CN1026205C

CN1026205C - 抗除草剂玉米选育方法

Info

Publication number: CN1026205C
Application number: CN88102755A
Authority: CN
Inventors: 冈特·多恩
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1987-05-13
Filing date: 1988-05-12
Publication date: 1994-10-19
Anticipated expiration: 2003-05-12
Also published as: EP0290987A2; IL86358A; ZA883345B; AU1609588A; CN88102755A; ATE114331T1; DK259688A; EP0290987A3; CA1310928C; JPS63304927A; DK259688D0; HUT49977A; AU616405B2; HU202709B; EP0290987B1; IL86358A0; FI882203A; FI882203A0; DE3852146D1; ES2066769T3

Abstract

抗除草剂玉米细胞株和植物选育和再生方法，其中首先选育愈伤培养物并让其在无氨基酸的培养基中生长，培养基中还补充一种或多种酸，选自柠檬酸循环酸，如柠檬酸，α-酮戊二酸，苹果酸，草乙酸和琥珀酸或丙酮酸，然后其这些细胞放在含除草剂的相同改性培养基中培养并选育出抗性细胞，最后让这些细胞再生成植物，并且可数代抗除草剂。

Description

本发明涉及能抗氨基酸生物合成抑制剂的玉米细胞株选育方法。

用源于未成熟胚的愈伤培养物可再生玉米植物[Green C.E.，Philips，R.L.Crop.Sci.15，47（1975）;EP160390;EP177738]。但最初只在少数几种基团型如近交系A188，W64A和Black mexican sweet上取得了成功。最初改型的营养培养基可用许多不同的近交系建立起形态生成和胚胎生成的愈伤培养物[Duncan et al.，Planta 165，322（1985）]。其中重要的条件是向营养培养基中加氨基酸。

要经过数月或数年才能再生成完整植物的细胞培养物适于突变和变种细胞株的选育。例如，向培养基中加致毒剂量的除草剂时，某些愈伤组织仍存活下来，由此即可再生抗除草剂植物。如用诱变剂处理愈伤组织，则可提高突变产量（US4443971）。

除草剂是酶的抑制剂，而酶又参与氨基酸的生物合成，而在培养基含氨基酸，特别是在其合成受到特定除草剂抑制的氨基酸的情况下，除草剂对细胞培养物的除草作用却很有限。因此，在氨基酸存在下，即到目前为止被认为特别有利于建立和接种可再生的玉米愈伤组织的条件下，难于同时找到可抗阻止氨基酸合成的抑制剂的突变型。

本发明目的就是提出选育这种能够抗阻止氨基酸合成的抑制剂，尤其是抗除草剂的细胞株的方法，其中可在无氨基酸营养培养基中培养植物细胞株。还可在这种营养培养基中用这种细胞株再生植物。这是特别出人意料的，因为氨基酸对愈伤培养物或植物的生长和再生起决定作用。这种培养物可用来选育抗除草剂细胞株，愈伤培养物或植物。

因此，本发明提出的能抗氨基酸生物合成抑制剂的玉米细胞株选育方法，其中在含有除草剂的改性MS或N₆营养培养基中进行培养，该法包括：

a）选育愈伤培养物或细胞悬浮培养物并让其在无氨基酸的营养培养基中生长，同时又保持其胚胎生成和形态生成能力;

b）体外诱变处理所选育的愈伤培养物或细胞悬浮培养物;

c）在无氨基酸的含除草剂营养培养基上培养这些培养物，选育抗除草剂的培养物并由此再生出完整的植物。

以下尤其是以其优选实施方案详述本发明

用下述本发明方法可培养出能再生的抗除草剂植物优选是单子叶植物特别是谷物细胞株。更优选的是采用玉米细胞株。

为选育抗除草剂细胞培养物，必须先建立能在无氨基酸培养基上完好繁殖并可以高频诱发再生植物。为此可在无氨基酸培养基如在改性Murashige Skoog（MS）培养基上进行培养[Physiol.Plant 15，473（1962）]或在改性N₆-培养基上进行培养[Chu C.C.et al，Sci，Sin.16，659（1975）]。这种培养基主要含碳源如蔗糖，葡萄糖，麦芽糖和棉子糖，氮源如铵盐或硝酸盐以及专业人员熟知的维生素，激素和无机盐。

优选的是向有关营养培养基中添加一种或多种可有效影响培养物生长的生理有机酸或其盐特别是柠檬酸循环酸如柠檬酸，苹果酸，草乙酸，琥珀酸和丙酮酸或其盐且优选为钠盐和钾盐特别是铵盐。这些添加剂有助于愈伤或细胞悬浮培养物在无氨基酸培养基上生长并且能够在标准培养条件下经过长时间即至少1-2年的接种而不丧失植物再生能力。因此，这些化合物可代替氨基酸加入营养培养基，其浓度优选为约0.1-10mmol特别是0.5-2mmol。标准培养条件理解为专业人员熟知的条件。如可在15-35℃优选为20-30℃下进行培养，其中可有光照或无光照。转移期限一般可选为10-30天优选为14-21天，当然这取决于培养物的生长情况。

然后再用能在无氨基酸培养基上进行生长的细胞株选育抗抑制剂特别是抗除草剂的愈伤培养物和细胞悬浮培养物。采用这些培养物可进行抗基本上所有抑制剂但优选的是抗阻止氨基酸合成的除草剂的选育。其中优选的是进行抗下式除草剂的选育

式中各取代基互不关联，

R¹为羟基或甲基，

R²为羟基，甲基或乙基，

R³为亚氨基甲基，亚羟基甲基或羰基，

R⁴为OH或

其中x为1-5优选为1-2，

n为0-4，优选为0-2。

特别优选的是Glufosinate（Phosphinothricin）或其结构类似物如Bialaphos以及二甲基氧膦基羟基乙酸。若为旋光的，则可用这些化合物的外消旋物或生物活性对映体。

为在选育时得到更好的收率，可将选出的细胞株进行诱变处理。这可用化学品如甲磺酸乙酯或N-甲基-N-亚硝基胍（MNG）进行或用射线如伦琴或UV射线进行。这种诱变剂的用量应使细胞株的30-70%杀死。

抗抑制剂细胞悬浮培养物优选是愈伤培养物的合适选育在上述无氨基酸营养培养基上进行，其中加入抑制剂并且在培养基中的浓度可在很宽的范围内变化，基本上可这样选育以使70-99优选为95-99%的愈伤组织致死。这种选育可在相同或不断上升的浓度下重复多次。抗性细胞或可再生愈伤组织的选育产量可在营养培养基中加有上述生理有机酸或其盐时得到提高。此外，500-5000Lux下光照约8-16h或提高培养愈伤培养物时的选育性。而在普通条件下进行的培养可在一个或多个通道优选为2-4个通道中进行并且可用琼脂或液态培养基。转移间隔按生长速度变化，一般可为1-5星期优选为3-4星期。

特别是通过重复接种抗性形态生成愈伤组织和细胞悬浮培养物可确立细胞株，这种细胞株可承受高达5mM的除草剂浓度并且可进行植物再生。

当然，用本发明方法还可选育细胞悬浮培养物和可再生愈伤培养物，这些培养物可抗具有不同活性部位的两种除草剂。

再生抗除草剂植物可按已知方法在营养培养基上进行，该培养基中还可含先前以其进行选育的除草剂。但有时在无除草剂的培养基中进行再生更有利。因此，本发明还涉及抗除草剂植物，该植物可按上述培养方法得到，还涉及这些植物与其它基因型进行杂交的应用，其中本发明的这部分优选的是涉及单子叶植物特别是谷物，而更优选的是玉米植物。

例如，通过杂交可得到能抗一种或两种除草剂的杂种。将抗除草剂植物与非抗性近交系杂交或将两种选来抗具有不同活性部位的不同除草剂的抗除草剂植物杂交即可达到这一目的。这种杂交也可按已知方法进行。抗除草剂植物可理解为在两倍于除草所需用量情况下不出现任何损害的植物。

本发明还涉及植物保护方法，其中在种植有按本发明方法得到的抗除草剂植物的地面上用除草剂选育性除去杂草。除草剂优选用可阻止氨基酸生物合成的物质特别是上述式Ⅰ化合物。特别优选的是Glufosinate或其结构类似物如二或三肽以及二甲基氧膦基羟基乙酸。若为旋光的，则可用外消旋物以及适宜的旋光化合物。除草剂可按已知方式施于地面上，在可能的情况下采取一定间隔优选为植物播种后约10-100天，直至杂草得到了有效的控制为止。

以下用实施例详述本发明。

实施例

1.在无氨基酸的营养培养上确立形态生成玉米细胞培养物

a）雌性花授粉后10-14天从未成熟的近交系B73，W64A，A188（也可用杂种）玉米核中分裂出未成熟胚胎。该胚胎优选长1-1.5mm，然后在无菌条件下将其转移到愈伤诱导培养基上并于25℃±2℃下在暗室中培养。适宜的愈伤诱导培养基为

A：改性Murashige和Skoog培养基，或

B：改性N₆培养基

其组成列于表1，其中添加脯氨酸（1500mg/l），天冬酰胺（500mg/l），谷氨酰胺（500mg/l），酪蛋白水解物（无维生素，500mg/l）和蔗糖（60g/l）。

将0.7%的琼脂加入营养培养基中并在高压灭菌处理之前用KOH调至pH5.8。维生素过滤灭菌后加入冷却培养基中。

表1

营养培养基

改性MS-培养基（A）改性N-培养基（B）

mg/l mg/l

MgSO₄·7H₂O 370 250

CaCl₂·2H₂O 440 166

KNO₃1900 2830

（NH₄）₂SO₄- 433

NH₄NO₃1650 -

KH₂PO₄170 400

2-3星期内即可形成愈伤培养物，而该培养物又可形成枝原基和体细胞胚。

然后将此愈伤培养物放在无氨基酸培养基A和B上培养。用1500个胚即可确立5个细胞系，该细胞系可在这种营养培养基上生长1年以上，同时又可保持其再生能力。每15-28天进行接种。

b）

操作同实施例1a），但向无氨基酸营养培养基中加以下有机酸：柠檬酸（200mg/l），α-酮戊二酸（150mg/l），苹果酸（130mg/l），草乙酸（130mg/l），琥珀酸（120mg/l）和丙酮酸（90mg/l）。有机酸的储备溶液在加入培养基之前用NH₃溶液调至pH5.8。

2.体外诱变

在由含0.1-1%甲磺酸乙酯的营养溶液B的盐构成的液态盐培养基中接种可在无氨基酸的营养培养基上的形态生成玉米愈伤节片达10～120分钟，用盐培养基每10分钟洗涤3次，然后放在培养基A或B上进行培养。活下来的形态生成愈伤节片经过2-4星期即在新的培养基上接种。再经过2-4星期之后可将愈伤培养物取出来进行选育试验。

3.选育抗除草剂的愈伤培养物

确定无氨基酸培养基A和B（按实施例1b）中95-99%的愈伤组织死去的除草剂浓度。对于Glufosinate和二甲基氧膦基羟基乙酸两者，浓度均为2×10^-4mol/l。

分别将10000个愈伤组织转移到含除草剂琼脂培养基（0.8%琼脂）并在6-8星期后进行评价。陪氏培养皿每天于25℃以1000-2000Lux光照12h进行培育。含Glufosinate培养基上形成12个愈伤组织，同时形成深绿色枝原基。而在含二甲基氧膦基羟基乙酸的培养基上得到3个这样的愈伤组织。

重复接种抗性形态生成愈伤组织即可确立细胞株，其除草剂耐受浓度高达5mmol/l并可进行植物再生。

4.植物再生

在再生培养基（无2，4-二氯苯氧乙酸的培养基A或B或Dicamba）上所得胚胎生成抗除草剂愈伤组织经3-5星期多数情况下是3-4星期即分化出完整的植物。一旦叶子长到1-3cm长，就可将植物从琼脂上移植到无机培养基（蛭石，珍珠石）上并且在最初的4-7天时间内于90-100%的相对湿度下进行培养。然后可在人工气候室或温室中进行培养。该再生玉米一直保养在溶液培养基中直到再长出2-4叶为此。之后就可将植物种植在土壤（砂质粘土）里。

5.撒除草剂

于4-5叶期向植物喷撒除草剂，其用量为常规用量（在Glufosinate和二甲基氧膦基羟基乙酸情况下均为50-200mg活性物质/m²，相当于0.5-2kg ai/ha）。除草剂以0.1-1%的水溶液态喷撒。14-28天后肉眼评价被处理植物。除草剂抗性试验在这样的条件下进行，即该条件会使市售玉米杂种（对比植物）出现严重损害（损害程度＞90%）。表2列出了向再生植物喷撒除草剂后的结果。

表2

二甲基氧膦基羟基乙酸和D，L-Glufosinate作用于抗除草剂愈伤组织再生植物的除草功效，为撒除草剂后4星期的评价结果。

所用除草剂用量损害%

若给出2个用量：对比植物抗性愈伤组织

则为间隔10天的再生植物

分用量

0+0 0 0

二甲基氧膦基 0.5+1.0 95 15

羟基乙酸 0.75+0.75 90 10

1.0+0 75 5

0 0 0

D，L-Glufosinate 0.75 90 0

1.0 98 0

b.再生植物上观察到的除草剂抗性遗传性

让部分Glufosinate处理再生植物长成能育植物。这些植物自交后用作为与对除草剂敏感的（野生）基因型如Karat（栽培品种Ⅰ）或Edo（栽培品种Ⅱ）进行杂交试验的杂种亲本（花粉供体）。授粉后6星期收获成熟的种子。

F₁代在人工气候室中进行培植，其中空气相对湿度为60%并于25℃白天温度以30000lux光照14h，而夜晚温度为20℃。植物在标准土地上培植。播种后14天向3-4叶期植物喷撒Glufosinate铵（

BASTA，Fa.Hoechst AG，市售配方）。试验用量为0.75和1.5Kg ai/ha。

表3给出了除草剂处理后4星期评价结果。

表3

抗Glufosinate在玉米再生植物的F₁后代评价结果

除草剂用量 0.75Kg ai/ha 1.5Kg ai/ha

基因型损害（%）

栽培品种Ⅰ 80 95

栽培品种Ⅱ 90 100

野生再生植物 95 100

Glufosinate 10株试 3株植物85 2株植物95

再生植物的F₁自交后代验植物 7株植物20 6株植物40

2株植物20

栽培品种Ⅰ与抗 6株植物85 7株植物95

性再生植物杂交 4株植物20 3株植物30

Claims

1、能抗氨基酸生物合成抑制剂的玉米细胞株选育方法，其中在含有除草剂的改性MS或N₆营养培养基中进行培养，该方法包括：

a)选育愈伤培养物或细胞悬浮培养物并让其在无氨基酸的营养培养基中生长，同时又保持其胚胎生成和形态生成能力；

b)体外诱变处理所选育的愈伤培养物或细胞悬浮培养物；

c)在无氨基酸的含除草剂营养培养基上培养这些培养物，选育抗除草剂的培养物并由此再生出完整的植物。

2、根据权利要求1所述的方法，其中包括向营养培养基中添加一种或多种酸或盐，选自柠檬酸，α-酮戊二酸，苹果酸，草乙酸，琥珀酸和丙酮酸或其盐。

3、根据权利要求2所述的方法，其中添加酸和盐的浓度0.5-1.5mmol/l。

4、根据权利要求1所述的方法，其中所加除草剂为通式（Ⅰ）化合物：

其中各取代基互不关联，

R¹为羟基或甲基，

R²为羟基，甲基或乙基，

R³为亚氨基甲基，亚羟基甲基或羰基，

R⁴为OH或

其中x为1-5，而n为0-4。

5、根据权利要求4所述的方法，其中所用除草剂为Glu-fosinate（phosphinothricin），Bialaphos或二甲基氧膦基羟基乙酸。

6、根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其中添加0.1-1mM的抑制剂。

7、根据权利要求6所述的方法，其中添加0.25-1mM的抑制剂。