JPH02222626A - タマネギとニンニクの雑種植物の生産方法 - Google Patents
タマネギとニンニクの雑種植物の生産方法Info
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Classifications
-
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
に関する。
、ネギ属の植物には、タマネギやネギ等、生殖によって
繁殖するいわゆる種子繁殖性のものと、ニンニクやワケ
ギ等、種球(球根)によって繁殖するいわゆる栄養繁殖
性のものとがある。
は、一般にその性質が顕著に相違するため、いずれか一
方の遺伝形質を他方に導入できれば極めて好都合である
。
殖性の植物と栄養繁殖性の植物間に限らず、植物の品種
改良の観点からは、種子繁殖性の植物相互間、或いは栄
養繁殖性の植物相互間で行われ、さらには同種の植物で
あって品種が異なる植物相互間で行われることも奨励さ
れるべきである。
入する手段の1つとして従来では交配法が採用されてい
る。
間にしか使用できないこと、及び作業時間や労力が多大
となること等の問題点もさることながら、そもそも上記
のような栄養繁殖性の植物については採用すること自体
が不可能であるという致命的な問題点がある。
に新しい遺伝形質を導入するために、品種改良により上
記のような種子繁殖性の植物と栄養繁殖性の植物との雑
種植物、或いは種子繁殖性の植物同士又は栄養繁殖性の
植物同士の雑種植物さらには同種の植物であって異なる
品種同士の雑種植物を育成し、特に栄養繁殖性の植物に
関して遺伝形質の導入を容易に行わしめることを課題と
してなされたものである。
解決せんとするものである。
る2種の異なる植物のプロトプラストを細胞融合し、次
にその細胞融合によって得られた雑種細胞を培養して生
育させることにある。
なる植物の融合材料を融合材料を調製する。
ケギ、ラッキョ、つ等、ネギ属に属する任、意の植物が
使用可能である。
器官1組織由来のカルス等の任意の材料が使用可能であ
る。
来のカルスを融合材料として使用した場合には、プロト
プラストやカルスレベルでの増殖能力や分化能が増大す
るという効果がある。又、生長点由来の植物体やカルス
を用いた場合、−iにウィルスに侵され易いネギ属植物
をいわゆるウィルスフリー化することができるという利
点がある。
プラストの精製を行う。プロトプラスト化の酵素処理液
としては、植物の種類、融合材料の種類に応じて任意の
ものが使用可能である。
るには、たとえば細胞融合後に、顕微鏡の可視領域にて
識別し、或いは蛍光顕微鏡におけるBjI域の励起光を
上記雑種細胞や未融合細胞の混合細胞に照射して発色の
有無により雑種細胞を識別する方法がある。
合材料としてカルスを用い、他方の植物の融合材料とし
て植物体の葉身部を用いた場合、カルスの細胞の特性と
しては一般に細胞質リッチ(液胞が小さく細胞質が大き
いもの)なことであり、又、葉身部の細胞の特性として
は、−iに可視領域において緑色の葉緑体顆粒が存在す
ることである。従って、いわゆる細胞質リッチで且つ緑
色の葉緑体顆粒が存在するという両者の特性を併備して
いるものが、所望の雑種細胞として識別されるのである
。
特に葉緑体顆粒が少ない場合には、透明なものとの識別
が容易ではない。従って、雑種細胞と細胞質リッチの未
融合細胞とは必ずしも容易に識別できない。
色の葉緑体顆粒が赤色に発色する。従って、このB領域
の励起光の照射により、上記雑種細胞を細胞質リッチな
未融合細胞と識別することが一層容易となる。尚、細胞
質リッチでない葉身部の未融合細胞と雑種細胞とは、そ
の細胞の形態によって自ずから識別でき、又、仮に識別
できなくとも、その後の培養時の培地の選定等によって
も選抜が可能である。
な識別後に摘出されるのであるが、その摘出前に予め培
養しておくことにより、細胞壁が再生し、活性も増大す
ることから、摘出操作による細胞の損傷が抑制される。
内に配設されたフィルターリングの外部に予め増殖能の
高いネギ属植物のプロトプラストを入れ、又はその増殖
能の高いネギ属植物のプロトプラストを入れる際に、前
記フィルターリングの内部に前記摘出された雑種細胞を
入れて増殖を行うと、フィルターリング内部の雑種細胞
の増殖が促進されることとなる。
せずに、雑種細胞及び2種の未融合細胞が混合した状態
のままで培養し、その後に雑種細胞のみを選抜すること
も可能である。
いては、ニンニクのように細分化能を有するものは、そ
のカルスがコンパクトで黄色である等の特徴を有する場
合が多い。従って、このニンニクのごとき細分化能を有
するものと、タマネギのように細分化能を有しないもの
とを上記のように混合培養する場合において、その混合
培養時の培地としてタマネギは生育するがニンニクは生
育し得ないような培地を使用すれば、その混合培養によ
ってニンニクのカルスが形成されることはあり得ない。
クトで黄色のカルスとは容易に識別される。
記のようにコンパクトで黄色のカルスが雑種細胞のカル
スである確率が高く、よってこのような判断のもとに所
望の雑種細胞のカルスを選別することができるのである
。
種方法についての実施例である。
する。
変BDS培地(I,25X 10−’ Mの2,4−ジ
クロロフェノキシ酢酸(以下、2.4−Dと略す)を含
む1%寒天培地〕に置床する。これによって得られた葉
身部生長点由来のカルスを、改変BDS培地〔2.5X
l0−6Mの2.4−Dを含む液体培地〕で継代培養す
る。そして、このような継代培養によって得られた懸濁
培養カルスであって植え継ぎ2日目のものをタマネギの
融合材料として使用する。
02mMKNO32,53■ 25.0201MN
H,NO3320,16■ 4.0信台NHJzP0
4230.06■ 2.0 +nM(NH4)!S0
. 134■ 1.01mMMgSO4・IH
zo 247111g 1.00mMMnS
O4・4LO13,2M O,045mMZnS
Oa ・7Ht0 2.Off1g 6.95
1tMCuSOa ・5Hz0 0.039 mg
0.1 unKl O,75■ 4
.52uMCoC1g・6L0 0.025■ 0
.105μhHJ(h 3.Omg O
,049DIMNa!MoO4H2)I□O0,251
11g 1.03gMNaHtPOa ’ 21
h0 172■ 1.04gMFeSO4・78z
O27,85mg 100 u MNagEDT
A 37.25mg 10011ニコチン酸
1.0mg 8.1uM塩酸チアミン
10■ 0 、03gM塩酸ピリドキシン
1.0■ 4.9μHメソ−イノシトール 100■
1.8 a+Mスクロース 30g
0.088 Mカザミノ酸 0.
03%一方、ニンニクについては、その種球を滅菌処理
して種球より普通葉を取り出し、これを改変BDS培地
〔ホルモンフリーな0.2%ゲランガム培地〕に1〜2
週間置床する。これによって得られた無菌幼植物体の葉
身部をニンニクの融合材料として使用する。
球の滅菌処理方法について説明すると、(a) 先ず
中性洗剤にてブラシを用いて種子及び種球を1個ずつ洗
浄する。尚、タマネギの種子については、・ガーゼでく
るむ。
て脱泡した後、2%のオスパン水溶液中で15分間超音
波洗浄する。
エタノール中に30〜60秒間浸漬し、その後、再度・
無菌水にて3回洗浄する。
15分間の超音波洗浄を2回繰り返す。
とによって所望の播種が得られる。
する。
ルス及びニンニクの葉身部をプロトプラスト化し、その
精製を行う。
説明する。
その培養に用いた培地上清を除去した後に次表2に示す
組成の酵素処理液を約25m l添加する。
オノズカR−10(Yakult) 1.0%マセロ
ザイムR−10(Yakult) 0.5%
ドリセラーゼ(協和発酵)0.5% マンニトール 0.6MMES G
ood’s buffer (p)I 5.6)尚、上
記表2中、M E 5Good’s bufferとは
、201MのMES−H,Oの4.265 gと、5
11片のMgCl2・6HzOの1.017 gとを蒸
留水に溶解して11とし、NaOH”i’PH5゜6に
調整したものである。
ルフォン酸である。
時開拡とう処理する(I00 rpm)。
なメツシュにおだやかにとおす。
ことによって、粒径の粗いものは除去され、必要なもの
のみが残存する。
600rpmで3分間遠心分離する。
渣を洗浄液に懸濁する。
7 gと、2.5 mMのCa CIg 0.09gと
を蒸留水にて250 dとし、pH5,6に調製したも
のを用いる。
遠沈管に入れ、600rpn+で3分間遠心分離し、こ
の操作を3回繰り返す。
ネギのプロトプラストが精製されることとなる。
。
切断する。
次表3に示す約25dの酵素処理液に懸濁する。
ノズカR−1o (Yakult) 2.0%マセロ
ザイムR−10(Yakult) 0.5%ド
リセラーゼ(協和発酵)1.0% マンニトール 0.6MMES G
ood’s buffer (pH5,6)(c)
次に、上記の様にして得られた液にて上記細断片を約5
〜6時開拡とう処理する(50rp*)e その後は、上記タマネギのプロトプラストの(c)〜(
g)と同様の操作を行ってニンニクのプロトプラストが
精製されることとなる。
2 X10’cells /mlに調製するとともに、
ニンニクプロトプラストのうち、グリーンプロトプラス
トが2 X10’cells / rrdlとなるよう
にそれぞれ調製して両プロトプラストを1;1で混合す
る。この混合液を0,8dとり、品性細胞融合装置5S
H−1を用いて電気融合処理を行った。融合条件は次表
4のとおりである。
Iz(b) 細胞泳動用高周波電圧(VAC) 4
0V(c) オートモード時にVACを印加する時間
105ec(d) パ
ルス幅 30 a+1crosec(e)
融合用方形波パルスの 印加電圧 200■(f)
電場の強さ 1.00 KV/cm(g)
パルス間隔に印加する 高周波電圧 35V(h) オ
ートモード時のパルス 印加間隔 35ec(i) 印
加パルス数 3回(D 印加パルス
電圧の減衰率 80%(k) 最終パルス印加
後の高周波 印加時間 155ec(I)
最終パルス印加後の高周波 電圧減衰率 90%(4)培養 次に、上記のように融合処理したプロトプラスト懸濁液
を、次表5に示す改変8p培地〔2.5X10−6Mの
2.4−Dを含む)に遠心置換を行い、この懸濁液0.
5 dと40°Cに保温しておいた0、6%Sea P
laqueアガロースを含む0.5 mの改変8p培地
〔2.5X10−6Mの2.4−Dを含む)とを混合し
、35rIa径のシャーレに広げて固化させた。この時
のプロトプラスト密度は約IX 10’cells /
Illであった。その後、25°Cの暗室で約10日
間静置培養した。
を約0.0511N添加していった。
ストのみが分裂し、コロニー形成するもので、ニンニク
プロトプラストはコロニー形成まで至らない。
1 グルコース 0.5M (C) ビタミン(■/l) イノシトール 100 ニコチンアミド l 塩酸ピリドキシン l 塩酸チアミン 1 パントテン酸り一カルシウム 1葉酸
0.4 パラアミノ・安息香酸 0.02ビオチン
0.Ol 塩化コリン 1.00 リボフラビン 0.20 アスコルビン酸 2.00 ビタミンA O,01 ビタミンDt 01Ol ビタミンBI! 0.02 (D) 有機酸(■/1)(NH,OHによりpHが
5.5に調製されている。〕 ピルビン酸ナトリウム 20 クエン酸 40 リンゴ酸 40 フマル酸 40 (E) カゼインの加水分解物及びココナツ水ビタミ
ンフリーカザミノ酸 250■/1ココナツ水
20d/f 尚、 全ての培地について、pHは5.6(NaOH)
に調製されている。
ル1に切り込みを入れた。
られたビード2を0.8 d改変BDS液体培地の入っ
た35IIlffl径のシャーレに3牧人れた。
30日間行う。
ンガムを含む改変BDS培地〔2.5X10−6M(7
)2.4−Dを含む)に移行しテ25°cで静置培養す
る。
個のカルスを5〜10m1の改変BDS液体培地入りの
50−マイヤーに入れ、50rpmで振とうし、徐々に
スケールアップしていった。
ムを含む改変MS培地(5,4Xl0−6MのNAA、
8.9 Xl0−6MのBA)で25°C,1500〜
2500LUll’培養した。
ようにアイソザイムの電気泳動バンドパターンにより同
定を行った。
形成されたカルスのうち、任意に摘出した2つのカルス
についての結果である。又、GとOはそれぞれニンニク
カルスとタマネギカルスについての結果である。
いては、GとOの双方のバンドの位置に対応してバンド
が認められ、従って、HYl及びHY2が、ニンニクと
タマネギの雑種細胞についてのバンドパターンであるこ
とが確認できた。
]及びエステラーゼ〔第4図(ロ)〕を用いた。
不定芽を形成しない。
ゲランガムを含む次表6の改変MS培地のl/2希釈培
地に移し、発根を促し、幼植物体を得る。
次いで培土に植え、完全な植物体を得る。
雑種植物が育種されることとなる。
ニンニクのプロトプラスト調製の操作として、上記(2
)の(ロ)の操作に代えて次のような操作にて行う。
菌幼植物体を約3mmに切断し、次にその細断片を上記
表6の改変MS液体培地(5,4×10−hMのナフト
ール酢酸及び8.9 Xl0−6M×ベンジルアデニン
を含む)に浸す。
う処理する(50rpm)。
様の操作を行う。
は、上記実施例1と同様のものを用いる。
る(4)の培養の操作に代えて、次のような培養の操作
を行う。
融合処理を施したプロトプラスト懸濁液を改変8p培地
〔2.5X10−6Mの2.4−Dを含む)に置換し、
予め0.2%ゲランガムを含む改変8p培地〔2.5X
10−6Mの2.4−Dを含む)の入った35III[
Il径のシャーレに広げ、これを25°Cの暗室に静置
した。
持つ細胞を、径100〜150u111のマイクロピペ
ットにてマニュアルビックアンプした。
顆粒が存在する。
顆粒が存在する。
を、第2図に示した保護培養系シャーレ3内の中央に配
設されたメンブランフィルタ−リング4内に入れた。
aplaque agaroseを含む改変8p培地〔
2.5X10−bMの2.4−Dを含む)を滴下しカバ
ーした。
aplaque agarose (F M CCor
poration)を含む改変8p培地〔2.5X10
−6Mの2,4−Dを含む)3−を入れ、培地が固化し
ないうちにメンブランフィルタ−リング4を置床してお
いた。さらに、培地固化後、メンブランフィルタ−リン
グ4外に最終濃度I X10’celIs/dになるよ
うに調製した0、3%5eaplaque agaro
seを含むタマネギプロトプラスト懸濁液〔改変8p培
地〔2.5X10−6Mの2.4−Dを含む)〕を2〜
2.5戚広げた。4〜5日おきにメンフ′ランフイルタ
ーリング4外に改変BDS培地〔2.5X10−6Mの
2.4−Dを含む)を0.15d添加した。
。
間開拡うした。
成されたコロニーを、カルス形成培地へ移行した。
の高いタマネギ寒天カルス5をナースとした保護培養系
シャーレ6内に融合細胞由来コロニー7(リング内コロ
ニー)ヲ移行し、25°Cの暗室で約14日間静置する
と、小カルスが形成された。
同様に行う。
トプラストの細胞融合によって雑種植物を育種する場合
について説明したが、ネギ属の植物種の種類はこれに限
定されるものではなく、たとえばタマネギとラッキョウ
の組み合わせ、タマネギとワケギの組み合わせ、ネギと
ニンニクの組み合わせ、ネギとタマネギの組み合わせ、
ネギとラッキョウの組み合わせ等、任意の組み合わせが
可能である。
品種の異なるものを組み合わせことも可能である。
の異なる植物のプロトプラストの細胞融合によって、新
種であるネギ属の雑種食物を育種しうるに至った。
の性質を具備した全く新規な雑種植物を提供することが
可能となった。
の場合には、次のようなことが可能となる。
入する。
。
クに導入する。
合には、タマネギの種子繁殖性を栄養繁殖性のラッキョ
ウに導入することができ、又、ラッキョウの耐乾性をタ
マネギに導入することができる。
には、上記のような種子繁殖性の導入の他、ニンニクの
有効成分をネギに導入することが可能となる。
には、ネギの耐ベト病性をタマネギに導入することが可
能となる。
従来の交配法によっては到底得られなかった栄養繁殖性
のネギ属植物についての雑種植物が得られるという格別
顕著な効果を有するに至った。
植物のどのような組み合わせによっても雑種細胞が得ら
れ、しかも交配法のように作業時間や労力を要すること
もなく、又、季節の制約もないという利点がある。
図。 第2図は、保護培養系の概略図で、(イ)は平面断面図
、(ロ)は側面断面図をそれぞれ示す。 第3図はカルス形成時の操作を示す概略平面図。 第4図はカルスのアイソザイムの電気泳動バンドパター
ンを示す写真であり、(イ)はNADH脱水素酵素に関
するもの、(ロ)はエステラーゼに関するものをそれぞ
れ示す。 (イ→ 第 第 (ロ) 手続補装置(方式) %式% 19事件の表示 平成1年特許願第47463号 2、発明の名称 ネギ属の雑種植物とその雑種植物の育種方法3゜ 補正をする者 事件との関係 住所 名称
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ネギ属に属する2種の異なる植物のプロトプラスト
の細胞融合により得られたことを特徴とするネギ属の雑
種植物。 2、前記2種の異なる植物がタマネギとニンニクである
請求項1記載のネギ属の雑種植物。 3、ネギ属に属する2種の異なる植物のプロトプラスト
を細胞融合し、次にその細胞融合によって得られた雑種
細胞を培養して生育させることを特徴とするネギ属の雑
種植物の育種方法。 4、プロトプラスト単離の前処理として、融合材料を予
め培地に浸し、一定時間振とうする請求項3記載のネギ
属の雑種植物の育種方法。 5、前記プロトプラスト単離の前処理に、ナフトール酢
酸又はベンジルアデニンを含む培地を使用する請求項4
記載のネギ属の雑種植物の育種方法。 6、融合材料として、通常の植物体、種球中の普通葉を
置床して得られた無菌幼植物体、生長点由来の植物体、
カルスからの再分化植物体、生長点由来のカルス、胚由
来カルス、若しくはその他の器官、組織由来のカルスを
使用する請求項3乃至5のいずれかに記載のネギ属の雑
種植物の育種方法。 7、細胞融合後に、蛍光顕微鏡におけるB領域の励起光
を照射して発色の有無により雑種細胞を識別し摘出して
培養する請求項3乃至6のいずれかに記載のネギ属の雑
種植物の育種方法。 8、細胞融合後、雑種細胞の摘出前に、未融合細胞と雑
種細胞とが混合された状態で予め培養を行う請求項7記
載のネギ属の雑種植物の育種方法。 9、前記雑種細胞の摘出後、その摘出された雑種細胞を
、保護培養用のシャーレ内に配設されたフィルターリン
グ内に入れ、且つ前記シャーレ内の前記フィルターリン
グの外部に、増殖能の高いネギ属植物のプロトプラスト
を入れて増殖を行う請求項7又は8記載のネギ属の雑種
植物の育種方法。 10、融合細胞の培養時において、培養初期は、次の(
I )に示す組成の培地〔改変8p培地〔2.5×10
^−^6Mの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(以下、
2,4−Dと略す)を含む〕を用い、4〜5日毎に次の
(II)に示す組成の培地〔改変BDS培地(2.5×1
0^−^6Mの2,4−Dを含む)を徐々に添加する請
求項3乃至9のいずれかに記載のネギ属の雑種植物の育
種方法。 ( I )〔改変8p培地の組成〕 (A)無機塩(mg/l) NH_4NO_3 600 KNO_3 1900 CaCl_2・2H_2O 600 MgSO_4・7H_2O 300 KH_2PO_4 170 KCl 300 Sequestrene330Fe(登録商標) 28 KI 0.75 H_3BO_3 3.00 MnSO_4・H_2O 10.00 ZnSO_4・7H_2O 2.00 Na_2MoO_4・2H_2O 0.25 CuSO_4・5H_2O 0.025 CoCl_2・6H_2O 0.025 (B)糖 グルコース 0.5M (C)ビタミン(mg/l) イノシトール 100 ニコチンアミド 1 塩酸ピリドキシン 1 塩酸チアミン 1 パントテン酸D−カルシウム 1 葉酸 0.4 パラアミノ安息香酸 0.02 ビオチン 0.01 塩化コリン 1.00 リボフラビン 0.20 アスコルビン酸 2.00 ビタミンA 0.01 ビタミンD_3 0.01 ビタミンB_1_2 0.02 (D)有機酸(mg/l)〔NH_4OHによりpHが
5.5に調製されている。〕 ピルビン酸ナトリウム 20 クエン酸 40 リンゴ酸 40 フマル酸 40 (E)カゼインの加水分解物及びココナツ水 ビタミンフリーカザミノ酸 250mg/l ココナツ水 20ml/l 尚、全ての培地について、pHは5.6(NaOH)に
調製されている。 (II)〔改変BDS培地〕 ▲数式、化学式、表等があります▼ 11、ネギ属に属する2種の植物の細胞融合後に、2種
の未融合細胞及び融合細胞の混合培養により得られたカ
ルスの中からコンパクトなもの、或いは黄色のものを選
抜する請求項3乃至6の何れかに記載のネギ属の雑種植
物の育種方法。
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