JPS6379548A - 雑種植物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞融合法を用いて効率よく雑種植物を作出
する方法に関するものである。詳しくは、光合成効率の
良いモリカンディア　アルペンシスの持ついくつかの０
４型光合成形質を、Ｃ１型光合成形質しか持たないブラ
シカ　オレラセアに導入することによって光合成効率の
改良された雑種植物を作出する方法に関するものである
。

〔従来の技術〕

モリカンディア　アルペンシスは、光呼吸が小さい、Ｃ
Ｏ，補償点が低い等の形質を有し、亀。

Ｃ４中間型植物とされておシ、該形質全Ｃ１型植物に導
入すれば、Ｃ３型植物の物質生産を飛躍的に増加させる
ことができると期待される。

しかし、モリカンディア属とブラシカ属は遠縁のため、
従来の交配法によっては雑種を得ることができない。一
方、このような遠縁属間で雑種植物を得る方法として、
細胞融合法は有効な手段である。

細胞融合法では、プロトプラストの調製、細胞融合、培
養、植物体の再分化といった多数のステップからなシ、
各ステップはたとえば植物種等てよっても条件が異な）
、必ずしもこ九ら一連のプロセスが種々の植物について
十分確立されているとは言えない。また、雑種植物を得
な条件を各植物種について決めなければならない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、モリカンディア　アルペンシスと。

ブラシカ　オレラセアの雑種植物を、細胞融合法によっ
て作出する方法の提供を目的とするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

この目的は、モリカンディア　アルペンシス由来のプロ
トプラストと、ブラシカ　オレラセア由来のプロトゲラ
ストを、デキストランを含む溶液中で融合させた後培養
してコロニーを形成させ、該コロニーを植物ホルモンと
してナフタレン酢酸およびベンジルアミノプリンを含む
培地中で培養して雑種植物を再分化させることを特徴と
する雑種植物の製造方法によシ達成される。

以下、本発明を説明するに、本発明で使用するブラシカ
　オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ）
としては、レッドキャベツ、カリフラワー等が挙げられ
る。

Ｂ、　ｏｌｅｒａｃｅａのプロトプラストは、播種後！
〜乙日目の下胚軸から単離することができる。

このような下胚軸からは、活性の高いプロトプラストを
得ることが可能となる。モリカンディア　アルペンシス
（Ｍ、ａｒｖｅｎｓｉｓ）のプロトプラストは、葉切片
由来のカルスを、０．！；−、！■／ｌの２．クージク
ロロフェノキシ酢酸（２，≠−Ｄ）を含むＭＳ培地（ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ△２．　　ｔｔ７３゜／り
乙コ）中で振盪培養したものから得ることができる。プ
ロトプラストは、常法に従い、セルラーゼとペクチナー
ゼの細胞壁分解酵素を含む酵素液中２３〜２♂℃でｌ晩
処理することによって得ることができる。

プロトプラストラ融合させる溶液は、分子量１０万のデ
キストランおよび塩化ナトリウムを、それぞれ、１ｏ−
ｘｏ％およびｊ〜１０ｚ含む溶液が好適に使用できる。

かかる溶液中に、上記プロトプラストを等密度で合計が
、　／Ｘ１０６〜ｊ　Ｘ　／　０６個／−となるように
混合して１０−２０分間保持し、次いで、水酸化カリウ
ムおよび塩化カリウムを、それぞれ、Ｏ，ＺＸおよび４
％含むアルカリ溶液を滴下する。さらに１ｏ−２゜分径
、／〜弘％の塩化カルシウムを含む希釈液を添加して、
プロトプラストを融合させる。

上述のようにして融合処理した処理液を遠心分離して沈
澱分画を集め、これをたとえば、ｌ〜４ｔ７ｖ／ｌの＄
２．４１−Ｄ、　　０．！；　〜！ｍ９／Ｌのベンジル
アミノプリン（ＢＡＰ）’ｉ含むＢ！培地（Ｅｘｐ、　
Ｃｅ１ｌ　Ｒｅθ、、　ｊＯ，／ｊ／　ｓ　／り＋、ｒ
）　　中、／Ｘ１０’〜ｊＸ１０”　　個／ゴとなるよ
うに懸濁して培養する。この培養液に週／回の頻度で新
しいＢ！培地を追加しながらさらに培養を続けると、／
ケ月位で／ｆｉφ程度のコロニーが形成される。

本発明においては、このコロニー１、ｏ、よ〜３■／ｌ
のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）およびＯ０！〜３■／ｌの
ベンジルアミノプリンを含む再分化培地、たとえば、Ｍ
Ｓ培地で培養するとシュートが形成される。このシュー
トが形成されたカルスを常法に準じ、植物ホルモンを含
まないＥｊ培地等の培地で発根させ、次いで、ポットに
移植して生長させると目的とする風聞雑種植物を得るこ
とができる。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例／ （１）　　プロトプラストの調製 モリカンディア　アルペンシス（Ｍ、ａｒｖｅｎｓｉｓ
）の葉切片を、ｌ■／ｌの１．ｒ、ｔａ−Ｄりを含むＭ
　Ｓ培ｍに置床し、カルスを得、とのカルスを液体培地
に移して振盪培養した。次いで、カルスｆ２％セルラー
ゼ、０．２％マセロザイム、０．１％　ｃ＋ａａｔ２＠
　２　Ｈ２Ｏおよび１０％マニトむ −ルを含〃酵素液（ｐＨｊ−よ）に移して、２よ℃、ｌ
晩装置してプロトプラストを単離した。

酵素処理液を濾過して未消化物を除去し、濾液を１００
×９で３分間遠心分離して沈澱分画を集め、次いで、０
−／　Ｘ　　Ｉ：！ａＯ４２”−２Ｈ２０および１０％
マニトールを含む洗浄液で３回洗浄した。

一方、ブラシカ　オレラセア（Ｂ、ｏ１θｒａｃｅａ）
はレッドキャベツを用い、無菌的に発芽させた！〜乙日
目の下胚軸を細分して、前述と同様に酵素処理全行ない
、プロトプラストを単離した。

（２）細胞融合 上記（１）で調製したプロトプラストをそれぞれ等密度
で合計が２×１０６個／−となるように浄洗液中で混合
し、その０．２　ｍｌ　ｆ、６ｃｍφノシャーレ中央で
、分子量！Ｏ万のデキストランおよびＫＣｌをそれぞれ
／！％および３％含む融合液Ｏ１了ゴと混合し％　／夕
分間放置した。次いで、ＫＯＨおよびＫＯｔｉそれぞれ
０６５％および６％含むアルカリ溶液を０．０！−滴下
し混合した。さらに／よ分径、！％のマニトールおよび
２％のＯａＯ’ｌ□・、ＺＨ２０を含む希釈液ＩＯ−を
シャーレ壁より静かに添加し、融合液と希釈液を徐々に
混合した。次いで、５℃でｌ晩装置した後、ｉｏｏｘｇ
で３分間遠心分離して沈殿分画を得た。この融合操作で
およそ１０％の融合細胞が得られる。

（３）　融合細胞の培養 上記（２）で得た融合処理後のプロトプラストを、λキ
／ｌの２．≠−り、　／■／ｌのＢＡＰおよびｇ％のマ
ニトールを含むＢ！液体培地中に、　２×１０５個／７
！の密度で懸濁して培養を行なった。徐々に浸透圧を下
げた新しいＢ！培地を添加しながらさらに培養を続けた
ところ、約／ケ月で／φのコロニーが形成された。

植したととる、約２週間後にシュートが形成された。シ
ュートが形成されたカルスを３週間毎に新しい同培地に
植継ぎながら培養を続けたところ、数ケ月にわたって多
数のシュートが形成された。

シュートｔホルモン無添加のＭＳ培地もしくはＢｊ培地
に移植すると発根が見られた。次いでポット中の培土に
移植して、温腟で苗を育成し、開花させた。

≠×１０５個のプロトプラスト’を培養することによっ
て、／ｊ個のカルスからシュートが形成され、さらに、
由来を異にする２個のカルスから植物体が再分化し、ｉ
ｏｏ個体以上の苗を育成することができた。

得られ念植物体について、下記の方法によう雑種検定し
たところ、すべての植物体が雑種植物であることがわか
った。

雑種検定は、常法に従い、葉形態および花形態の特徴、
酸性ホスファテースおよびアスパラギン酸アミントラン
スフエレースのアイソザイムの電気泳動パターン、さら
に染色体数全基に解析した。得られた雑種植物における
これらの特徴は全て合致していた。

７１１う”／６　　　７レラ（ア とＥｒａｓｓ土ｃａ　ｏｌθｒａｃｅａの風聞雑種植物
を効率よく得ることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）モリカンデイア　アルベンシス（Ｍｏｒｉｃａｎ
   ｄｉａａｒｖｅｎｓｉｓ）由来のプロトプラストと、ブ
   ラシカ　オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃ
   ｅａ）由来のプロトプラストを、デキストランを含む溶
   液中で融合させた後培養してコロニーを形成させ、該コ
   ロニーを植物ホルモンとしてナフタレン酢酸およびベン
   ジルアミノプリンを含む培地中で培養して雑種植物を再
   分化させることを特徴とする雑種植物の製造方法。