NL1035698C2 - Cytoplasmatisch mannelijk steriele plant met een van prei verkregen nicleairkerngenoom, werkwijze voor het verkrijgen hiervan, cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant en gebruik van een cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant voor het overbrengen van cytoplasmatische mannelijke steriliteit in een plant. - Google Patents

Description

CYTOPLASMATISCH MANNELIJK STERIELE PLANT MET EEN VAN PREI VERKREGEN NUCLEAIRKERNGENOOM, WERKWIJZE VOOR HET VERKRIJGEN HIERVAN, CYTOPLASMATISCH MANNELIJK STERIELE KNOFLOOKPLANT EN GEBRUIK VAN EEN CYTOPLASMATI SCH MANNELIJK STERIELE 5 KNOFLOOKPLANT VOOR HET OVERBRENGEN VAN CYTOPLASMATI SCHE

MANNELIJKE STERILITEIT IN EEN PLANT.

De onderhavige uitvinding heeft volgens een eerste aspect betrekking op een cytoplasmatisch mannelijk steriele 10 plant met een ten minste gedeeltelijk van prei afkomstig nucleairgenoom. Volgens een verder aspect heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van de onderhavige cytoplasmatisch mannelijk steriele plant met een tenminste gedeeltelijk van prei afkomstig nucleair genoom. Een 15 verder aspect van de uitvinding heeft betrekking op een cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant. De onderhavige cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant is bruikbaar in een werkwijze volgens de uitvinding voor het verkrijgen van een cytoplasmatisch mannelijk steriele plant 20 met een tenminste gedeeltelijk van prei afgeleid kerngenoom. Het gebruik van een cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant voor het overbrengen van cytoplasmatische mannelijke steriliteit in een plant vormt een verder aspect van de uitvinding.

25 Prei (Allium porrum tevens bekend als Allium ampeloprasum) behoort tot de familie Alliaceae. Dit gewas wordt in diverse landen in verschillende variëteiten als voedingsgewas op de markt gebracht, onder andere door Bejo Zaden BV, Nederland. Tot voor kort waren er alleen zogenaamde 30 open bestoven (OP) rassen beschikbaar. Recent zijn preihybriden ontwikkeld. Preihybriden hebben een aantal grote voordelen, zoals uniformiteit, groeikracht en ziektetolerantie. Deze voordelen worden in de markt als zeer 1035698 2 waardevol gezien. Het gebruik van hybridelijnen geeft tevens de mogelijkheid een keuze te maken wat betreft combinatiegeschiktheid van ouderlijnen.

De bestaande preihybriden worden allen met behulp van 5 zogenaamde "nucleair mannelijke steriliteit" (NMS) geproduceerd. De genetische factor voor deze vorm van steriliteit is in het nucleaire of kerngenoom gelegen. Voor de producent van zaad van preihybriden heeft deze techniek echter een aantal nadelen waarvan de belangrijkste de noodzakelijke 10 vegetatieve vermeerdering van de NMS ouderlijn is. De mannelijk steriele ouderlijn kan namelijk niet via zelfbestuiving in stand worden gehouden omdat vanwege de complexe genomische structuur (prei is een tetraploïd gewas) deze eigenschap van NMS typisch in een 1:16 verhouding 15 uitsplits.

Onder andere hierom moet het gewas vegetatief vermeerderd worden. Vermeerdering via weefselkweek is een langdurig en kostbaar proces. Andere vormen van vegetatieve vermeerdering, zoals productie van jonge plantjes op 20 bloemhoofden, geeft een grote kans op ontwikkelingsstoornissen en de verspreiding van ziekten en infecties, bijvoorbeeld veroorzaakt door virussen. Zie voor een overzicht Engelke et al.

Toepassing van cytoplasmatische mannelijke steriliteit 25 (CMS) zou de productie van zaad van preihybriden zeer sterk vereenvoudigen omdat deze eigenschap niet-Mendeliaans overerft via de vrouwelijke lijn, dat wil zeggen niet via het nucleaire genoom. Vormen van CMS zijn voor het gewas prei zijn echter niet beschikbaar.

30 Binnen de familie der Alliaceae komt CMS wel voor bij onder andere ui (Allium cepa L.) stengelui (A. fistulosum), bieslook (A. schoenoprasum), kurrat (A. kurrat) en enkele niet gecultiveerde verwanten als A. galanthum. Het gaat hierbij 3 steeds om CMS waarvan de bepalende factor in het cytoplasma ligt. Bij veel planten die CMS bezitten is aangetoond dat het om een mutatie van het mitochondriaal DNA gaat. Mitochondriën worden alleen via de eicel doorgegeven aan het nageslacht, en 5 niet via pollen of zaadcellen.

Het belang van ontwikkeling van CMS in de praktijk van zaadontwikkeling wordt duidelijk, gezien de diversiteit aan aangevraagde (en verleende) octrooien op dit vakgebied, bijvoorbeeld voor toepassing van protoplastenfusie om tot 10 snelle introductie van CMS te komen. Zo zijn op deze wijze CMS Brassica oleracea (EP0810284; WO9205251) en CMS Cichorium intytous (W09745548) gewassen verkregen.

Om het probleem van ontbreken van mannelijke steriliteit bij prei op te lossen is door Buiteveld et al. voorgesteld om 15 door middel van celfusie CMS uit ui in prei te introduceren.

Ook Peterka et al. beschrijven een methode om, door middel van kruising gevolgd door embryo rescue, CMS cytoplasma uit ui over te brengen naar prei. Tot nu toe echter heeft overdracht van CMS uit verwante kruisbare soorten naar prei nog niet tot 20 de ontwikkeling van een succesvol eindproduct geleid (Engelke et al.)

Engelke en medewerkers hebben onder andere pogingen genoemd om andere typen cytoplasma in de genenpool van prei te brengen door genoverdracht vanuit niet-kruisbare soorten met 25 behulp van kruising danwel door middel van protoplastfusie. Indien dit zou slagen zou er mogelijk door moleculaire c.q. biochemische "miscommunicatie" tussen kern en cytoplasma zogenaamde alloplasmatische mannelijke steriliteit kunnen optreden (Budar and Berthomé). Bij de introductie van 30 cytoplasma wordt geredeneerd dat, indien er meer genetische discrepanties aanwezig zijn tussen de diverse cytoplasma-types enerzijds en het nucleaire genoom anderzijds, de kans op het optreden van steriliteit vergroot kan worden. Hierbij wordt 4 het gebruik van het cytoplasma afkomstig uit knoflook en olifantsknoflook met name genoemd.

De hypothese hierbij is dat een mogelijk verschil in cytoplasmatisch DNA, bij voorkeur rond het mitochondriale ATP6 5 gebied, in een kruisingsproduct kan leiden tot ontstaan van CMS. Echter, nadere bestudering van dergelijke genoverdracht bij Bejo Zaden B.V. heeft tot de conclusie geleid, zoals overigens ook al aangegeven door Engelke et al., dat dergelijk ontwikkeld materiaal, naast mannelijk steriel ook vrouwelijk 10 steriel is. Het optreden van vrouwelijke steriliteit maakt het materiaal voor verdere toepassingen ongeschikt. Zoals bekend is een goede vrouwelijke fertiliteit, resulterend in een goede zaadopbrengst, een eerste vereiste voor deze toepassing van CMS in de productie van hybridezaad. Verder blijkt ook dat bij 15 verdere terugkruisingen met dergelijk materiaal er problemen ontstaan door de aanwezigheid van "vreemd" cytoplasma bij het prei genomisch materiaal.

Yanagino et al. beschrijven een interspecifieke hybride tussen prei en knoflook. Deze hybride is ontstaan uit kruising 20 tussen een prei en een normale, mannelijk fertiele knoflook met als doel het gevormde interspecifieke kruisingsproduct zelf als nieuw gewas toe te passen. Deze wordt als zodanig vegetatief in stand gehouden en vermeerderd. Yanagino et al. merkt op dat er nagenoeg geen fertiel pollen wordt gevormd 25 door de interspecifieke hybride. Dit houdt in dat enig fertiel pollen wordt gevormd. Gezien het feit dat enig fertiel pollen wordt gevormd en de interspecifieke hybride wordt verkregen doormiddel van kruising van een mannelijk fertiele knoflookplant kan hier geen sprake zijn van een CMS 30 eigenschap.

Aldus wordt in de stand der techniek succesvolle introductie van CMS in prei niet beschreven. Voorts worden de in de stand der techniek gebruikte technieken voor CMS

5 introductie in prei aangemerkt als recombinant DNA technieken, waardoor de resulterende planten worden beschouwd als genetisch gemodificeerde organismen (GMO's). Hierdoor worden er in sommige landen bijzondere eisen gesteld aan de 5 introductie van dergelijke planten in het milieu. Tevens bestaan er consumentengroepen die een voorkeur hebben voor (voedings)producten, die geen GMO's bevatten.

De onderhavige uitvinding beoogt een oplossing te bieden voor de problemen van de stand der techniek door het 10 verschaffen van mannelijk steriele planten met een tenminste gedeeltelijk van prei afkomstig nucleair genoom.

Bij het zoeken naar de oplossing van het probleem om CMS te introduceren in prei hebben de uitvinders van de onderhavige uitvinding een onconventionele benadering gevolgd. 15 Voor het vinden van een geschikte bron voor CMS is men namelijk allereerst op zoek gegaan naar CMS eigenschappen in een gewas waarin CMS eerder nog niet beschreven is. Dit gewas is knoflook (Allium sativum L.).

Door gebruik te maken van de technieken beschreven in 20 W09847371 hebben de uitvinders de mogelijkheid gekregen om pollenfertiliteit van knoflook nader te bestuderen. Hierdoor zijn de uitvinders er in geslaagd om gericht te zoeken naar mannelijke steriliteit in knoflook. In het bijzonder zijn de uitvinders er in geslaagd om knoflookplanten te ontwikkelen 25 die, met behoud van vrouwelijke fertiliteit, een volledig ontwikkelde, mannelijk steriele bloeiwijze hebben. Uit bestudering van de overerving blijkt deze mannelijke steriliteit niet-Mendeliaans, via de vrouwelijke lijn, over te erven. Wat aldus aanduidt dat hier sprake is van een vorm van 30 CMS of mannelijke cytoplasmatische steriliteit.

Navolgende kruising van CMS knoflookplanten met preiplanten en doorkruising met de preilijn heeft geresulteerd in cybride planten met een gedeeltelijk van prei afgeleid 6 kerngenoom welke planten drager zijn van CMS . Dergelijke cybride planten maken de weg vrij naar de succesvolle ontwikkeling van preihybrides.

De uitvinding heeft derhalve volgens een eerste aspect 5 betrekking op een plant met een tenminste gedeeltelijk van prei afkomstig nucleair genoom welke plant drager is van CMS. Een dergelijke plant met een tenminste gedeeltelijk van prei afkomstig nucleiar genoom welke drager is van CMS is niet eerder beschreven. Zaden van een dergelijke plant zijn 10 gedeponeerd bij het NCIMB, Aberdeen, Scotland, UK onder nummer NCIMB 41556.

De term "CMS" wordt in deze beschrijving gebruikt volgens het normale gebruik in het vakgebied. Aldus verwijst de term naar planten met mannelijke steriliteit, dat wil 15 zeggen dat zij in hoofdzaak geen vruchtbaar pollen produceren. Hierdoor zijn deze niet in staat tot (zelf-)bestuiving. De eigenschap van mannelijke steriliteit erft niet-Mendeliaans over via de vrouwelijke lijn. Cytoplasmatisch mannelijk steriele hybride planten dragen deze CMS eigenschap via het 20 cytoplasma van de eicel over op hun nageslacht. Bij voorkeur is de plant tevens vrouwelijk fertiel en draagt ze deze vrouwelijke fertiliteit over in het merendeel van haar nageslacht, dat wil zeggen in meer dan 90%, zoals 95%, bij voorkeur meer dan 97%, zoals meer dan 99%, met de meeste 25 voorkeur 100%.

Bij CMS eigenschappen bestaat er de mogelijkheid van optreden van herstel van fertiliteit door Mendeliaans overervende Rf (restoration of fertility) genen. Deze Mendeliaanse overerving wijst er op dat deze Rf genen in het 30 nucleaire genoom zijn gelegen (zie bijvoorbeeld Engelke et al.). In voorkomende gevallen heeft het de voorkeur te selecteren op de afwezigheid van Rf genen in de ouderlijnen die gebruikt worden in een terugkruisingsprogramma. De plant 7 volgens de uitvinding heeft volgens een voorkeursuitvoeringsvorm een CMS eigenschap die afkomstig is van knoflook (Allium sativum L.) . Van deze soort zijn door de uitvinders van de onderhavige uitvinding CMS varianten 5 gevonden waarvan de CMS eigenschap is overgedragen in planten die worden verkregen door kruising met prei. De uitvinders van de onderhavige uitvinding zijn er in geslaagd knoflook-prei cybriden te ontwikkelen met CMS eigenschappen die alleen via de vrouwelijke lijn overerven. Dit is tevens aangetoond door 10 gebruik te maken van mitochondriaal-specifieke probes. Deze merkers zijn specifiek voor knoflook cytoplasma en zijn daardoor gekoppeld aan de eigenschap CMS.

Zoals bekend is in het vakgebied kunnen techniek als embryo-rescue of andere technieken zoals in vitro kieming 15 voordelen bieden bij het kruisen van planten van verschillende soorten. In een aantal gevallen kan het gebruik van dergelijke technieken zelfs noodzakelijk zijn. Hoewel niet noodzakelijk kan het gebruik van deze technieken ook in de onderhavige uitvinding voordelen bieden. De CMS eigenschap van de plant 20 volgens de uitvinding is bij voorkeur gecodeerd door mitochondriaal DNA dat afkomstig is van knoflook. Bekend is dat veel CMS eigenschappen door mitochondriaal DNA worden gecodeerd. Door de aanwezigheid van mitochondriaal DNA van knoflook en nucleair DNA van prei kan een dergelijke plant 25 volgens deze voorkeursuitvoeringsvorm worden aangemerkt als een cybride. De term "cybride" wordt in het kader van deze uitvinding gebruikt om een plant aan te duiden waarvan de cellen in de celkern en in de celorganellen (mitochondriën en/of chloroplasten) genetisch materiaal hebben dat zijn 30 oorsprong heeft uit onderscheidene soorten van planten. De cybride plant kan een gemengd kerngenoom hebben met genetisch materiaal van een eerste plantensoort en een tweede plantensoort en mitochondriën van de tweede plantensoort. Bij 8 voorkeur is de cybride plant een plant waarvan het kerngenoom van de cellen in hoofdzaak afkomstig is van de eerste plantensoort en de cellen verder uitsluitend mitochondriaal DNA van de tweede plantensoort bevatten.

5 Volgens een verdere voorkeursuitvoeringsvorm is in het kerngenoom van de plant het aandeel van het genetisch materiaal van prei groter dan 75%, bij voorbeeld groter dan 85%, bij voorkeur groter dan 93%, bij voorbeeld groter dan 97%, waarbij met nog meer voorkeur het kerngenoom in hoofdzaak 10 bestaat uit genetisch materiaal van prei en waarbij met de meeste voorkeur het kerngenoom volledig uit genetisch materiaal van prei bestaat De deskundige zal begrijpen dat hoe groter het aandeel van genetisch materiaal van prei in het kerngenoom des te meer de plant eigenschappen van een 15 preiplant zal hebben. De deskundige zal verder begrijpen dat planten met in het kerngenoom een aandeel van het genomisch materiaal van prei kleiner dan 100% met behulp van standaard technieken kunnen worden gekruist met preiplanten om zodoende te komen tot nageslacht met een verhoogd percentage genetisch 20 materiaal van prei in het kerngenoom. Over het algemeen zal bij kruising van een preiplant met een plant met in het kerngenoom genetisch materiaal anders dan van prei het aandeel van dit andere genetisch materiaal in het kerngenoom halveren in de navolgende generatie. Op deze manier kan door het 25 uitvoeren van een dergelijke terugkruising over een aantal

generaties een plant worden verkregen waarvan het kerngenoom in hoofdzaak tot zelfs volledig uit genetisch materiaal van prei bestaat. Een dergelijke plant kan worden aangeduid als preiplant. Planten met in het kerngenoom een aandeel van het 30 genetisch materiaal van prei kleiner dan 100% die een CMS

eigenschap dragen zijn uitermate geschikt voor het verkrijgen van preiplanten met CMS eigenschappen.

9

In de hier beschreven uitvinding is gebleken dat de eliminatie van het knoflook genetisch materiaal sneller verloopt dan op grond van een theoretisch gelijkelijke verdeling van de chromosomen verwacht zou worden. Na iedere 5 generatie is door middel van meting met een flowcytometer vastgesteld in hoeverre de verkregen hybride planten een intermediair prei-knoflookgenoom bevatten door de relatieve hoeveelheid DNA te meten. Hierbij bleek verrassenderwijs dat enkele planten na 2 generaties terugkruisen geen meetbare 10 hoeveelheid knoflook genoom meer bevatten dus -binnen de nauwkeurigheid van dit type meting- een zuiver preigenoom toonden.

Een mogelijke verklaring hiervoor is het vóórkomen van ongereduceerde gameten (zie Ramsey and Schemske 6) . De bijdrage 15 van een volledig preigenoom via niet gereduceerde gameten in combinatie met eliminatie van overgebleven knoflook chromosomaal DNA kan verklaren waarom relatief snel een plant is gevonden met een flowcytogram overeenkomend met prei en daarbij met een CMS afkomstig van knoflook.

20 Een verder aspect van de uitvinding heeft betrekking op vermeerderingsmateriaal van de plant volgens de uitvinding.

Met vermeerderingsmateriaal wordt hierbij bedoeld materiaal dat kan worden gebruikt om op geslachtelijke danwel op ongeslachtelijke wijze nageslacht tot stand te brengen. Het 25 zal voor de deskundige duidelijk zijn welke materialen kunnen worden gebruikt om op geslachtelijke dan wel ongeslachtelijke wijze nageslacht tot stand te brengen. Het zal duidelijk zijn dat vermeerderingsmateriaal kan worden gekozen uit bijvoorbeeld zaden, pollen, levensvatbare delen van volwassen 30 plantdelen of levensvatbare delen uit embryonale delen, inclusief cellen.

Uit het voorgaande is duidelijk dat volgens een voorkeursuitvoeringsvorm een CMS knoflook plant een wezenlijk 10 onderdeel vormt van de uitvinding. De uitvinding heeft derhalve volgens een verder aspect betrekking op een dergelijke knoflookplant met cytoplasmatische mannelijke steriliteit.

5 Een dergelijke knoflookplant met CMS kan worden verkregen door selectie van planten uit een populatie knoflookplanten waarvan de bloeiwijze is verbeterd met de methode zoals beschreven in W09847371. Een meer gedetailleerde beschrijving voor het verkrijgen van een knoflookplant met een 10 CMS eigenschap wordt beschreven in voorbeeld 1. Zaden van planten met de2e vorm van CMS zijn gedeponeerd bij het NCIMB, Aberdeen, Scotland, UK onder nummer NCIMB 41563.

Volgens een verder aspect heeft de uitvinding betrekking op vermeerderingsmateriaal van een knoflookplant met 15 cytoplasmatische mannelijke steriliteit. De term vermeerderingsmateriaal en voorbeelden hiervan zijn hierboven reeds toegelicht.

Zoals boven beschreven is een knoflook plant (Allium sativum L.) met CMS bruikbaar voor het overbrengen van CMS 20 naar een plant van het geslacht Allium. De uitvinding heeft derhalve volgens een verder aspect betrekking op het gebruik van een knof lookplant met CMS voor het overbrengen van CMS naar een plant, bijvoorbeeld een plant van het geslacht Allium. Planten uit het geslacht Allium kunnen worden 25 geselecteerd uit prei (Allium ampeloprasum) , ui (A. cepa L.), bieslook (A. schoenoprasum) , daslook (A. ursinum),Chinese look (A. tuberosum Rottier) of (Allium sativum L.).

Zoals hierboven reeds aangegeven kan met behulp van een knoflookplant met een CMS eigenschap deze CMS eigenschap niet 30 alleen worden overgebracht in prei, maar tevens in andere met knoflook kruisbare soorten uit het geslacht Allium. De uitvinding heeft derhalve volgens een verder aspect betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van een CMS plant met een 11 kerngenoom dat ten minste gedeeltelijk is afgeleid van een plant gekozen uit het geslacht Allium. Deze werkwijze omvat de volgende stappen: (i) kruising van een cytoplasmatisch mannelijk steriele 5 knoflookplant met een mannelijk fertiele plant van een soort gekozen uit het geslacht Allium, waarbij een populatie gekruiste F1 planten omvattende cytoplasmatisch mannelijk steriele planten wordt verkregen; (ii) terugkruising van een cytoplasmatisch mannelijk 10 steriele F1 plant met een mannelijk fertiele plant van dezelfde soort als gekozen onder (i), waarbij een populatie terug-gekruiste TK planten omvattende cytoplasmatisch mannelijk steriele planten wordt verkregen; (iii) optioneel het voor een aantal achtereenvolgende 15 generaties uitvoeren van terug-kruisingen tussen geselecteerde cytoplasmatisch mannelijk steriele individuen uit de achtereenvolgende TK-generaties met een mannelijk fertiele plant van dezelfde soort als gekozen onder (i).

In de werkwijze volgens de uitvinding wordt een 20 cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant (moederplant) gekruist met een mannelijk fertiele plant (vaderplant) van een soort gekozen uit het geslacht Allium. Feitelijk kan aldus een knoflookplant met CMS, bijvoorbeeld een plant gedeponeerd bij het NCIMB onder het nummer 41563, worden beschouwd als 25 uitgangsmateriaal (of intermediair) voor het verkrijgen van de planten volgens de uitvinding waarvoor in een voorkeursuitvoeringsvorm de CMS is afgeleid van knoflook- Bij de eerste kruising wordt een populatie Fl planten verkregen.

In deze Fl populatie zijn planten aanwezig die CMS 30 overgedragen hebben gekregen vanuit de vrouwelijke lijn. Over het algemeen heeft 100% van het Fl nageslacht de CMS overgedragen gekregen vanuit de vrouwelijke lijn. Planten uit het Fl nageslacht kunnen worden getest op CMS door te 12 onderzoeken of ze in staat zijn tot zelf bestuiving en door te onderzoeken of de mannelijke steriliteit wordt overgedragen via de vrouwelijke lijn.

Cellen van de uit stap (i) verkregen F1 planten zullen 5 over het algemeen een kerngenoom hebben dat intermediair is tussen knoflook en de plant van de soort gekozen uit het geslacht Allium. Het cytoplasma en de mitochondriën en chloroplasten daarin zijn afgeleid van de knoflook moederlijn. Om planten te verkrijgen waarvan in de cellen het aandeel van 10 genomisch materiaal van de plant van de soort gekozen uit het geslacht Allium is vergroot, worden cytoplasmatisch steriele Fl planten, die in stap (i) zijn verkregen, teruggekruist met een mannelijk fertiele plant van de soort gekozen uit het geslacht Allium (stap (ii)). Uit het TK nageslacht (TK1) van 15 deze kruising kunnen doorgekruiste TK planten worden geselecteerd waarvan in de cellen het aandeel van genomisch materiaal van de plant gekozen uit het geslacht Allium is vergroot. Ook in de populatie teruggekruiste TK planten zijn planten aanwezig die de CMS overgedragen hebben gekregen 20 vanuit de vrouwelijke lijn. Over het algemeen heeft ook in deze populatie 100% van het nageslacht de CMS overgedragen gekregen vanuit de vrouwelijke lijn.

De terugkruising van cytoplasmatisch mannelijk steriele planten met een fertiele plant van een soort gekozen uit het 25 geslacht Allium kan nog over een aantal generaties, bij voorkeur achtereen volgende generaties, worden doorgezet om in het kerngenoom van de lijn van TK planten het aandeel van het genomisch materiaal van de plant gekozen uit het geslacht Allium te vergroten. Bij voorkeur vindt deze terugkruising 30 over een aantal generaties (bijvoorbeeld TK2, TK3 etcetera) van de TK-lijn plaats. De terugkruisingen kunnen worden uitgevoerd totdat in het kerngenoom van geselecteerde individuen uit de populatie teruggekruiste planten het aandeel 13 van het genomisch materiaal van de plant gekozen uit het geslacht Allium groter is dan 75%, bij voorkeur groter dan 85%, met meer voorkeur groter dan 93%, zoals groter dan 97% en waarbij met nog meer voorkeur het kerngenoom in hoofdzaak, met 5 de meeste voorkeur volledig, uit genomisch materiaal van de plant uit de soort gekozen uit het geslacht Allium bestaat. De werkwijze volgens de uitvinding resulteert in een plant met een tenminste gedeeltelijk van een plant van een soort gekozen uit het geslacht Allium afgeleid kerngenoom welke plant drager 10 is van cytoplasmatische mannelijke steriliteit (CMS), afkomstig van knoflook (Allium sativum L.). Dergelijke planten zijn niet eerder beschreven.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de navolgende voorbeelden en met verwijzing naar de bijgesloten 15 figuren. In deze figuren toont:

Figuur 1: Foto's van A: de bloeiwijze van een cytoplasmatisch steriele knoflookplant volgens de uitvinding ,B: een foto van de bloeiwijze van een mannelijk fertiele 20 knoflook en C: de bloeiwijze van een cytoplasmatisch steriele plant volgens de uitvinding met een van prei afgeleid kerngenoom.

Figuur 2 toont het restrictie fragment patroon verkregen uit het PCR digestie experiment van voorbeeld 2.

25

Voorbeeld 1

Door toepassing van de uitvinding als beschreven in W09847371 zijn knoflookplanten verkregen die een goede bloei 30 vertoonden. Onder goede bloei wordt hier verstaan de gedeeltelijke of gehele afwezigheid van broedbollen in de bloeiwijze van deze knoflook. Tevens zijn de aanwezige bloemen goed en volledig ontwikkeld.

14

Behandeling van knoflookplanten zoals in dit octrooi omschreven leidde er toe dat voor het eerst de bloeiwijze van knoflook goed bestudeerd kon worden.

Verrassenderwijs bleek hierbij in een aantal 5 knoflookplanten geselecteerd te kunnen worden waarbij een niet-Mendels overervende vorm van mannelijke steriliteit (CMS) werd vastgesteld. Hierbij is bepaald dat deze planten geen stuifmeel vormden en dat deze eigenschap voor 100 % via de eicellen werd doorgegeven aan de volgende generatie. Wanneer 10 hier sprake zou zijn van een "Mendels" overervende eigenschap zou 50 % van de volgende generatie deze eigenschap bezitten.

De bloeiwijze van een CMS knoflookplant is weergegeven in figuur IA. Bij vergelijking van deze bloeiwijze met de bloeiwijze van een mannelijk fertiele knoflook plant zoals 15 weergeven in figuur 1B is duidelijk dat in de bloeiwijze van figuur IA geen stuifmeel dragende meeldraden aanwezig zijn.

Voorbeeld 2 20 Een 6-tal CMS knoflooklijnen, gekenmerkt door de nummers 618110, G18132, G18133, G18135, G18161 resp. G18166, zoals verkregen in voorbeeld 1, is gezamenlijk afgebloeid met een breed spectrum aan preilijnen om slagen van bestuiving zo groot mogelijk te maken. Dit spectrum is zo gekozen om 25 bloeitraject van de preibestuiver zo lang mogelijk te maken.

Op dit 6-tal lijnen is in meerdere of mindere mate asymmetrische vruchtzetting waargenomen en in vitro kieming is toegepast, bij voorkeur 6 tot 8 weken na bestuiving.

Indien de zich ontwikkelende embryo's niet van de plant 30 verwijderd en opgezet worden, vindt degeneratie van het endosperm plaats. Dit fenomeen is duidelijk beschreven door bijvoorbeeld Sharma et al. 7 en leidt niet tot verdere ontwikkeling van levensvatbaar zaad. Deze techniek is 15 toegepast indien de typische asymmetrische zetting duidelijk met het blote oog zichtbaar was. Opzet van vruchtbeginsels, variërend in de kleur lichtbruin tot zwart, vindt plaats op B5 medium (Gamborg et al. 8) , een medium dat vaak wordt gebruikt 5 bij de techniek van in vitro kieming.

Essentieel bij de toepassing van deze techniek is ook de bloeivertraging van prei en bloeistimulering van knoflook gebleken door middel van behandelingen die de bloeitijd beïnvloeden. Voorbeelden hiervan zijn hormoonbehandelingen, 10 variatie in temperatuur en variatie in daglengte.

In dit specifieke geval zijn een honderdtal vruchtbeginsels, in verschillende stadia van ontwikkeling, opgezet. Hieruit zijn 43 individuele planten ontstaan.

Door toepassing van de flowcytometrie (Partec, Münster, 15 Duitsland) zijn de relatieve DNA hoeveelheden van het ontwikkelde plantmateriaal gemeten. Door toepassing van deze techniek is vastgesteld dat: - 27 planten het verwachte intermediaire patroon tussen knoflook en prei bleken te hebben 20 - 14 planten ontsnappend bleken te zijn (knoflook FCM patroon) - 2 planten vertoonden een afwijkend patroon.

Van alle planten is vast komen te staan dat deze een cytoplasma van het CMS knoflook type hebben.

Hiervoor is gebruik gemaakt van de volgende primers: 25 pl2351: 5'-ACCAGAAGGATTCGGATTGA-3' pl2352: 5'-TGACATAAGTCCCTCCCTACAA-3'

Condities van de PCR reactie Programma SA59: zijn: stap 1 94 °C 5 minuten DNA 2 μΐ 2 60 °C 1 minuut buffer 10 x 2,5 μΐ 3 72 °C 1 minuut 16 50 mM MgCl2 1,2 μΐ 4 94 °C 30 seconden NTP's 0,6 μΐ 5 59 °C 1 minuut pl2351 (5 pM) 1 μΐ P12351 6 72 °C 1 minuut pl2352 (5 pM) 1 μΐ P12352 7 GA NAAR stap 4 29 H20 16,6 μΐ maal

Platinum Taq 0,1 μΐ 8 72 °C 5 minuten 9 20 °C 20 minuten

Amplificatie van een fragment met behulp van deze primers geeft in zowel knoflook als prei een fragment van 845 bp.

5 Na digestie van dit fragment met het restrictie enzym

Taql worden bij CMS knoflook drie fragmenten van respectievelijk 60 bp, 160 bp en 625 bp verkregen terwijl bij prei vier fragmenten van resp. 50 bp, 60 bp, 110 bp en 625 bp verkregen worden.

10 Figuur 2 toont het restrictiefragment banden patroon behorend bij dit experiment op een electroforese gel. Het meest kenmerkende verschil tussen het patroon van knoflook en prei zijn de banden van 110 bp en 160 bp. Deze band van 110 bp is aanwezig in het prei patroon en afwezig in het CMS knoflook 15 patroon. Omgekeerd is de band van 160 bp aanwezig in het CMS knoflook patroon terwijl deze band afwezig is in het prei patroon. Aan de hand van de aanwezigheid van de 160 bp band en de afwezigheid van de 110 bp band kon worden bepaald dat de CMS knoflook-prei cybriden in lanen 4-9 cytoplasma 20 overeenkomstig dat van CMS knoflook hebben.

Bij de beschreven kruising tussen knoflook (2n = 2x = 16) en prei (2n = 4x = 32) ontstaan planten die in zekere zin triploïd genoemd kunnen worden (2n = 3x = 24); dergelijke planten zijn vrijwel altijd mannelijk en vrouwelijk steriel 25 omdat de meiose niet correct verloopt. Om te bewijzen dat er 17 toch sprake is van een cytoplasmatische mannelijke steriliteit, is een deel vein de ontwikkelde planten doorontwikkeld tot een 4n (= 6x = 48) plant.

Een in dit vakgebied gebruikelijk toegepaste techniek 5 van chromosoomverdubbeling door middel van colchicine heeft plaatsgevonden. Hiervoor zijn meristemen 3 tot 6 dagen op een colchicine houdend instandhoudingsmedium B5 (aangevuld met 35 mg colchicine/1) geplaatst. Daarna heeft verdere uitgroei tot complete plant plaatsgevonden op B5 medium zonder additieven. 10 In het tweede seizoen zijn deze planten op bloeiwijze bekeken.

Als conclusie na visuele beoordeling, alsmede beoordeling door middel van pollenkleuring- en pollenkiemings-technieken, is vast komen te staan dat alle ontwikkelde 15 kruisingsproducten mannelijk steriel zijn. Ook de bovengenoemde 4n (= 6x = 48) planten bleken niet tot zelfbevruchting in staat.

Hiermee is bewezen dat overdracht van het CMS cytoplasma, ontwikkeld na hormoontoepassing in knoflook, met 20 behoud van functionaliteit is overgebracht naar prei.

Via verdere kruising met prei is het mogelijk gebleken om bij alle zes knoflook CMS lijnen nakomelingen te krijgen; hierbij is opnieuw de hierboven beschreven methode van in vitro kieming toegepast.

25 Metingen aan deze kruisingsproducten door middel van flowcytometrie zijn wel uitgevoerd, echter door de toenemende hybridisatie van genomen bewegen de pieken van de cytogrammen naar elkaar toe. Hierdoor is de techniek van flowcytometrie na meerdere terugkruisingen niet meer onderscheidend. Om deze 30 reden is gekozen voor een globale groepsgewijze indeling van de nakomelingschappen.

Hierbij is de volgende indeling aangehouden; 18 - groep 1: verwacht flowcytogram met een TK1 patroon (=terugkruising 1).

- grpep 2: flowcytogram gemeten na duplicatie van kernmateriaal.

5 - groep 3: ouderplant FCM patroon (hierbij is moederweefsel vermeerderd in plaats van een uitgroeiend embryo geïsoleerd).

- groep 4: afwijkende FCM patronen.

In de eerste groep van "verwacht TK1 patroon", is het 10 mogelijk gebleken om opnieuw kruising met prei te laten plaatsvinden (TK2= terugkruising 2), met dit verschil dat afrijping van zaad aan de plant kan plaatsvinden. Dit laatste is een belangrijke stap in de ontwikkeling van het product, omdat voor praktische toepassing van zaadteelt een toepassing 15 van de in vitro kieming techniek commerciële toepassing van de uitvinding in de weg staat.

Deze "natuurlijke" kruising met prei is bij onderhavige uitvinding al in de TK2 fase tot stand gekomen, echter dit is in sommige achtergronden pas in de TK3, de TK4 of zelfs in 20 latere generaties tot stand gekomen.

Voorbeeld 3

Ook is het mogelijk gebleken om uit de set van 25 ontwikkelde FI in vitro gekiemde planten tussen knoflook en prei, in tegenstelling tot de bovenvermelde "3x"- planten, direct een 4n (6x) plant te ontwikkelen. Verrassenderwijs heeft op spontane wijze verdubbeling van de chromosomen in de knoflookeicel plaatsgevonden, resulterend in een zogenaamde 2n 30 gameet, welke na kruising met prei (2n pollen) een tetraploïde nakomeling heeft opgeleverd.

Het optreden van ongereduceerde gameten is in de literatuur beschreven (Ramsey and Schemske 6) .

19

In het werk van Peterka et al. 9 is aangegeven dat, bij de verkregen terugkruisings-plant bij de prei /ui hybride, een ongereduceerde gameet van de ui hieraan ten grondslag heeft gelegen.

5 Deze 4n plant is door middel van flowcytometrie opgespoord en deze is in sterke mate compatibel met prei gebleken.

Daarom is op deze plant na kruising met prei spontaan zaadzetting opgetreden, die met in vitro kieming tot volwassen 10 planten kon worden uitgegroeid. Kieming vond plaats bij 15°C in het donker.

Voorbeeld 4 15 Als vierde mogelijkheid wordt aangegeven dat, via de tussenstap van het tetraploïd maken van knoflook, de kruising met prei uitgevoerd kan worden. De genetische samenstelling van beide plantensoorten is hiermee beide van tetraploid karakter, hetgeen de samensmelting van gameten tot een 20 levensvatbare combinatie, kan bespoedigen.

Hierbij blijft echter de ontwikkeling van CMS knoflooklijnen gevolgd door bovengenoemde beschreven technieken noodzakelijk.

20

Referenties l. Engelke, T., E. Agbicodo and T. Tatlioglu. Euphytica 137: 181-191 (2004) 5 2. Buiteveld, J., Y. Suo, M.M. van Lookeren Campagne and J. Creemers-Molenaar. Theor. Appl. Genetics 96: 765-775 (1998) 3. Peterka, Η., H. Budahn and O. Schrader. Theor. Appl. Genetics 94: 383-389 (1997) 10 4. Budar, F. and R. Berthomé. Ann. Plant. Reviews 31: 278-307 (2007) 5. Yanagino, T., E. Sugawara., M. Watanabe and Y. Takahata. Theor. Appl. Genetics 107: 1-5 (2003) 6. Ramsey, J. and D.W. Schemske; Ann. Rev. Ecol. Syst.

15 29: 467-501 (1998) 7. Sharma, D.R., R. Kaur and K. Kumar. Euphytica 89: 325-337 (1996) 8. Gamborg, L.L., R.A. Miller and K. Ojima. Exp. Cell Res. 50: 151-158 (1968) 20 9. Peterka, Η., H. Budahn, O. Schrader and M.J. Havey.

Theor. Appl. Genetics 105: 173-181 (2002) 1035698

Claims (12)

1. Plant met een tenminste gedeeltelijk van prei (Allium ampeloprasvm) afkomstig nucleair genoom welke plant 5 drager is van cytoplasmatische mannelijke steriliteit (CMS), bijvoorkeur een plant zoals gedeponeerd bij het NCIMB (Aberdeen, Scotland, UK) onder het nummer NCIMB 41556.

2. Plant volgens conclusie 1, waarbij de CMS 10 eigenschap afkomstig is van knoflook (Allium sativum L.) .

3. Plant volgens conclusie 2, waarbij in het nucleair genoom het van prei afkomstig genomisch materiaal meer is dan 75%, bijvoorkeur meer dan 85%, meer bij voorkeur meer dan 93%, 15 nog meer bij voorkeur meer dan 97%, en meest bij voorkeur is dat het nucleaire genoom in hoofdzaak, bijvoorkeur 100%, wordt gevormd door genomisch materiaal van prei.

4. Plant volgens een van de conclusies 1-3, waarbij 20 de cytoplasmatische mannelijke steriliteit mitochondriaal gedragen wordt.

5. Vermeerderingsmateriaal, bijvoorbeeld zaden, pollen, levensvatbare delen van volwassen plantdelen of 25 levensvatbare delen uit embryonale delen, inclusief cellen, van een plant volgens een der conclusies 1-4.

6. Knoflookplant (Allium sativum L.) met cytoplasmatische mannelijke steriliteit, bijvoorkeur een plant 30 zoals gedeponeerd onder nummer 41563 bij het NCIMB (Aberdeen, Scotland, UK). 1035698

7. Vermeerderingsmateriaal, bijvoorbeeld zaden, pollen, levensvatbare delen van volwassen plantdelen of levensvatbare delen uit embryonale delen, inclusief cellen, van een knoflookplant volgens conclusie 6. 5

8. Gebruik van een knoflook plant (Allium sativum L.) met cytoplasmatische mannelijke steriliteit, voor het overbrengen van cytoplasmatische mannelijke steriliteit in een plant, bijvoorkeur een plant van het geslacht Allium, zoals 10 prei (Allium ampeloprasum), ui (Allium cepa L.), Chinese look (AIlium tuberosum Rottier), knoflook (Allium sativum L.).

9. Werkwijze voor het verkrijgen van een cytoplasmatisch mannelijk steriele plant met een nucleair 15 genoom dat ten minste gedeeltelijk is afgeleid van een plant van een soort gekozen uit het geslacht Allium omvattende: (i) kruising van een cytoplasmatisch mannelijk steriele knoflookplant met een mannelijk fertiele plant van een soort gekozen uit het geslacht

20 Allium waarbij een populatie gekruiste F1 planten omvattende cytoplasmatisch mannelijk steriele planten wordt verkregen; (ii) terugkruising van een cytoplasmatisch mannelijk steriele F1 plant met een mannelijk fertiele plant 25 van dezelfde soort als gekozen onder (i) waarbij een populatie terug-gekruiste TK planten omvattende cytoplasmatisch steriele planten wordt verkregen; (iii) optioneel het voor een aantal achtereenvolgende 30 generaties uitvoeren van terugkruisingen tussen geselecteerde cytoplasmatisch mannelijk steriele individuen uit de achtereenvolgende TK-generaties met een mannelijk fertiele plant van dezelfde soort als gekozen onder (i).

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij stap (iii) 5 wordt uitgevoerd totdat in het kerngenoom van planten uit een TK-generatie het aandeel van het genetisch materiaal van de plant uit het geslacht Allium, zoals gekozen onder (i), groter is dan 75%, bij voorbeeld groter dan 85%, bij voorkeur groter dan 93%, bij voorbeeld groter dan 97%, waarbij met nog meer 10 voorkeur het kerngenoom in hoofdzaak bestaat uit genetisch materiaal van de plant uit het geslacht Allium, zoals gekozen onder (i) bestaat en waar bij met de meeste voorkeur het kerngenoom volledig bestaat uit genetisch materiaal van de plant uit het geslacht Allium, zoals gekozen onder (i). 15

11. Werkwijze volgens een der conclusies 9-10, waarbij selectie van individuen uit het nageslacht van TK planten plaatsvindt op basis van analyse van nucleair DNA.

12. Werkwijze volgens een der conclusies 9-11, waarbij de plant uit het geslacht Allium wordt gekozen uit prei (Allium ampeloprasum), ui (Allium cepa L.), Chinese look (Allium tuberosum Rottier), knoflook (Allium sativum L.) en bij voorkeur wordt gekozen als prei (Allium ampeloprasum). 25 1035698