．２ｍｇ／Ｌ　ピクローラムを２．５ｍｇ／Ｌ　ダイカンバに置換、カルベニシリンを除去）に置床し、２５℃、暗黒下で２日間培養した。次に、胚軸を除去後、改変ＷＬＳ培地－１に置床し、さらに５日間培養した。肥大した未熟胚を、改変培地ＷＬＳ培地―２（カルベニシリンを除去）に置床し、２５℃、暗黒下で２週間培養した。各未熟胚を２分割後、改変培地ＷＬＳ培地―２に再度置床し、さらに２週間培養した。増殖したカルスを、カルベニシリンとセフォタキシムを除いた改変ＬＳＺ培地で、２５℃、明所にて２週間培養した。最後に、再生した植物体を、カルベニシリンを除いた改変ＬＳＦ培地で、２５℃、明所にて２週間培養した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示された通り、再生した植物体を得られた未熟胚は、Ｆｉｅｌｄｅｒは３０個中２９個であったのに対し、農林６１号は４８個中２個からのみであった。このことから、Ｆｉｅｌｄｅｒは比較的培養しやすい性質があり、一方農林６１号は培養が困難な品種であると言える。
　実施例４：コムギ難培養品種受精卵の植物体再生効率における固形培地の効果
　実施例２と同様にコムギ品種農林６１号から受精卵細胞を単離し、植物体の再生を行い、植物体再生前に細胞塊を固形培地上で培養した場合（試験区）と、固形培地に置床する替わりに液体培地で同日数培養した場合（対照区）で、植物体再生効率を比較した。
　その結果、対照区の植物体再生効率は７１％であったのに対し、試験区は１００％であった。これによって、培養が困難なコムギ品種の受精卵細胞の培養においても、受精卵から得られた細胞塊は、植物体再生させる前に固形培地で培養することによって、再生効率が高まることが示された。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例５：トウモロコシ受精卵の植物体再生率における固形培地の効果
　トウモロコシ（品種：Ａ１８８）の交配適期の雌穂のシルクを長さ１０ｃｍのところで切断し、その先端に、同品種の雄穂から採取した花粉を受粉させ、２５℃、日長１２時間の培養室にて培養した。交配後１６時間経過した雌穂の胚珠から、胚嚢を含む珠心切片を摘出し、３．５ｃｍプラスチックシャーレ中の１ｍＬの６５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ　マンニトール溶液に入れた。さらに、酵素混合液（１％　セルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）、０．３％　マセロザイム（ヤクルト本社製）、０．０５％　ペクトリアーゼ（盛進製薬製を０．７％マンニトール溶液中に溶解））０．５ｍＬを添加し、室温にて１０分消化した。その後、このうち０．７５μＬを除去し、６５０　ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ　マンニトール溶液　０．７５μＬを添加し、良く混和後、さらに室温にて２０分消化した。２本のガラス針のうち一方で胚珠切片を固定し、もう一方で受精卵が存在すると推測される領域の組織を軽く押すことにより受精卵を取り出した。領域の推定は、受精が行われると、２個存在する助細胞のうち花粉管が侵入した方が変性し、暗褐変化するのでそれを目印とした。
　３．５ｍＬプラスチックシャーレの中に直径１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＣＭインサート（ミリポア社製）を入れ、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＣＭインサートの内側に、２，４－Ｄ濃度を０．２ｍｇ／Ｌ、浸透圧を６５０　ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ、ｐＨを５．７に変更した改変ＭＳＯ培地（Ｋｒａｎｚ　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，（１９９３））を０．２ｍＬ、外側に上述の改変ＭＳＯ培地を２ｍＬとＯｃ培養細胞（理研バイオリソースセンター）を添加した。単離した受精卵の培養を、ミクロキャピラリーを用いてＭｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＣＭインサートのメンブレン上に移した。受精卵は、２５℃の暗所で２日培養し、上述の改変ＭＳＯ液体培地とＯｃ培養細胞を交換後、さらに１週間培養した。浸透圧を４５０　ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏに変更した改変ＭＳＯ培地とＯｃ培養細胞を交換後、さらに５週間培養した。
　直径２ｍｍ以上になった細胞塊１つを、改変ＭＳＯ固形培地（上述の４５０　ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏに変更した改変ＭＳＯ培地のグルコースを２０ｇ／Ｌ　シュークロースに置換し、２倍の濃度で調製した液体培地と１．６％ゲルライト溶液を等量混合して固めた培地）に置床し、２５℃の暗所で１週間培養した。次に、細胞塊を、再分化用培地ＲＭＳ１培地（Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９））に置床し、２５℃の明所で２週間培養したところ、細胞塊から複数のシュートが再分化した。次に、発根用培地ＲＭＳ２培地（Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９））で１週間、さらにＲＭＳ３培地（（Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．（１９９９））で２週間培養したところ、１つの細胞塊から形態が正常なシュートと根が再分化した個体が４個体獲得できた。

Claims (17)

  1. 　植物受精卵細胞を固形培地で培養することを含む、植物受精卵細胞の培養方法。
  2. 　植物受精卵細胞からの植物再生方法であって、
    　植物受精卵細胞を培養する工程の一部において、植物受精卵細胞を固形培地において培養することを含む、前記方法。
  3. 　植物受精卵細胞が細胞塊になった後に固形培地において培養することを含む、請求項２に記載の植物再生方法。
  4. 　植物受精卵細胞からの植物再生方法であって、
    　（１）植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得し、ここにおいて、当該工程の一部において、植物受精卵細胞を固形培地において培養する；
    　（２）前記培養細胞塊を再生する、
    ことを含む、前記方法。
  5. 　植物受精卵細胞からの植物再生方法であって、
    　（１）（ｉ）植物受精卵細胞を培養して培養細胞塊を取得し；
    　（１）（ｉｉ）該培養細胞塊を、固体培地において培養し；
    　（２）前記培養細胞塊を再生する、
    ことを含む、前記方法。
  6. 　さらに、（０）植物受精卵細胞を取得する、ことを含む、請求項４または５に記載の方法。
  7. 　直径が０．３ｍｍ以上の細胞塊の状態の植物受精卵細胞を固体培地において培養する、ことを含む、請求項１－６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　直径が１ｍｍ以上の細胞塊の状態の植物受精卵細胞を固体培地において培養する、ことを含む、請求項１－６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　植物が、単子葉植物である、請求項１－８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　植物が、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム及びライムギからなる群から選択される、請求項１－９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　固形培地が、植物成長調整物質を含む、請求項１－１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　植物成長調整物質が、オーキシン類である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　オーキシン類が、２，４－Ｄ、ピクローラム、ダイカンバからなる群より選択される植物ホルモンである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　植物成長調整物質の固体培地中の濃度が、０．０５ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下である、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 　植物成長調整物質の固体培地中の濃度が、０．０１ｍｇ／Ｌ以上１０ｍｇ／Ｌ以下である、請求項１２または１３に記載の方法。
  16. 　植物受精卵細胞が、卵細胞を、植物の卵細胞を含む組織から単離した後に、精細胞を融合させることによって得られるものである、請求項１－１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　植物受精卵細胞が、物質が導入された植物受精卵細胞である、請求項１－１５のいずれか１項に記載の方法。
     
     
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JP2000350526A (ja) * 1989-11-21 2000-12-19 Ajinomoto Co Inc タマネギとニンニク又はニラの雑種植物体及びそれらの育種方法、増殖方法
WO2018143480A1 (ja) * 2017-01-31 2018-08-09 日本たばこ産業株式会社 植物に物質を導入する方法

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Title
"Succeeded in observing the division of fertilized eggs of plants alive ～Revealing remarkable regenerative ability of plants", 10 July 2015 (2015-07-10), pages 1 - 8, XP055707380, Retrieved from the Internet <URL:https://www.jst.go.jp/pr/announce/20150710/index.html> [retrieved on 20191125] *

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