JPS63173530A - イネ科雑種植物およびその製造方法 - Google Patents

イネ科雑種植物およびその製造方法

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JPS63173530A
JPS63173530A JP61223346A JP22334686A JPS63173530A JP S63173530 A JPS63173530 A JP S63173530A JP 61223346 A JP61223346 A JP 61223346A JP 22334686 A JP22334686 A JP 22334686A JP S63173530 A JPS63173530 A JP S63173530A
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protoplasts
rice
cells
plant
cultured
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功 島本
淳子 経塚
理枝 寺田
泰行 林
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Mitsubishi Kasei Corp
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Mitsubishi Corp
Mitsubishi Kasei Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞融合法を用いて作出したイネ科雑種植物お
よびその効率的製造方法に係るものである。
〔従来の技術〕
細胞融合法は従来の交配法によって得ることのできない
種間あるいは風聞の雑種を得る方法として有効な手段で
ある。
しかし、主要作物を含むイネ科の植物ではヒエであるＰ
ｅａｒｌ　ｍ１ｌｌｅｔと牧草のＧｕｎｉａｇｒａｓｓ
との、１）胞融合の例が報告（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔ。
２０３．３６ｓ　〜３７０．／り♂乙）されているだけ
で他の重要作物の細胞噂合例は報告されていない。また
効率よく雑種植物を得るためには融合条件、雑種の選抜
法、植物体再生法が確立されなければならないが、イネ
科植物に関してこの様な条件はほとんど報告されていな
い。
〔発明が解決しようとする問題点〕
本発明は細胞融合法により製造したイネ科植物、特にイ
ネと他のイネ科槓物の体細胞雑種植物およびその効率的
な製造性を提供することを目的とするものである。
〔問題点を解決するための手段〕
上記目的は本発明に従いイネ由来のカルスま念はサスペ
ンション細胞から調製したプロトプラストと他のイネ科
植物由来のカルスまたはサスペンション細胞から調製し
たプロトプラストとを融合させ穴径、イネ培養細胞を含
有する培地で培養してコロニーを形成させ、該コロニー
を植物ホルモンを含む培地で生育させることにより達成
される。
本発明の詳細な説明するに、本発明の対象となるイネと
しては日本晴、コシヒカリ、ササニシキ等の錆培イネが
挙げられ、その完熟および未熟種子、葉しよう、根の組
織に由来するサスペンション細胞あるいはカルスを液体
培地で培養した後、プロトプラストを調製する。
例えば上記植物材料を次亜塩素酸ソーダ等で滅菌処理し
た後Ｍｕｒａａｈｉｇｅ　ａｎｃｌ　Ｓｋｏｏｇ　（Ｍ
Ｓ）（Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ、　／ｊ；　４Ｃ
７ｊ−４ｃ９７　、　／り≦２）寒天培地等に置床し、
２！−，２／’Ｃ，２０００−３００θ１ｕｘ（／７ｈ
ｒ日畏）の条件下で培養してカルスを誘導し、このカル
スをＭＳ−ｉたｄＲ２（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙ
ｅｉｏｌ、／ＩＩ　；　／／／ｊ−／／２／。
／９７３）液体培地中、上記条件で撮とう培養（ｒ　Ｏ
−／　ｓ　Ｏｒｐｍ　）　シプロトブラストを得る。
栽培イネ以外のイネ科植物、例えばタイヌビエ（Ｅｃｈ
ｉｎｏｃｌｏａ　０ｒｙｚｉｃＯ１ａ　）　　において
は、完熟種子または無菌条件下で生育させた実生植物の
葉しようあるいは根をＭ　Ｓ　ＳＬ（天培地に置床しカ
ルスを得、栽培イネと同様の方法で振とり培養しプロト
プラストを得る。
上記培養細胞からプロトプラストを得るためにはセルラ
ーゼやマセロザイム等の細胞壁分解酵素を含む酵素液中
２５〜３θ０．０〜ｊθｓｐｍのφ件で３〜７６時間程
度酵素処理する。酵素処理終了後、ろ過して未消化物を
除き、ろ液に２〜！培ｉＯＫＭｃ液（ＫＣ！１０．／　
／／Ｍ　、　Ｍｇ（！１４θ、θｒ／７Ｍ　、　ＣａＣ
１４０，ＯｒｙＭ　、　ｐＨ４，０）　（Ｔｈｅｏｒ。
Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　ｓＪ　；　ｊ　７−６　Ｊ
　、　／ワ２／）等を加え、遠心分離し、精製されたプ
ロトプラストを得る。
得られたプロトプラストはマニトール、モルフォリノエ
タンスルホン酸（ＭＢ２）等を含む溶液に懸だくした後
、例えば交流および直流の電流で電気処理することによ
り融合させるが、イネ由来のプロトプラストは予め／〜
ｊＯｍＭ濃度のヨードアセトアミド、モノヨード酢酸等
のヨード化合物で参℃付近でｊ〜３０分程度処理してお
くことが好ましい。
また、必要に応じ、他のイネ科植物由来のプロトプラス
トは、予め５〜１０θμＭの濃変のロダミン６Ｇなどの
ロダミン系化合物で、室温で１０〜７２０分程度処理し
ておく。その際、プロトプラストの密度は、／×７０”
〜／Ｘ１０Ｔｃｅｌｌｓ／ｘｅであるのが好ましい。
これらの処理によりブロトプラストは後述の培養培地で
単独では分裂能がなくなる。他のイネ科植物由来のプロ
トプラストがそれ単独では後述の培養培地で分裂能がな
いときは、上述のロダミン系化合物、での処理は特に行
なわなくともよい。
プロトプラストを電気処理により融合させるには、プロ
トプラストを０．２〜０．６　Ｍ−ｆニトールとｏ、ｏ
　ｒ　−ｏ、ｓ％ＭＦＳを含む溶液中に等密度で合計が
／〜ＪＸ１０’／Ｍｌとなるように混合し、２．０００
〜７，０００　ＫＨｚ　、　ｓθ〜ｓ　ｏ　ＯＶ／Ｃｍ
の交流を７〜３０秒与え、その後へｓ　〜７．ｓ　ＫＶ
／　ｃｍの直流パルスを０．７〜／秒おきに／〜７００
μ秒間、７〜７０回与え、再び上記条件の交流を７〜．
２００秒加え融合させる。
好ましくは上述のようにして融合処理したプロトプラス
トを例えばＲ２の無機成分とＭ日のビタミン混合液を含
む液体培地（Ｒ，２／ＭＥＩ）あるいはＭＥＩ培地で好
ましくは窒素源として硝酸カリウムをθ、２〜０．５含
有する培地に懸だくし、これを／、０〜３．０チ程度の
アガロースを含むＲ２／　Ｍ　ＳあるいはＭＳ培地等と
等量づつ混ぜ、速やかにシャーレ中に広げてうずく同め
る。この時のプロトプラストの密度は約２〜！×７０”
個／ｙｔｌとなるようにし、またアガロースの厚さは平
均０．７　ｗｎ程度となるようにするのがよい。
固化したアガロースゲルをｊ　％　２０　ｔａｎ程度の
大きさに切り、上記液体培地中で培養する。その際イネ
培養細胞を１００〜３００〜ＦＷ／シヤーレ程度共存さ
せ、２θ−ｊＯｒｐｍの回転でゆつくシ振とうしながら
、暗条件下２３〜２７℃で培養する。
イネ培養細胞と共存させる方法は上記の方法のほかに、
イネ培養細胞を、底にメンブランフィルタ−等を設けた
容器内に入れ、その容器をプロトプラストを含む液体培
地中に浸してメンブランフィルタ−を介して共存させる
方法がある。
本発明で使用するイネ培養細胞は、旺盛に分裂している
細かい細胞塊から成るものが好ましい。このような培養
細胞を得るには、例えば、イネ植物の種子、茎、根ある
いは駒より得られたカルスを液体培地中で継代して選抜
して行く等の公知の方法に準じて容易に得られる。
かかる培養によって融合細胞のみが分裂増殖してくる。
培養開始後３〜７日目で第１分裂が始まシ、約７０８目
にはすべての分裂能を持つ念細胞が第１分裂を終えイネ
培養細胞と特に共存しなくとも増殖するようになるので
新しい培地に更新すると同時にイネ培養細胞を取り除く
。培養後３〜／週間後には０．５〜／、０ｔｒａｓφ程
度のコロニーが形成される。
次いでこのコロニーを増殖培地、例えばＲ６基本培地（
Ｓｃｉ、　Ｓｉｎ、＃；　；　ｔｓ９−６１１　、　／
　？７ｆ）に植物ホルモン、例えば２２μｍジクロロフ
ェノキシ酢酸（２，弘−Ｄ）を２９７を程度、アガロー
スを０．７〜７．０％加え九寒天培地上でλ〜参週間、
照明下（１０００−４θ０θ１ｕｘ）、２Ｊ〜２７℃で
培養し３〜６ｒｙｍφの雑種カルスを得る。
この雑種カルスを例えば０．３ｒ〜７．５％アガロース
を含むＮ６培地（但しホルモンフリーあるいはサイトカ
イニンを／〜１０ｙｎｇ／を添加）でＪＪ〜２７℃、２
０００〜４ｃ０００１ｕｘの灸件下に培養すれば２〜／
θ週間で不定胚（８ｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏ　）の形
成が認められる。更に２〜３週間ホルモンを含まないＲ
６培地等で培養することにより移植可能な雑種個体が得
られる。
〔実施例〕
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はそ
の要旨を超えない限り、以下の実施例に制約されるもの
ではない。
（１）　　プロトプラストの調製 穀培イネ（品種：日本晴）の完熟種子を滅菌処理した後
、ＭＳ寒天培地（２■／１２，４−Ｄ％？２／ｌバクト
アガー、ｐ）！　！、♂）に置床し、２６℃、３０θ０
１ｕｘで３週間培養することによりカルスを誘導した。
次にそのカルスをＲ２／　Ｍ　Ｓ液体培地（Ｒ２無機塩
、Ｍ日ビタミン、／■／１２，４−Ｄ、３０９／ｌしよ
糖、ｐＨｓ、ｒ　）中で数週間振とう培養（／２θｒｐ
ｍ、２ｓ℃、ＪＯＯＯｌｕｘ）した後弘チセルラーゼＲ
８，／％マセロザイムＲ−１０％Ｏ０弘Ｍマニトールを
含む酵素液（ｐＨｊ、に）で３〜４４時間３０℃で処理
した。
酵素処理液をろ過した後、ろ液に参倍量のＫＭＣ液（Ｋ
Ｃｌ　θ、／　／　／　Ｍ　、　　ＣａＣ１１０，６７
ｊ　Ｍ　。
０．０７７７Ｍ　ｐＨに、０）を加え遠心分離して沈降
したプロトプラストを集めさらにＫＭＯ液で２回洗浄し
た。
一方タイヌビエ（ｚｃｈｌｎｏｃｌｏａ　ｏｒ７ｚｉｃ
ｏｌａ　）の種子を滅菌処理した後、ホルモンを含まな
いＭＳ寒天培地（ＪＯｔ／１しよ糖、ｔｒｙ／ｌバクト
アガーｐＨｊ、？）上で発芽させ（２５℃、３ｔ）ｏｏ
ｌｕｘ）、７０日後葉しようの部分を厚さ０．ｊｔｒｒ
ＬＲのディスク状に切シ出し、　４ｃｓｐ／１２．弘−
Ｄを含む上記寒天培地上に置床し、３週間培ｇ＃（２ｊ
℃、３ｏｏｏ１ｕｘ）した後カルスを誘導した。次にそ
のカルスをＭＳ液体培地（／η／１２．弘−り、Ｊθｔ
　／　ｔ　ｌ、よ糖ｐａ　ｓ、ｒ　）中で数週間振とう
培養（／２θｒｐｍコｊ℃、３０θｏ　１ｕＸ　）　し
た後４Ｌ％セルラーゼＲ８，／％マセロザイＡＲ−７０
，０，４４Ｍ　マニトールから成るｐＨｊ、乙の酵素液
で３〜参時間、３０℃で処理した。
酵素処理液をろ過した後、ろ液に参倍量のＫＭＣ液を加
え、遠心分離して沈降し次プロトプラストを集め、さら
にＫＭＯ液で２回洗浄した。
（２）　　ヨードアセトアミド処理 上記（１）で？ＡＭしｆｃ＊培イネの培養細胞由来プロ
トプラストご×７０６ａを、ＫＭＣ液！−に懸だくシ、
これにｓ　ＯｍＭヨードアセトアミドｆｆＬを最終濃度
が、２　ｊ　ｍＭとなるように添加し、参℃、７５分間
、暗条件下で処理した。
処理後Ｓ分間遠心分離して集めたプロトプラストを一回
ＫＭＣ液で洗浄した。
（３）　　細胞融合 上記（１）および（２）でｖ４製したプロトプラストを
それぞれ／〜コ×１０７個／ｍｌとなるようにＯ０≠ｊ
Ｍマニトール、／ｆ／ＩＭＭＢを含むｐＨｊｊの溶液に
懸だくし、これを７０θ〜２００　ｐＬとシ、ａｃｈｉ
ｏθθ２細胞融合装置を用い電気処理を行なった。融合
条件としては、まず弘、θθＯＫＨｚ　、　２　ｊ　Ｏ
Ｖ／７７＋の交流を３〜７秒かけ穴径、３．ｊＫｖＺσ
の直流を７秒おきに３回、１０μ秒間かけ、その後再び
３０秒間ｔｔ、０００　Ｋｌ（ｇ　）交流ｆ：２　ｊ　
ＯＶ　／　２から徐々に減少しながらかけ念。融合処理
したプロトプラストは直接培養した。
（４）融合細胞の培養 上記（３）で得た融合細胞を０．４ｃ％ＫＮＯ３を含む
Ｒ，２／Ｍ　Ｓ培地（２ｍ９／　ｔ　２．弘−Ｄ１θ、
≠Ｍしよ糖、ｐＨｊ、６　）に懸だくし、この懸だ〈液
０、ｓｚｉと約≠θ℃に温めたアガロース２％を含む１
．２　／　Ｍ　Ｓ培地θ１ｙｘｌとを混合し、速やかに
３５−φシャーレに均一に広げて固化させた。この時の
細胞密度はｊ　Ｘ　／　０　’　／　ｍであった。この
固化したアガロースゲルをｊＸ２Ｏｆ位の大きさに切シ
、上記Ｒ２／Ｍ　Ｅｌ培地ｊ　ａｔのはいっている６ｍ
φのシャーレに浮かべ、同時にイネの培養細胞１０θ〜
／ｊ０■（ＦＷ）を加えた。このイネの培養細胞は次の
ようにして調製し次。即ち、実生のイネの根に由来細か
い（／ｇＩｒＭφ以下）の細胞塊を用いた。
プロトプラストの培養はＪ　Ｏｒｐｍ位の回転でゆつ＜
シ損とうしながら暗条件下、２ｊ℃で行なった。培養開
始後３〜５日目で第１分裂が始まシ、７０日目までには
第１分裂が終了した。培養／θ日目にイネ培養細胞を取
り除き、アカロースゲルを新しいＲ２／ＭＥ培地！罰の
はいったシャーレに移し、引続き同−千件で培養を行つ
念ところ３〜４Ｌ週間後には０．５〜／、０ｖｒｔｎφ
のコロニーが形成された。形成され元コロニーは通常の
ＰＥ！Ｇ−ＤＭＳＯ法により融合処理したプロトプラス
トを使用した場合の約５〜１０倍であった。
このコロニーをＮ６ソフトアガー培地（Ｎｓ：、２〜／
１２，４−Ｄ％Ｏ，ｊη／ｌ−９ジＯ，ｊηプリン、５
％しよ糖、θ、２ｊ％アガロース、ｐＨｊ、に）でコル
３週間、２ｊ℃、３．θ０Ｑ１ｕｘの条件で培養し念後
、個々のコロニーをＮ６増殖培地（Ｎ、　：　ｘｒｒｑ
／ｌ　ｓ、ｐ−Ｄ、　ｏ、！ｒｍｔｌ／ｌベンジルアミ
ノプリン、コチしよ糖、０．５％アガロース、ｐＨｊｊ
　）に移し引続き同−東件で培養を行ったところ２〜３
週間で一〜３鰭φのカルスが形成された。
このカルスをさらに一〜？週間、同−東件でＮ６再分化
培地（Ｎ６：ぶチしよ糖、ｐＨｊ、ｔ　）で培養したと
ころ不定胚の形成が認められ念。
更に常法に従って育成し、植物体を得念。
得られたカルスは下記の方法によって雑種検定したとこ
ろＪ″θ％０％以上が雑種であることがわかった。その
内弘個（Ｈ／〜Ｈ弘）のカルスの染色体数は表／に示す
通シであった。また、Ｈ／及びＦｉ２についてのアイソ
ザイムの電り泳動結果を図／に示した。
表／　　イネ、ヒエ及び雑種カルスの染色体数雑種検定
は常法に従い染色体数、抜型解析、ロイシンアミノペプ
チダーゼ等のアイソザイムの電気泳動パターンおよび形
態的特徴を基に解析した。
〔発明の効果〕
本発明方法によれば、再現性が高く、交雑法で得られな
いイネ科雑種揮物を効率よく得ることができる。
【図面の簡単な説明】
図／は本発明方法で得られたカルスのＬＡＰ（ロイシン
アミノペプチダーゼ）アイソザイムの電気泳動バンドパ
ターン図を示す写真である。 ０８：イネ、　勃：タイヌピ゛工 Ｈｌ　、　Ｈ２：雑種カルス ｍｉｘ　：　ＯｓとＥＯのｍ１ｘｔｕｒｅ出　願　人　
三菱商事株式会社 三菱化成工與株式会社 代　理　人　　弁理士　長谷用　　　−ほか／名

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）イネ由来のプロトプラストと他のイネ科植物のプ
    ロトプラストの細胞融合により得られる雑種植物
  2. （２）他のイネ科植物がタイヌビエである特許請求の範
    囲第１項記載の雑種植物
  3. （３）イネ由来のカルスまたはサスペンション細胞から
    調製したプロトプラストと他のイネ科植物由来のカルス
    またはサスペンション細胞から調製したプロトプラスト
    とを融合させた後、イネ培養細胞を含有する培地で培養
    してコロニーを形成させ、該コロニーを植物ホルモンを
    含む培地で生育させることを特徴とするイネ科雑種植物
    の製造方法。
  4. （４）融合に先立ちイネ由来のプロトプラストまたはサ
    スペンション細胞から調製したプロトプラストをヨード
    化合物で処理し、一方他のイネ科植物由来のカルスまた
    はサスペンション細胞から調製したプロトプラストは必
    要に応じロダミン系化合物で処理することを特徴とする
    特許請求の範囲第３項記載のイネ科雑種植物の製造方法
    。
  5. （５）プロトプラストの融合を電気処理で行なうことを
    特徴とする特許請求の範囲第３項記載のイネ科雑種植物
    の製造方法。
  6. （６）融合細胞をイネ培養細胞及び窒素源として硝酸カ
    リウムを０．２〜０．５％含有する培地中で培養してコ
    ロニーを形成させることを特徴とする特許請求の範囲第
    ３項記載のイネ科雑種植物の製造方法
  7. （７）植物ホルモンが２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
    であることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載のイ
    ネ科雑種植物の製造方法
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EP87402105A EP0263017B1 (en) 1986-09-20 1987-09-21 Process for preparing gramineous hybrid plants
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