JPS61192283A - ミカン科植物の体細胞雑種の作出方法 - Google Patents
ミカン科植物の体細胞雑種の作出方法Info
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- JPS61192283A JPS61192283A JP60030611A JP3061185A JPS61192283A JP S61192283 A JPS61192283 A JP S61192283A JP 60030611 A JP60030611 A JP 60030611A JP 3061185 A JP3061185 A JP 3061185A JP S61192283 A JPS61192283 A JP S61192283A
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- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
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- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はミカン科植物の体細胞雑種をプロトプラストに
よる高等植物の細胞融合法により効率良（作出する方伍
に関する。
よる高等植物の細胞融合法により効率良（作出する方伍
に関する。
従来、ナス科、セリ科及びアブラナ科等の一邪の植物に
ついては、細胞融合法による体細胞雑種の作出例が見ら
れるが（Ｇｌｅｂａ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎｎ’ Ｐ
ｌａｎｔａリリ、ｔｉ２〜／／７頁、１９ｇθ年）％ポ
リエチレングリコ−ル等による植物細胞の融合処理は、
植物細胞に障害を与えることや、細胞間の不和合性等に
まり体細胞雑種が得られなかったり。
ついては、細胞融合法による体細胞雑種の作出例が見ら
れるが（Ｇｌｅｂａ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎｎ’ Ｐ
ｌａｎｔａリリ、ｔｉ２〜／／７頁、１９ｇθ年）％ポ
リエチレングリコ−ル等による植物細胞の融合処理は、
植物細胞に障害を与えることや、細胞間の不和合性等に
まり体細胞雑種が得られなかったり。
又細胞融合により生じた雑種細胞のみの選択法等が確立
されていない等の理由により、ミカン科植物については
細胞融合にょる体細胞雑種の作出の成功例がない。更に
ミカン科植物の場合、多胚性、無核性やさらに不和合性
等の現象により、従来の交雑育種法では組合せによって
雑種を得ることが極めて困難であった。
されていない等の理由により、ミカン科植物については
細胞融合にょる体細胞雑種の作出の成功例がない。更に
ミカン科植物の場合、多胚性、無核性やさらに不和合性
等の現象により、従来の交雑育種法では組合せによって
雑種を得ることが極めて困難であった。
上記したように、これまでミカン科植物の細胞融合によ
る体細胞雑種の作出例は見当らない。
る体細胞雑種の作出例は見当らない。
かぐして、細胞融合法によりミカン科植物の体細胞雑種
を効率良（、シかも確実に得ることの出来る作出手段の
開発が業界では強（要望されている。この問題点を解決
したのが未発明である。
を効率良（、シかも確実に得ることの出来る作出手段の
開発が業界では強（要望されている。この問題点を解決
したのが未発明である。
木発明者等は一プロトプラスト融合処理によるミカン科
植物の体細胞雑種の作出法に関し鋭意検討を重ねた結果
、不定胚形成細胞より得た融合処理に耐性でかつ分裂増
殖能等の旺盛な珠心由来のミカン科植物の不定胚形成細
胞のプロトプラストと分裂増殖能を持たない他のミカン
科植物の葉肉細胞等のプロトプラストを融合させた後、
これを植物ホルモンを含まず、高濃度の蔗糖等の糖の存
在下で培養すれば、雑種以外の未融合の不定胚形成細胞
又は珠心由来の不定胚形成細胞同志の融合細胞の不定胚
分化を抑え、ミカン科植物の雑種細胞のみを選択的に得
ることが出来ることを知り。
植物の体細胞雑種の作出法に関し鋭意検討を重ねた結果
、不定胚形成細胞より得た融合処理に耐性でかつ分裂増
殖能等の旺盛な珠心由来のミカン科植物の不定胚形成細
胞のプロトプラストと分裂増殖能を持たない他のミカン
科植物の葉肉細胞等のプロトプラストを融合させた後、
これを植物ホルモンを含まず、高濃度の蔗糖等の糖の存
在下で培養すれば、雑種以外の未融合の不定胚形成細胞
又は珠心由来の不定胚形成細胞同志の融合細胞の不定胚
分化を抑え、ミカン科植物の雑種細胞のみを選択的に得
ることが出来ることを知り。
本発明を完成した。
すなわち、本発明はミカン科植物の胚珠を植物ホルモン
を含まない培地に培養して得た珠心由来の培養細胞を、
植物ホルモンを含む培地で継代培養することにより未分
化増殖細胞を得、これを植物ホルモンを含まない培地又
は植物ホルモンを含み培地組成を変更した培地で培養す
ることにより不定胚形成細胞を得、この不定胚形成細胞
より得たプロトプラストと、他のミカン科植物の組繊細
胞又は胚珠以外の組織を培地に培養して得られる分化能
を殆どもしくは全く持たない培養細胞より得たプロトプ
ラストとを融合させた後、これを植物ホルモンを含まず
、かつ高濃度の糖を含む培地で培養することにより、細
胞融合した雑種細胞のみを不定胚分化させ、体細胞雑種
のみを選択的に得ることを特徴とする、ミカン科植物の
体細胞雑種の作出方法である。
を含まない培地に培養して得た珠心由来の培養細胞を、
植物ホルモンを含む培地で継代培養することにより未分
化増殖細胞を得、これを植物ホルモンを含まない培地又
は植物ホルモンを含み培地組成を変更した培地で培養す
ることにより不定胚形成細胞を得、この不定胚形成細胞
より得たプロトプラストと、他のミカン科植物の組繊細
胞又は胚珠以外の組織を培地に培養して得られる分化能
を殆どもしくは全く持たない培養細胞より得たプロトプ
ラストとを融合させた後、これを植物ホルモンを含まず
、かつ高濃度の糖を含む培地で培養することにより、細
胞融合した雑種細胞のみを不定胚分化させ、体細胞雑種
のみを選択的に得ることを特徴とする、ミカン科植物の
体細胞雑種の作出方法である。
先ず、本発明に用いられる珠心由来のミカン科植物の培
養細胞は、例えばオレンジ、グレープフルーツ、レモン
等のミカン科植物の開花日からｇ週目程度までの花より
、その胚珠を無菌的に取り出し、これを植物ホルモンを
含まない培地例えば５％（Ｗ／■）蔗糖とＱ −ｇ 、
／−θ係（Ｗ／Ｖ ３の寒天を含む培地〔例えばムラ
シゲとタッカ−のＭＴ基本培地（Ｐｒｏｃ、Ｆｉｒｓｔ
Ｉｎｔ、Ｃ１ｔｒｕｓ Ｓｙｍｐ。
養細胞は、例えばオレンジ、グレープフルーツ、レモン
等のミカン科植物の開花日からｇ週目程度までの花より
、その胚珠を無菌的に取り出し、これを植物ホルモンを
含まない培地例えば５％（Ｗ／■）蔗糖とＱ −ｇ 、
／−θ係（Ｗ／Ｖ ３の寒天を含む培地〔例えばムラ
シゲとタッカ−のＭＴ基本培地（Ｐｒｏｃ、Ｆｉｒｓｔ
Ｉｎｔ、Ｃ１ｔｒｕｓ Ｓｙｍｐ。
１９乙９１Ｆ−、ＶｏＬ ／ ３．７１３３〜／〕、（
／頁参照〕〕もしくはこれにベンジルアミノプリン、ナ
フタレン酢酸、マルトエキストラクト、アデニン等を含
有させた培地に置床し、弱光下で一〜Ｓケ月程度培養す
ることにより得ることが出来る０次に、上記した珠心由
来の培養細胞を、植物ホルモンを含む培地１例えばサイ
トカイニン、オーキシン、ジベレリン等のノ種又はそれ
以上の植物ホルモンを添刀０した寒天培地もしくは液体
培地で継代培養することにより、不定胚形成が抑えられ
。
／頁参照〕〕もしくはこれにベンジルアミノプリン、ナ
フタレン酢酸、マルトエキストラクト、アデニン等を含
有させた培地に置床し、弱光下で一〜Ｓケ月程度培養す
ることにより得ることが出来る０次に、上記した珠心由
来の培養細胞を、植物ホルモンを含む培地１例えばサイ
トカイニン、オーキシン、ジベレリン等のノ種又はそれ
以上の植物ホルモンを添刀０した寒天培地もしくは液体
培地で継代培養することにより、不定胚形成が抑えられ
。
未分化増殖細胞が得られる。その際、培養は弱光下、２
０〜３０℃程度で行なうのが望ましく、寒天培地の場合
は約グ週間毎に、又液体培地の場合は約−週間毎に継代
培養する。
０〜３０℃程度で行なうのが望ましく、寒天培地の場合
は約グ週間毎に、又液体培地の場合は約−週間毎に継代
培養する。
このように継代培養した培養物を１例えば金網。
ナイロンメツシュ等により濾過し未分化増殖細胞を得る
。
。
次に、このような未分化増殖細胞を植物ホルモンを含ま
ない培地１例えば前述のＭＴ培地より植物ホルモンを除
去した培地等で培養するか、又は植物ホルモンを含み培
地組成を変更した培地１例えば前述のＭＴ培地の糖成分
である蔗糖をガラクトースもしくはラクトースに変えた
培地もしくはこれにアンモニウムイオン等の還元型窒素
を加えて培地組成を変更した培地で培養し、不定胚形成
を誘導、促進させることにより、細胞融合処理に耐性の
有る不定胚形成細胞を得る０ そして、上記した如（、未分化増殖細胞を植物ホルモン
を含まない培地又は培地組成を変更した液体培地もしく
は固体培地で、ス〜グ週間培養し。
ない培地１例えば前述のＭＴ培地より植物ホルモンを除
去した培地等で培養するか、又は植物ホルモンを含み培
地組成を変更した培地１例えば前述のＭＴ培地の糖成分
である蔗糖をガラクトースもしくはラクトースに変えた
培地もしくはこれにアンモニウムイオン等の還元型窒素
を加えて培地組成を変更した培地で培養し、不定胚形成
を誘導、促進させることにより、細胞融合処理に耐性の
有る不定胚形成細胞を得る０ そして、上記した如（、未分化増殖細胞を植物ホルモン
を含まない培地又は培地組成を変更した液体培地もしく
は固体培地で、ス〜グ週間培養し。
該培養物より細胞のみを分離し、これを更に同じ組成の
培地に植継ぎ３〜２日間培養した後、該培養物より常法
により分離して不定胚形成細胞のみを得る。
培地に植継ぎ３〜２日間培養した後、該培養物より常法
により分離して不定胚形成細胞のみを得る。
次に、この不定胚形成細胞より該細胞のプロトプラスト
を得るには、該細胞を、例えばペクトリ７−ゼＹ−２３
（盛進製薬株式会社製）−マセロザイムＲ−／θ（ヤク
ルト薬品工業株式会社製）等のマセレーション酵素を含
む溶液及びセルラーゼｙ −Ｃ（盛進製薬株式会社製）
、セルラーゼオノズカＲ−／θ（ヤクルト薬品工業株式
会社製）。
を得るには、該細胞を、例えばペクトリ７−ゼＹ−２３
（盛進製薬株式会社製）−マセロザイムＲ−／θ（ヤク
ルト薬品工業株式会社製）等のマセレーション酵素を含
む溶液及びセルラーゼｙ −Ｃ（盛進製薬株式会社製）
、セルラーゼオノズカＲ−／θ（ヤクルト薬品工業株式
会社製）。
セルラーゼオノズ力Ｒ８（ヤクルト薬品工業株式会社製
）、ドリセラーゼ（協和醗酵工業株式会社製）等の細胞
壁分解酵素を含有する溶液に浸漬し。
）、ドリセラーゼ（協和醗酵工業株式会社製）等の細胞
壁分解酵素を含有する溶液に浸漬し。
暗黒下約−θ〜３０℃で５〜／、ｇ時間程度、穏やかに
振盪することにより、不定胚形成細胞のブロトフ”ラス
トを得、これをミラクロスＣカルビオヶムーヘーリング
社製、米国）、ナイロンメツシュのプロトプラストの懸
濁液を得る。
振盪することにより、不定胚形成細胞のブロトフ”ラス
トを得、これをミラクロスＣカルビオヶムーヘーリング
社製、米国）、ナイロンメツシュのプロトプラストの懸
濁液を得る。
一方、上記珠心由来のミカン科植物の不定胚形成細胞よ
り得たプロトプラストと融合する他のミカン科植物の組
繊細胞又は胚珠以外の組織を培地に培養して得られる分
化能を殆どもしくは全く持たない培養細胞よ′り該細胞
のプロトプラストを得る手段を以下に述べる。
り得たプロトプラストと融合する他のミカン科植物の組
繊細胞又は胚珠以外の組織を培地に培養して得られる分
化能を殆どもしくは全く持たない培養細胞よ′り該細胞
のプロトプラストを得る手段を以下に述べる。
先ず、カラタチ、ｌ−ロイヤー・シトレンジ、温州ミカ
ン、夏ミカン等のミカン科植物の根１葉より採取した組
繊細胞又は該ミカン科植物の胚珠以外の組織を適当な培
地例えば植物ホルモンを含む寒天培地に置床して得られ
る分化能をほとんどもしくは全く持たない培養細胞を、
必要により２０％（Ｖ／Ｖ １エタノール溶液で殺菌し
、これを例えばＴｗｅｅｎ ２θを含む次亜塩素酸溶液
に浸漬し、更に滅菌した後、カミソリ、メス等で小片に
したものを、例えばペクトリアーゼＹ−ｊｌｌマセロザ
イムＲ−／θ等のマセレーション酵素を含む溶液及びセ
ルラーゼＹ−Ｃ，セルラーゼオノズカＲ−／ ０．セル
ラーゼオノズカＲ８、ドリセラーゼ等の細胞壁分解酵素
を含有する溶層に浸漬し、暗黒下約２０〜３０℃でオ〜
／、（時間程度、穏やかに振盪することにより、組繊細
胞又は培養細胞のプロトプラストを得、これをミラクロ
ス、ナイロドブラストの懸濁液を得る〇 次に、上記した珠心由来のミカン科植物の不定胚形成細
胞のプロトプラスト懸濁液と、上記した他のミカン科植
物の組繊細胞もしくは培養細胞のプロトプラスト懸濁液
とを、夫々の懸濁液の細胞密度がｌθ５〜ｌθ’／ｍｅ
程度に予じめ調整したものを混合し１次いでこれに、該
混合液とほぼ等容量のカルシウムイオンとポリエチレン
グリコールもしくはポリビニルアルコール含有液を加え
て混合し、１０〜ツタ分程度静置した後、これに塩化カ
ルシウムを含むマンニトール溶液を加えることにより、
融合されたプロトプラストを得る。
ン、夏ミカン等のミカン科植物の根１葉より採取した組
繊細胞又は該ミカン科植物の胚珠以外の組織を適当な培
地例えば植物ホルモンを含む寒天培地に置床して得られ
る分化能をほとんどもしくは全く持たない培養細胞を、
必要により２０％（Ｖ／Ｖ １エタノール溶液で殺菌し
、これを例えばＴｗｅｅｎ ２θを含む次亜塩素酸溶液
に浸漬し、更に滅菌した後、カミソリ、メス等で小片に
したものを、例えばペクトリアーゼＹ−ｊｌｌマセロザ
イムＲ−／θ等のマセレーション酵素を含む溶液及びセ
ルラーゼＹ−Ｃ，セルラーゼオノズカＲ−／ ０．セル
ラーゼオノズカＲ８、ドリセラーゼ等の細胞壁分解酵素
を含有する溶層に浸漬し、暗黒下約２０〜３０℃でオ〜
／、（時間程度、穏やかに振盪することにより、組繊細
胞又は培養細胞のプロトプラストを得、これをミラクロ
ス、ナイロドブラストの懸濁液を得る〇 次に、上記した珠心由来のミカン科植物の不定胚形成細
胞のプロトプラスト懸濁液と、上記した他のミカン科植
物の組繊細胞もしくは培養細胞のプロトプラスト懸濁液
とを、夫々の懸濁液の細胞密度がｌθ５〜ｌθ’／ｍｅ
程度に予じめ調整したものを混合し１次いでこれに、該
混合液とほぼ等容量のカルシウムイオンとポリエチレン
グリコールもしくはポリビニルアルコール含有液を加え
て混合し、１０〜ツタ分程度静置した後、これに塩化カ
ルシウムを含むマンニトール溶液を加えることにより、
融合されたプロトプラストを得る。
このようにして得られた融合プロトプラストを遠心分離
してプロトプラストを集め、マンニ） −ル溶液で洗浄
した後、これを植物ホルモンを含まず、かつ高濃度の糖
、例えば珠心由来細胞の不定胚形成の誘導及び該細胞の
成長を抑制する効果のある蔗糖、グルコース、フルクト
ース等の糖を通常θ、４ｔ〜θ、ｇＭ程度含む高濃度の
糖含有培地で液体培養もしくは固体培養を行なう。その
際、培養はｌθ４〜ノθ’／ｍｌ；程度の細胞密度で１
弱光下もしくは暗黒下約ユθ〜３０℃程度で行なう。
してプロトプラストを集め、マンニ） −ル溶液で洗浄
した後、これを植物ホルモンを含まず、かつ高濃度の糖
、例えば珠心由来細胞の不定胚形成の誘導及び該細胞の
成長を抑制する効果のある蔗糖、グルコース、フルクト
ース等の糖を通常θ、４ｔ〜θ、ｇＭ程度含む高濃度の
糖含有培地で液体培養もしくは固体培養を行なう。その
際、培養はｌθ４〜ノθ’／ｍｌ；程度の細胞密度で１
弱光下もしくは暗黒下約ユθ〜３０℃程度で行なう。
なお、液体培養の場合、培養開始時より３〜グ週間後、
これに植物ホルモ“ンを含まず、かつ０．３Ｍ程度の糖
を含有する寒天培地を加えて培養することが望ましく、
又固体培養の場合、培養開始時より７ケ月程度経過後に
５％（Ｗ／Ｗ ）蔗糖を含む液体培地を加え、以後７ケ
月程度毎に該液体培地を加えて培養するのが望ましい。
これに植物ホルモ“ンを含まず、かつ０．３Ｍ程度の糖
を含有する寒天培地を加えて培養することが望ましく、
又固体培養の場合、培養開始時より７ケ月程度経過後に
５％（Ｗ／Ｗ ）蔗糖を含む液体培地を加え、以後７ケ
月程度毎に該液体培地を加えて培養するのが望ましい。
なお又、培養開始時より２〜３週目以後は、約３θθθ
ルツクス程度の光照射下で培養するのが望ましい。
ルツクス程度の光照射下で培養するのが望ましい。
上記した培養により、２〜３７月後に雑種細胞のみが不
定胚を分化して胚様体となり、該胚様体を植物ホルモン
を含まずマルトエキストラクト。
定胚を分化して胚様体となり、該胚様体を植物ホルモン
を含まずマルトエキストラクト。
アデニン等を含む培地で培養、増殖させ、次いでこれを
ジベレリンを含む培地に移し１発根１発芽させる。′こ
のようにして、ミカン科植物の体細胞雑種が得られる。
ジベレリンを含む培地に移し１発根１発芽させる。′こ
のようにして、ミカン科植物の体細胞雑種が得られる。
本発明によれば、交配手段では得られない遺伝的特性を
有するミカン科植物の体細胞雑種を、極めて効率良？、
しかも確実に得ることができるので、本発明は産業上極
めて有利である。
有するミカン科植物の体細胞雑種を、極めて効率良？、
しかも確実に得ることができるので、本発明は産業上極
めて有利である。
以下に本発明の実施例を示すが１本発明はこれにより制
限されるものではない。
限されるものではない。
実施例 １
トロビンオレンジの開花当日の花から胚珠を無菌的にビ
ンセットで取り出し、これをマルトエキストラクト（／
００ｍ９／、ｅ ）、アゾ：７（２０ｍ９／Ａ）を含
み、植物ホルモンを含まないＭＴ培地（Ｐｒｏｃ、 Ｆ
ｉｒｓｔ Ｉｎｔ、Ｃ１ｔｒｕｓ ５ｙｒｎｐ、 ／
９１９年−ＶｏＬ ’ ３、／／ｊｆｊ、１１乙７頁参
照）に置床し、１６０日間培養することにより球心由来
の培養細胞を得た。これを植物ホルモンとしてベンジル
アデニン’Ｏｍ９／Ａを含むＭＴ寒天培地で、未分化増
殖細胞の状態で約！年間保持、増殖させた０この細胞の
ノ部を／ ０ｍ９／Ａのベンジルアデニンを含む液体培
地に移し、約ノ年間継代培養し、培養物をナイロンメツ
シュで濾過して未分化増殖細胞を得た。
ンセットで取り出し、これをマルトエキストラクト（／
００ｍ９／、ｅ ）、アゾ：７（２０ｍ９／Ａ）を含
み、植物ホルモンを含まないＭＴ培地（Ｐｒｏｃ、 Ｆ
ｉｒｓｔ Ｉｎｔ、Ｃ１ｔｒｕｓ ５ｙｒｎｐ、 ／
９１９年−ＶｏＬ ’ ３、／／ｊｆｊ、１１乙７頁参
照）に置床し、１６０日間培養することにより球心由来
の培養細胞を得た。これを植物ホルモンとしてベンジル
アデニン’Ｏｍ９／Ａを含むＭＴ寒天培地で、未分化増
殖細胞の状態で約！年間保持、増殖させた０この細胞の
ノ部を／ ０ｍ９／Ａのベンジルアデニンを含む液体培
地に移し、約ノ年間継代培養し、培養物をナイロンメツ
シュで濾過して未分化増殖細胞を得た。
つぎに、この未分化増殖細胞を植物ホルモンを含まない
ＭＴ液体培地に移し、２週間培養した後。
ＭＴ液体培地に移し、２週間培養した後。
この培養細胞を上記組成の培地に植え継ぎｊ日間継代培
養することにより不定胚形成細胞を得た。
養することにより不定胚形成細胞を得た。
この不定胚形成細胞をミラクロス（カラビオヶムーヘＩ
Ｊング社製）でｒ過分離して得られた約１９の不定胚形
成細胞を、−２θｍ乙の無菌の酵素液〔０，３％（Ｗ／
■〕マセロザイムＲ−／θ（ヤクルト薬品工業株式会社
製）−０，２％（Ｗ／Ｖ ）セルラーゼオノズカＲ−ｔ
θ（ヤクルト薬品工業株式会社製）、０，１％（Ｗ／Ｖ
）ト’リセラーゼ（協和醗酵工業株式会社製）、θ、ｌ
グＭ蔗糖、θ、オ乙Ｍマンニトールを含み、かつＭ Ｔ
培地組成のうち主要無機塩成分のみを含む酵素水溶液〕
に浸し、暗黒下／Ｊ時間グｔ ｒ、ｐ、ｍ−回転振盪さ
せプロトプラストを得た。得られたプロトプラストをミ
ラクロスで濾過したのち、こね・をｇｏｏｌ−、ｐ、ｍ
−−１１＝ の懸濁液を得た。
Ｊング社製）でｒ過分離して得られた約１９の不定胚形
成細胞を、−２θｍ乙の無菌の酵素液〔０，３％（Ｗ／
■〕マセロザイムＲ−／θ（ヤクルト薬品工業株式会社
製）−０，２％（Ｗ／Ｖ ）セルラーゼオノズカＲ−ｔ
θ（ヤクルト薬品工業株式会社製）、０，１％（Ｗ／Ｖ
）ト’リセラーゼ（協和醗酵工業株式会社製）、θ、ｌ
グＭ蔗糖、θ、オ乙Ｍマンニトールを含み、かつＭ Ｔ
培地組成のうち主要無機塩成分のみを含む酵素水溶液〕
に浸し、暗黒下／Ｊ時間グｔ ｒ、ｐ、ｍ−回転振盪さ
せプロトプラストを得た。得られたプロトプラストをミ
ラクロスで濾過したのち、こね・をｇｏｏｌ−、ｐ、ｍ
−−１１＝ の懸濁液を得た。
一方、カラタチの種子をバーミキュライトに播き１．２
才℃、３θθθルックス、ｌ３時間７日の光条件下で約
コケ装置いてカラタチの幼植物を得た。こレラの葉を２
０％ｒＶ／Ｖ）エタノールで１θ秒間濯いだ後−０−’
％Ｔｗ６ｅｎ ｘ ｏを含むｏ−ｔ％（Ｗ／Ｖ１次亜塩
素酸水溶液に２０分間浸し、更に滅菌水で洗浄した後、
カミソリで−２ｍｍ間隔に切り、これを直ちにＯ７乙Ｍ
マンニトールとＭＴ培地の主要無機成分を含む／ ｍＭ
のＭＥＳＣｓ −ｒＮ−モルホリノ）エタン−スルホン
酸、モノハイドレート〕緩衝液（ｐｉ（３−ｇ ）にノ
時間浸漬した。
才℃、３θθθルックス、ｌ３時間７日の光条件下で約
コケ装置いてカラタチの幼植物を得た。こレラの葉を２
０％ｒＶ／Ｖ）エタノールで１θ秒間濯いだ後−０−’
％Ｔｗ６ｅｎ ｘ ｏを含むｏ−ｔ％（Ｗ／Ｖ１次亜塩
素酸水溶液に２０分間浸し、更に滅菌水で洗浄した後、
カミソリで−２ｍｍ間隔に切り、これを直ちにＯ７乙Ｍ
マンニトールとＭＴ培地の主要無機成分を含む／ ｍＭ
のＭＥＳＣｓ −ｒＮ−モルホリノ）エタン−スルホン
酸、モノハイドレート〕緩衝液（ｐｉ（３−ｇ ）にノ
時間浸漬した。
浸漬後の葉の小片θ−１，９を、２０ｍ１の無菌の酵Ｗ
［［０２３％（Ｗ／Ｖ）マセロザイムＲ−ノθ。
［［０２３％（Ｗ／Ｖ）マセロザイムＲ−ノθ。
３ ％ （Ｗ／ Ｖ ） セルラーゼオノズカＲ，−ｔ
ｏ、ｏ、ｔＭマンニト−ルを含み、かつＭＴ培地の主要
無機成分のみを含む７ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨｔ、ｆ
）’ｌに浸し、暗黒下／Ｊ時間、 ｇ −ｔ ｒ−ｐ、
ｍ、で回転振盪させプロトプラストを得た。得られたプ
ロトプラストをミラクロスで２過した後、これをｇｏｏ
ｒ、ｐ、ｍ。
ｏ、ｏ、ｔＭマンニト−ルを含み、かつＭＴ培地の主要
無機成分のみを含む７ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨｔ、ｆ
）’ｌに浸し、暗黒下／Ｊ時間、 ｇ −ｔ ｒ−ｐ、
ｍ、で回転振盪させプロトプラストを得た。得られたプ
ロトプラストをミラクロスで２過した後、これをｇｏｏ
ｒ、ｐ、ｍ。
＝ １２−
を得た。
次に、上記したトロビタオレンジのプロトプラストの懸
濁液及びカラタチのプロトプラストの懸濁液を、夫々細
胞密度が／ ｏ６個／ ｍＩＶとなるように調整し、混
合した。この混合懸濁液を２００μにづつプラスチック
シャーレ（直径６ｃｍ）に分注し。
濁液及びカラタチのプロトプラストの懸濁液を、夫々細
胞密度が／ ｏ６個／ ｍＩＶとなるように調整し、混
合した。この混合懸濁液を２００μにづつプラスチック
シャーレ（直径６ｃｍ）に分注し。
該シャーレ内の懸濁液の周囲に、ｐＨ１，、夕のＰＥＧ
水溶液〔グθ％・Ｗ／Ｗポリエチレングリコール。
水溶液〔グθ％・Ｗ／Ｗポリエチレングリコール。
７００ｍＭ ＣａＣｌ２及びｌθθｍＭＴ−ＴＥＰＥＳ
（Ｎ −コーヒドロキシエチルピペラジンーＮ’−一
一エタンスルホン酸〕緩衝液を含む水溶１＆〕２０θμ
ｋを置き、これを静かに混合し、７０分間静置した後、
θ、オｍｌｊの洗浄液（オθｍＭ ＣａＣＬ及び０．３
Ｍマンニトールを含む水溶液）を静かに添加し。
（Ｎ −コーヒドロキシエチルピペラジンーＮ’−一
一エタンスルホン酸〕緩衝液を含む水溶１＆〕２０θμ
ｋを置き、これを静かに混合し、７０分間静置した後、
θ、オｍｌｊの洗浄液（オθｍＭ ＣａＣＬ及び０．３
Ｍマンニトールを含む水溶液）を静かに添加し。
プロトプラストの融合を行った。次いで１５分間プロト
プラスト懸濁液を遠心管に移し、ｌθθ０ｒ−ｐ−ｍ、
で夕分間遠心分離することにより融合プロトプラストを
集めた。
プラスト懸濁液を遠心管に移し、ｌθθ０ｒ−ｐ−ｍ、
で夕分間遠心分離することにより融合プロトプラストを
集めた。
ることにより２回洗浄し、更に０．６Ｍ蔗糖を含み植物
ホルモンを含まないＭＴ＃１体培地で上記と同様な遠心
分離により洗浄した後、細胞密度が７ｔ）５個／ ｍｌ
Ｖとなるように調整する。この細胞懸濁液Ｏ，オｍｌｊ
をシャーレ（直径６ｍ）に入れ、バラフィルムでシール
した後、弱光下２４ｔ−２７℃で培養した。
ホルモンを含まないＭＴ＃１体培地で上記と同様な遠心
分離により洗浄した後、細胞密度が７ｔ）５個／ ｍｌ
Ｖとなるように調整する。この細胞懸濁液Ｏ，オｍｌｊ
をシャーレ（直径６ｍ）に入れ、バラフィルムでシール
した後、弱光下２４ｔ−２７℃で培養した。
植物ホルモンを含まない〕を、前記培養液に加えて培養
し１．２ｔ月後に得られた胚様体をマルトエキストラク
ト（，３′θθｍｇ ／ ｐ ）、アデニン（４ｔθｍ
ｇ ／ Ａ １を含むＭＴ培地（植物ホルモンを含まな
い）に移し、増殖させ、さらにジベレリン（１０ｍ９／
Ｉりを含むＭＴ培地（／ ｏｍｇ／ Ａ ） ニ移シ。
し１．２ｔ月後に得られた胚様体をマルトエキストラク
ト（，３′θθｍｇ ／ ｐ ）、アデニン（４ｔθｍ
ｇ ／ Ａ １を含むＭＴ培地（植物ホルモンを含まな
い）に移し、増殖させ、さらにジベレリン（１０ｍ９／
Ｉりを含むＭＴ培地（／ ｏｍｇ／ Ａ ） ニ移シ。
植物体を得た。
このようにして得られた植物体は、形態的にオレンジと
カラタチの中間を示すこと、染色体数が３乙で両親（λ
１１ ＝＝ ／ ｇ ）の和であること等から。
カラタチの中間を示すこと、染色体数が３乙で両親（λ
１１ ＝＝ ／ ｇ ）の和であること等から。
雑種であると推定され、さらにリボゾームＲＮＡ遺伝子
１葉の精油成分の分析によっても、得られた植物は両親
の特徴的な型を共に有することから。
１葉の精油成分の分析によっても、得られた植物は両親
の特徴的な型を共に有することから。
該植物体はオレンジとカラタチの体細胞雑種であること
が確認された。
が確認された。
実施例 ２
トロビタオレンジの開花当日の花から胚珠を無菌的にビ
ンセットで取り出し、これをマルトエキストラクト（）
００ｍ９７Ａ）、アデニン（２０ｍ９／りを含み、植物
ホルモンは含まないＭＴ培地（Ｐｒｏｃ、 Ｆｉｒｓ
ｔ Ｉｎｔ、 Ｃ１ｔｒｕｓ Ｓｙｍｐ 、
〕 ９ ｔｑ＊。
ンセットで取り出し、これをマルトエキストラクト（）
００ｍ９７Ａ）、アデニン（２０ｍ９／りを含み、植物
ホルモンは含まないＭＴ培地（Ｐｒｏｃ、 Ｆｉｒｓ
ｔ Ｉｎｔ、 Ｃ１ｔｒｕｓ Ｓｙｍｐ 、
〕 ９ ｔｑ＊。
ＶｏＬ１３．’ノｊタ〜ｌノにノ頁参照）に置床し。
ｊＪ’０日間培養することにより球心由来の培養細胞を
得た。これを植物ホルモンとしてベンジルアデニン’
Ｏｍ９７ Ａ含むＭＴ寒天培地で、未分化増殖細胞の状
態で約ｊ年間保持、増殖させた。この細胞の１部を／
Ｑ ｍｇ ／ Ａのベンジルアデニンを含む液体培地に
移し、約７年間柄代培養し培養物をナイロンメツシュで
１過して未分化増殖細胞を得た。つぎに、この未分化増
殖細胞を５％（Ｗ／Ｖ）ガラクトースを含み植物ホルモ
ンを含まないＭＴ液体培地に移し、２週間培養した後、
この培養細胞を上記組成の培地に植え継ぎ、再びλ週間
培養し、さらに夕日間継代培養することにより不定胚形
成細胞を得た。
得た。これを植物ホルモンとしてベンジルアデニン’
Ｏｍ９７ Ａ含むＭＴ寒天培地で、未分化増殖細胞の状
態で約ｊ年間保持、増殖させた。この細胞の１部を／
Ｑ ｍｇ ／ Ａのベンジルアデニンを含む液体培地に
移し、約７年間柄代培養し培養物をナイロンメツシュで
１過して未分化増殖細胞を得た。つぎに、この未分化増
殖細胞を５％（Ｗ／Ｖ）ガラクトースを含み植物ホルモ
ンを含まないＭＴ液体培地に移し、２週間培養した後、
この培養細胞を上記組成の培地に植え継ぎ、再びλ週間
培養し、さらに夕日間継代培養することにより不定胚形
成細胞を得た。
この不定胚形成細胞をミラクロスＣカラビオケムーベー
リング社製）で１過分離して得られた約／ｇ−の不定胚
形成細胞を、−〇ｍｌの無菌の酵素液〔０，３（Ｗ／■
〕マセロザイムＲ−１０（ヤクルト薬品工業株式会社製
）、００．２％（Ｗ／Ｖ）セルラーゼオノズカＲ−／θ
〔ヤクルト薬品工業株式会社製） 、 ｏ −／ ％
（Ｗ／Ｖ ）ドリセラーセ（協和醗酵工業株式会社製）
、０−１７Ｍ蔗糖。
リング社製）で１過分離して得られた約／ｇ−の不定胚
形成細胞を、−〇ｍｌの無菌の酵素液〔０，３（Ｗ／■
〕マセロザイムＲ−１０（ヤクルト薬品工業株式会社製
）、００．２％（Ｗ／Ｖ）セルラーゼオノズカＲ−／θ
〔ヤクルト薬品工業株式会社製） 、 ｏ −／ ％
（Ｗ／Ｖ ）ドリセラーセ（協和醗酵工業株式会社製）
、０−１７Ｍ蔗糖。
ｏ、、ｔｔＭマンニトールを含み、かつＭＴ培地組成の
うち主要無機塩成分のみを含む酵素水溶液〕に浸し、暗
黒下ノ乙時間グ、！： ｒ、ｐ＋ｍ＋回転振盪させプロ
トプラストを得た。得られたプロトプラストをミラクロ
スで１過Ｉ−たのち、これをｇθθｒ ＋ ｐ 、ｍ。
うち主要無機塩成分のみを含む酵素水溶液〕に浸し、暗
黒下ノ乙時間グ、！： ｒ、ｐ＋ｍ＋回転振盪させプロ
トプラストを得た。得られたプロトプラストをミラクロ
スで１過Ｉ−たのち、これをｇθθｒ ＋ ｐ 、ｍ。
の懸濁液を得た。
一方、トロイヤーシトレンジの実生植物体を温室内、自
然光下で約７年間育てた０この植物の十分に育成した若
い葉を２θ４（Ｖ／Ｖ）エタノールで７部秒間濯いた後
、θ、ノ％Ｔｗｅｅｎ 、２０を含む０．５％（Ｗ／Ｖ
）次亜塩素酸水浴液に１０分間浸し、更に滅菌水で洗浄
した後、カミソリで−ｍｍ 間隔に切り、こね、を直ち
に０．６ＭマンニトールとＭＴ培地の主要無機成分を含
む／ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５７ｇ）にノ時間浸漬した
。浸漬後の葉の小片１．０９を、２０蛯の無菌の酵素液
〔θ、３％ｒＷ／Ｖ）マセロザイムＲ−ノθ、３％（Ｗ
／■〕セルラーゼオノズカ１１（、−／θ％０−／、Ｍ
マンニトールを含み、かつＭＴ培地の主要無機成分のみ
を含む／ ｍＭのＭＥＳ緩衝ｇ （ｐＩ（Δ′０ｇ）〕
に浸し、暗黒下／Ｊ時間、ゲタｒ−ｐ−ｍ−で回転振盪
させプロトプラストを得た。得られたプロトプラストス
トの懸濁液を得た。
然光下で約７年間育てた０この植物の十分に育成した若
い葉を２θ４（Ｖ／Ｖ）エタノールで７部秒間濯いた後
、θ、ノ％Ｔｗｅｅｎ 、２０を含む０．５％（Ｗ／Ｖ
）次亜塩素酸水浴液に１０分間浸し、更に滅菌水で洗浄
した後、カミソリで−ｍｍ 間隔に切り、こね、を直ち
に０．６ＭマンニトールとＭＴ培地の主要無機成分を含
む／ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５７ｇ）にノ時間浸漬した
。浸漬後の葉の小片１．０９を、２０蛯の無菌の酵素液
〔θ、３％ｒＷ／Ｖ）マセロザイムＲ−ノθ、３％（Ｗ
／■〕セルラーゼオノズカ１１（、−／θ％０−／、Ｍ
マンニトールを含み、かつＭＴ培地の主要無機成分のみ
を含む／ ｍＭのＭＥＳ緩衝ｇ （ｐＩ（Δ′０ｇ）〕
に浸し、暗黒下／Ｊ時間、ゲタｒ−ｐ−ｍ−で回転振盪
させプロトプラストを得た。得られたプロトプラストス
トの懸濁液を得た。
次に、上記したトロビタオレンジのプロトプラストの懸
濁液及びトロイヤーシトレンジのプロトプラストの懸濁
液を夫々細胞密度がｌθ６個／ ｍｌとなるように調整
し、混合した。この混合懸濁液を、２００μｆづつプラ
スチックシャーレ〔直径乙Ｃｒｎ）に亦注し、該シャー
レ内の懸濁液の周囲に。
濁液及びトロイヤーシトレンジのプロトプラストの懸濁
液を夫々細胞密度がｌθ６個／ ｍｌとなるように調整
し、混合した。この混合懸濁液を、２００μｆづつプラ
スチックシャーレ〔直径乙Ｃｒｎ）に亦注し、該シャー
レ内の懸濁液の周囲に。
ｐＨざ、！のＰＥＧ水浴液（４ｔｏ％・Ｗ／Ｗポリエチ
レングリコール、）００ｍＭ ＣａＣ１□、及ヒｌθ
θｍＭの）ＩＥＰＥＳ緩衝液を含む水溶液）ユθθμｋ
を置き−これを静かに混合し、１０分間静置した後、ｏ
、ｓｍｅｔｒ）洗浄液（５θｍＭ ＣａＣｌ２及びθ、
乙Ｍマンニトールを含む水溶液）を静かに添加しプロト
プラストの融合を行なった。次いでＪｊ分間プロトプラ
スト懸濁液を遠心管に移し、ノθθθｒ−ｐ、ｍ、で遠
心分離することにより融合プロトプラストを集めた。
レングリコール、）００ｍＭ ＣａＣ１□、及ヒｌθ
θｍＭの）ＩＥＰＥＳ緩衝液を含む水溶液）ユθθμｋ
を置き−これを静かに混合し、１０分間静置した後、ｏ
、ｓｍｅｔｒ）洗浄液（５θｍＭ ＣａＣｌ２及びθ、
乙Ｍマンニトールを含む水溶液）を静かに添加しプロト
プラストの融合を行なった。次いでＪｊ分間プロトプラ
スト懸濁液を遠心管に移し、ノθθθｒ−ｐ、ｍ、で遠
心分離することにより融合プロトプラストを集めた。
次［得られた融合プロトプラストを０．６Ｍマンニトー
ルで／Ｑθθｒ、ｐ１ｍ、で５分間遠心分離することに
より２回洗浄し、更に０，１．Ｍ蔗糖を含み植物ホルモ
ンを含まないＭＴ培地で同様に洗浄した後、細胞密度が
２×ｌθ５個／ｍｌＶとなるように調整する。この細胞
懸濁液ｌ罰にθ、４Ｍ蔗Ｈ及びｔ −，２％ジ−プラー
クアガロース（マリンコロイド社製）を含むＭＴ培地を
／ ｍｌ加え、シャーＶＣ直径１．Ｃｍ）に入れてパラ
フィルムでシールし１弱光下２グル２フ℃で培養した。
ルで／Ｑθθｒ、ｐ１ｍ、で５分間遠心分離することに
より２回洗浄し、更に０，１．Ｍ蔗糖を含み植物ホルモ
ンを含まないＭＴ培地で同様に洗浄した後、細胞密度が
２×ｌθ５個／ｍｌＶとなるように調整する。この細胞
懸濁液ｌ罰にθ、４Ｍ蔗Ｈ及びｔ −，２％ジ−プラー
クアガロース（マリンコロイド社製）を含むＭＴ培地を
／ ｍｌ加え、シャーＶＣ直径１．Ｃｍ）に入れてパラ
フィルムでシールし１弱光下２グル２フ℃で培養した。
培養開始時よりｙ週間後にｊθθｍＢの、５′％蔗糖を
含み、植物ホルモンを含まないＭＴＭ体培地を加えて培
養し。
含み、植物ホルモンを含まないＭＴＭ体培地を加えて培
養し。
λケ月培養後得られた胚様体をマルトエキストラクト（
夕θθｍ９／Ａ）、アゾ＝ン（ｙＯｍ９／Ａ）を含むＭ
Ｔ培地〔植物ホルモンを含まない）に移し、増殖させ、
さらにジベレリン（ｉ ０ｍ９７Ｂ ）を含むＭＴ培地
に移し、植物体を得た。
夕θθｍ９／Ａ）、アゾ＝ン（ｙＯｍ９／Ａ）を含むＭ
Ｔ培地〔植物ホルモンを含まない）に移し、増殖させ、
さらにジベレリン（ｉ ０ｍ９７Ｂ ）を含むＭＴ培地
に移し、植物体を得た。
Claims (1)
- ミカン科植物の胚珠を植物ホルモンを含まない培地に培
養して得た珠心由来の培養細胞を、植物ホルモンを含む
培地で継代培養することにより未分化増殖細胞を得、こ
れを植物ホルモンを含まない培地又は植物ホルモンを含
み培地組成を変更した培地で培養することにより不定胚
形成細胞を得、この不定胚形成細胞より得たプロトプラ
ストと、他のミカン科植物の組繊細胞又は胚珠以外の組
織を培地に培養して得られる分化能を殆どもしくは全く
持たない培養細胞より得たプロトプラストとを融合させ
た後、これを植物ホルモンを含まず、かつ高濃度の糖を
含む培地で培養することにより、細胞融合した雑種細胞
のみを不定胚分化させ、体細胞雑種のみを選択的に得る
ことを特徴とする、ミカン科植物の体細胞雑種の作出方
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60030611A JPS61192283A (ja) | 1985-02-20 | 1985-02-20 | ミカン科植物の体細胞雑種の作出方法 |
| US06/782,385 US4940836A (en) | 1985-02-20 | 1985-10-01 | Somatic hybrids of Rutaceae plants |
| IL76634A IL76634A (en) | 1985-02-20 | 1985-10-09 | Method for producing somatic hybrids of ructaceae plants and culture medium for the production of said hybrids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60030611A JPS61192283A (ja) | 1985-02-20 | 1985-02-20 | ミカン科植物の体細胞雑種の作出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61192283A true JPS61192283A (ja) | 1986-08-26 |
| JPH0320229B2 JPH0320229B2 (ja) | 1991-03-18 |
Family
ID=12308667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60030611A Granted JPS61192283A (ja) | 1985-02-20 | 1985-02-20 | ミカン科植物の体細胞雑種の作出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4940836A (ja) |
| JP (1) | JPS61192283A (ja) |
| IL (1) | IL76634A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01120282A (ja) * | 1987-11-02 | 1989-05-12 | Nakano Vinegar Co Ltd | アセトバクター属細菌のスフェロプラスト再生方法 |
| JPH01168289A (ja) * | 1987-12-25 | 1989-07-03 | Nakano Vinegar Co Ltd | 酢酸菌スフェロプラストの融合方法 |
| JPH01168290A (ja) * | 1987-12-25 | 1989-07-03 | Nakano Vinegar Co Ltd | 酢酸菌スフェロプラストの電気的融合法 |
| JPH03117440A (ja) * | 1989-09-30 | 1991-05-20 | Norin Suisansyo Kajiyu Shikenjo | ミカン科植物の体細胞雑種利用による育種法 |
| US5310673A (en) * | 1986-06-26 | 1994-05-10 | Oji Paper Company, Ltd. | Mass propagation through shoot primordia and regeneration of plants from protoplasts of shoot primordia |
| CN109554330A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-04-02 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种马尾松原生质体制备方法 |
-
1985
- 1985-02-20 JP JP60030611A patent/JPS61192283A/ja active Granted
- 1985-10-01 US US06/782,385 patent/US4940836A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-10-09 IL IL76634A patent/IL76634A/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5310673A (en) * | 1986-06-26 | 1994-05-10 | Oji Paper Company, Ltd. | Mass propagation through shoot primordia and regeneration of plants from protoplasts of shoot primordia |
| JPH01120282A (ja) * | 1987-11-02 | 1989-05-12 | Nakano Vinegar Co Ltd | アセトバクター属細菌のスフェロプラスト再生方法 |
| JPH01168289A (ja) * | 1987-12-25 | 1989-07-03 | Nakano Vinegar Co Ltd | 酢酸菌スフェロプラストの融合方法 |
| JPH01168290A (ja) * | 1987-12-25 | 1989-07-03 | Nakano Vinegar Co Ltd | 酢酸菌スフェロプラストの電気的融合法 |
| JPH03117440A (ja) * | 1989-09-30 | 1991-05-20 | Norin Suisansyo Kajiyu Shikenjo | ミカン科植物の体細胞雑種利用による育種法 |
| CN109554330A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-04-02 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种马尾松原生质体制备方法 |
| CN109554330B (zh) * | 2019-01-08 | 2022-02-22 | 广西壮族自治区林业科学研究院 | 一种马尾松原生质体制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL76634A (en) | 1990-03-19 |
| US4940836A (en) | 1990-07-10 |
| JPH0320229B2 (ja) | 1991-03-18 |
| IL76634A0 (en) | 1986-02-28 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |