JPS63304927A - 除草剤抵抗性栽培植物、その選択および再生化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 未成熟の胚に由来するカルス培養物からと５もろこし植
物を再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ　）させることは可能
である（　Ｇｒｅｅｎ、　Ｃ，Ｅ、　、　Ｐｈ１ｌｉｐ
ｓ　、　Ｒ，Ｌ、　、ｒＣｒｏｐ。

Ｓｃｉ、Ｊｊ巨、４１７　　（１９７５）；　　ＢＰ　
　１６０．３９０；ＥＰ１７ス７３８〕。

しかしながらこれははじめは少数の遺伝子型、例えば近
交系Ａ１８８、Ｗ６４Ａおよびブラックメキシカンスウ
ィートにおいてしか成功しなかった。

改良された栄養培地によってはじめて、多数の異なる近
文系から形態形成性かつ胚形成性のカルス培養物を確立
することができた［　Ｄｕｎｃａｎ氏他、ｒＰ代地ｎｔ
ａＪ　１６５　、３２２　（１９８５）　〕ｏこの方法
の重要な前提条件は栄養培地にアミノ酸を添加すること
である。

数か月または数年にわたり完全な植物体に再生できる細
胞培養物が突然変異株および変異植物細胞系統の選択に
適する。栄養培地に例えば有毒量の除草剤が添加される
と、いくらかのカルス区分が生き延び、それらから除草
剤抵抗性植物が再生されうる。カルス組織を突然変異誘
発剤で処理すると、突然変異株の収率が高まる（米国特
許第４．４４！１，９７１）。

アミノ酸の生合成に関与する酵素の阻害剤である除草剤
は、培地がアミノ酸、特にその生合成が該除草剤により
阻害されるアミノ酸を含有する場合は、組織培養物には
弱い作用しか及ぼさない。それゆえアミノ酸の存在下に
、すなわちこれまで再生化能のあるとうもろこしカルス
の確立および継代培養にとって特に好都合であると見做
された条件、下において、アミノ酸生合成阻害剤に対し
て抵抗性である突然変異株をも同時に見出すことは非常
に困難である。

驚くべきことに、何らアミノ酸を含有しない栄養培地中
で栽培植物に由来する再生能のある細胞系統が培養され
５ることが見出された。これら細胞系統からかかる栄養
培地中で栽培植物を再生させることもできる。これは特
に予想外のことであった、何故ならアミノ酸はカルス培
養物または植物の生長および再生にとって必須物である
からである。かかる培養物は除草剤抵抗性である細胞系
統、カルス培養物または植物の選択に用いられさる。

それゆえ本発明は阻害剤を含有する栄養培地上で培養す
ることにより、アミノ酸生合成阻害剤忙対して抵抗性を
有する栽培植物細胞系統を確実に選択するに当り、 ａ）アミノ酸を含有しない栄養培地上でその胚形成能お
よび形態形成能を保持したまま生育するカルス培養物ま
たは細胞懸濁培養物を選択し、ｂ）これら培養物をアミ
ノ酸を含有しない、阻害剤含有栄養培地上で培養し、そ
れから完全なる植物が再生される阻害剤抵抗性培養物を
選択する、 ことからなる方法に関する。

以下に本発明を特にその好ましい態様に関して詳細に記
載する。

以下に記載される本発明による方法を用いて、鏡検植物
、好ましくは単子葉栽培植物特に穀物植物の再生化能の
ある、除草剤抵抗性細胞系統が形成され５る。とうもろ
こし細胞系統で操作を行うのが特に好都合である。

除草剤抵抗性細胞系統物を選択しうるためには、アミノ
酸を含有しない培地上で充分に良好に増殖できその上高
い頻度で植物再生化が誘発され５る細胞系統を第１段階
で確立することが必要である。そのためＫはカルス培養
物をアミノ酸を含有しない培地、例えば改良されたムラ
シゲ−ｘクープ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　８ｋｏｏｇ　（
ＭＳ）　）培地ＣｒＰｈｙｓｉｏｌ、　ＰｌａｎｔＪ　
１５．４７５　（１９６２）　］または改良されたＮ６
培地（Ｃｈｕ　、　Ｃ，Ｃ，代地のｒ８ｃｉ、８１ｎ、
Ｊ　１６゜６５９　（１９７５）　］上で培養する。か
かる栄養培地！！、　例１’！？スクロース、グルコー
ス、マルトースおよびラフィノースのよ５な炭素原、ア
ンモニウム塩または硝酸塩のよ５な窒素原、ならびに当
業者に知られたビタミン、ホルモンおよびミネラル塩を
本質的に含有する。

当該栄養培地には培養物の生育にシラスの影響を与える
１稲またはそれ以上の生理学的有機酸またはその塩、特
にクエン酸サイクルの酸例えばクエン酸、りんご酸、オ
キサロ酢酸、コハク酸およびピルビン酸、あるいはそれ
らの塩が添加されるのが好ましい。ナトリウムおよびカ
リウム塩が好ましく、アンモニウム塩が特に好ましい。

これらの添加物はアミノ酸を含有しない培地上のカルス
または細胞懸濁培養物の生長を助長しそして標準的な培
養条件下に植物への再生化能を失うことなく長期間、少
くとも１〜２年にわたる継代培養を助長する。それゆえ
これら化合物はアはノ酸代替物として好ましくは約０．
１〜１０ミリモル、特に０．５〜２ミリモルの濃度で栄
養培地に添加されうる。標準的な培養条件とは当業者に
通常の条件を意味する。照射の有無に関りなく約１５〜
３５℃、好ましくは２０〜３０℃で培養が行われうる。

継代の間隔としては通常約１０〜３０日、好ましくは１
４〜２１日が選択され、これは当然培養物の生育の如何
によらなければならない。

次にアミノ酸を含有しない栄養培地上で生育し５る細胞
系統を阻害剤抵抗性、特に除草剤抵抗性のカルス培養物
および細胞懸濁培養物の選択に使用する。これら培養物
を用いて原則的にすべての阻害剤に対して選択が行われ
うるが、しかしアミノ酸生合成を阻害しうる除草剤に対
して選択を行うのが好ましい。この群のうちでは下記一
般式 ％式％ 〔式中、相互に独立して、 Ｒ１はヒＰロキシルまたはメチルであり、Ｒ２はヒＰロ
キシル、メチルまたはエチルであり。

１３はアミノメチレン、ヒＰロキシメチレンまたはカル
ゼニル基であり、 Ｒ４はＯＨまたは しくは１〜２である）であり、そして ｎは０〜４好ましくは０〜２である〕を有する除草剤に
対し【選択が行われるのが好ましい。

特に好ましいのはグルフォシネート（ホスフィノスリシ
ン）またはその構造類似物例えばパイアラフォス、なら
びにジメチルホスフィニルヒドロキシ酢酸である。光学
活性阻害剤の場合、その化合物のラセミ体または生物学
的に活性な鏡像異性体のいずれでも使用されさる。

選択に際してより良好な収率な得るには、選択された細
胞系統をそれ自体知られた方法により突然変異誘発物質
で処理することができる。

この操作は例えばエチルメタンスルホネートまたはＮ−
メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＧ）のような化
学物質を用いるととＫよるか、あるいは例えばＸ線また
はＵＶ光線を用いるような照射により実施されうる。か
かる突然変異誘発剤は細胞の３０〜７０１が死滅するよ
うな濃度で使用される。

阻害剤抵抗性の細胞懸濁培養物、好ましくはカルス培養
物の実際の選択は阻害剤が添加された、前記したアミノ
酸を含有しない栄養培地上　−で行われる。培地中にお
けるその濃度は広範囲に変動でき、そして実質上カルス
の７０〜９９慢、好ましくは９５〜９９憾が死滅するよ
うに選択される。この選択は同じ濃度かまたは除草剤濃
度を高めて反復することができる。抵抗性細胞または再
生化能のあるカルスを選択する場合の収率は、前記した
栄養培地に生理学的な有機酸またはその塩が添加された
場合に高められうる。さらＫ、選択性はカルス培養物を
５ｏｏ〜５０００ルツクスの光線の下で約８〜１６時間
培養することにより改良されうる。培養は慣用の条件下
に１回またはそれ以上、好ましくは２〜４回継代して行
われ、適当な培地は寒天および液体培地である。継代間
隔は生育速度の如何に応じ変動しそして一般的には１〜
５週、好ましくは３〜４週である。

特に抵抗性の、形態形成性カルスおよび細胞懸濁物を反
復して継代培養することにより、５吐までの濃度の除草
剤に耐容できそしてなお植物への再分化能を有する細胞
系統が確立されうる。

もちろん、異なる作用部位を有する２種の除草剤に対し
て抵抗性を有する細胞懸濁培養物および再分化能のある
カルス培養物も本発明による方法を用いて選択されうる
。

除草剤に対して抵抗性を有する植物の再分化はそれ自体
知られた方法に従い、その除草剤に対する選択が予め行
われた該除草剤を同様に含有する栄養培地上で遂行され
る。しかしながら状況によっては、何ら除草剤を含有し
ない栄養培地上で再生化が行われるのが好都合な場合も
ありうる。それゆえ本発明はまた前記した培養法で得ら
れ５る除草剤抵抗性培養植物、ならびにそれら植物と他
の遺伝子型との交雑へのその使用にも関し、ここで本発
明のこの部分は好ましくは単子葉栽培植物％に穀物植物
、および特に好ましくはとうもろこし植物に関する。

交雑させることにより、例えば１種または２種の除草剤
に対して抵抗性を有す、る雑種を生成させることもでき
る。これは除草剤抵抗性植物を非抵抗性通交系と交配さ
せるか、または異なる作用部位を有する異なる除草剤に
対して選択された２種の除草剤抵抗性植物を交雑させる
ことＫより達成される。かかる交雑は知られた方法によ
っても実施され５る。除草剤抵抗性植物なる用語は、雑
草の駆除に必要である適用割合の２倍で何ら損傷の徴候
を示さない植物を意味する。

本発明はまた、本発明方法により得られ、従って除草剤
に対して抵抗性を有する植物が植えつけられた田畑上の
雑草をその除草剤で選択的に死滅させることからなる栽
培植物の保護法にも関する。除草剤としてはアミノ酸の
生合成を阻害する物質、特に前記一般式■を有する化合
物が用いられるのが好ましい。特に好ましいのはグルフ
オシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）またはその構造
類似物、例えばジーおよびトリーペプチド、ならびにジ
メチルホスフィニルヒドロキシ酢酸である。それが光学
活性阻害剤である場合には、ラセミ化合物も光学活性化
合物も使用されうる。

除草剤または除草剤の混合物はそれ自体知られた方法で
好ましくは栽培植物の播種約１０〜１００日後に雑草が
充分に抑制されるまで、できるならば断続的に田畑に適
用される。

本発明を以下の実施例により詳細に説明する。

実施例 ｔ　アミノ酸を含有しない栄養培地上での形態形成性と
５もろこし細胞培養物の確立 ａ）通交系Ｂ７３、Ｗ６４ＡおよびＡ１８８　（それら
のハイブリッＰも同様に使用できる）の未成熟のと５も
ろこし粒から雌花の受粉１０〜１４日後に。

未分化胚をとり出した。好ましくは１〜１．５■の長さ
の胚を無菌条件下にカルス誘発培地に移しそして２５℃
±２℃で暗中にて培養した。適当なカルス誘発培地は第
１表にその組成が示される Ａ：ムラシゲおよびスクーグ氏の改良培地、または Ｂ：改良されたＮ６−培地、 にプロリン（１５００■／ｌ）、アスノぐラギン（５０
０■／ｌ）、グルタミン（５００ダ／Ｊ）、カゼイン氷
解物（ビタミン不含、５００１９／ｊ）およびスクロー
ス（６０ｆ／ｌ　’）を添加したものである。

この栄養培地に０．７−の寒天を加え、圧熱滅菌前６Ｃ
ＫＯＨを用いてｐＨ５，８に調整した。ビタミンを滅菌
−過しそして冷却された培地に加えた。

２〜３週間以内に画状原基および体細胞胚形成能のある
カルス培養物が形成された。

次にこのカルス培養物をアミノ酸を含有しない栄養培地
人およびＢで培養した。１５００の胚からかかる培養基
上で１年以上にわたり再生化能を保持したまま生育しう
る５つの細胞系統が確立された。継代培養は１５〜２８
日毎に行われた。

ｂ）実施例１　ａ）と同様にし【操作した。しかしなが
らアミノ酸を含有しない栄養培地に下記有機酸が添加さ
れた、すなわち、クエン酸（２００ｙｎｙ／ｌ＞、α−
ケトグルタレート（１５０ｍｊｐ／Ａり、りんご酸（１
３０〜／ｌ）、オキサロアセテート（１３０■／ｌ）、
コハク酸（１２０ダ／Ｊ）およびピルビン酸（９０Ｗｖ
／ｌ）。有機酸の原溶液は培地への添加に先立ちＮＨ５
溶液でｐＨ５，８Ｋ調整した。

２、　イン・ビトロ突然変異誘発 アミノ酸を含有しない栄養培地上に生育しさる形態形成
性とうもろこしカルス片をα１〜１％のエチルメタンス
ルホネートを含有する栄養溶液Ｂの塩からなる液体基壇
地中で１０〜１２０分間インキュベートし、前記基壇地
を用いて１０分間間隔で３回洗いそして培養基Ａまたは
Ｂ上で培養した。生き延びた形態形成性カルスセグメン
トを２〜４週間後に新鮮な培地上で継代した。

さもＶＣ２〜４週後にはカルスを選択実験にかけること
ができた。

＆　除草剤抵抗性カルス培養物の選択 アミノ酸を含有しない培地ＡまたはＢ（実施例１ｂ参照
）中における除草剤のどの濃度で９５〜９９チのカルス
が死ぬかを調査した。グル７オシネートについてもジメ
チルホスフィニルヒドロキシ酢酸についてもその濃度は
２　Ｘ　１０”−’モル／ｌであった。

それぞれ１００００個のカルスを除草剤を含有する寒天
培地（寒天α８チ）上に移し、６〜８週後に評価した。

Ｋ）　１３皿を２５℃および１０００〜２０００ルツク
スの下に１２時間の光同期でインキュベートした。グル
フォシネートを含有する培地上に暗緑色の画状原基を形
成して生育する１２個のカルスが形成された。ジメチル
ホスフィニルヒドロキシ酢酸を含有する培地では３個の
かかるカルスが得られた。

抵抗性の形態形成性カルスを反復して継代培養するとと
くより５ミリモル／ｌまでの濃度の除草剤に耐容できそ
してなお植物体に再分化し５る細胞系統を確立すること
ができた。

４、植物体への再分化 得られた胚形成能を有する除草剤抵抗性カルスは再生化
用培地（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸またはジカン
パ（ｄｉｃａｍｂａ）を含有しない培地ＡまたはＢ）上
で５〜５週、大抵は３〜４週以内で完全な植物体に分化
した。葉が１〜５３の長さに違したら、植物を寒天から
ミネラル性培養基質（バーミキュライト、パーライト）
に移植しそして最初の４〜７日間相対湿度９０〜１００
チで培養した。次に植物を生育キャビネット中または温
室中でさらに培養することができた。

さらに２〜４枚の葉が形成されるまで前記と５もろこし
再分化物を水耕法で生育させる。次に植物を土壌（砂質
ローム）Ｋ移植した。

５、除草剤の適用 植物が４〜５葉の時期に達したら、実際上慣用の適用割
合（グルフォシネートおよびジメチルホスフィニルヒド
ロキシ酢酸では活性成分（ａ、ｉ、）α５〜２に５７／
ｈａｌｃ相当する５　０〜２００　ＩＩ／ｍ２の活性化
合物）で植物に除草剤溶液を噴霧する。

除草剤は０．１〜１慢水溶液として噴霧される。処置さ
れた植物を１４〜２８日後に肉眼で評価した。除草剤抵
抗性に関する試験は市販のとうもろこしハイブリッド（
対照植物）で重い損傷（傷害等級＞９０％）を生ずる条
件下に実施された。

第２表に再生化植物への除草剤適用の結果をまとめる。

胴側合本９−）　　　損傷幅 ｔｏ＋０７５チ　　　　５％ Ｄ山−グルアオシ　００チ　　　　ｏｅｓネート　　　
　　　　　０．７５　　　　　　　　９０チ　　　　　
　０％１．０　　　　　　　９８％　　　　１０％６、
　再生化植物で観察される除草剤抵抗性の遺伝度 グルフオシネートで処理された再生化植物の一部は繁殖
力のある植物に生育した。これを自家受粉させそして除
草剤感受性（野生凰）遺伝子型例えばカラー）　（Ｋａ
ｒａｔ）　（品種［）または工Ｙ　（Ｂｄｏ）　（品Ｓ
用）との交雑実験にノ・イブリッドペアレント（花粉供
与体）として用いた。受精６週間後に成熟した種子を採
取した。

２１世代を生育キャビネット中日中温度２５℃および３
００００ルツクスの光同期１４時間、ならびに夜間温度
２０℃で相対湿度６０チで生育させた。植物は標準土壌
で生育させた。播種１４日後３〜４葉状態の植物にグル
フオシネートアンモニウム（０ＢＡ８ＴＡ　、　Ｈｏｅ
ｃｈｓｔ社製品、市販社製剤）を噴霧した。試験された
適用割合は０．７５およびｔ５ゆａ、ｉｖ／ｈａに相当
した。

第３表は除草剤処理４週後の得点結果を示す。

と□ 除草剤の適用割合： 品ＩＩＩ 品種■ 野生型再生化植物 品種Ｉ×抵抵抗性再生化 物の交雑 〉もろこし再生化植物の α７　ｓＴＫｇａｉ／ｈａ　　　ｔ　５ｋｙ　ａＶ誌９
０惨　　　　　１００１ ９５慢　　　　　１００憾 ６植物８５−７植物９５憾 ４植物２０憾　　５植物３０嗟

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）阻害剤を含有する栄養培地上で培養することにより
   、アミノ酸生合成阻害剤に対して抵抗性を有する栽培植
   物細胞系統を選択するに当り、 ａ）アミノ酸を含有しない栄養培地上でその胚形成能お
   よび形態形成能を保持したまま 生育するカルス培養物または細胞懸濁培養 物を選択し、 ｂ）これら培養物をアミノ酸を含有しない、阻害剤含有
   栄養培地上で培養し、そしてそ れから完全なる植物が再生される阻害剤抵 抗性培養物を選択する、 ことからなる方法。 ２）栄養培地に１種またはそれ以上の生理学的有機酸ま
   たはその塩が添加されることからなる請求項１記載の方
   法。 ３）栄養培地にクエン酸サイクルの酸または塩またはピ
   ルビン酸の酸または塩が添加されることからなる請求項
   ２記載の方法。 ４）前記酸または塩が０．１〜１０ミリモル／ｌの濃度
   で添加されることからなる請求項２または３記載の方法
   。 ５）前記酸または塩が０．５〜２ミリモル／ｌの濃度で
   添加されることからなる請求項４記載の方法。 ６）阻害剤が除草剤であることからなる請求項１〜５の
   いずれかに記載の方法。 ７）除草剤が一般式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I 〔式中、相互に独立して、 Ｒ＾１はヒドロキシルまたはメチルであり、Ｒ＾２はヒ
   ドロキシル、メチルまたはエチルであり、 Ｒ＾３はアミノメチレン、ヒドロキシメチレンまたはカ
   ルボニル基であり、 Ｒ＾４はＯＨまたは ▲数式、化学式、表等があります▼（ここでｘは１〜５
   で ある）であり、そして ｎは０〜４である〕を有する化合物であることからなる
   請求項６記載の方法。 ８）用いられる除草剤がグルフォシネート（ホスフィノ
   スリシン）、バイアラフォスまたはジメチルホスフィニ
   ルヒドロキシ酢酸であることからなる請求項７記載の方
   法。 ９）培養物の７０〜９９％までを死滅させるような濃度
   で阻害剤が添加されることからなる請求項１〜８のいず
   れかに記載の方法。 １０）培養物の９５〜９９％までを死滅させるような濃
   度で阻害剤が添加されることからなる請求項９記載の方
   法。 １１）請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により培
   養することにより得られる再生する能力のある、阻害剤
   抵抗性細胞系統。 １２）請求項１１記載の細胞系統からの再生により得ら
   れうる、阻害剤抵抗性栽培植物。 １３）請求項１１記載の細胞系統から得られる再生植物
   から得られうる、阻害剤抵抗性増殖用ストック。 １４）新規な、阻害剤抵抗性の栽培植物を育種するのに
   請求項１２記載の栽培植物を使用すること。 １５）植えつけられた栽培植物を、田畑を除草剤で処理
   することにより保護するにあたり、請求項１２記載の除
   草剤抵抗性栽培植物が植えられた田畑中の雑草植物相を
   アミノ酸の生合成を阻害する除草剤で処理することによ
   り選択的に破壊することからなる方法。 １６）前記除草剤が式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ I 〔式中、相互に独立して、 Ｒ＾１はヒドロキシルまたはメチルであり、Ｒ＾２はヒ
   ドロキシル、メチルまたはエチルであり、 Ｒ＾３はアミノメチレン、ヒドロキシメチレンまたはカ
   ルボニル基であり、 Ｒ＾４はＯＨまたは ▲数式、化学式、表等があります▼（ここでｘは１〜５
   で ある）であり、そして ｎは０〜４である〕を有する化合物であることからなる
   請求項１５記載の方法。 １７）除草剤がグルフォシネート（ホスフィノスリシン
   ）および／またはバイアラフォスおよび／またはジメチ
   ルホスフィニルヒドロキシ酢酸であることからなる請求
   項１５または１６記載の方法。