JPH03117440A - ミカン科植物の体細胞雑種利用による育種法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業−にの利用分野〕 本発明はミカン科植物の体細胞雑種利用による育種法に
関する。

〔従来の技術〕

従来、ミカン科植物の育種は交雑育種、突然変異育種な
どによって行われてきた。しかし、ミカン科植物は多胚
性、無核性、自家および交雑不和合性等の現象によって
雑種作出が非常に困難で、また開花結実に時間がかかる
ため育種に非常に長期間を要する問題点を有する。

近年組織培養技術の発展に伴い、細胞融合法が開発され
て非常に短期間に酸量雑種を含むいくつかの体細胞雑種
の作出が可能となったが、−１１Ｈに植物の体細胞雑種
は遺伝的に不安定となり、不稔となる場合が多く、稔性
を示し成功したのはわずかにナス科植物のタバコ、ジャ
ガイモなどの種間雑種が知られているにすぎず１、ミカ
ン科植物では全く知られていない。

一方、ミカン科植物において、２倍体間の交雑により得
られた雑種中に３倍体が出現することが見出されており
、また４倍体と２倍体との交雑により３倍体を作出した
例も知られている。

ミカン科植物の３倍体は一般に無核性を示すとともに耐
寒、耐病虫性にすぐれ、樹勢、果実の品質とも優れてい
ると考えられており、育種素材として極めて重要である
。

しかしながら、これまでのところ３培体作出は、組合せ
の幅が極めて限定されている点で不十分であった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、体細胞雑種を利用して従来のミカン科
植物の育種方法では得られなかった優れた形質を有する
ミカン科植物を効率良く、確実に得る方法を提供するこ
とである。

〔課題を解決するための手段］ 本発明者等は、先に、細胞融合により交雑では得られな
い遺伝的特性を有する体細胞雑種を効率良く確実に得る
方法を示したが、本発明者等はさらに、このようにして
得た体細胞雑種が稔性を有することを見出し、これを交
配親として既存のミカン科植物（２倍体）と交配するこ
とができ、このような交配により、細胞融合して作出し
た雑種の優れた特性と、３倍体としての優れた特性とを
併せ持った、従来にない形質を有するミカン科植物の交
配雑種を作出できることを知り、この知見に基づいて本
発明を完成した。

即ち、本発明は、細胞融合して作出したミカン科植物の
体細胞雑種を交配親として、これを他のミカン科植物と
交雑することを特徴とするミカン科植物の体細胞雑種利
用による育種法である。

また、本発明は、細胞融合して作出したミカン科植物の
体細胞雑種を交配親として、これと他のミカン科植物と
の交雑により３倍体雑種を作出することを特徴とするミ
カン科植物の体細胞雑種利用による育種法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に用いる、細胞融合して作出したミカン科植物の
体細胞雑種としては、特開昭６１−１９２２８３号「ミ
カン科植物の体細胞雑種の作出方法」に記載された方法
、即ちオレンジやグレープフルーツなどのミカン科植物
の花の球心由来の培養細胞から調製されたプロトプラス
ト（裸の細胞）と、カラタチや温州ミカン、夏ミカン等
の他のミカン科植物の根あるいは葉などの組織又は分化
能を有しない培養細胞から調製されたプロトプラストの
二種のプロトプラストを人為的に融合し、その融合細胞
を、植物ホルモンを含まない高濃度の糖の存在下で培養
して、両方の性質を併せ持った雑種細胞のみを選択的に
得、これをさらに培養して胚様体を誘導しミカン科植物
の新種の植物体、即ち体細胞雑種を作出する方法、及び
これに類する方法により作出した体細胞雑種が挙げられ
る。

他のミカン科植物とは、上記体細胞雑種とは別異の交配
可能なミカン科植物で、自家受精以外のミカン科植物が
対象となる。

次に、上記細胞融合により得られたミカン科植物の体細
胞雑種と、他のミカン科植物との交配は、その一方の開
花前日又は前々日の花を除隨して、雌すい（蕊、）を残
し、これに他方の花粉を筆で受粉させ、パラフィン紙の
袋をかぶせて、以下常法により栽培することにより行わ
れる。

なお、交配親（父）（オレタチ）の原木の写真を第４図
に、交配親（母）（フレメンテイン）の原木の写真を第
５図に示す。

細胞融合して作出して得られた体細胞雑種が、復２倍体
の場合、これを既存の２培体栽培品種と交雑すると３倍
体雑種が得られる。

ミカン科植物では３倍体は一般に無核となり、耐寒性、
耐病虫性にすぐれ、樹勢が旺盛となり、また果実の品質
も既存の２培体栽培品種と同等か、それ以上となること
が知られている。

従って、３倍体の交配雑種を得ることは、極めて大きな
意義を有する。

特に、本発明により得られた３倍体雑種は、従来知られ
ていた３倍体とは異なり、細胞融合に用いた２種類の植
物の遺伝的形質と、交雑した２倍体の形質を併せ持った
ものである。即ち細胞融合によってのみ得られ、交雑で
は得られない遺伝的特性を持っている。さらに３倍体と
しての優れた性質を有することが予想される０例えば、
無核性、耐寒性、耐病性を有すること、旺盛な生育を示
し、果汁が多く、果実の品質が優れていること等である
。

〔実施例） 以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明する。

実施例１ （１）トロビタオレンジとカラタチの体細胞雑種の作出 トロビタオレンジの開花当日の花から胚珠を無菌的にビ
ンセットで取り出し、これをモル１エキストラクｌ−（
１００ｍｇ／　Ｑ　）　、アデニン（２０ｍｇ／ｒ）を
含み、植物ホルモンを含まないＭＴ培地（Ｐｒｏｃ、　
Ｆｉｒｓｔ　Ｉｎｔ、　Ｃ１ｔｒｕｓ　Ｓｙｍｐ、　１
９６９年。

Ｖｏｌ、１３．１１５５〜１１６１ｊＱ参照）に置床し
、１５０日間培俣することにより球心由来の培養細胞を
得た。これを植物ホルモンとしてベンジルアデニン１０
■／ｉ！、を含むＭＴ寒天培地で、未分化増殖細胞の状
態で約５年間保持、増殖させた。この１１胞の１部を１
０■／ｌのベンジルアデニンを含む液体培地に移し、約
１年開基代培養し、培養物をナイロンメツシュで濾過し
て未分化増殖細胞を得た。

つぎに、この未分化増殖細胞を植物ホルモンを含まない
ＭＴ液体培地に移し、２週間培養した後、この培養細胞
をト記組成の培地に植え継ぎ５日間継代培養することに
より胚様体形成細胞を得た。

この胚様体形成細胞をミラクロス（カラビオケムーベー
リング社製）で濾過分離して得られた約１ｇの不定胚形
成細胞を、２０ｍ１の無菌の酵素液〔０，３％（−ハ）
マセロザイムＲ−１０（ヤクルト薬品工業株式会社製）
、０．２％（Ｗ／Ｖ）セルラーゼオノズカＲ−１０（ヤ
クルト薬品工業株式会社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）　　ド
リセラーゼ（協和醗酵工業株式会社製）　、０．１４Ｍ
蔗糖、０．５６Ｍマンニトールを含み、かつＭＴ培地組
成のうち主要無機塩成分のみを含む酵素水溶液〕に浸し
、暗黒下１６時間４５ｒ、ｐ、ｍ、回転振盪させプロト
プラストを得た。

得られたプロトプラストをミラクロスで濾過したのち、
これを８０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２分間遠心分離したものを
０．６Ｍマンニトール溶液に懸濁し、トロビタオレンジ
のプロトプラストの懸濁液を得た。

一方、カラタチの種子をバーミキュライトに播き、２５
°Ｃ１３０００ルツクス、１６時間／日の光条件Ｆで約
２ケ月置いてカラタチの幼植物を得た。

これらの葉を７０％（Ｖ／ｌ／）エタノールで１０秒秒
間−た後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．５％（Ｗ
／Ｖ）次亜塩素酸水溶液に２０分間浸し、更に滅菌水で
洗浄した後、カミソリで２印間隔に切り、これを直ちに
０．６ＭマンニトールとＭＴ培地の主要無機成分を含む
１ｍＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタン−スル
ホン酸、モノハイトレーＦ・］緩衝液（ｐＨ５，８）に
１時間浸漬した。浸漬後の葉の小片０．６ｇを、２０ｍ
ｆｌの無αｉの酵素液〔０，３％（Ｗ／Ｖ）マセロザイ
ムＲ−１ｏ、３％（Ｗ／Ｖ）セルラーゼオノズ力Ｒ−１
０，０，６Ｍマンニト−ルを含み、かつＭＴ培他の主要
無機成分のみを含む１１のＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５，８）
　）に浸し、暗黒下１６時間、４５ｒ、ｐ、ｍ、で回転
振のさせプロトプラストを得た。

得られたプロ［・プラストをミラクロスで濾過した後、
これを８００ｒ、ｐ、ｍ、で２分間遠心分離したものを
０．６Ｍマンニトール溶液に懸濁してカラタチのプロト
プラスト 次に、上記したトロビタオレンジのプロトプラストの懸
濁液及びカラタチのプロトプラストの懸濁液を、各々細
胞密度が１０６個／雁となるように調整し、混合した。

この混合懸濁液を２００μ２ずつプラスチックシャーレ
（直径６（Ｊ）に分注し、該シャーレ内の懸濁液の周囲
に、ｐＨ６、５のＰＥＧ水？容を夜〔４０％・Ｗ／Ｗポ
リエチレングリコール、１００ｍＭ　ＣａＣ１ｚ及び１
００ｍＭ　ＩＩＥＰＥｓ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）！！衝液を
含む水溶液］２００μｌを置き、これを静かに混合し、
１０分間静置し７た後、０．５ｄの洗浄液（５０ｍＭＣ
ａＣ　ｌ　２及び０．６Ｍマンニトールを含む水溶液）
を静かに添加し、プロトプラストの融合を行った。

次いで１５分間隔で１　ｍｌの洗浄液を２回静かに加え
、更に１５分後約２威の０．６Ｍマンニトール溶液で希
釈した後、プロトプラスト懸濁液を遠心管に移し、１０
００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離することにより融合
プロトプラストを集めた。

次に得られた融合プロトプラストを０．６Ｍマンニトー
ル溶液で１００Ｏｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離するこ
とにより２回洗浄し２、更に０．６Ｍ蔗糖含含み植物ホ
ルモンを含まないＭＴ液体培地で上記と同様な遠心分離
により洗滌した後、細胞密度が１０’個／ｄ、となるよ
うに調整する。この細胞懸濁液０．５　ｄをシャーレ（
直径６ＣＴ１１）に入れ、パラフィルムでシールした後
、弱光下２４〜２７℃で培養した。培養開始時より３週
間後に、１　ｄの５％蔗糖を含み１，２％（Ｗ／Ｖ）の
寒天を含むＭＴ寒天培地（植物ホルモンを含まない）を
、前記培養液に加えて培養し、２ケ月後に得られた胚様
体をモルトエキストラクト　（５００ｍｇ／　１．　）
、アデニン（４０ｍｇ＃りを含むＭＴ培地（植物ホルモ
ンを含まない）に移し、増殖させ、さらにジベレリン（
１０ｍｇ／（２）を含むＭＴ培地（１０＋＋＋ｇ／ｆｆ
）に移し、植物体を得た。

このようにして得られた植物体は、形態的にオレンジと
カラタチの中間を示すこと、染色体数が３６で、両親（
２ｎ１．８）の和であることから雑種であると推定され
、さらにリボソーＪ、ＲＮＡ遺伝子、葉の精油成分の分
析によっても、得られた植物は両親の特徴的な型を共に
有することから、該植物体はトロビタオレンジとカラタ
チの複２培体体細胞雑種であることが確認された。

（２）オレンジとカラタチの複２培体体細胞雑種と栽培
品種（単胚性の２培体品種りレメンティン（Ｃｉｔｒｕ
ｓ　Ｃ１ｅｌｌｌｅｎｔｉｎａＨｏｒｔ、））の交配に
よる３培体雑種の作出 単胚性の２倍体品種りＩ／メンテインの開花前日の花を
除雄して、雌すい（蕊）を残Ｕ２、これに上記で作出し
たトロビタオレンジとカラタチの体細胞雑種を高接ぎ用
台木に接木し栽培４年目に開花した花の花粉を筆を用い
て受粉（交配）させ、パラフィン紙の袋をかぶせて、以
下常法により栽培し、果実を得た。このようにして得ら
れた果実に含まれる種子はほぼすべて不完全種子になっ
ている。そこで、これら不完全種子から胚を無菌的に取
り出し、モルトエクストラクト（５００ｍｇ／　１　）
、アデニン（４０■／１）を含むＭＴ寒天培地に置床し
、２５°Ｃ１３０００ルンクスの光条件下で約２ケ月培
養した。

その後再生した植物体を鹿沼土を入れた鉢に移し、順化
を経て健全植物体（植物個体総数２９個体）を得た。

このようにして得られた２９個体の植物の葉形および染
色体数（測定供試個体：２１個体）を調べた結果、下記
第１表に示す通り、母親である単葉のフレメンテインか
ら採種した種子であるにも拘らず、葉形は父親であるオ
レンジとカラタチの複２培体雑種と同じ三出葉であり、
また染色体数も母親（１８）及び父親（３６）と異なり
、添付の写真に示す通り、２７であることから３培体雑
種であることが確認された。

（本頁以下余白） 第１表 （発明の効果〕 従来、ミカン科植物の品質改良では、交雑による新植物
の作出と、突然変異の探索や誘発が主な方法であった。

そしてこれらの植物ではこれまでに行われた交雑育種の
知見から、有望な子は優良な親から生まれることが一般
的に知られており、現在の優良品種が未来をになう品種
を生み出すと考えられている。

従って、育種事業では、このような有望組合わせを集中
的にとりあげ、１組合わせの雑種を可能な限り多数作出
することが新品種育成の近道と考えられているが（農業
及び園芸、第５３巻、第３号（１９７８）、４５９〜４
６４頁参照）、冒頭でも述べたように、ミカン科植物は
雑種作出が非常に困難で、また育種に非常に長期間を要
する。

これに対し、本発明の育種方法、または育種、増殖方法
によれば、ミカン科植物において、任意の有望品種の組
合わせによる雑種を非常に短期間に効率良く作出するこ
とができる。

また、体細胞雑種を利用することにより従来の交雑育種
法では得られない優れた遺伝的特性を有する新規な３倍
体のミカン科植物を効率的に得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の３倍体植物の全体像を示す写真であり
、第２図はこの３倍体植物の根端細胞における染色体像
の顕微鏡写真（倍率３０００倍）を示す。第３図は単葉
及び三出葉を示す図である。第４図は交配親（父）の原
木の写真、第５図は交配親（母） の原木の写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞融合して作出したミカン科植物の体細胞雑種を
   交配親として、これを他のミカン科植物と交雑すること
   を特徴とするミカン科植物の体細胞雑種利用による育種
   法。 ２、細胞融合して作出したミカン科植物の体細胞雑種を
   交配親として、これと他のミカン科植物との交雑により
   ３倍体雑種を作出することを特徴とするミカン科植物の
   体細胞雑種利用による育種法。