JPH02222626A - タマネギとニンニクの雑種植物の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ネギ属の雑種植物とその雑種植物の育種方法
に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）−ａに
、ネギ属の植物には、タマネギやネギ等、生殖によって
繁殖するいわゆる種子繁殖性のものと、ニンニクやワケ
ギ等、種球（球根）によって繁殖するいわゆる栄養繁殖
性のものとがある。

そして、これら種子繁殖性の植物と栄養繁殖性の植物と
は、一般にその性質が顕著に相違するため、いずれか一
方の遺伝形質を他方に導入できれば極めて好都合である
。

又、このような遺伝形質の導入は、上記のような種子繁
殖性の植物と栄養繁殖性の植物間に限らず、植物の品種
改良の観点からは、種子繁殖性の植物相互間、或いは栄
養繁殖性の植物相互間で行われ、さらには同種の植物で
あって品種が異なる植物相互間で行われることも奨励さ
れるべきである。

ところで、一般にある植物種の遺伝形質を他の植物に導
入する手段の１つとして従来では交配法が採用されてい
る。

しかしながら、この方法によれば、ごく近縁の植物相互
間にしか使用できないこと、及び作業時間や労力が多大
となること等の問題点もさることながら、そもそも上記
のような栄養繁殖性の植物については採用すること自体
が不可能であるという致命的な問題点がある。

本発明は、上述のような点に鑑み、任意のネギ属の植物
に新しい遺伝形質を導入するために、品種改良により上
記のような種子繁殖性の植物と栄養繁殖性の植物との雑
種植物、或いは種子繁殖性の植物同士又は栄養繁殖性の
植物同士の雑種植物さらには同種の植物であって異なる
品種同士の雑種植物を育成し、特に栄養繁殖性の植物に
関して遺伝形質の導入を容易に行わしめることを課題と
してなされたものである。

（課題を解決するための手段） そして、本発明は、細胞融合により上記のような課題を
解決せんとするものである。

すなわち、その課題解決のための手段は、ネギ属に属す
る２種の異なる植物のプロトプラストを細胞融合し、次
にその細胞融合によって得られた雑種細胞を培養して生
育させることにある。

これをより詳細且つ具体的に説明すると、先ず２種の異
なる植物の融合材料を融合材料を調製する。

植物としては、たとえばタマネギ、ネギ、ニンニク、ワ
ケギ、ラッキョ、つ等、ネギ属に属する任、意の植物が
使用可能である。

又、融合材料としては、たとえば通常の植物体。

種球中の普通葉を置床して得られた無菌幼植物体。

生長点由来の植物体、カルスからの再分化植物体。

生長点由来のカルス、胚由来カルス、若しくはその他の
器官１組織由来のカルス等の任意の材料が使用可能であ
る。

特に、生長点由来の植物体、生長点由来のカルス、胚由
来のカルスを融合材料として使用した場合には、プロト
プラストやカルスレベルでの増殖能力や分化能が増大す
るという効果がある。又、生長点由来の植物体やカルス
を用いた場合、−ｉにウィルスに侵され易いネギ属植物
をいわゆるウィルスフリー化することができるという利
点がある。

次に、両融合材料をプロトプラスト化し、その両プロト
プラストの精製を行う。プロトプラスト化の酵素処理液
としては、植物の種類、融合材料の種類に応じて任意の
ものが使用可能である。

次に、精製された両プロトプラストを融合する。

その融合処理後の所望の雑種細胞を未融合細胞と識別す
るには、たとえば細胞融合後に、顕微鏡の可視領域にて
識別し、或いは蛍光顕微鏡におけるＢｊＩ域の励起光を
上記雑種細胞や未融合細胞の混合細胞に照射して発色の
有無により雑種細胞を識別する方法がある。

これをより詳細に説明すると、たとえば一方の植物の融
合材料としてカルスを用い、他方の植物の融合材料とし
て植物体の葉身部を用いた場合、カルスの細胞の特性と
しては一般に細胞質リッチ（液胞が小さく細胞質が大き
いもの）なことであり、又、葉身部の細胞の特性として
は、−ｉに可視領域において緑色の葉緑体顆粒が存在す
ることである。従って、いわゆる細胞質リッチで且つ緑
色の葉緑体顆粒が存在するという両者の特性を併備して
いるものが、所望の雑種細胞として識別されるのである
。

一方、上記葉緑体顆粒は可視領域では緑色ではあるが、
特に葉緑体顆粒が少ない場合には、透明なものとの識別
が容易ではない。従って、雑種細胞と細胞質リッチの未
融合細胞とは必ずしも容易に識別できない。

しかし、上記１３９１域の励起光を照射すれば、上記緑
色の葉緑体顆粒が赤色に発色する。従って、このＢ領域
の励起光の照射により、上記雑種細胞を細胞質リッチな
未融合細胞と識別することが一層容易となる。尚、細胞
質リッチでない葉身部の未融合細胞と雑種細胞とは、そ
の細胞の形態によって自ずから識別でき、又、仮に識別
できなくとも、その後の培養時の培地の選定等によって
も選抜が可能である。

尚、このようにして識別された雑種細胞は、上記のよう
な識別後に摘出されるのであるが、その摘出前に予め培
養しておくことにより、細胞壁が再生し、活性も増大す
ることから、摘出操作による細胞の損傷が抑制される。

さらに、前記雑種細胞の摘出後、保護培養用のシャーレ
内に配設されたフィルターリングの外部に予め増殖能の
高いネギ属植物のプロトプラストを入れ、又はその増殖
能の高いネギ属植物のプロトプラストを入れる際に、前
記フィルターリングの内部に前記摘出された雑種細胞を
入れて増殖を行うと、フィルターリング内部の雑種細胞
の増殖が促進されることとなる。

尚、上記のように、細胞融合後に、雑種細胞のみを摘出
せずに、雑種細胞及び２種の未融合細胞が混合した状態
のままで培養し、その後に雑種細胞のみを選抜すること
も可能である。

これをより具体的に説明すれば、一般にネギ属植物にお
いては、ニンニクのように細分化能を有するものは、そ
のカルスがコンパクトで黄色である等の特徴を有する場
合が多い。従って、このニンニクのごとき細分化能を有
するものと、タマネギのように細分化能を有しないもの
とを上記のように混合培養する場合において、その混合
培養時の培地としてタマネギは生育するがニンニクは生
育し得ないような培地を使用すれば、その混合培養によ
ってニンニクのカルスが形成されることはあり得ない。

一方、タマネギのカルスは細分化せず、従って、コンパ
クトで黄色のカルスとは容易に識別される。

この結果、混合培養によって生育したカルスのうち、上
記のようにコンパクトで黄色のカルスが雑種細胞のカル
スである確率が高く、よってこのような判断のもとに所
望の雑種細胞のカルスを選別することができるのである
。

（実施例） 以下、本発明の実施例について説明する。

丈施桝土 本実施例は、タマネギとニンニクの雑種細胞及びその育
種方法についての実施例である。

先ず、その育種方法の操作手順について説明する。

（Ｉ）融合材料の調整 先ス、タマネギとニンニクのそれぞれの融合材料を調製
する。

先ず、滅菌処理したタマネギの種子を、次表１に示す改
変ＢＤＳ培地（Ｉ，２５Ｘ　１０−’　Ｍの２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（以下、２．４−Ｄと略す）を含
む１％寒天培地〕に置床する。これによって得られた葉
身部生長点由来のカルスを、改変ＢＤＳ培地〔２．５Ｘ
ｌ０−６Ｍの２．４−Ｄを含む液体培地〕で継代培養す
る。そして、このような継代培養によって得られた懸濁
培養カルスであって植え継ぎ２日目のものをタマネギの
融合材料として使用する。

表１（改変ＢＤＳ培地の組成） 成分　　　　　重量／ｌ　　モル濃度 ＣａＣ１ｇ　・２Ｈｚ０　　１５０　ｍｇ　　　　１．
０２ｍＭＫＮＯ３２，５３■　　　２５．０２０１ＭＮ
Ｈ，ＮＯ３３２０，１６■　　４．０信台ＮＨＪｚＰ０
４２３０．０６■　　２．０　＋ｎＭ（ＮＨ４）！Ｓ０
．　　　１３４■　　　１．０１ｍＭＭｇＳＯ４・ＩＨ
ｚｏ　　　２４７１１１ｇ　　　　１．００ｍＭＭｎＳ
Ｏ４・４ＬＯ１３，２Ｍ　　　　Ｏ，０４５ｍＭＺｎＳ
Ｏａ　・７Ｈｔ０　　２．Ｏｆｆ１ｇ　　　　６．９５
１ｔＭＣｕＳＯａ　・５Ｈｚ０　　０．０３９　ｍｇ　
　　０．１　ｕｎＫｌ　　　　　　Ｏ，７５■　　　４
．５２ｕＭＣｏＣ１ｇ・６Ｌ０　　０．０２５■　　０
．１０５μｈＨＪ（ｈ　　　　　３．Ｏｍｇ　　　　Ｏ
，０４９ＤＩＭＮａ！ＭｏＯ４Ｈ２）Ｉ□Ｏ０，２５１
１１ｇ　　　　１．０３ｇＭＮａＨｔＰＯａ　’　２１
ｈ０　１７２■　　　１．０４ｇＭＦｅＳＯ４・７８ｚ
Ｏ２７，８５ｍｇ　　　　１００　ｕ　ＭＮａｇＥＤＴ
Ａ　　　３７．２５ｍｇ　　　　１００１１ニコチン酸
　　　　１．０ｍｇ　　　　８．１ｕＭ塩酸チアミン　
　　　１０■　　　０　、０３ｇＭ塩酸ピリドキシン　
１．０■　　４．９μＨメソ−イノシトール　１００■
　　１．８　ａ＋Ｍスクロース　　　　　３０ｇ　　　
　０．０８８　Ｍカザミノ酸　　　　　　　　　　０．
０３％一方、ニンニクについては、その種球を滅菌処理
して種球より普通葉を取り出し、これを改変ＢＤＳ培地
〔ホルモンフリーな０．２％ゲランガム培地〕に１〜２
週間置床する。これによって得られた無菌幼植物体の葉
身部をニンニクの融合材料として使用する。

そして、上記のようなタマネギの種子及びニンニクの種
球の滅菌処理方法について説明すると、（ａ）　　先ず
中性洗剤にてブラシを用いて種子及び種球を１個ずつ洗
浄する。尚、タマネギの種子については、・ガーゼでく
るむ。

（ｂ）　　次に、これらを１５〜２０分間無菌水につけ
て脱泡した後、２％のオスパン水溶液中で１５分間超音
波洗浄する。

（ｃ）　　次に、無菌水にて３回洗浄した後、７０％の
エタノール中に３０〜６０秒間浸漬し、その後、再度・
無菌水にて３回洗浄する。

（ｄ）　　次に、２％アンチホルミンの５％水溶液中で
１５分間の超音波洗浄を２回繰り返す。

（ｅ）　　その後、無菌水によって６回以上洗浄するこ
とによって所望の播種が得られる。

尚、ニンニクについては、洗浄後にメスで普通葉を摘出
する。

（２）　　プロトプラストの精製 次に、上記のように滅菌処理したタマネギの懸濁培養カ
ルス及びニンニクの葉身部をプロトプラスト化し、その
精製を行う。

（イ）タマネギのプロトプラスト精製 先ず、タマネギのプロトプラストについての精製手順を
説明する。

（ａ）　　タマネギの懸濁培養細胞塊の約０．５ｇに、
その培養に用いた培地上清を除去した後に次表２に示す
組成の酵素処理液を約２５ｍ　ｌ添加する。

表２（タマネギプロトプラスト酵素処理液）セルラーゼ
オノズカＲ−１０（Ｙａｋｕｌｔ）　　１．０％マセロ
ザイムＲ−１０（Ｙａｋｕｌｔ）　　　　　　０．５％
ドリセラーゼ（協和発酵）０．５％ マンニトール　　　　　　　　　０．６ＭＭＥＳ　　Ｇ
ｏｏｄ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐ）Ｉ　５．６）尚、上
記表２中、Ｍ　Ｅ　５Ｇｏｏｄ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒとは
、２０１ＭのＭＥＳ−Ｈ，Ｏの４．２６５　　ｇと、５
１１片のＭｇＣｌ２・６ＨｚＯの１．０１７　ｇとを蒸
留水に溶解して１１とし、ＮａＯＨ”ｉ’ＰＨ５゜６に
調整したものである。

ここに、ＭＥＳとは、２−（Ｎ−モルホリン）エタンス
ルフォン酸である。

（ｂ）　　次に、上記の様にして得られた液を約５〜６
時開拡とう処理する（Ｉ００　ｒｐｍ）。

（ｃ）　　次に、上記のように処理した液を、次のよう
なメツシュにおだやかにとおす。

ｉ　）　１５０μｍのメッシュ ｉｉ　）　９０　　μｍのメツシュ ■）６０　　μｍのメツシュ １ｖ）４０　　μｍのメツシュ ■）４０　μｍのメツシュ 上記ｉ）〜Ｖ）のようなメツシュに通す操作を順次行う
ことによって、粒径の粗いものは除去され、必要なもの
のみが残存する。

（ｄ）　　次に、上記のようにメツシュを通した液を、
６００ｒｐｍで３分間遠心分離する。

（ｅ）　　そして、遠心分離した上澄を除去し、沈澱残
渣を洗浄液に懸濁する。

この洗浄液としては、０．５Ｍのマンニトール２２．７
７　ｇと、２．５　ｍＭのＣａ　ＣＩｇ　０．０９ｇと
を蒸留水にて２５０　ｄとし、ｐＨ５，６に調製したも
のを用いる。

（ｆ）　　次に、上記（ｅ）で得られた液を、１０ｄの
遠沈管に入れ、６００ｒｐｎ＋で３分間遠心分離し、こ
の操作を３回繰り返す。

（ｇ）　　その後、遠心分離及び上澄の除去によりタマ
ネギのプロトプラストが精製されることとなる。

（ロ）ニンニクのプロトプラスト精製 衣に、ニンニクのプロトプラストの精製手順を説明する
。

（ａ）　　ニンニクの無菌幼植物体をメスで約３ｍｍに
切断する。

（ｂ）　　上記（ａ）の切断によって得られた細断片を
次表３に示す約２５ｄの酵素処理液に懸濁する。

表３にンニクプロトプラスト酵素処理液）セルラーゼオ
ノズカＲ−１ｏ　（Ｙａｋｕｌｔ）　　２．０％マセロ
ザイムＲ−１０（Ｙａｋｕｌｔ）　　　　　０．５％ド
リセラーゼ（協和発酵）１．０％ マンニトール　　　　　　　　　０．６ＭＭＥＳ　　Ｇ
ｏｏｄ’ｓ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ５，６）（ｃ）　　
次に、上記の様にして得られた液にて上記細断片を約５
〜６時開拡とう処理する（５０ｒｐ＊）ｅ その後は、上記タマネギのプロトプラストの（ｃ）〜（
ｇ）と同様の操作を行ってニンニクのプロトプラストが
精製されることとなる。

（３）細胞融合 上記のようにして得られたタマネギのプロトプラストを
２　Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ　／ｍｌに調製するとともに、
ニンニクプロトプラストのうち、グリーンプロトプラス
トが２　Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ　／　ｒｒｄｌとなるよう
にそれぞれ調製して両プロトプラストを１；１で混合す
る。この混合液を０，８ｄとり、品性細胞融合装置５Ｓ
Ｈ−１を用いて電気融合処理を行った。融合条件は次表
４のとおりである。

表４（細胞融合の条件） （ａ）　　細胞泳動用高周波の周波数　　　　Ｉ　Ｍ）
Ｉｚ（ｂ）　　細胞泳動用高周波電圧（ＶＡＣ）　　４
０Ｖ（ｃ）　　オートモード時にＶＡＣを印加する時間
　　　　　　　　　　　　１０５ｅｃ（ｄ）　　　　パ
ルス幅　　　　　　　３０　ａ＋１ｃｒｏｓｅｃ（ｅ）
　　融合用方形波パルスの 印加電圧　　　　　　　　　　　２００■（ｆ）　　　
　電場の強さ　　　　　１．００　ＫＶ／ｃｍ（ｇ）　
　パルス間隔に印加する 高周波電圧　　　　　　　　　　　３５Ｖ（ｈ）　　オ
ートモード時のパルス 印加間隔　　　　　　　　　　　３５ｅｃ（ｉ）　　印
加パルス数　　　　　　　　　３回（Ｄ　　印加パルス
電圧の減衰率　　　　８０％（ｋ）　　最終パルス印加
後の高周波 印加時間　　　　　　　　　　　１５５ｅｃ（Ｉ）　　
最終パルス印加後の高周波 電圧減衰率　　　　　　　　　　９０％（４）培養 次に、上記のように融合処理したプロトプラスト懸濁液
を、次表５に示す改変８ｐ培地〔２．５Ｘ１０−６Ｍの
２．４−Ｄを含む）に遠心置換を行い、この懸濁液０．
５　ｄと４０°Ｃに保温しておいた０、６％Ｓｅａ　Ｐ
ｌａｑｕｅアガロースを含む０．５　ｍの改変８ｐ培地
〔２．５Ｘ１０−６Ｍの２．４−Ｄを含む）とを混合し
、３５ｒＩａ径のシャーレに広げて固化させた。この時
のプロトプラスト密度は約ＩＸ　１０’ｃｅｌｌｓ　／
　Ｉｌｌであった。その後、２５°Ｃの暗室で約１０日
間静置培養した。

そして、４〜５日おきに、次表６に示す改変ＢＤＳ培地
を約０．０５１１Ｎ添加していった。

尚、上記改変８ｐ培地においては、タマネギプロトプラ
ストのみが分裂し、コロニー形成するもので、ニンニク
プロトプラストはコロニー形成まで至らない。

表５（改変８ｐ培地の組成） （Ａ）　　無機塩（■／１） ＮＨ，ＮＯ。

ＫＮＯ。

ＣａＣ１ｔ２Ｈ２Ｏ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＜・７　Ｈ，Ｏ ＫＨ！ＰＯ。

Ｃｌ ５ｅｑｕｅｓｔｒｅｎｅ３３０Ｆｅ（登録商標）ｌ ）ｆ、Ｂ　Ｏ。

Ｍｎ５Ｏ，・Ｈ，０ ＺｎＳＯ４・７Ｈ，Ｏ Ｎａ、ＭｏＯ４’２Ｈ，０ ０、７５ ３、００ １０，００ ２、００ ０、２５ ＣｕＳＯａ’　　５ＨｚＯ０，０２５ ＣｏＣ１ｚ・６Ｈｚ０　　　　０．０２５（Ｂ）　　＄
１ グルコース　　　　　　０．５Ｍ （Ｃ）　　ビタミン（■／ｌ） イノシトール　　　　　　１００ ニコチンアミド　　　　　　　　ｌ 塩酸ピリドキシン　　　　　　　　ｌ 塩酸チアミン　　　　　　　　１ パントテン酸り一カルシウム　　　　　１葉酸　　　　
　　　０．４ パラアミノ・安息香酸　　　　０．０２ビオチン　　　
　　０．Ｏｌ 塩化コリン　　　　　　１．００ リボフラビン　　　　　０．２０ アスコルビン酸　　　　　２．００ ビタミンＡ　　　　　　　　Ｏ，０１ ビタミンＤｔ　　　　　　　０１Ｏｌ ビタミンＢＩ！　　　　　　０．０２ （Ｄ）　　有機酸（■／１）（ＮＨ，ＯＨによりｐＨが
５．５に調製されている。〕 ピルビン酸ナトリウム　　　　２０ クエン酸　　　　　４０ リンゴ酸　　　　　４０ フマル酸　　　　　４０ （Ｅ）　　カゼインの加水分解物及びココナツ水ビタミ
ンフリーカザミノ酸　　　２５０■／１ココナツ水　　
　　２０ｄ／ｆ 尚、　全ての培地について、ｐＨは５．６（ＮａＯＨ）
に調製されている。

又、すべての培地は、濾過除菌されている。

そして、静置後に、第１図に示すように、アガロースゲ
ル１に切り込みを入れた。

次に、上記のようにアガロースゲルｌの切断によって得
られたビード２を０．８　ｄ改変ＢＤＳ液体培地の入っ
た３５ＩＩｌｆｆｌ径のシャーレに３牧人れた。

その後、５０ｒｐｍの振とう処理を２５゛Ｃの暗室で約
３０日間行う。

そして、コロニーが形成された後、これを００２％ゲラ
ンガムを含む改変ＢＤＳ培地〔２．５Ｘ１０−６Ｍ（７
）２．４−Ｄを含む）に移行しテ２５°ｃで静置培養す
る。

これによって小カルスが形成されることとなる。

（５）カルスから植物への育成 （ａ）　　増殖について 上記のような培養によって得られた小カルスのうち、１
個のカルスを５〜１０ｍ１の改変ＢＤＳ液体培地入りの
５０−マイヤーに入れ、５０ｒｐｍで振とうし、徐々に
スケールアップしていった。

（ｂ）　　再分化について 次に、上記（ａ）で得られたカルスを０．２％ゲランガ
ムを含む改変ＭＳ培地（５，４Ｘｌ０−６ＭのＮＡＡ、
８．９　Ｘｌ０−６ＭのＢＡ）で２５°Ｃ，１５００〜
２５００ＬＵｌｌ’培養した。

その後、約４ケ月で不定芽が形成された。

このようにして得られたカルスについて、第４図に示す
ようにアイソザイムの電気泳動バンドパターンにより同
定を行った。

第４図において、ＨＹＩ及びＨＹ２は上記のようにして
形成されたカルスのうち、任意に摘出した２つのカルス
についての結果である。又、ＧとＯはそれぞれニンニク
カルスとタマネギカルスについての結果である。

この結果からも明らかなように、ＨＹＩ及びＨＹ２につ
いては、ＧとＯの双方のバンドの位置に対応してバンド
が認められ、従って、ＨＹｌ及びＨＹ２が、ニンニクと
タマネギの雑種細胞についてのバンドパターンであるこ
とが確認できた。

尚、酵素としては、ＮＡＤＨ脱水素酵素〔第４図（イ）
］及びエステラーゼ〔第４図（ロ）〕を用いた。

尚、この改変ＭＳ培地においては、タマネギのカルスは
不定芽を形成しない。

（ｃ）　　雑種植物の育成 上記のような再分化によって得られた不定芽を０．２％
ゲランガムを含む次表６の改変ＭＳ培地のｌ／２希釈培
地に移し、発根を促し、幼植物体を得る。

表６（改変ＭＳ培地） Ｈ４ＮＯ３ Ｎ０３ ＣａＣ１ｚ　’　２ｔｌｚＯ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ＫＩＩｔＰＯ４ Ｉ Ｈ，ＢＯ。

ＭＩＩＳＯ４’　４）１ｚＯ ＺｎＳＯａ　’　４ＨｚＯ Ｎａ２ＭｏＯ４・２ＨｚＯ ＣＬＩＳＯ４・５１１２０ ＣｏＣ１ｇ　’　６Ｈ２Ｏ ＮａｌＥＤＴＡ Ｐｅｓｏ４’　ＩＨｚＯ ミオイノシトール ニコチン酸 塩酸チアミン 塩酸ピリドキシン ０．８３ ６．２ ２２．３ ８．６ ０．２５ ０．０２５ ０．０２５ ３７．３ ２７．８ ０．５ ０．１ ０．５ ｍｇ／ｌ！ ■／１ ■／！ ■／２ ■／ｊ２ ■／Ｐ ■／ｌ ■／ｌ ＩＩＩｇ／Ｉｌ Ｋ／！！ ｍｇ／ｌ ■／２ ■／１ ■／！ ｍｇ／／！ ■／ｌ ■／ｌ ■／１ グリシン　　　　　２■／ｌ スクロース　　　　　３％ カザミノ酸　　　　　０．０３％ この幼植物体をバーミキュライトに植え、順化を行い、
次いで培土に植え、完全な植物体を得る。

以上のような操作手順により、タマネギとニンニクとの
雑種植物が育種されることとなる。

ス着眉叉 （イ）本実施例は、前記実施例１の操作手順において、
ニンニクのプロトプラスト調製の操作として、上記（２
）の（ロ）の操作に代えて次のような操作にて行う。

（ａ）　　先ず、上記実施例１と同様に、ニンニクの無
菌幼植物体を約３ｍｍに切断し、次にその細断片を上記
表６の改変ＭＳ液体培地（５，４×１０−ｈＭのナフト
ール酢酸及び８．９　Ｘｌ０−６Ｍ×ベンジルアデニン
を含む）に浸す。

（ｂ）　　次に、これを２５°Ｃの暗室で２４時間浸と
う処理する（５０ｒｐｍ）。

（ｃ）　　その後、酵素処理した後、上記実施例１と同
様の操作を行う。

尚、このニンニクプロトプラスト用の酵素処理液として
は、上記実施例１と同様のものを用いる。

（ロ）次に、本実施例においては、上記実施例１におけ
る（４）の培養の操作に代えて、次のような培養の操作
を行う。

（ａ）　　先ず、前記実施例１の（３）の操作にて細胞
融合処理を施したプロトプラスト懸濁液を改変８ｐ培地
〔２．５Ｘ１０−６Ｍの２．４−Ｄを含む）に置換し、
予め０．２％ゲランガムを含む改変８ｐ培地〔２．５Ｘ
１０−６Ｍの２．４−Ｄを含む）の入った３５ＩＩＩ［
Ｉｌ径のシャーレに広げ、これを２５°Ｃの暗室に静置
した。

融合処理５日以内に、次のｉ）、ｉｉ）のような特徴を
持つ細胞を、径１００〜１５０ｕ１１１のマイクロピペ
ットにてマニュアルビックアンプした。

ｉ）可視領域においては、細胞質リッチで緑色の葉緑体
顆粒が存在する。

１ｉ）Ｂ領域の励起光下においては、葉緑体色素の赤色
顆粒が存在する。

（ｂ）　　上記のようにしてピックアップした融合細胞
を、第２図に示した保護培養系シャーレ３内の中央に配
設されたメンブランフィルタ−リング４内に入れた。

（ｃ）　　リング内は４０°Ｃに保温した０、３％５ｅ
ａｐｌａｑｕｅ　ａｇａｒｏｓｅを含む改変８ｐ培地〔
２．５Ｘ１０−ｂＭの２．４−Ｄを含む）を滴下しカバ
ーした。

（ｄ）　　保護培養系シャーレ３には、予め１％の５ｅ
ａｐｌａｑｕｅ　ａｇａｒｏｓｅ　（Ｆ　Ｍ　ＣＣｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む改変８ｐ培地〔２．５Ｘ１０
−６Ｍの２，４−Ｄを含む）３−を入れ、培地が固化し
ないうちにメンブランフィルタ−リング４を置床してお
いた。さらに、培地固化後、メンブランフィルタ−リン
グ４外に最終濃度Ｉ　Ｘ１０’ｃｅｌＩｓ／ｄになるよ
うに調製した０、３％５ｅａｐｌａｑｕｅ　ａｇａｒｏ
ｓｅを含むタマネギプロトプラスト懸濁液〔改変８ｐ培
地〔２．５Ｘ１０−６Ｍの２．４−Ｄを含む）〕を２〜
２．５戚広げた。４〜５日おきにメンフ′ランフイルタ
ーリング４外に改変ＢＤＳ培地〔２．５Ｘ１０−６Ｍの
２．４−Ｄを含む）を０．１５ｄ添加した。

（ｅ）　　次に、２５°Ｃの暗室で約１０日間静置した
。

（ｆ）　　上記（ｅ）の静置の後、５０ｒｐｍで３０日
間開拡うした。

（ｇ）　　これによって、コロニーが形成され、その形
成されたコロニーを、カルス形成培地へ移行した。

すなわち、第３図のように、３日前から置床した増殖能
の高いタマネギ寒天カルス５をナースとした保護培養系
シャーレ６内に融合細胞由来コロニー７（リング内コロ
ニー）ヲ移行し、２５°Ｃの暗室で約１４日間静置する
と、小カルスが形成された。

以上のような培養の操作以外の操作は、上記実施例１と
同様に行う。

尚、上記実施例においては、タマネギとニンニクのプロ
トプラストの細胞融合によって雑種植物を育種する場合
について説明したが、ネギ属の植物種の種類はこれに限
定されるものではなく、たとえばタマネギとラッキョウ
の組み合わせ、タマネギとワケギの組み合わせ、ネギと
ニンニクの組み合わせ、ネギとタマネギの組み合わせ、
ネギとラッキョウの組み合わせ等、任意の組み合わせが
可能である。

又、同種の植物（たとえばニンニク同士）であっても、
品種の異なるものを組み合わせことも可能である。

（発明の効果） 叙上のように、本発明においては、ネギ属に属する２種
の異なる植物のプロトプラストの細胞融合によって、新
種であるネギ属の雑種食物を育種しうるに至った。

この結果、ネギ属における異なる２種の植物のそれぞれ
の性質を具備した全く新規な雑種植物を提供することが
可能となった。

（ａ）　　たとえば、タマネギとニンニクの組み合わせ
の場合には、次のようなことが可能となる。

ｉ）ニンニクの有効成分（アリシン等）をタマネギに導
入する。

ｉｉ）タマネギの耐寒性、耐暑性をニンニクに導入する
。

ｉｉｉ　）タマネギの種子繁殖性を栄養繁殖性のニンニ
クに導入する。

（ｂ）　　又、タマネギとラッキョウの組み合わせの場
合には、タマネギの種子繁殖性を栄養繁殖性のラッキョ
ウに導入することができ、又、ラッキョウの耐乾性をタ
マネギに導入することができる。

（ｃ）　　さらに、ネギとニンニクの組み合わせの場合
には、上記のような種子繁殖性の導入の他、ニンニクの
有効成分をネギに導入することが可能となる。

（ｄ）　　さらに、ネギとタマネギの組み合わせの場合
には、ネギの耐ベト病性をタマネギに導入することが可
能となる。

さらに、細胞融合によって雑種細胞が育成されるため、
従来の交配法によっては到底得られなかった栄養繁殖性
のネギ属植物についての雑種植物が得られるという格別
顕著な効果を有するに至った。

さらに、細胞融合を利用する結果、任意の２つのネギ属
植物のどのような組み合わせによっても雑種細胞が得ら
れ、しかも交配法のように作業時間や労力を要すること
もなく、又、季節の制約もないという利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図はアガロースゲルの切り込み操作を示す概略平面
図。 第２図は、保護培養系の概略図で、（イ）は平面断面図
、（ロ）は側面断面図をそれぞれ示す。 第３図はカルス形成時の操作を示す概略平面図。 第４図はカルスのアイソザイムの電気泳動バンドパター
ンを示す写真であり、（イ）はＮＡＤＨ脱水素酵素に関
するもの、（ロ）はエステラーゼに関するものをそれぞ
れ示す。 （イ→ 第 第 （ロ） 手続補装置（方式） ％式％ １９事件の表示 平成１年特許願第４７４６３号 ２、発明の名称 ネギ属の雑種植物とその雑種植物の育種方法３゜ 補正をする者 事件との関係 住所 名称

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ネギ属に属する２種の異なる植物のプロトプラスト
   の細胞融合により得られたことを特徴とするネギ属の雑
   種植物。 ２、前記２種の異なる植物がタマネギとニンニクである
   請求項１記載のネギ属の雑種植物。 ３、ネギ属に属する２種の異なる植物のプロトプラスト
   を細胞融合し、次にその細胞融合によって得られた雑種
   細胞を培養して生育させることを特徴とするネギ属の雑
   種植物の育種方法。 ４、プロトプラスト単離の前処理として、融合材料を予
   め培地に浸し、一定時間振とうする請求項３記載のネギ
   属の雑種植物の育種方法。 ５、前記プロトプラスト単離の前処理に、ナフトール酢
   酸又はベンジルアデニンを含む培地を使用する請求項４
   記載のネギ属の雑種植物の育種方法。 ６、融合材料として、通常の植物体、種球中の普通葉を
   置床して得られた無菌幼植物体、生長点由来の植物体、
   カルスからの再分化植物体、生長点由来のカルス、胚由
   来カルス、若しくはその他の器官、組織由来のカルスを
   使用する請求項３乃至５のいずれかに記載のネギ属の雑
   種植物の育種方法。 ７、細胞融合後に、蛍光顕微鏡におけるＢ領域の励起光
   を照射して発色の有無により雑種細胞を識別し摘出して
   培養する請求項３乃至６のいずれかに記載のネギ属の雑
   種植物の育種方法。 ８、細胞融合後、雑種細胞の摘出前に、未融合細胞と雑
   種細胞とが混合された状態で予め培養を行う請求項７記
   載のネギ属の雑種植物の育種方法。 ９、前記雑種細胞の摘出後、その摘出された雑種細胞を
   、保護培養用のシャーレ内に配設されたフィルターリン
   グ内に入れ、且つ前記シャーレ内の前記フィルターリン
   グの外部に、増殖能の高いネギ属植物のプロトプラスト
   を入れて増殖を行う請求項７又は８記載のネギ属の雑種
   植物の育種方法。 １０、融合細胞の培養時において、培養初期は、次の（
   I ）に示す組成の培地〔改変８ｐ培地〔２．５×１０
   ＾−＾６Ｍの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（以下、
   ２，４−Ｄと略す）を含む〕を用い、４〜５日毎に次の
   （II）に示す組成の培地〔改変ＢＤＳ培地（２．５×１
   ０＾−＾６Ｍの２，４−Ｄを含む）を徐々に添加する請
   求項３乃至９のいずれかに記載のネギ属の雑種植物の育
   種方法。 （ I ）〔改変８ｐ培地の組成〕 （Ａ）無機塩（ｍｇ／ｌ） ＮＨ＿４ＮＯ＿３　６００ ＫＮＯ＿３　１９００ ＣａＣｌ＿２・２Ｈ＿２Ｏ　６００ ＭｇＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　３００ ＫＨ＿２ＰＯ＿４　１７０ ＫＣｌ　３００ Ｓｅｑｕｅｓｔｒｅｎｅ３３０Ｆｅ（登録商標）　２８ ＫＩ　０．７５ Ｈ＿３ＢＯ＿３　３．００ ＭｎＳＯ＿４・Ｈ＿２Ｏ　１０．００ ＺｎＳＯ＿４・７Ｈ＿２Ｏ　２．００ Ｎａ＿２ＭｏＯ＿４・２Ｈ＿２Ｏ　０．２５ ＣｕＳＯ＿４・５Ｈ＿２Ｏ　０．０２５ ＣｏＣｌ＿２・６Ｈ＿２Ｏ　０．０２５ （Ｂ）糖 グルコース　０．５Ｍ （Ｃ）ビタミン（ｍｇ／ｌ） イノシトール　１００ ニコチンアミド　１ 塩酸ピリドキシン　１ 塩酸チアミン　１ パントテン酸Ｄ−カルシウム　１ 葉酸　０．４ パラアミノ安息香酸　０．０２ ビオチン　０．０１ 塩化コリン　１．００ リボフラビン　０．２０ アスコルビン酸　２．００ ビタミンＡ　０．０１ ビタミンＤ＿３　０．０１ ビタミンＢ＿１＿２　０．０２ （Ｄ）有機酸（ｍｇ／ｌ）〔ＮＨ＿４ＯＨによりｐＨが
   ５．５に調製されている。〕 ピルビン酸ナトリウム　２０ クエン酸　４０ リンゴ酸　４０ フマル酸　４０ （Ｅ）カゼインの加水分解物及びココナツ水 ビタミンフリーカザミノ酸　２５０ｍｇ／ｌ ココナツ水　２０ｍｌ／ｌ 尚、全ての培地について、ｐＨは５．６（ＮａＯＨ）に
   調製されている。 （II）〔改変ＢＤＳ培地〕 ▲数式、化学式、表等があります▼ １１、ネギ属に属する２種の植物の細胞融合後に、２種
   の未融合細胞及び融合細胞の混合培養により得られたカ
   ルスの中からコンパクトなもの、或いは黄色のものを選
   抜する請求項３乃至６の何れかに記載のネギ属の雑種植
   物の育種方法。