JPH05507415A - バラ植物及びそれらの生産方法並びに遺伝的形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バラ植物及びそれらの生産方法並びに遺伝的形質転換光里■宜員 １、光贋至丘互 本発明は、−ｉ的に植物組織培養法及び高等植物の細胞を遺伝的に変えるための 方法に関する。より詳しくは、本発明は、ローザハイブリダ（Ｒｏｓａ　ｈｙｂ ｒｉｄａ）の体細胞胚を生成するための方法及びそれらからの再生された植物の 獲得法及びバラ植物からの細胞を遺伝的に形質転換するための方法に関する。

ハイブリッド　バラ、すなわちローザ　ハイブリダは、すべての栽培される植物 の中で最っとも一般的なものの１つである。価値ある植物種に関して、栽培者（ グリ−グー）は、従来の交叉交配技法を用いて、存在する種類を改良し、そして 新種を創造するために長（研究して来た。特定の興味の特徴は、色、香料、形態 、耐除草性、耐農薬性、耐環境性、切断された花の花ビンでの寿命及び同様のも のを包含する。これらの分野のほとんど又はすべてにおける改良及び変異が達成 されて来たが、その進行は、植物の多年生性質及び異常染色体数により引き起こ される植物不稔性の高い頻度のために遅い。

組織培養は、変異の天然源及び突然変異が行なわれ得る便利な培地を時々提供す る。さらに、インビトロ形質転換は、形質転換された植物の再生が達成される場 合、植物改良のための道具として使用され得る。

組換え［ｌＮＡ技法はまた、制御された及び予定されたＢ様で新規バラ培養体を 生成するためにも使用され得る。所望する性質を導入するだめに個々のバラ植物 細胞を遺伝的に形質転換し、そして変性された細胞から活性体細胞胚及びバラ苗 木を再生できることが特に所望される。そのような方法は、バラ植物細胞に予備 選択された外来性遺伝子を導入することができ、そしてその遺伝子を発現できる 形質転換された細胞の選択を可能にすべきである。その方法は、遺伝子を安定し て組込んだ、再生されたバラ植物を生成すべきである。

光コ皇！打 本発明は、体細胞胚からバラ植物、特にローズ　ハイブリッド木の調節された再 生のための方法に関し、ここで前記方法は：（ａ）体細胞胚を供給し； （ｂ）分化された胚を生成するために胚の分化を誘発することができる成熟培地 上で前記体細胞胚を培養し；（ｃ）発芽された胚を生成するために発芽培地上で 前記分化された胚を発芽し；そして （ｄ）土壌状態に移され得る成熟苗木を生成するために成長培地上で前記発芽さ れた胚を成長せしめることを含んで成る。

本発明はさらに、ローズ　ハイブリダの成熟体細胞胚から少なくとも１種の体細 胞胚を得るための方法にも向けられ、ここで前記方法は： （ａ）少なくとも１種の誘発されたカルスを得るために、有効量の栄養培地、エ ネルギー源、オーキシン及びサイトキニンを含むカルス誘発培地上で成熟体細胞 胚を培養し；そして（ｂ）少なくとも１種の体細胞胚を得るために、有効量の栄 養培地、エネルギー源、オーキシン及びサイトキニンを含む、体細胞胚の増殖の 完結を誘発できる再生培地において前記誘発されたカルスを培養することを含ん で成る。

成熟体細胞組織は、たとえば雄ずい花糸、葉外植体又は細胞懸濁培養物から得ら れる。成熟体細胞組織が雄すい花糸又は細胞懸濁培養物から得られる場合、再生 培地における、サイトキニンに対するオーキシンの割合はカルス誘発培地に存在 する、サイトキニンに対するオーキシンの割合に対して少なくとも２〜約１５倍 減じられ得、そして／又は再生培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源は 、カルス誘発培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源とは異なる。換言す れば、再生培地におけるサイトキニンに対するオーキシンの割合は、体細胞組織 が雄すい花糸又は細胞懸濁培養物から得られる場合、誘発培地におけるサイトキ ニンに対するオーキシンの割合よりも２〜１５倍低い。成熟体細胞組織が葉外植 体から得られる場合、サイトキニンに対するオーキシンの割合は、カルス誘発培 地に存在するサイトキニンに対するオーキシンの割合に対して高められ得、そし て／又は再生培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源は、カルス誘発培地 におけるオーキシン及びサイトキニンの源とは異なる。

体細胞胚の利用性及びそのような胚の増殖能力は、植物形質転換の現在の方法、 たとえばＤＮＡ回収の発射方法を実施するための便利な原料又はアグロバクテリ ウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物を提供する。

本発明は、バラ植物胚組織又はカルス細胞を遺伝的に形質転換し、そして好まし い態様においては、形質転換された組織又はカルス細胞を体細胞胚中で再生し、 そして最後に、生存バラ苗木に戻すための方法をさらに含んで成る。組織又はカ ルス細胞は、典型的には選択可能マーカー遺伝子及び発現されるべき１又は複数 の遺伝子を含む外来性ＤＮＡ配列を担持するアグロバクテリウム細胞と共にイン キュベーションすることによって形質転換される。形質転換された組織又はカル ス細胞は典型的には、マーカーの不在下で増殖を阻害する培地上で選択され、そ してＤＮＡ配列を安定して組込む体細胞胚及び苗木に再生され得る。

本発明はさらに、外来性ＤＮＡ配列を組込むバラカルス細胞、体細胞バラ胚、及 びバラ苗木を含んで成る。好ましくはそのような形質転換された細胞、胚及び苗 木は、本発明の方法により得られる。

本発明の方法は、予測でき且つ急速な態様で新規バラ培養体を選択的に増殖する ための特に便利な技法を提供する９種々の特性、たとえば色、芳香、形態、耐除 草剤性、耐殺虫剤性、花ビン寿命、耐環境性及び他の園芸学的特徴がカルス細胞 中に故意に導入され、そして再生された胚及び苗木の染色体中に安定して組込ま れ得ることが予測される。

皿里二１１奏Ｍ３− 第１図は、ローザ　ハイブリダ　ｖａｒ、ロヤルテイ（Ｒｏｓａ　ｈｙｂｒｉｄ ａｖａｒ、Ｒｏｙａｌｔｙ）の花糸外植体からの体細胞胚形成の種々の段階を示 す。

（Ａ）−次カルス（右）及び球状胚（左）からの分化の初期段階；バー２．０１ １１；　（Ｂ）球状胚分化−生存する胚からの複数の出芽の存在が注目される； バー０．７ｍｍ；（Ｃ）胚増殖の初期段階の間の子葉形成；バー０．８ａ＊；（ Ｄ）子葉分化；バー１．０＋ｍ；（Ｅ）体細胞胚に由来するもろい胚発生組織； バー１．０■；　（Ｆ）成長の後期段階での複数の体細胞胚；バー１．７！ＩＩ ；（Ｇ）胚軸の伸び及び子葉の拡張により特徴づけられる胚発芽の初期段階；バ ー１．２ｍ；（Ｈ）発芽培地における３週間後のバラの発芽された体細胞胚；バ ー１．２ｍｍ。

第２図は、ローザ　ハイブリダ　ｖａｒ、ソニア（１？ｏｓａ　ｈｙｂｒｉｄａ 　ｖａｒ。

５ｏｎｉａ）の葉外植体からの体細胞胚形成の種々の段階を示す。（Ａ）培養物 における３週間後の腋芽からの苗木；バー１４．３ｍｍ　；　（Ｂ　）　−次項 地上での３週間後、葉から形成される海綿状カルス；バー１．１鴎；　（Ｃ）再 生培地上での６週間後、−次カルスからの胚分化の初期段階ｉバー１．２ｍｍ； （Ｄ）ややもろい胚発生組織からの球状の胚分化；バー１．２ｍ；（Ｅ）球状の 胚増殖；バー１．２ｍ＋；（Ｆ）球状の胚増殖の拡大；バー０．５ｍｍ 第３図は、ローザ　ハイブリダ　ｖａｒ、ロヤルティの成熟葉カルスからの胚発 生細胞懸濁液の種々の段階を示す。（Ａ）培養での３週間後、成熟葉外植体から の一次カルス増殖；バー６．２ｍ；（Ｂ）液体培養における酸化された球状カル スに由来するコンパクトな白色胚発生組織；バー１．１ｍ；（Ｃ）コンパクトな 胚発注組織からのすばらしい細胞懸濁液；バー１０．Ｏ■；　（Ｄ）固体培地上 での４週間後、細胞懸濁液からのバラ体細胞胚の再生；バー０．７園。

第４図は、ローザ　ハイブリダ　ｖａｒ、ロヤルティからの雄すい花糸から苗を 生成するために使用される一般的な方法を示す。

第５図は、ローザ　ハイブリダ　ｖａｒ、ソニアからの葉外植体から体細胞胚を 生成するために使用される一般的な方法を示す。

第６図は、ローザ　ハイブリダ　ｙａＬロヤルティからの細胞懸濁液から体細胞 胚を生成するために使用される一般的な方法を示す。

第７図は、この後の実験セクションにおける例１で使用される二元プラスミドｐ ＪＪ３４９９の地図である。

第８図は、この後の実験セクションの例２において使用されるブラスミｔ’ｐＪ Ｊ３４９１　（７）’Ｔ−ＤＮＡ　ｉｉｌ域を示ｔ。７’　ラスミＦ　ｐＪＪ３ ９３１　？！、ｎｏｓ／ＮＰＴ　融合体及び３５Ｓ／ルシフ工ラーゼ融合体を担 持する。

第９図は、はたるルシフェラーゼ遺伝子を担持する形質転換されたハラ胚発生カ ルスからの棒グラフの発光測定である。１５種の推定上の形質転換されたカルス （Ｎｏ、１〜１５）及び１２種の形質転換されていない対照カルス（Ｃにより示 される）が、１．５ｄのマイクロ遠心分離管における２００１のルシフェリン溶 液６０Ｍに３０分間、暗室においてそれぞれ配置された。次に、管は、シンチレ ーションバイアルに置かれ、そしてシンナレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒ ｄ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣＱ、　、　Ｐｏ１１ｎｅｒｓ、　Ｇｒｏｖｅ、　ｒ Ｌ、　ＵＳＡ　）により測定された。バーは、ｃｐ−の対数尺度で個々のサンプ ルから発せられる光単位の数を示す（計数７分）、アッセイが、一般的に、Ｏｗ など、（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：８５６〜８５９に記載されるよ うにして行なわれた。

豊定旦欅■ｙ鳳 本発明は、ローザ　ハイブリダの少なくとも１つの体細胞胚を生成する方法及び それらから少な（とも１つの再生された植物を獲得法に向けられる。次の４段階 が、本発明の方法を用いて成熟苗木を得ることに包含される＝　（ａ）体細胞胚 の生成；　（ｂ）胚の分化を誘発することができる成熟培地上での前記体細胞胚 の培養；　（Ｃ）発芽培地上での前記分化された胚の発芽：及び（ｄ）土壌状態 に移され得る成熱苗木を生成するために成長培地上での前記発芽された胚の成長 。

本発明はまた、培養されたバラ植物カルス細胞の染色体中への外来性ＤＮＡ配列 の選択的導入により、遺伝的に形質転換されたバラ植物、細胞及び胚を得ること にも向けられる。その方法は、一定の出発材料、たとえばバラカルス細胞、導入 されるべきＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列を担持し、そしてハラカルス細胞にそれらの 移行を仲介するためのアグロバクテリウム細胞、及びカルス誘発、ＤＮＡ　）ラ ンスファー及び胚及び苗木の再生の段階のために適切な培養培地を必要とする。

個々の必要な出発材料がここに記載されるであろう。

■光礼料 本明細書及び請求の範囲に使用される場合、次の用語は、次の意味を有するであ ろう： 体細胞胚：体細胞細胞から生じる接合胚に類似する構造体。ハラ体細胞胚に由来 する植物は、その植物が予備形成された分裂組織の増殖の刺激により単純に得ら れないことにおいてこれまでの組織培養生成バラ植物とは区別される。

胚　：体細胞胚になることができる。バラにおいて、カルスは、胚になることが できる表面構造体（たとえば約０．５−〜１ｍ）を有する。

予備−胚発性：胚発性することができる。バラにおいて、これらのカルスはこわ れやずく、白っぽいクリーム色で、粒状である。

カルス　：インビトロで種々の器官の培養により通常生成される未分化細胞塊状 物。それは、硬質、軟質、分散性、コンパクト性、海綿状、乾燥性、水性又は同 様の状態のものであり得る。

カルス構遺体二上記を参照のこと。

体細胞　二斗殖細胞（性生殖細胞）を除く生物のいづれかの本体。

栄養培地：塩、炭素源及びビタミンを、培養された植物細胞の維持をもたらすの に必要な濃度で含む培地。

有効量　：列挙された段階をもたらすのに必要な一定の成分の量。

カルス細胞を生成するために使用されるハラ植物組織は、ハラ属、ローザのいづ れかの種から得られる。典型的な種は、ローザ　ダマスセナ（Ｒｏｓａ　ｄａｍ ａｓｃｅｎａ）　、ローザ　マルチフロラ（Ｒｏｓａ　＋ｎａｌｔｉｆｌｏｒａ ）、ローザ　ガリ力（Ｒｏｓａ　ｇａｌｌｉｃａ）　、ローザ　ハイブリダ及び 同様のものを包含する。ローザ　ハイブリダの種々の栽培体、たとえばロヤルテ ィ（Ｒｏｙａｌｔｙ）、フリスコ（Ｆｒｉｓｃｏ）　、ソニア（Ｓｏｎｉａ）及 び同様のものが特に興味の対象である。

カルス細胞の生成のために使用される植物組織は、成熟又は未熟、好ましくは成 熟体細胞組織であり得る。適切な未熟植物組織は、インビトロ植物組織培養技法 、たとえばＩｌ＋＋ｍ１ｒａｔｏなど、Ｊａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、第５巻、　ＭｃＧｒａｗ−Ｈ４ｌｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈ ｉｎｇ　Ｃｏ、、ＮｅｗＹｏｒｋ、　１９９０．特にチャプター２９．７１６〜 ７４７ページ（この開示は引用により本明細書に組込まれる）から得られる。組 織培養材料から得られるカルス細胞は、下記のように形質転換の前、“細胞懸濁 液”にゆだねられ得る。そのような細胞懸濁液は、液体培養培地に細胞を懸濁し 、そしてその懸濁液を、典型的には約１００〜５００　ｒｐ−で振盪することを 含んで成る。多くの場合、細胞？Ａ濁液は、胚細胞の生成に有用である。

好ましい成熟体細胞植物組織は、カルスを生成できる成熟バラ植物のいづれかの 部分から得られる。適切な植物部分は、雄ずい花糸、葉外植体、茎断片、新芽先 端、花弁、ガタ片、葉柄、花柄及び同様のものを包含し、そして雄ずい花糸及び 葉外植体が特に好ましい。

一般的に、成熟植物組織源は、カルス誘発培養物に導入される前、殺菌されるで あろう、適切な殺菌段階は、たとえば７５％エタノールによる約１分間のアルコ ール洗浄、続く漂白剤及び適切な界面活性剤、たとえば０．１％Ｔｗｅｅｎ　＠ による２０分間の洗浄を含んで成る。次に植物材料は、通常、培養の前、滅菌さ れた脱イオン水により、２〜３度、それぞれ約５分間すすがれる。

適切な雄すい花糸は、長約０６５〜１．５ｃ１１．好ましくは約１１のものであ ろう。茎及び葉断片は好ましくは、約１ｃｍＸ１ｃ＋ｍ、好ましくは約０．５　 ＣＩ　Ｘ　Ｑ、　５　ｃｌｌの大きさに切断される。新芽先端は、約０．５〜３ ｇ、好ましくは約Ｉｍの長さに切断されるであろう。

導入されるべき外来性ＤＮＡ配列は通常、形質転換されたカルス細胞（すなわち 外来性ＤＮＡをそれらの染色体中に組込んでいる細胞）のスクリーニング及び選 択を可能にするための少なくとも１種の選択ｉｉＪ能マーカー遺伝子、並びに得 られる植物における所望する特徴又は表現型の発現を増強し、抑制し又は変性す るために選択される１又は複数の゛′機能的”遺伝子を担持するであろう。その よ・うな特徴は、色、芳香、耐除草剤性、耐殺虫剤性、耐疾病性、耐環境性、形 態学、成長特性及び同様のものを包含する。

導入されるべき機能的遺伝子は、所望する表現型を付与するペプチドをコードす る構造遺伝子であり得る。他方、その機能的遺伝子しることができる調節遺伝子 であり得る。遺伝子発現の制御は、観察できる植物特徴に対して直接的な衝撃を 有することが理解される。

他の機能的“遺伝子”は、内因性遺伝子の発現を抑制し、又は変性するために調 製され得るセンス及びアンチ−センスＤＮＡ配列を包含する。アンチ−センスの 使用は一般的に、ｖａｎ　ｄｅｒ　ｋｒｏｌなど、。

（１９９０）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２２０：２０４〜２１２（この開 示は引用により本明細書に組込まれる）に記載される。センスＤＮＡ配列の使用 は、種の文献、たとえばＮａｐｏｌｉなど、（１９９０）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ １．　２　：　２７９〜２８９及びｖａｎ　ｄｅｒ　ｋｒｏｌなど、（１９９０ ）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、２　：　２９１〜２９９（これらの開示は引用によ り本明細書に組込まれる）に記載される。

挿入されるべき構造及び調節遺伝子は、寄託物、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎＴｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙ ｌａｎｄ　２０８５２から、並びに典型的には、従来のハイブリダイゼーション 技法、たとえばＭａｎｉａｔｉｓなど、、Ｍｏ１ｅｃｕｌｏｒ　ＣＩｏｒｉｉｎ ｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ（１９８５）に記載される技法を用いて、ケツム又はｃＤＮＡライ ブラリーのスクリーニングにより、他の生物からの単離により得られる。スクリ ーニングは、（１）他の生物からの相同遺伝子を用いての核酸ハイブリダイゼー ション、（２）所望するタンパク質配列をコードする特定の配列にハイブリダイ ズするように合成的に生成されたプローブ、又は（３）ＤＮＡ配列決定及び既知 配列への比較により行なわれ得る。特定の遺伝子のための配列は、種々のコンピ ューターデータベース、たとえばＧｅｎＢａｎｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　）ｌｅａｌｔｈ並びにＵｎｉｔｅｃｌ　５ｔａｔｅｓＰａ ｔｅｎｔ　０ｆｆｉｃｅにより維持されるデータベースに見出され得る。

対象の遺伝子はまた、相同機能をコードする遺伝子を固定するために相同タンパ ク質に対して製造される抗体による発現ライブラリーの抗体スクリーニングによ り固定され得る。トランスポゾン標識がまた、所望する遺伝子の単離を助けるた めに使用され得る。トランスポゾン標識は、典型的には、標的遺伝子の変異を包 含する。トランスポゾンが標的遺伝子中に挿入され、そして得られる表現型を変 える変異遺伝子が単離される。トランスポゾンのためのプローブを用いて、変異 誘発された遺伝子が単離され得る０次に、単離された変異化遺伝子におけるトラ ンスポゾンに隣接するＤＮＡをプローブとして用いて、標的遺伝子の正常な野生 型対立遺伝子が単離され得′る。そのような技法は、たとえばＭｃＬａｕｇｈｌ ｉｎ　ａｎｄ　Ｗａｌｂｏｔ（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１１７：７７１ 〜７７６；Ｄｏｏｎｓｒなど、（１９８５）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ、２００：２４０〜２４６；及びＦｅｄｅｒｏｆｆなど、（１９８４）　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾、８１：３８２５〜３８２９　（こ れらの開示は、引用により本明細書に組込まれる）に教授される。

本発明の方法に従ってバラカルス細胞中に導入され得る特定の遺伝子は、カルコ ンシンターゼ遺伝子（Ｎａｐｏｌｉなど、（１９９０）　Ｐｌ、ａｎｔＣｅｌｌ 　２　２７９：２８９）及び昆虫耐性遺伝子（Ｖａｅｃｋなど、（１９８７）Ｎ ａｔｕｒｅ　３２８　：　３３）を包含する。

挿入されるべきＤＮＡ配列に対する選択可能マーカー遺伝子は通常、選択培地に おいて形質転換されたカルス細胞の生存を可能にする機能をコードするであろう ０通常、選択可能マーカー遺伝子は、耐抗生物質性、特に耐カナマイシン性、耐 ハイグロマイシン性、耐ストレプトマイシン性、耐クロロスルフロン性（耐除草 剤性）又は同様のものをコードするであろう、適切な選択培地の組成は下記の通 りである。

“機能”遺伝子及び選択可能マーカー遺伝子の他に、ＤＮＡ配列はまた、外来性 ＤＮＡ配列の存在及び発現のための形質転換されたカルス細胞及び植物材料のス クリーニングを促進するレポーター遺伝子を含むことができる。典型的なレポー ター遺伝子は、この後より詳細に記載されるように、β−グルクロニダーゼ及び ルシフェラーゼを包含する。

外来性ＤＮＡ配列は、適切なプラスミド、典型的にはＴｉプラスミド上に見出さ れるトランスファーＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）領域内にトランスファーされるべき 配列を担持するアグロバクテリウム細胞と共にインキュベートすることによりカ ルス細胞に導入されるであろう。Ｔｉプラスミドは、植物細胞の形質転換のため に不可欠な２つの領域を含む。

これらの１つのＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　９Ｍ域は植物核に移され、そして腫瘍形成を 誘発する。ビルレンス（ｖｆｒ）８Ｎ域として言及される他の領域は、Ｔ−ＤＮ Ａのトランスファーのために不可欠であるが、しかしそれ自体トランスファーさ れない。Ｔ−ＤＮＡ　８Ｉ域中に、トランスファーされるべき［ｌＮＡ配列を挿 入することによって、植物ゲノムへの０ＩＪＡ配列の導入がもたらされ得る。通 常、Ｔｉプラスミドは、腫瘍を引き起こす遺伝子を欠失せしめ又は不活性化する ために変性され、その結果、それらは本発明の遺伝子構造体のトランスファーの ためのベクターとしての使用のために適切である。他のプラスミドは、本発明の ＤＮＡ配列をカルス細胞にトランスファーするためにアグロバクテリウムと共に 使用され得る。

Ｍ換えＴｉプラスミドの構成は、従来の組換えＤＮＡ技法、たとえばＭａｎｉａ ｔｉｓなど１．前記に記載される技法を用いて達成され得る０時々、プラスミド は、適切な宿主、典型的には、アグロバクテリウム以外のＨｔｌ宿主、たとえば Ｅ、コリの操作及び構成を可能にする追加の選択マーカー遺伝子を含むであろう 。適切な選択マーカー遺伝子は、耐カナマイシン性、耐カナマイシン性、耐アン ピシリン性及び同様のものを包含する。

ＤＩｉＡ配列内の遺伝子は典型的には、バラ植物宿主のために適切である適切な 転写及び翻訳制御配列に結合されるであろう。たとえば、その遺伝子は典型的に は、プロモーターが転写活性を確保するために通常効果的である距離に対応する プロモーターからの距離に位置している。通常、ポリアデニル化部位及び転写終 結部位は、遺伝子コード配列の３′末端で供給されるであろう０時々、その必要 な制御機能は、それが他の宿主の標的植物から単離される場合、構造遺伝子と一 緒に得られる。そのような損なわれていない遺伝子は通常、コード配列の上流（ ５′）又は下流（３′）のいづれかに、コード配列、イントロン、プロモーター 、エンハンサ−及びすべての他の調節要素を含むであろう。

場合によっては、二元ベクターシステムは、本発明のＤＮＡ配列を導入するため に使用され得る。第１のプラスミドベクター株は、Ｔ−ＤＮＡ配列を担持し、そ して第２のプラスミドベクターはビルレンス（ｖｉｒｌＨｆｆ域を担持する。カ ルス細胞と共に両プラスミドを担持するアグロバクテリウム細胞をインキュベー トすることによって、カルス細胞の感染が達成される。Ｈｏｅｋｅｍａなど、（ １９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：１７９〜１８０（この開示は引用により本 明細書に組込まれる）を参照の適切なアグロバクテリウム株は、アグロバクテリ ウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｒｅｎ ｓ）及びアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉ ｚｏｇｅｎｅｓ）を包含する。野生型のアグロバクテリウム　リゾゲネスが使用 され得るが、アグロバクテリウム　ツメファシェンスは“武装解除”されるべき であり、すなわち使用の前、そのｌＩ！瘍誘全誘発性活性去すべきである。好ま しいアグロバクテリウム　ツメファシェンス株は、Ｈｏｅｋｅｍａなど、　（１ ９８３）Ｎａｔｕｒｅ、　３０３：１．７９〜１８０により記載されるようなＬ ＢＡ４４０４及びＨｏｏｄなど、（１９８６）　Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、、１ ６８：１２９１−１３０１により記載されるようなＥＨＡＩＯＩを包含する。好 ましいアグロバクテリウム　リゾゲネス株は、Ｂｉｒｏｔなど、（１９８７）　 Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２５：３２３〜３２５により 記載されるような１５８３４である。

所望する外因性ＤＮＡ配列を担持するアグロバクテリウム株が調製された後、そ れらは通常、バラカルス細胞と共にインキュベートする前、一定時間、培養され るであろう。最初に、アグロバクテリウムは、栄養物、エネルギー源及びゲル化 剤を含む固体培地上で培養され得る。適切な栄養物は、塩、トリプトン及び酵母 抽出物を包含し、そしてほとんどの糖はエネルギー源として適切であり、そして ゲル化剤は寒天、ＧｅＩ−ｒｊｔｅ＠又は同様のものであり得る。好ましい培地 はＬ−Ｂｒｏｔｈであり、これはこの後の実験セクションに詳しく説明されてい る。通常、培地は、プラスミドＤＮＡ配列を担持するアグロバクテリウムを選択 するために抗生物質を含むであろう。

アグロバクテリウム細胞は典型的には、好ましくは約２８°Ｃで暗室において約 １〜３日間、培養され、そしてまず白色のクリーム色の間、すなわちカン色にな る前、固体培地から削落とされることによって集められる０次に、細胞は液体培 地、たとえばＬ−ブイヨンにおいて、又はより好ましくは、次の成分を含む誘発 ブイヨンに懸濁される： 塩化アンモニウム　０．５〜３　ｇ　／　ｅ　１．　ｇ　／　１２硫酸マグネシ ウム　０．５〜３ｇ／ｌ　１ｇ／ｌ塩化カリウム　０．０５〜２ｇ／ｊ！　０． １５ｇ／Ｉ！力Ｊレシウム　２〜２０ｍｇ／　ｌ　１０＋＋ｇ／　ｌ硫酸第一鉄 　０．５〜１０ｗｇ／　ＩＩ　２．５請ｇ／ｌ−塩基性＃　スフ　ｘ　ｈ　５０ 〜１０００ｍｇ／　ｊ！　２７２　ｍｇ／　ＮＭＥ５　１０００〜１０．０００ ａ＋ｇ／　ｌ　３９０４＋ｇ／　１グルコース　２〜３０ｇ／ｌ　５ｇ／ｌアセ トシリンゴン　１０〜２００　μＭ　１００μＭスクロース　１０〜３０ｇ／ｊ ２　２０ｇ／ｌｐ！（５〜７５．５ アグロバクテリウム細胞は、好ましくは約２０°Ｃ〜３０℃の適度な温度で、撹 拌されながら、約１〜１０時間、好ましくは約２〜３時間、Ｌ−ブイヨン又は誘 発ブイヨン中で培養される。

体細胞胚生成は次の通りにして達成され得る。次の２段階が、ローザ　ハイブリ ダの成熟体細胞組織から体細胞胚の生成に包含される：　（ａ）少なくとも１つ の誘発されたカルスを得るために、栄養媒体、エネルギー源、オーキシン及びサ イトキニンの有効量を含むカルス誘発培地上で成熟体細胞組織を培養し；そして （ｂ）体細胞胚を得るために、栄養媒体、エネルギー源、オーキシン及びサイト キニンの有効量を含んで成る、体細胞胚の成長の完結を誘発できる再生培地にお いて前記誘発されたカルスを培養する段階。１つの態様においては、その段階は 、誘発されたカルスを単離し、そして誘発されたカルスを単離し、そして誘発さ れたカルスが体細胞胚を生成するために再生される前、誘発されたカルスの量を 高めるために維持培地上で誘発されたカルスの培養を含んで成る。

カルス誘発は次の通りにして達成され得る。バラ組織が上記植物部分のいづれか から得られ、そして適切な栄養物、エネルギー源、成長調節物及び同様のものを 含む、植物材料におけるカルス形成を誘発するために選択されたカルス誘発培地 に配置される。カルス増殖を支持するために窒素及び塩の適切な供給を提供する 種々の基本的な栄養培地、たとえばＷｈｉｔｅ’ｓ　Ｂ５．Ｎ６及びＭＳ培地が 知られている。

いづれかの糖がエネルギー源として使用され得る。適切な選択の中には、グルコ ース、マルトース、スクロース又はラクトース、又は上記糖のいづれかとの組合 してのスクロース、又はマンノスが存在る。

カルス誘発培地は好ましくは、少なくとも１種のオーキシン及び少なくとも１種 のサイトキニンを含む。オーキシンは、天然の又は合成のいづれかのオーキシン 、たとえばインドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２．４−ジ クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ビクロラム及びジカンバ（ｄｉｃａｍｂ ａ）であり得る。サイトキニンは、天然の又は合成のいづれかの既知サイトキニ ン、たとえば６−ヘンシルアデニン（６−ＢＡ）、ゼアチン（ＺＥＡ）、キニム ン（ＫＩＮ）、及びイソペンチルアデノシン（ｉＰ）から選択され得る。カルス は、オーキシン及びサイトキニンのいくつかの組合せの存在下で誘発され得る。

しかしながら、卓越した結果は、２．４−Ｄ及びゼアチンを含む誘発培地上で観 察される。他の有用な組合せは、キネチンとＮＡＡである。一般的に、オーキシ ンは、約０．１〜１０■／Ｉｄの量で存在し、そしてサイトキニンは約０，２〜 １５．０■／ｄの量で存在する。オーキシンがＮＡＡである場合、培地中の濃度 は好ましくは、約０．５〜２．５■／ｌ及び最っとも好ましくは約２．０■／ｌ である。　２．４−Ｄが使用される場合、その量は好ましくは約０．５〜１０． ０［／ｉ及び最っとも好ましくは約２．５■／ｌである。サイトキニンがキネチ ンである場合、培地中のその濃度は好ましくは約０，５〜５１Ｉｇ／ｌ、及び最 っとも好ましくは約０．５■／ｌである。ゼアチンが使用される場合、その濃度 は好ましくは、約０．２〜１２．５■／ｌ及び最っとも好ましくは約１．５■／ ｌである。他の非本質的な成分はまた、カルス誘発を最適化するために培地に添 加され得る。たとえば、アミノ酸、たとえばグリシンが窒素源として使用され得 る。ある態様において、追加の増殖ｔｌｉｉ節物の使用が、カルス誘発の促進に おいて適切であり得る。

たとえば、約Ｏ９１〜０．２■／２の量でのアブシジン酸（ＡＢＡ）の添加は、 カルス誘発において、特に胚発生組織を誘導するより球状のカルスを促進するこ とに有用である。ＡＢＡはすべての外植体源と共に使用され得るが、しかし特に 、インビトロ葉外植体の培養に関して有用である。

当業者は、植物組織培養に時々使用される他の成分がカルス誘発培地に導入され 得ることを理解するであろう０種々のビタミン、たとえば？ＩＳビタミン、ｗｈ ｉｔｅビタミン、ニコチン酸、イノシトール、ピリドキシン又はチアミンの添加 が通常である。同様に、固体培地のためには、適切な量の固化剤、たとえば寒天 又はＧｅ１−ｒｉｔｅ”が、混合物に添加される。

再生培地へのカルスの移行の前、維持培地にカルスを移行することが所望される （通常、形質転換の場合）、この培地、こわれやすい胚発生組織又はカルスを単 離し、そして再生の前、このタイプのカルスを助けるために使用される。再生は 、成熟相なしには生じ得るが、維持培地へのカルスの移行は、特定カルス細胞系 の良好な制御及び増殖を可能にする。

維持培地の主成分は、無機栄養物、少なくとも１種の成長調節剤、及びエネルギ ー源を有する適切な塩基性培地である。いづれかの垢がエネルギー源として使用 され得る。増殖調節剤は、オーキシン、サイトキニン、アブシジン酸及びジベレ リン酸を包含する群から選択され得るが、但しこれだけには限定されない。オー キシンは、天然の又は合成のいづれかのオーキシン、たとえばＴＡＡ　、　ＮＡ Ａ　、　２．４−Ｄ及びビクロラムであり得る。オーキシンは約０．１〜１１０ ｌ１／ＩＩｉの量で存在するであろう、サイトキニンは、合成の又は天然のいづ れか既知のサイトキニン、たとえば６−ＢＡ、　ＺＥＡ　、　ＫＩＮ及びｉＰか ら選択され得る。サイトキニンは、約０．２〜１５．０■／ｄの量で存在し得る 。

アブシジン酸は約０．２〜２■／ｉ！、の量で存在し得る。ジベレリン酸は約０ ．５〜５■／１の量で存在し得る。

カルス維持は、できるだけ長く、好ましくは定期的な継代培養により続けられる 。一般的に、予備胚発生カルスは、約１２〜２４カ月又はそれ以上維持され得る 。

特定の態様において、胚が細胞懸濁液から生成される場合、誘発の後の細胞が、 特定の維持培地、すなわち培養において組織外植体の酸化なしに細胞増殖を促進 する５Ｍ−１に移され得る。５Ｍ−１培地の利用性は、ＡＢＡ及び２．４−Ｄの 存在下で存在する。好ましい態様において、２．４−Ｄは約１．６５■／２の濃 度で存在し、そしてＡＢＡは約０．２６ｍｇ／　ｌの濃度で存在する。５Ｍ−１ における培養に続いて、組織は良く且つコンパクトになり、そして結果的に、好 結果をもたらす完結方法のために必要な良好な細胞懸濁液のための主成分を供給 する小さな細胞群を形成し始める。

さらに、細胞懸濁培養の特定の場合、１又は複数のならし培地が、液体培地にお いてこわれやすい細胞系の選択を可能にするために維持培地への移行の前に使用 され得る。そのならし培地は、無機栄養物、成長ｍ！ｆｆ物及びエネルギー源と 共に適切な塩基性培地を含んで成る。いづれかの塘がエネルギー源として使用さ れ得る。成長調節物は、オーキシン、サイトキニン、アプシジン酸及びジベレリ ン酸を包含する群から選択され得るが、但しこれだけには限定されない。

オーキシンは、天然の又は合成のいづれかのオーキシン、たとえばＩＡＡ　、　 ＮＡＡ　、　２．４−Ｄ及びピクロラムであり得る。オーキシンは、約０．１〜 １０■／ｄの量で存在するであろう。サイトキニンは、天然の又は合成のいづれ か既知のサイトキニン、たとえば６−ＨＡ、　ＺＥＡ　。

ＫＩＮ及びｉＰから選択され得る。サイトキニンは、約０．２〜１５．０ｇ／ｌ の量で存在し得る。アブシジン酸は、約０．２〜２■／Ｉｌの量で存在し得る。

ジベレリン酸は、約０．５〜５■／２の量で存在し得る。

カルスは、ならし培地において約３〜６週間、培養され得る。

バラカルス細胞は、本発明の方法に従って形質転換され得る。バラ組織はまず、 形質転換のために分散されたカルス細胞の源として使用する少なくとも１つのカ ルスを生成するのに十分な時間、カルス誘発培地上で培養される。典型的には、 組織は、早く成長するカルスを生成するために、約３〜１３週間、通常約７〜ｌ Ｏ週間、及び好ましくは約８週間、カルス誘発培地に維持され得る。初めに、カ ルス形態は硬質、海綿状、水性、砂状又は球状であり、そして培地の特定の組成 に依存して白色、クリーム色又は黄色を有する０本発明の形質転換法に使用する ための好ましい形態は、カルスが白色がかったクリーム色及び粒状コンシスチン シーを伴って、ひじょうにこわれやすく又は分散性になる場合、約７〜１０週間 後、通常約８週間後に生じる。これらの特徴を有するカルスからの細胞は最っと も適切であることが見出されたが、硬質で且つコンパクトであるカルスからの細 胞もまた、約２〜３■の寸法を典型的には有する小さな断片に切断することによ って、形質転換のために使用され得る。

上記のようにして培養されたカルスは、形質転換のためにカルス細胞源として直 接的に使用され得、又は出発材料として使用する前、継代培養され得る。継代培 養は、本発明の方法のための出発材料の源としてカルス細胞の連続した維持を可 能にする。

所望する形質転換を達成するためには、上記カルス材料が、形質転換されるべき 外来性ＤＮＡ配列を担持するアグロバクテリウム細胞と共に、典型的には１〜４ 日間インキュベートされる。インキュベーシッンは、栄養物、エネルギー源、及 びアグロバクテリウムのビルレンス（ｖｉｒ）ｆｉｉ域の形質転換効率の増強を 誘発するために選択された誘発化合物を含む同時培養培地において達成される。

誘発化合物は、そのようなビルランスを誘発することが知られているいづれかの フェノール化合物、好ましくは約１０〜２００　μＭ、好ましくは約１００　μ Ｍで存在するアセトシリンボン（Ａｓ）であり得る。適切なフェノール化合物は 、Ｂｏｌｔｏｎなど、（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：９８３〜９８５ に記載される。

好ましい同時培養培地は、エネルギー源としてスクロース（２０ｇ、’Ｒ）、オ ーキシンとして２．４．−ＤＣ５■／ｉ）及びサイトキニンとしてゼアチン（１ ■／２）を含む。ジベレリン酸（１■／りがまた好ましくは、成長ｔＡ節物とし て存在する。同時培養培地のための好ましい配合物は、この後の実験セクション に示されるＮ１２ＡＳである。

カルス細胞は、約２０〜２８°Ｃ１好ましくは約２４゛Ｃの適度な温度で、約１ 〜４日間、通常約１〜２日間、同時培養培地中でアグロバクテリウム細胞と共に 組合される。その培地は好ましくは暗室に保持され、そして同時培養は、アグロ バクテリウムが、コロニーがカルス上に直接的に又は顕微鏡を通して観察できる ように十分に増殖するまで続けられる。

アグロバクテリウム細胞は、約１０７〜１０ｉｏ個の細胞／ｄ、好ましくは約１ ０９個の細胞／ｄの濃度で存在する。カルス細胞は、体積に基づいて、約１：ｌ 〜約１０：１（カルス細胞：アグロバクテリウム細胞）、好ましくは約３：１の 比で存在する。通常、カルス材料約１〜１００　ｍ、好ましくはＩＯｄの合計量 が、約１〜１００　ｄ、好ましくは約ｌＯ〜１２ｄの合計培養体体に使用される 。好ましくは、カルス細胞及びアグロバクテリウム細胞は、同時培養培地上での フィルター紙マトリックス、たとえば−ｈａｔｍａｎ　ｅ　ｌ上に置かれる。

形質転換が完結された後、カルス細胞を、水、又は栄養物、エネルギー源、成長 ｔｏｙ物及び同時のものを含む培養培地により、アグロバクテリウム細胞から洗 浄される。小さなカルス構造体、典型的には約０．２〜０．３閣の大きさのもの のためには、Ｎ１２培地（実験セクションを参照のこと）の使用が特に適切であ る。大きなカルス構造体、典型的には約０．４〜０．７閣の大きさのもののため には、Ｎ５３培地の使用が特に適切である。

形質転換されたカルスは、洗浄媒体と共に、典型的には約１：３〜約１：３０（ カルス：液体）、好ましくは約１：１０で混合され、そして好ましくは５００　 ｒｐ−で約５分間遠心分離される。はとんどの細菌を含む得られた液体画分を除 去し、そしてカルスを含むより濃い画分が保護される。洗浄を２〜６回くり返し 、そして抗生物質が、いづれかの残存するアグロバクテリウム細胞を殺害するた めに後期洗浄に少なくとも使用される。アグロバクテリウムを殺害できるいづれ かの抗生物質、たとえばカルベニシリン（２００−１０００■／り、バンコマイ シン（１００〜５００■／ｌ）、クロキサシリン（２００〜１０００ｍｇ／β） 、セフォタキシン（２００〜１０００■／ｆ）及びエリスロマイシン（２００〜 １０００■／ｉｔ）が使用され得る。

洗浄の後、カルスは、外来性ＤＮＡの一部として導入されるマーカーの存在に基 づいて、形質転換されたカルスの固定を可能にする植物選択物質を含む適切な選 択培地上に置かれる０便利には、その選択培地は、カルスの部分、典型的にはそ れぞれ約１００■のカルスと共にベトリ皿に置かれる。選択培地は、一般的な増 殖培地、たとえば植物選択物質により補充されたＮ１２又は門５３（この後の実 験セクションに記載される）であり、そして通常抗−アグロバタテリウム抗生物 質を含む。適切な植物選択物質は、次のものを含む。

薮五生隻ｌ盟　゛　１町の゛ カナマイシン　２００〜５００ｇ／ｊ！ヒグロマイシン　２０〜８０■／ｌ スペクチノマイシン　２０〜ＢＯｔｇ／ｌストレプトマイシン　１００〜５００ ｇ／Ｉｌクロルスルフロン　０．００１〜０．０５■／ｉ。

好ましい選択培地は、サイトキニン又はオーキシンを含まないが、しかし約０． ５〜４［／ｆｆｉ、好ましくは約２■／ｊ２で添加されるアブシジン酸を存する Ｎ１２及び祁３　（この後の実験セクションを参照のこと）である。Ｎ５３は、 カルス構造体が約０．４〜０．７閣の大きさである場合、特に好ましい。耐カナ マイシン性が選択可能マーカーである場合、Ｎ１２ＣＫ及びＮ５３ＣＫ　（この 後の実験セクションを参照のこと）が特に適切である。

選択培養は、形質転換されたカルス細胞の増殖及び白色かかったクリーム色のカ ルスの生成を可能にするのに十分な時間、維持され、ところが非形質転換カルス 細胞はカッ色に変わり、そして死滅する。

典型的には、選択培養は、主に植物選択剤の濃度に依存して、約２５〜５０日続 くであろう。たとえば３０日が一般的に３００■／ｌでのカナマイシンのために 十分であり、そして５０日は、２００■／ｌでのカナマイシンのために適切であ る。しかしながら、選択培養の終結における主な基準は、形質転換された増殖細 胞と形質転換されていない非増殖細胞との間の明確な差異である。

生存性は、カルス細胞が形質転換されたことを示唆するが、標準のアッセイ方法 、たとえばサザンブロント、ノザンブロント、制限酵素消化、ポリメラーゼ鎖反 応（ＲＣＲ）アッセイを用いて、又はレポーター遺伝子の使用により形質転換を 確かめることが通常所望される。適切なレポーター遺伝子及びアッセイは、Ｊｅ ｆｆｅｒｓｏｎ、ＧｔｌＳ　ＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎ　５ｙｓｔｅｓｓ　Ｕｓｅｒ ’ｓ　ｆｆａｎｕａｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８７）に記 載されるようなβ−グルクロニダーゼ（Ｇ１１Ｓ）及びＯｗ（１９８６）Ｓｃｉ ｅｎｅ　２３４　：８５６〜８５９により記載されるようなルシフエラーゼアン セイを包含する。適切には、これらのアッセイは、形質転換工程に続いてすぐに 、又は本発明に従っての形質転換された植物材料の再生の間、いづれかの続く点 で行なわれ得る。

誘発培地（及び場合によっては維持培地）上での培養、又は選択培地上での形質 転換及び選択に続いて、カルスは、体細胞胚の生成のために再生培地に移される 。この培地は、その主要成分として、オーキシン、サイトキニン、エネルギー源 及び適切な栄養培地、たとえばＷｈ　ｉ　ｔｅ　’　ｓ又はＢ５培地を含む。形 質転換に続いて、培地ｌよまた、抗−アグロバクテリウム抗生物質及び通常ＡＢ Ａ又はジベレリン酸を含むであろう。好ましい後−形質転換再生培地は、Ｎ５３ Ｃ（特に、Ｎ１２ＣＫが選択培地である場合）及びＮ２０Ｃ（特に、Ｎ５３ＣＫ が選択培地である場合）である。

再生培地の配合は、体細胞組織の源に依存して調整され得る。成熟体細胞組織が 雄すい花糸又は細胞懸濁培養物から得られる場合、オーキシン：サイトキニンの 比は、カルス誘発培地に存在するオーキシン：サイトキニンの比に対して少なく とも２〜１５倍減しられ得、そして／又は再生培地におけるオーキシン及びサイ トキニンの源はカルス誘発培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源と異な るであろう。好ましい態様において、誘発培地及び選択培地におけるよりも再生 培地におけるより弱いサイトキニン及びオーキシンが使用される。特に、２．４ −Ｄは強いオーキシンであり、すなわちＮＡＡよりも増殖調節に対して高い効果 を有し、そしてゼアチンはキネチンよりも強いサイトキニンである０例として、 花糸の再生は、カルス誘発培地において４．０の割合でのＮＡＡ／キネチンに比 較して、１．３の割合で２．４−Ｄ／ゼアチンを含む培地において生じ得る。

成熟体細胞組織が葉の外植体から得られる場合、オーキシン：サイトキニンの比 は、カルス誘発培地に存在するオーキシン：サイトキニンの比に対して高められ 得、そして／又は再生培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源は、カルス 誘発培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源とは異なるであろう。例とし て、葉外植体の再生は、１．３の割合での２．４−Ｄ／ゼアチンに比較して、２ ．０の割合でのＮＡＡ／ＫＩＮを含む維持培地において生し得る。

形質転換されたカルスと共に使用するための好ましい再生培地は、Ｎ５３Ｃ（特 ニＮ１２ＣＫが選択培地である場合）及びＮ２０Ｃ（特ニＭ５３（Ｊが選択培地 である場合）である。

再生培地上での期間は一般的に約２０〜６０日、通常約３０日である。

り球状〜心臓形状の胚が通常、この時間の後に培養物の表面上に現われるであろ う。多くの場合、そのようにして形成される胚は、継代培養に基づいて、それら の外表面上で二次胚を発生することができる。この二次胚の生成が特に所望され る場合、球状の胚は新鮮な再生培地に移され、そして３〜６週間、培養され得る 。

上記のようにして生成された体細胞胚は、多くの数の形質転換された胚を付与す るために反復して継代培養され得る。これらの胚はまた、発射法（５ａ１ｆｏｒ ｄ、など、）を通しての植物形質転換のための有用な標的である。しかしながら 、完全な植物材料を再生するためには、体細胞胚は、成熟工程にゆだねられるこ とが所望される。

体細胞胚の成熟は、栄養物、エネルギー源、及びオーキシン、サイトキニン、ア ブシジン酸、及びジベレリン酸を含む（但し、これだけには限定されない）成長 調節物を含む培地に球状胚を移すことによって達成される。オーキシンは、天然 の又は合成のいづれかのオーキシン、たとえばＩＡＡ、　ＮＡＡ　、　２．４− Ｄ及びピクロラムであり得る。オーキシンは、約０．１〜１０■／ｄの量で存在 するであろう、サイトキニンは、天然の又は合成のいづれか既知のサイトキニン 、たとえば６−ＢＡ、　ＺＥＡ　、　ＫＩＮ及びｉＰから選択され得る。サイト キニンは、約０．２〜１５．０■／２の量で存在し得る。アブシジン酸は、約０ ．２〜２＠／Ｈの量で存在し得る。ジベレリン酸は、約０．５〜５■／ｌの量で 存在し得る。好ましい成熟培地は、Ｎ２０（この後の実験セクションを参照のこ と）である。

カルス細胞は、成熟体細胞胚が得られるまで、好ましくは約３０日ごとに継代培 養しながら成熟培地上で維持される。成熟の期間は一般的に、約３〜６週間であ る。球状胚は成熟培地の表面上に現われ、そして多くの胚は、二次胚にそれらの 外表面上で発生する。そのような二次胚生成が所望される場合、球状胚が新鮮な 維持培地（上記のような）に移され、そして多くの胚を得るために返復して継代 培養され得る。そのような継代培養は好ましくは、１１２０培地上で行なわれる 。

上記のようにして生成される成熟体細胞胚は次に、発芽された胚を生成するため に発芽培地に移される０発芽培地は栄養物及びエネルギー源を含んで成る。培地 はさらに、サイトキニン、アブシジン酸及びジベレリン酸を含む（但しこれだけ には限定されない）成長調節物を含む。サイトキニンは、約０．１〜１．０■／ ｌの濃度で存在し得る。アブシジン酸は、約０．２〜２■／！の量で存在し得る 。ジベレリン酸は約０．５〜５■／！の量で存在し得る。発芽培地はまたさらに 、約５〜１５％、Ｖ／Ｖでココナツツ水を含むことができる。好ましい発芽培地 は旧３である。体細胞胚は、発芽された胚を生成するために、発芽培地上で約１ 〜４５日、通常約２４日間維持される。

胚発芽の初期段階は、胚軸の拡張、子葉及びクロロフィルの成長により特徴づけ られる。発芽の後期段階において、子葉が拡大し、胚軸が拡張し、そして先端の 根が成長する。分化された胚は、発芽培地上に約２４日間維持され得る。その結 果物は、２〜４枚の葉を有する長さ１〜４ｍの苗条を有する体細胞胚である。

場合によっては、発芽された胚は、拡張された苗条を生成するために苗条拡張培 地に移され得る。その培地は、一般的に上記のように栄養物、エネルギー源、及 び成長ｍｍ物を含むが、しかし減じられた塩濃度（５０％まで低い）及び減じら れた成長１１節吻合有率を有し、好ましくは１〜６■／！でのＢＡ及び０．１〜 １■／２でのＩＡＡを有するであろう。好ましい苗条拡張培地はＮ１３−８　（ この後の実験セクションを参照のこと）である。胚は、苗条が長さ約１０〜２０ ａｗになり、３〜５枚の十分に緑で且つ拡張された葉及び茎を成長せしめるまで 、典型的には３〜４週間、拡張培地に維持される。

発芽された（そして場合によっては、苗条拡張された）胚は、適切な栄養物、エ ネルギー源、オーキシン及びサイトキニンを含む成長（又は苗条増幅）培地に連 続的に移される。オーキシンは、天然の又は合成のいづれかのオーキシン、たと えばＩＡＡ、　ＮＡＡ　、　２．４−Ｄ及びピクロラムであり得る。オーキシン は、約０．１〜１０ｇ／ａｄＯ量で存在するであろう、サイトキニンは、天然の 又は合成のいづれか既知のサイトキニン、たとえば６−ＢＡ、　ＺＥＡ　、　Ｋ ＩＮ及びｉＰから選択され得る。サイトキニンは、約０．２〜１５．０■／ｌの 量で存在し得る。

好ましいＢ欅において、オーキシンは、ＩＡＡであり、約０．３■／ｌの濃度で 存在し、そしてサイトキニンは６−ＨＡであり、約３．０■／ｌの濃度で存在す る。栄養培地は、Ｗｈｉｔｅ’ｓ　、　ＭＳ、　Ｂ５及びＮ６培地から成る群か 選択されるが、但しこれだけには限定されない。好ましい成長又は苗条増幅培地 はＮ１３（この後の実験セクションを参照のこと）である。いづれかの糖がエネ ルギー源として使用され得る。オーキシンは、天然の又は合成のいづれかのオー キシン、たとえばＩＡＡ　、　ＮＡＡ　、　２．４−Ｄ及びピクロラムであり得 る。オーキシンは、約０．１〜１０■／ｄの量で存在するであろう、サイトキニ ンは、天然の又は合成のいづれか既知のサイトキニン、たとえば６−ＢＡ、　Ｚ ＥＡ。

Ｋｌ）ｌ及びｉＰから選択され得る。サイトキニンは、約０．２〜１５．０■／ ！の量で存在し得る。

発芽された胚は、約２０〜２００日間、好ましくは約３０日間、成長培地におい て培養され得る。十分に成長された苗木が得られ、そしてたとえば根の生成のた めに人工土壌に移され得る。１つの態様において、複数の苗条は、土壌に移す前 、単一の苗木から分離され得る。

約１０〜４０閣の長さ及び好ましくは約５〜１０枚の葉を有する十分に成長され た苗条が、根再生のために選択される。根再生のための好ましい方法は、人工土 壌を含む、典型的には根誘発ホルモンを含む培地により飽和された小さなポット に根ずくされるべき苗条を移すことである。適切な根誘発は栄養物を含むが、し かし糖及び他のエネルギー源を奪うその培地はさらに、チアミンを、好ましくは チアミン−ＨＣｌの形で、約０．５〜２■／２で及びオーキシン、たとえばＩＡ Ａを約１〜４■／ｉ！で含むことができる。好ましい根再生培地はＮ３−４（後 の実験セクションを参照のこと）である。ポットにおいて、苗条は容器、たとえ ばｍａｇｅｎｔａ　ＧＡ　−７培養容器に配置され、そして２４時間当たり１６ 時間の光下で成長チャンバーにおいてインキュベートされる。

他の根再生方法は、適切な根誘発ホルモン、たとえばＲｏｏＴｏｎｅ　（ＴＭ） に根を含浸することである。次に、苗条が温室において、好ましくは高い相対温 度を維持するためにプラスチックカバー下で維持されている土壌に直接的に置か れる。カバーは、苗条の硬化を引き起こすために、一定期間にわたって徐々に除 去され得る。

上記アプローチのいづれかにより、根は約７〜３５日で典型的には得られる０次 に根を有した苗条が温室内に又は組織培養苗木のための従来の態様で移植され得 る。

得られた苗木の形質転換は、外来性ＤＮＡにより組込まれたいづれかの表現型に ついて植物材料をアッセイすることによって確かめられ得る。特に、適切なアッ セイは、特定のレポーター遺伝子、たとえばβ−グルクロニダーゼ及び／又はル シフェラーゼの存在を決定するために存在する。他の方法、たとえばＰＣＲ，制 限酵素消化、サザンブロット　ハイブリダイゼーション及びノザンブロット　ハ イブリダイゼーションがまた使用され得る。

上記方法及び次の例は、多くの異なったハイブリッド茶の種類、たとえば“ソニ ア”及び“ロヤルティ”に適用された。好結果をもたらす手段は、ある程度、遺 伝子型特異的であり；しかしながら、一定の種類による組織培養方法の実質的な 好結果は、上記誘発培地の１つを利用するこわれやすい予備胚発性組織の選択に より決定され得る。従って、当業者は、本発明の方法を他の種類に容易に適用す ることができる。

次の例は、例示的であって、本発明を制限するものではない。

ス】■１蛙 ？　） ＡＢＡ　；アフ′シジン酸　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｓ＋ｔｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ 、　Ｌｏｕｔｓ−＋ＭＯ，ｔｌｓＡ アセトシリンゴネ　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、＋　Ｍｉ１ｗａ ｕｋｅｅ＋何ｆ、ｌｌ５Ａ 寒天；ＴＣ寒天　Ｈａｚｌｅｔｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、＋Ｌｅｎ ｅｘａ、ＫＳ、ＩＪＳＡ Ａｓ：　アセトシリンゴネ　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、１Ｍｔ １ｗａｕｋｅｅ＋Ｍｌ、ＵＳＡ Ｂ−５塩　Ｇａｓ＋ｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｔ、　（１９６８）　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ ｌＲｅｓ、５０：１５１−１５８ ＢＡ、ベンジルアデニン　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　 Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ，［ｌＳＡ バクトガ−Ｄｉｆｃｏ−Ｌａｂ、　Ｄｅｔｒｏｔｔ、　旧、　ＵＳＡカルベニシ リン　Ｇｅｏｐｅｎ ２＋４−Ｄ；２＋４−　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ｓｔ、　Ｌ ｏｕｉｓ＋ジクロロフェノキシ酢酸　？ＩＯ，ＩＪＳＡＤｒｏｐｐ、この活性成 分がチダ　Ｎｏｒ−Ａｍ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｗｉｌ＋ｗｉｎｇｔｏ ｎ。

ウズロンである綿の落葉剤　ＤＥ、　ＵＳＡＧＡ３；ジベレリン酸　Ｓｉｇｍａ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ＋ＭＯ，ｔｌｓＡ Ｇ４１８；ゲネチシン　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌ ｏｕｉｓ。

阿Ｏ９υ５Ａ ＧｔｌＳ、β−グルクロニダーゼ ＩＡＡ；インドール−３−酢酸　Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａＩ　Ｃｏ、、　Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｉｓ＋ＭＯ，ＵＳＡ ＩＢＡ；インドール−酪酸　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、 　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ，ＩＪＳＡ インソリトール　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｔｃａｌ　Ｃｏ、＋　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉ ｓ。

Ｎｏ、　ＵＳＡ Ｊｉｆｆｙ　Ｍｉｘ　Ｂａ１ｌ　Ｊｉｆｆｙ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＴＬ、　Ｕ ＳＡ許　・ ＪｉＨｙ　Ｐｏｔｓ　Ｂａ１ｌ　Ｊｉｆｆｙ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ｒＬ、！ＪＳＡ ＭＳ塩　ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｌｅｎｅｘａ＋　ＫＳ、　ＵＳＡ伍　 ・ トリトン、　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、 　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ，ＵＳＡ トリプトン　Ｄｉｆｃｏ−Ｌａｂ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ、　ＵＳＡＴｗｅ ｅｎ＠　ＩＣＩ　１ｌｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ、ｆｃ、。

Ｗｉｌｓ＋ｉｎｇｔｏｎ、ＤＢ、ＵＳＡバンコマイシン　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ−＋　ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

問、ＩＪＳＡ ビタミ７　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ。

ＭＯ，［ＩＳＡ 酵母抽出物　Ｄｉｆｃｏ−Ｌａｂ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　ＭＩ、　ＬｔＳＡゼア チア　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、＋　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ＋ＭＯ， ｔｌｓＡ 埜１１■え批 チアミンＨＣＩ　：　１０．０■／ｌ ピリドキニン　：　２．Ｏｍｇ／ｆｆｉニコチン酸　：　２．０ｍ１ｇ／ｆ Ｋ？ｌ−８Ｐビタミン　：１ｘ し一グルタミン酸　：　０．６に／１ システィン　：　０・２１ｇ／ｌ ビタミンを有さない カザミノ酢　：２５ｏ■／２ ＭＳ塩　：１ｘ チアミンＲＣＩ　：　０．５■／２ イノシトール　：　１００．０■／Ｅ ピリドキシン　二０．５■／２ ニコチン酸　＝０．５■／ｉ グリシン　：２．０■／ｌ ＢＡ　：　３．０■／Ｉ！ １４４　：　０．３■／Ｅ 寒天　：　６．Ｏｇ／ｌ チアミン）ＩＣＩ　：　５■／ｌ イノシトール　：　１００．０■／２ ピリドキシン　：１．５■／２ ニコチン酸　：１．５■／１ ＫＡＯビタミン１：１ｘ ココナツツ水”　：　ｉｏ％Ｖ／Ｖ スクロース　：　２０ｇｙｌ Ｇｅｌ−ｒｉｔｅ＠　二　２．４　ｇ　／　１Ｍ２Ｏ＋力ルヘニシリｙ　：　５ ００ｇ／ｌ１Ｍ２０に２００Ｃ Ｍ２０Ｃ十カナマイシン：２ｏｏ■／ｊ！皿Ｌ ＭＳ塩　：工ｘ チアミン１（Ｃ１：　５■／ｉ イノシトール　＝　２０．１ｇ／ｌ ピリドキシン　：　Ｌ５ｔｇ／ｌ ニコチン酸　：　１．５ｇ／ｊ！ グリシン　：　２．０［／ｊ！ ＧＡ、　、　ｌ、Ｑ■／１ ＡＢＡ　：　２．０ａ／ｊ！ スクロース　：　３０ｇ／ｌ Ｇｅ１−ｒｔｔｅ＠　：　２．４　ｇ／　１１Ｍ５３　＋Ａｓ　：　１００　μ Ｍ ５３Ｃ １’１５３＋カルヘニシリ７　：　５００＋ａｇ／ｆ５３ＣＫ Ｍ５３Ｃ十カナマイシフ　：　３００ｇ／ｆＭＳ塩　：１ｘ ＭＳ　ビタミン　：１ｘ グリシン　＝　２■／２ ＫＩＮ　：　０．５［＃２ ＮＡＡ　、　２■／ｌ スクロース　：　３０ｇ／ｌ Ｇｅ１−ｒｉｔｅ＠　：　２．４８７１２Ｍ５塩　：　１χ チアミン−ＨＣｌ　：　５■／ｉ イノシトール　：　１００■／１２ ピリドキシン　：　１．５　ｍｇ／　１ニコチン酸　：１．５■／ｌ グリシン　：　２■／ｌ ゼアチン　：１．５■／Ｉ！ ＮＡＡ　：　０．０２５　Ｎ／Ｉ ＧＡ３　：　１ｇ＃！ スクロース　：　２０ｇ／ｌ Ｇｅ１−ｒｉｔｅ＠　：　２．４　ｇ／Ｉｌ阿Ｓ塩　：　工χ チアミン−ＨＣｌ　：　５■／２ イノシトール　：　１００■／２ ビニドチム　＝１．５■／２ ニコチン酸　：１．５■／２ グリシン　：　２■／ｉ。

ココナツツ水　：１５４ ＧＡ３　：　１．０■／ｆ ＡＢＡ　：　０．２■／ｉ ＫＭ−８Ｐビタミン　：１ｘ スクロース　：　２０ｇ／ｊ！ Ｇｅ１ｒｉｔｅ　：　２．４　ｇ　／　１Ｍ１３４−５３ ６塩　：１ｘ チアミン１（Ｃ１：　５■／ｆ イノシトール　：　１００■／Ｅ ピリドキシン　：１．５■／Ｅ ニコチン酸　；１．５■／Ｅ グリシン　：　２ｘ１ｇ／ｊ！ ＧＡ３　：　１．０■／！ ＡＢＡ　：　２．Ｏｕ／１ スクロース　：　２０ｇ＃！ Ｇｅ１ｒｉｔｅ　：　２．４　ｇ　／　１硫酸アンモニウム　：　３２９ｑ／ｊ ！チアミン−ＨＣｌ　：　５ｇ／ｌ イノシトール　：　１００１ｇ／　１ ピリドキシン　：１．５■／２ ニコチン酸　：１．５■／ｌ グリシン　：　２■／１ ２．４−Ｄ　：　１．５５ａｇ／　ｌ。

スクロース　：　３０ｇ／ｉ。

Ｇｅ１−ｒｉｔｅ＠　：　２．４　ｇ／ｊ！次のようにして変性されたＭ２Ｂ５ 　：２．４−Ｄ　：　２、Ｏｕ／Ｉ！ ゼアチン　：１．５■／ｌ Ｕ」 Ｎ＆塩　：　１／２ｘ チアミンＨｃｌ　：　１．Ｏ＊／ｆ スクロース　：　２０ｇ／Ｉ！。

Ｇｅ１−ｒｔｔｅ＠　：　２．２　ｇ／１次のようにして変性されたＮ３−１　 ：Ｎ、塩　：１ｘ チアミンＩ（Ｃ１：　５■／β イノシトール　：　１００．０■／２ ピリドキシン　：１，５■／ｌ ニコチン酸　：１．５■／２ グリシン　：２．０■／Ｅ ２．４−Ｄ：　：　５．０■／！ ゼアチン　：１，０■／１ ＧＡ３　：　１．Ｏｇ／Ｉ ＫＡＯビタミン　：１ｘ スクロース　：　２０ｇ／ｌ Ｇｅ１−ｒｉｔｅ■　：　２．４ｇ／ｊ！Ｎ１２　＋Ａｓ　：　１００　＃Ｍ ■韮 Ｎ１２十カベニジリン　＝５００■／２月遣郊− １１１２ｃ＋カナマイシン　：３００■／２肚１ にＨｚＰＯｉ　：　１０．５　ｇ　／　ｆｆ１（ＮＨａ）ｚｓＯ４：　１．Ｏｇ ／ｌ クエン酸ナトリウム・２ＨｚＯ：　０．５　ｇ＃！寒天　：　１５ｇ／Ｉ し一ブイヨン１ トリプトン　：　ｌｏｇ／ｌ 酵母抽出物　５ｇ／ｊ！ 寒天　：　１５ｇ／ｌ ＊　；寒天添加の前、Ｏ，１〜５　ＮのＮａＯＨを用いて７．０〜７．２に調整 されたｐＨ；２５ｄ／プレートで分散する。

方進３己口番果 史上 バーの・、立　びアグロバクテリウム　百ゾネス／　−１、カルスを生成するた めにカルス誘発培地上での培養組織。

花糸から苗木を得るための一般的なスケムは第４図に示される。

ローザ　ハイブリダ　Ｌ、　ｖａｒ、Ｏヤルティ（Ｎ、　Ｈ，Ｗｒｉｇｈｔ、　 Ｉｎｃ、。

Ｎｕｒｓｅｒｙ、　Ｃｒａｎｂｕｒｙ、　ＮＪから得られた）の雄すい花糸を、 １４日間、２°Ｃでの冷却予備処理の後、約１．５ｃｍの長さの花の芽から切り 取った。芽を、Ｃ１ｏｒｏｘ　（１０％）　／Ｔｗｅｅｎ　＠２０　（０，１％ ）により２０分間、殺菌し、滅菌脱イオン水により３度すずき、そしてカルス誘 発培地（？１１３０−３）に置いた。すべての培地を、ｐＨ調整の後、２４°Ｃ 及び１５ｐｓｉで２０分間オートクレーブ処理した。ベトリ皿における培養物を パラフィンにより密封し、そして２４゛Ｃで暗室に維持した。早く成長する半固 体状の黄色のカルスを、Ｍ１３０−３における３週間後、花糸外植体から得た。

この培地における継代培養の後、カルスは乾燥外観に変化した。

カルスを維持培地Ｍ１３９に置いた。　Ｍ１３９培地は、酸化を防ぎ、そして少 ないコンパクトカルスに導びくカルス品質を改良した。

２、　予備−胚形成カルス誘発培地及びそれらの維持。

変性された成長調節物２．４−Ｄ（２，０■／ｌ）及びゼアチン（１，５■／ｎ ）を有するＭ１３９培地を、予備胚発生のこわれやすいカルス誘発（再生）培地 （１’１１３９−２）として使用した。予備胚発生カルスの初期段階は、１．４ ３％の頻度で、旧３９−２上へのカルス培養物の３週間後に観察された（第１Ａ 図）。球状胚を同じ培地上で継代培養し、そして二次胚（第１Ｂ図）を、−次胚 の外表面上に形成した。胚は、阿９−２１及びＮ９−２上に移された後３週間で 成熟した（第１Ｃ−Ｄ図）。

８９−２１培地は、Ｎ６塩（Ｃｈｕなと、（１９７５）　５ｃｉｅｎｔｉａ　５ ｉｎｉｃａ　１８：６５９〜６６８）及び２．４−Ｄ（１［／　ｆｆｉ　）並び にゼアチン（０，７５■／ｌ）に基づかれ；　Ｎ９−２培地は２．４−Ｄ（２■ ／ｌ）及びゼアチン（１，５■／２）により補充されたＭＳ塩を用いた。残る他 の成分はＭ２Ｂ５と同しであるが、但し、スフローズ（２０ｇ／／りを除く。

胚は、旧３４−２に移された後、３週間で発芽した。ｐＨは、オートクレーブ処 理の前、５．７に調整された。高い形態学的変動性が、正常なタイプからひじょ うに短い胚軸に変わる発芽胚、異常な数及び形状の子葉及び根の存在又は不在間 で観察された。正常な発芽が、単離された胚又は胚クラスターから観察された０ 発芽の初期段階は、胚軸の拡張及び円錐形状の子葉（第１Ｆ−０図）の存在によ り特徴づけられた。遅い発芽胚は合着子葉の開放、胚軸の追加の拡張及び強い先 端の根の成長により区別された。異常な胚は、増殖培地、１’１１３４−１への 移行に基づいて再生能力を有する新規培養物を確立するために卓越した源である ことがわかった。　ＫＭ−８Ｐビタミン（にａｏ　ａｎｄ？Ｉｔｃｈａｙｌｕｋ （１９７５）　Ｐｌａｎｔａ、　１２６：１０５〜１１０）及び成長調節物がフ ィルター殺菌され、そして増殖培地のオートクレーブ処理された部分に添加され た。

３週間後、球状構造の存在を有するひじょうに早く増殖するこわれやすい白色の 胚組織が生成された。培地上でのこの組織の定期的な継代培養が、増殖し、球状 構造体を生成するその能力を維持した。

そのような組織は、Ｎ１２培地上で８力月間、維持され得た。

他方、カルスが形質転換される予定である場合、変性された成長調節物２．４− Ｄ（２，０■／４２）及びゼアチン（１，５■／ｆ）を含むＨ１３９培地が、予 備胚発生性のこわれやすいカルス誘発（再生）培地（Ｍ２Ｂ５−２）として使用 された。予備胚発住カルスの初期段階は、１．４３％の頻度で、Ｍ２Ｂ５−２上 での８週間のカルス培養の後、観察された。球状構造体は、増殖培地、たとえば Ｍ１３４−１上で継代培養された。

にＭ−８Ｆ　ビタミン（Ｋａｏ　ａｎｄ　Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ（１９７５）　Ｐ ｔａｎｔａ、　１２６：１０５〜１１０）及び成長調節物がフィルター殺菌され 、そして増殖培地のオートクレーブされた部分に添加された。３週間後、ひじょ うに早く増殖する、こわれやすい白色胚発生組織（球状構造の存在を伴う）が生 成された。培地上でのこの組織の定期的な継代培養が、球状構造体を増殖し、そ して生成するその能力を維持した。そのような組織は、Ｎ１２培地上で８力月間 、維持され得た。

３、　アグロバクテリウム　リゾゲネス培養物及び調製。

二元ベクターｐＪＪ３４９９を含むアグロバクテリウム　リゾゲネス野生型株１ ５８３４（Ｂｉｒｏｔなど、（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅ曽、　２５：３２３〜３２５）が形質転換のために使用された。ｐＪ Ｊ３４９９は、ツバリンシンターゼ　プロモーター、及び耐カナマイシン性を付 与するネオマイシン　ホスホトランスフェラーゼＩＩ　（ＮＰＴ　Ｉｔ）遺伝子 及びカリフラワー　モザイクウィルス３５Ｓプロモーターを含む。β−グルクロ ニダーゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：８４４７〜８４５１．）は、レポーター 遺伝子として存在する。菌株１５８３４は単独で、対照接種物として使用された 。細菌は、１０■／２のテトラサイクリンを含む１．５％バクトアガーにより固 化されたＬ−ブイヨン培地上で維持された。細菌は、ループを用いて固体培地が ら削り落とされ、そして１００μＭのアセトシリンボンを含む°゛誘発ブイヨン ゛′培地（Ｗｉｎａｎｓなど、（１９８９）　Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１７１：１６ １６〜１６２２）に懸濁され、そして２８°Ｃで３時間、シェーカー（１２０ｒ ｐｍ）上で培養された。

４、　同時培養培地上での同時培養。

アグロバクテリウム細胞が、６力月後に選択されたこわれやすいカルスと共に３ ：１の体積比（植物細胞：アグロバクテリウム細胞）で混合された。カルス及び アグロバクテリウムが、１１００１Ｉのアセトシリンボンにより補充された同時 培養培地Ｎ１２の上部上の７．０　ｃｍの殺菌されたＷｈａｔｍａｎ　；＃　１ フイルタ一祇円上に置かれた。プレートが暗室において４８時間、２４゛Ｃで調 節された環境のインキュベーターに置かれた。

５、洗浄。

カルスが、５００■／ｌのカルベニシリンにより補充された液体培地Ｎ１２によ りアルボバクテリウムから洗浄された。カルスが、１：１０（カルス：培地）の 体積比で培地と共に十分に混合され、遠心分離され（５００ｒｐ−で５分間）、 そして上滑液が捨てられた。洗浄は４回くり返えされた。

６、選択培地。

洗浄の後、１０−１２個のカルス塊状物（それぞれ約１００■）が、選択のため に３００■／ｌの硫酸カナマイシン及び残留アグロバクテリウムを殺害するため に５００■／Ｅのカルベニシリンを含む選択培地Ｎ１２ＣＫ上に置かれ、そして 広げられた。３０日間の培養期間の最後で、はとんどのカルスはカッ色に変色し たが、しかしながら、個々のカルスの１〜数個の断片が白みかかったクリーム色 のカルスを生成するために増殖し始めた。８１個の接種されたカルスのうち７５ 個が、耐カナマイシン性カルスを生成した（第１表）。

７、　体細胞胚を生成するために再生培地上での培養。

次に、白みかかったクリーム色のカルス組織が、５００■／ｌのカルへニジリン （但し、カナマイシンではない）又はＭ５３Ｇを含むＮ１２Ｃ培地に２３日間移 された。次に、Ｎ１２Ｃ上での組織が培地Ｍ５３に３週間移された。カルスはさ らにこれらの培地上で増殖し、そしてより大きな球状構造体を生成した。

８、　成熟体細胞胚を生成するために成熟培地上での培養。

バート２からのカルス組織が、成熟培地Ｍ１３４−５３に３〜５週間移された。

その組織は続いて、成熟培地？！２０において９〜１１週間培養された。

バート７からのカルス組織が、成熟培地Ｍ２０に８又は１１週間培養された。こ の培地上で、４週間後開始し、そして進行し続ける成熟胚が得られた。成熟胚が 、広い子葉（通常２及び時々３又は４）及びひじょうに短い胚軸及び根を有する 構造体上に出現した。その胚は白色であった。同じ結果が、８週間及び１１週間 の培養の期間で得られた。

９、　発芽培地上での培養。

成熟肝組織の発芽が、２週間後、Ｎ１３培地上で達成された。１６時間／日の光 照射（約１５００ルクス）下で、組織は緑色になり、子葉は５〜１０倍に拡張し 、そして胚は３〜５倍の大きさに拡大し、そして１〜５個の緑色の苗条を生成し た。他方、成熟された肝組織の発芽は、Ｎ３−１培地において達成された。＆ｌ ｌ織はＮ３−１培地上で３週間インキュベートされた。次に十分に発芽された胚 が、苗木の成長を完結するためにＮ１３培地に移された。６週間後、十分に成長 された苗木が得られ、そして人工土壌への移行のための条件下で存在した０葉腋 苗条増殖が観察された。

１０、苗条増殖培地上での培養。

発芽された胚が新鮮なＮ１３培地上で継代培養された。この培地上で、苗条はさ らに増殖し、そして４週間後、元の胚当たり１０〜３０個の苗条が生成された。

１１、苗条拡張培地上での培養。

苗条クラスターの断片を切断し、そしてクラスター当たり４〜６個の苗条をＮ１ ３−８培地に移した。苗条は３〜４週間内で１０〜１５Ｃ１の大きさに拡張した 。

１２、根の再生のために人工土壌上での培養。

苗条を、Ｎ３−４培地により飽和されたＪｉｆｆｙ　Ｍｉｘにおいて培養した。

６週間後、十分に成長された苗条を得、そして人工土壌への移行のための条件下 に存在した。

１３、根の再生のために土壌における苗条の培養。

苗条を、Ｒｏｏｔｏｎｅ（ＴＭ）に浸し、そして温室において、ミックス土壌（ ３：１の５ｕｐｅｒ　５ｏｉｌ：Ｐｅｒｌｅｔｔ、　Ｒｏｄ　ＭｃＬｅｌｌａｎ 　Ｃｏ、、　Ｓｏ、　５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ＋　ＵＳＡ）に植え込 み、そして必要な場合、水をかけた。

３週間後、根は再生され、そして完全なトランスゲニンク植物が得られた。植物 をプラスチックシートにより被覆し、これを徐々に（２週間以内に）除去し、植 物を堅くした。

１４、形質転換の結果及び例示。

形質転換はいくつかの手段により確かめられた：１　）　Ｍ２ＯＫ２Ｏ０Ｃ上に トランスファーされた形質転換カルスは、それらの増殖を続けることができ、と ころが非形質転換の対照カルスは培地上で増殖を停止し、カッ色に変色し、そし て結果的に死滅した（第２表）；２）形質転換されたカルス、体細胞胚、及び形 質転換された苗条からの葉の断片はすべて試験で陽性であり、そして非形質転換 性対照はＧＵＳアンセイにおいて負であった（第３表）（形質転換体は青色に染 色し、そして非形質転換性組織は青色に染色しなかった）。

葉カルスアッセイを、５個のトランスジェニック苗条に対して行なった。培地は 、組織が形質転換されたことを確かめるために５０■／ｌのカナマイシンを含ん だ、すべての形質転換体はカナマイシンの存在下でカルスを形成し、従って形質 転換を確証した。

１又ｌ 門２０　１上での　カルスの　カ　マイシン　についてのアッセイ形質転換され な　２５　２００　０ かった対照　２５　０　２５ こわれやすい細胞　６５　６５　１００胚カルス　４２　４２　１００ 体細胞胚　４８　４７　９Ｂ 苗条　２１　２１　１００ 植物　１３　１３　１００ 】：アッセイは、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（１９８７）　、前記に記載されているよ うにして行なわれた。

旦ｌ バーのアグロバクテリウム　ツメファシェンスノ　−１、　カルスを得るために カルス誘発培地上での培養組織。

例１と同じ。

λ　予備−胚形成カルス誘発培地及びそれらの維持。

例１と同じ。

３、　アグロバクテリウム　ツメファシェンス培養物及び調製。

例１と同じである。但し、二元ベクターｐＪＪ３９３１　（第８図）を含むアグ ロバクテリウム　・ンメファシエンス株ＬＢＡ４４０４０１ｏｅｋｅ＋ｗｕなど 。

（１，９８３）　、前記）を、形質転換のために使用した。　ｐＪＪ３９３１は ｐＪＪ３４９９と同じである。但し、それは３５５プロモーターの制御下で、レ ポーター遺伝子として使用されるＧＵＳの代わりにルシフェラーゼ（ＬＩＪＣ） 遺伝子（Ｏｌｌなど、（１９８６）　、前記）を担持する。

４、　同時培養培地上での同時培養。

例１と同じ。

５、　洗浄。

例１と同じ。

６、　選択培地。

例１と同じである。但し、３３個の接種されたカルスのうち２５個のカルスが耐 カナマイシン性カルスを生成した（第１表）。

７、　体細胞胚を生成するために維持培地上での培養。

例１と同じ。

８、　成熟体細胞胚を生成するために成熟培地上での培養。

例１と同じ。

９、　発芽培地上での培養。

例１と同じ。

１０、苗条増殖培地上での培養。

例１と同じ。

１１、苗条拡張培地上での培養。

例１と同し。

１２、根の再生のために人工土壌上での培養。

例１と同し。但し、苗条は、Ｎ３−４培地により飽和されたＪｉｆｆｙ　Ｐｏｔ ｓにおいて培養された。４週間後、完全な植物が土壌に移された。

１３、土壌への移行。

完全な植物を土壌に移し、そして成長チャンバー（１６時間／日の光、１６°Ｃ での夜の温度、２４′Ｃでの日中の温度）において２１間インキュベートした。

植物をプラスチックにより被覆し、これを２週間にわたって徐々に除去し、植物 を堅くした。

１４、形質転換の結果及び例示。

形質転換はいくつかの手段により確かめられた：Ｉ）形質転換されたカルスはＭ ２ＯＫ２Ｏ０Ｃ培地上で増殖を続けることができ（第２表）、そして２）はとん どの形質転換されたカルスは陽性であり、そして非形質転換カルスはＬＵＣアッ セイにおいて陰性であった（第４表及び第９図）。

員土人 こわれやすいカルス　１．５　１４　９３胚発生性カルス　１３　１．３　１０ ０１：アッセイは、Ｏｗ　（１９８６）　、前記に記載されているようにして行 なわれた。

■主 インビトロでの ローザ　ハイブリダ　Ｌ、　ｖａｒ、ソニアからの葉外植体から体細胞胚を生成 するために使用される方法は、第５図に示される。ローザハイブリｆ　［、、ｖ ａｒ、ソニアのインビトロ苗条からの葉（第２Ａ図）を、カルス誘発のための外 植体温として用いた。側面の芽からの苗条を、Ｈａｓｅｇａｗａ培地（Ｈａｓｅ ｇａ＠ａ　（１９７９）　！４：６１０〜６１２）上で培養した。

葉の茎部及び頂点領域を、接種の前に除去した。

Ｍ１３９培養誘培養地を、ホルモンの濃度を変えることにより使用した：　２， ４−Ｄ（１，５〜２．０　Ｗｇ／ｌ　）　、ゼアチン（１，０〜２．０　ｗｌ／ 　Ｉ！、　）及びＡＢＡ　（０〜０．２■／ｉ）、カルス誘発培地において培養 された葉は、３〜４週間後、ひじょうに海綿質の組織を形成した（第２Ｂ図）。

これらの海綿質のカルスを、Ｗｈｉｔｅ塩（Ｗｈｉｔｅ（１９４３）　Ｈａｎｄ ｂｏｏｋ　ｏｆＰｌａｎｔ　Ｔｊｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ｌａｎｃａｓｔ ｅｒ＋　ＵＳＡ）　、　ＭＳ　０．５ｘ鉄溶液、Ｗｈｉｔｅビタミン及びアミノ 酸、ＫＩＮ（２，０Ｗｇ／ｌ　）　、ＮＡＡ（４■／ｊり、ＧＡ３（１，０■／ 　１　）　、スクロース（２０ｇ　／　ｊ！　）及びＳｉｇｍｕ寒天（８ｇ／２ ）から成る−２５−１（ｐＨ５）において培養した。ここで、それらは４〜６週 間後、薄縁色の非晶性カルスから白色のいくぶんこわれやすいカルスに変わり、 これは自由な球状胚に起因した（第２０及びＤ図）。同じ培地におけるそれらの 球状胚の継代培養は、二次胚形成を誘発した（第２Ｅ図）、追加の二次胚を形成 するこの能力は４回の連続的な継代培養の間、続いた。４回目の継代培養の後に 生成される球状構造体は、ひじょうに硬質で、膨潤性で且つでこぼこ状に変わり 、後で、ひじょうに乾燥したカルスに変化した。

±↓ 豊凶五盪隻１隻 ローザ　ハイブリダ　Ｌ、　ｖａｒ、　ロヤルティからの細胞＠濁液から体細胞 胚を生成するために使用される方法は、第６図に示される。

ローザ　ハイブリダ　Ｌ、ｖａｒ、ロヤルテイの液体培養物は、野で生長した植 物の成熟葉に起因する一次カルスから確立された０表面殺菌は、エタノール（７ ０％）により２分間、続いてｃｌｏｒｏｘ　（１０％）／Ｔｗｅｓｎ−２０（０ ，１％）により８分間行なわれた。５分間隔での殺菌脱イオン水による４回のす すぎが必要とされた。約０．５　ｃｄの葉片を、カルス誘発培地（阿１３０−７ ）　：阿Ｓ塩、にＩＮ（１，０■／２）により補充されたＭＳビタミン、ＮＡＡ （２■／ｌ）、寒天上に接種し、そして２４°Ｃで光下で、１１５　ｒｐｍでの シェーカー上に維持した。成熟葉は、＋１１３０−７における接種後３〜５週で 硬質のカルスを生成した（第３Ａ図）。

液体）’１１３０−７において継代培養されたカルスは、３週間後、酸化した。

この酸化工程は、第２液体培地、Ｍｌｌの存在下で、続＜１０週間の培養の間、 続いた。その間、ひじょうに球状の白色の部分が、強く酸化されたカルスから生 じた（第３Ｂ図）０組織酸化を克服するために、新規の液体培地Ｗ２５−３　（ Ｗ２５−１と同じとあるが、但し寒天を含まない）を利用した。追加の成長は観 察されず、そして組織酸化は、この培地において３週間で完結した。最終液体培 地（ＳＭ−１，Ｐｒ１ｏｌｉａｎｄ　５ｏｎｄａｈｌ（１９８９）　Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：５８９〜５９４）を用いて、球状構造体から良好な細 胞懸濁液を生成した。５Ｍ−１中への酸化されたカルスの移行は、白色でコンパ クトは胚発生組織の発生を可能にし、これは３〜４週間内で、小さな細胞塊状物 を形成し始めた。良好な細胞懸濁液がこれらの培養物から確立しく第３Ｃ図）、 そして１回の３〜４日間の継代培養による懸濁培養物１００ｄ当たりバンクされ た細胞１０ｄの密度で維持された。このタイプの液体培養での２週間後、これら の良好な細胞懸濁液の再生能力を、Ｗ２６−１回体培地上で評価した。この再生 培地は、Ｗ２５−１におけるような変性されたーｈｉｔｅ塩、チアミン−ＨＣＩ （５■／り、イノシトール（１００■／ｊり、ピリドキシン（１，５■／ｊ２Ｌ ニコチン酸（１，５■７２）、グリシン（２，０■／　ｆｆｉ　）　、ＫＩＮ（ ２，０ｍ／　ｆｆｉ　）　、ＮＡＡ（０，２５■／ｊ２）、スクロース（２０ｇ ／ｊり及びＳｊｇｍａ寒天（６ｇ　／　ｌ　）　、ｐＨ５，６から成った。初期 発生段階での体細胞胚は、再生培地上での４週間後、１２６−１において眼に見 えた（第３Ｄ図）＠ 本明細書に記載される発明は、ここに開示される特定のＢ様により発明の範囲を 制限するものではない、なぜならば、これらの態様は、本発明のいくつかの観点 の例示として向けられるからである。

いづれかの同等の態様も、本発明の範囲内に向けられる。

前述の発明は理解の目的で詳細に記載されて来たが、ある修飾が本発明の範囲内 で実施され得ることは明らかであろう。

種々の文献が本明細書に引用され、そしてそれらの開示は、引用により本明細書 に組込まれる。

ｂυ　ＩＡ。

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＃５　／ｃＦ／に、　１０゜ ＩＣＩＦ ＦＩＧ、／６：　Ｆ／に、　ＩＨ ｂ蜆　２Ｃ ＦＩＧ　、６グ ｎに、２Ｆ ７ｃ／６：３Ａ ｎＧ、４Ａ。

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国際調査報告 １ｍｓ＋醪・１１間１＾−”””　ＦＣｒＡ！養１／αシ１２ＰＣＴ　／ＵＳ９ １１０４４１２ Ａ、ＩＩａＣＩ’１ｍｅｎＬ　［ＯＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０Ｓｅａｒｃｈ　Ｌｅ ｒｍＳ ｒｏｓａ　ｈｖｂｒｉｄａ ｓｏｍａｌｃ　ｅｍｂｒｙｏ？ ｐｐｌｅ ｅａｒ ｎｅｃｔａｒ＋ｎｅ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｅａｃｈ ｒｅｇｅｎｅｒａＬ？ ｐ［ａｎｔｌｅｔア Ｃａ１ｌＬ１３ ａｌｌｉ ＰＣＴ　／ＵＳ９１１０４４１２ ＡＬＬａｃｈｍｅｎ口ｏ　ＰＣＴ　Ｔｅ１ｅｐｈｏｎｅ　Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ （・　：　Ｖ Ｇｒｏｕｐ　１．　ｃｌａｉｍｓ　１−２５．　ｄｒａｖｎ　ｔｏ　ｒｅｇｅｎ ｅｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔｓ　ａ獅■ ｓｏｍａｔ＋ｃｅｒｎｂｒｙａｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｌａｉ ｍｅｄ　ｍｅｔｈｏｄＧｒｏｕｐ　Ｉ　１．　ｃｌａｉｍｓ　２６−５５．　ｄ ｒａｖｎ　ｔｏ　ａ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄｒ ｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐｌａｎｔ　ｌ５ｓｕｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔ ｈｅ　ｍｅｔｈｏｄＧｒｏｕｐ　ｌ　ａｎｄ　Ｇｒｏｕｐ　ＩＩ　ａｒｅ　＋ｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎｓ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｔｈｅ　ｍｅｔ ■盾■ ｏｒ　Ｇｒｏｕｐ　ｌ　ｃａｎ　ｂｅ　ｐｒａｃｕｃｅｄ　５ｅｐａｒａｔｅｌ ｙ　ａｎｄ　１ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　高■狽■盾п@ｏｒ Ｇｒｏｕｐ　１１　ａｎｄ　ｒｅｃＩｔｅｓ　ｄｉｌＴｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｃｅ ｓｓ　５ｔｅｐｓ。

Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ、Ｇｒｏｕｐｓ　ｌ　ａｎｄ　Ｉ　ｌ　ｃｏｎｔａｉｎ 　１ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　ｖｈｏｌｌｙｓｅｐａｒａｔｅ　ｐｒｏｄ ｕｃｔｓ、　Ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｄＵｒｅｒ　５ｔｒｕｃｔｕ ｒａｌｌｙ、　Ｌｉｋｅｗｔｓ■A　ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｖｏｕｌｄ　１ｎｖ ｏｌｖｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｏｃｅｓｓ　５ｔｅｐ■ Ｂｅｃａｕｓｅ　ｔｈｅｓｅ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎｓ　ａｒｅ　ｄｉｓｔｉｎｃ ｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒｅａｓｏｎｓ　ｇｉｖｅｎ　ａｂｏ魔■@ａｎｄ ｈａｖｅ　ａｃｑｕ＋ｒｅｄ　ａ　５ｅｐａｒａｔｅ　ｓｔ＠ｔｕｓ　ｉｎ　ｔ ｈｅ　ａｒｔ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｏｒ　ｔｈｅ「ｒｅｃｏｇ獅奄嘯■■ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ　５ｕｂｉｅｃｔ　ｍａｔｔｅｒ、　ｆａｌｌ　１ｎｔｏ　 ｄｔｒｆｅｒｅｎｔ　５ｔａｔｕｔｏｒｙ　ｃｌａｓｓｅｓ@ｏｒ　１ｎｖｅｎ ｔｉｏｎ ａｎｄ　ａｒｅ　５ｅｐａｒａｔｅｌｙ　ｃｌａｓｓ山ｅｄ　ａｎｄ　５ｅａｒ ｃｈｅｄ、　ｒｅｓｉｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｅｒａｍｔ獅≠狽奄盾■ ｐｕｒｐｏｓｅｓ　ａｓ　１ｎｄｉｃａｔｅｄ　ｉｓ　ｐｒｏｐｅｒＰＣＴ　置 ＥＰＨＯＮＥ　ＭＥＭＱＲＡＮＤ［ＪＭ口Ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｐａｙｍｅｎｔ 　ＡｐｐｒＯＶｃｔｄ　９０　Ｄｅｐｏｓｉｔ　Ａｃｃｏｕｎセ　Ｎｕ＋＋＋ｂ ｅｒ　ｔｏ　ｂｅ　Ｃｈａｒｇｅｄ口Ａｔｔｏｒｎｅｙ　ｅｌｅｃｔｅｄセｏ　 ｐａｙ　ｆｏｒ　ＡＬＬ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｎＶｅｎセ１ｏｎｓ 口　Ａｔｔｏｒｎ＠ｙ　ｅｌｅｃｔｅｄ　セａ　ｐａｙ　ｏｎｌｙ　ｆｏｒ　ｔ ｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｉｎｖｅｎセｔｏｎｓ　ｃｏｖｅｒｅｄ　ｂｙＧ　 ｘｔｔｏｒｎｅｙ　ｗａｓ　ｏｒａｌｌｙ　ａｄｖｉｓ＠ｄ虹ｈａｔ　ｔｈｅｒ ｅ　Ｌｓ　ｎｏ　’ｒｉｇｈｔｔｏ　ｐｒｏｔＵｉｔ、　ｆＯＫ　Ｊｌｎｌ／　 ｑｒＱｕｐ　ｎｏｔ　ｐａｉｄ　ｆｏｒ。

Ｃｏｎセ１ｎｕｅｄ　ｏｎ　ａ　５ｅｐａｒａｔｅ　５ｈｅｅセ

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．体細胞脛からのバラ苗木の調節された再生のための方法であって： （ａ）体細胞脛を供給し； （ｂ）分化された胚を生成するために脛の分化を誘発することがで奉る成熟培地 上で前記体細胞胚を培養し；（ｃ）発芽された胚を生成するために発芽培地上で 前記分化された胚を発芽し；そして （ｄ）土壌状態に移され得る成熟苗木を生成するために成長培地上で前記発芽さ れた脛を成長せしめることを含んで成る方法。
2. ２．前記成熟培地が有効量の栄養培地、エネルギー源及び成長調節物を含んで成 る請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記エネルギー源が糖であり、そして前記成長調節物がアブシジン酸及びジ ベレリン酸から成る群から選択される請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．前記発芽培地が有効量のＮ６又はＭＳ栄養培地及びエネルギー源を含んで成 り、そして前記分化された胚が発芽培地において約１〜４週間培養される請求の 範囲第１項記載の方法。
5. ５．前記成長培地が有効量の栄養培地、エネルギー源、オーキシン及びサイトキ ニンを含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．前記オーキシンがＩＡＡ，ＮＡＡ，２，４−Ｄ及びピクロラムから成る群か ら選択され、約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、そして前記サイトキニ ンが６−Ｂ４、ゼアチン、キネチン及びｉＰから成る群から選択され、約０．２ 〜１５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記発芽された胚が成長培地において約４〜８週間、培養される請求の範囲 第１項記載の方法。
8. ８．バラ植物の成熟体細胞組織から少なくとも１種の体細胞胚を得るための方法 であって： （ａ）少なくとも１種の誘発されたカルスを得るために、有効量の栄養培地、エ ネルギー源、オーキシン及びサイトキニンを含むカルス誘発培地上で成熟体細胞 胚を培養し；そして（ｂ）少なくとも１種の体細胞胚を得るために、有効量の栄 養培地、エネルギー源、オーキシン及びサイトキニンを含む、体細胞胚の増殖の 完結を誘発できる再生培地において前記誘発されたカルスを培養することを含ん で成り、ここで前記再生培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源は、カル ス誘発培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源とは異なることを特徴とす る方法。
9. ９．前記成熟組織が花糸、葉外植体又は組織懸濁培養物である請求の範囲第８項 記載の方法。
10. １０．前記カルス誘発培地における培養培地はＮ６又はＭＳ培地であり、前記栄 養源が糖であり、そして前記オーキシンが約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存 在し、そして前記サイトキニンがカルス誘発培地において約０．２〜１５．０ｍ ｇ／ｍｌの濃度で存在する請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．前記カルス誘発培地がさらに、約０．１〜０．２ｍｇ／ｌの濃度で存在す るアビシジンを含んで成る請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記胚がカルス誘発培地上で約３〜９週間、培養される請求の範囲第１０ 項記載の方法。
13. １３．前記再生培地における栄養培地がＷｈｉｔｅ′ｓ　Ｎ６，　ＭＳ及びＢ５ 培地から成る群から選択され、そして前記エネルギー源が糖であり、前記オーキ シンがＮＡＡ又は２．４−Ｄであり、そして前記サイトキニンがキネチン又はゼ アチンである請求の範囲第８項記載の方法。
14. １４．前記カルスが再生培地上で約３〜６週間、培養される請求の範囲第１３項 記載の方法。
15. １５．カルス誘発培地上で成熟体細胞組織を培養した後、及び再生培地において 誘発されたカルスを培養する前、誘発されたカルスを単離するために維持培地に おいて前記誘発されたカルスを培養することをさらに含んで成る請求の範囲第８ 項記載の方法。
16. １６．前記維持培地がＭｈｉｒｅ′ｓ　Ｍ５，Ｎ６及びＭＳ培地から放る群から 選択された栄養培地、エネルギー源、及びオーキシン、ジベレリン酸及びアブシ ジン酸から成る群から選択された成長調節物の有効量を含んで成る請求の範囲第 １５項記載の方法。
17. １７．バラ植物の雄ずい花糸から体細胞胚を得るための方法であって： （ａ）少なくとも１種の誘発されたカルスを得るために、有効量の栄養培地、エ ネルギー源、オーキシン及びサイトキニンを含むカルス誘発培地上で雄ずい花糸 を培養し；そして（ｂ）体細胞腔を得るために、有効量の栄養培地、エネルギー 源、オーキシン及びサイトキニンを含む、体細胞胚の増殖の完結を誘発できる再 生培地において前記誘発されたカルスを培養することを含んで成り、ここでサイ トキニンに対するオーキシンの割合が、前記カルス誘発培地において、サイトキ ニンに対するオーキシンの割合に関して２〜約１５倍、減じられることを特赦と する方法。
18. １８．前記再生培地におけるオーキシン及びサイトキニンの源は、カルス誘発培 地におけるオーキシン及びサイトキニンの源とは異なる請求の範囲第１７項記載 の方法。
19. １９．カルス誘発培地上で成熟体細胞組織を培養した後、及び再生培地におて前 記カルスを培養する前、誘発されたカルスを単離するために維持培地において前 記誘発されたカルスを培養することをさらに含んで成る請求の範囲第１７項記載 の方法。
20. ２０．バラ植物の葉外植体から体細胞胚を得るための方法であって：（ａ）少な くとも１種の誘発されたカルスを得るために、有効量の栄養培地、エネルギー源 、オーキシン及びサイトキニンを含むカルス誘発培地上で前記葉外植体を培養し ；そして（ｂ）体細胞胚を得るために、有効量の栄養培地、エネルギー源、オー キシン及びサイトキニンを含む、体細胞胚の増殖の完結を誘発できる再生培地に おいて前記誘発されたカルスを培養することを含んで成り、ここで前記再生培地 におけるオーキシン及びサイトキニンの源は、カルス誘発培地におけるオーキシ ン及びサイトキニンの源とは異なることを特徴とする方法。
21. ２１．前記サイトキニンに対するオーキシンの割合が、カルス誘発培地において 、サイトキニンに対するオーキシンの割合に関して高められる請求の範囲第２０ 項記載の方法。
22. ２２．カルス誘発培地上で成熟体細胞組織を培養した後、及び再生培地において 前記カルスを培養する前、誘発されたカルスを単離するために維持培地において 前記誘発されたカルスを培養することをさらに含んで成る請求の範囲第２１項記 載の方法。
23. ２３．請求の範囲第１項記載の方法により生成される成熟バラ植物。
24. ２４．バラ植物体細胞胚。
25. ２５．請求の範囲第８項記載の方法により生成される体細胞胚。
26. ２６．バラ植物からのカルス細胞を遺伝的に形質転換するための方法であって： 外来性ＤＮＡ配列を担持するアグロバクテリウム細胞と共にカルス細胞をインキ ュベートし；そして 前記外来性ＤＮ４配列の少なくとも一部を発現するカルス細胞を選択することを 含んで成る方法。
27. ２７．前記カルス細胞及びアグロバクテリウム細胞が、栄養物、エネルギー源及 びビルレンス誘発化合物を含む培地において、約１〜約４日間インキュベートさ れる請求の範囲第２６項記載の方法。
28. ２８．予備−胚発生性カルス細胞が前記アグロバクテリウム細胞と共にインキュ ベートされる請求の範囲第２６項記載の方法。
29. ２９．バラ植物を遺伝的に形質転換するための方法であって：（ａ）カルスを生 成するために選択された条件下でバラ植物からの組織を培養し； （ｂ）外来性ＤＮＡを担持するアグロバクテリウム細胞と共に段階（ａ）カルス からの細胞をインキュベートし；（ｃ）前記ＤＮＡ配列の少なくとも一部を発現 する段階（ｂ）からのカルス細胞を選択し；そして （ｄ）段階（ｃ）の選択されたカルス細胞から形質転換された苗木を生成するこ とを含んで成る方法。
30. ３０．前記組織が、雄ずい花糸、葉外植体、茎断片、苗条端、花弁、がく片、葉 柄及び花柄から成る群から選択された植物部分に由来する請求項２９記載の方法 。
31. ３１．前記組織が、こわれやすい球状のカルスが生成されるまで、培養される請 求項３０記載の方法。
32. ３２．前記組織が、硬化されたカルスが生成されるまで培養され、前記カルスを 、インキュベーションの前、断片に切断することをさらに含んで成る請求項３０ 記載の方法。
33. ３３．前記形質転換された苗木が、 体細胞胚を生成するために選択された維持培地において前記選択されたカルス細 胞を培養し； 分化された体細胞胚を生成するために選択された成熟培地において前記体細胞胚 を培養し； 苗条及び葉形成を胚上で誘発するために選択された発芽培地において前記分化さ れた体細胞胚を培養し；そして苗木を生成するために前記発芽された胚を根づか せることによって生成される請求項２９記載の方法。
34. ３４．外来性ＤＮＡ配列を発現するバラ体細胞胚を生成するための方法であって ： （ａ）カルス形成を誘発するために、栄養物、エネルギー源、オーキシン、成長 調節物及びサイトキニンを有効量含むカルス誘発培地上でバラ植物からの組織を 培養し、ここで前記組織は、雄ずい花糸、葉外植体、茎断片、苗条端、花弁、が く片、葉柄及び花柄から成る群から選択された植物部分に宙来し；（ｂ）アグロ バクテリウム細胞によるカルス細胞の感染を可能にし、そしてカルス細胞染色体 に外来性ＤＮＡ配列をトランスファーする条件下で、外来性ＤＮＡ配列を担持す るアグロバクテリウム細胞と段階（ａ）のカルスからの細胞を、栄養物、エネル ギー源及び誘発化合物を含む同時培養培地において組合し；（ｃ）栄養物、エネ ルギー源、オーキシン、サイトキニン、及び選択可能マーカー遺伝子を発現しな いカルス細胞の増殖を阻害する物質を含む選択培地において、段階（ｂ）からの カルス細胞を培養し；そして （ｄ）栄養物、エネルギー源、抗細菌剤、及びオーキシン又はサイトキニン以外 のアブシジン酸及びジベレリン酸から選択された成長調節剤を、体細胞歴を生成 するための有効量で含む再生培地において段階（ｃ）で選択された細胞を培養す ることを含んで成る方法。
35. ３５．（ｅ）分化された体細胞胚を生成するための有効量で、栄養物、エネルギ ー源及び成長調節物を含む成熟培地において体細胞胚を培養し； （ｆ）胚上に苗条及び葉を生成するための有効量で、栄養物、エネルギー源及び 成長調節物を含む発芽培地において段階（ｅ）からの分化された体細胞胚を培養 し；そして（ｇ）活性的な苗木を生成するために前記発芽された胚を根づかせる ことによって、段階（ｄ）で生成された体細胞胚から形質転換苗木を生成するこ とをさらに含んで成る請求項３４記載の方法。
36. ３６．前記組織が、こわれやすい球状のカルスが生成されるまで培養される請求 項３５記載の方法。
37. ３７．前記組織が、硬化されたカルスが生成されるまで培養され、前記カルスを 、インキュベーションの前、断片に切断することをさらに含んで成る請求項３５ 記載の方法。
38. ３８．長期間、予備−胚発生性カルスを維持するための有効量、栄養物、エネル ギー源及び成長調節物を含む再生培地において段階（ａ）からのカルス細胞を培 養することをさらに含んで成り、ここで前記維持培地からの予備−胚発生性カル ス細胞が段階（ｂ）で使用される請求の範囲第３５項記載の方法。
39. ３９．前記カルス細胞及びアグロバクテリウム細胞が、約１〜約４日間、同時培 養培地において培養され、そしてその同時培養培地におけるカルス細胞：アグロ バクテリウムの体積比が約１：１〜１０：１（カルス：アグロバクテリウム）の 範囲で存在する請求の範囲第３５項記載の方法。
40. ４０．前記アグロバクテリウム細胞が約１０７〜１０１０個の細胞／ｍｌの範囲 の濃度で同時培養培地に存在する請求の範囲第３９項記載の方法。
41. ４１．前記外来性ＤＮＡ配列が選択可能マーカー遺伝子を含み、そしてカルス細 胞が前記選択可能マーカー遺伝子を発現しないカルスの増殖を阻害する選択培地 において選択される請求の範囲第３４項記載の方法。
42. ４２．前記選択培地が抗−アグロバクテリウム抗生物質をさらに含み、そしてカ ルス細胞が約２５〜５０日間、選択培地において培養される請求の範囲第３４項 記載の方法。
43. ４３．前記選択されたカルス細胞が、再生培地において約２０〜６０日間培養さ れる請求の範囲第３５項記載の方法。
44. ４４．前記体細胞胚が約２０〜４０日間、段階（ｅ）において培養される請求の 範囲第３５項記載の方法。
45. ４５．前記分化された体細胞胚が約１〜４５日間、段階（ｆ）において培養され る請求の範囲第３５項記載の方法。
46. ４６．発芽培地に比べて、低められた塩及び成長調節物濃度を有する苗条拡張培 地において段階（ｆ）からの発芽された胚を培養することをさらに含んで成る請 求の範囲第３５項記載の方法。
47. ４７．段階（ｆ）からの発芽された胚を苗条増殖培地において約２０〜２００日 間培養することをさらに含んで放る請求の範囲第３５項記載の方法。
48. ４８．前記発芽された胚がエネルギー源を有さない根づけ培地において段階（ｇ ）で根づけられる請求の範囲第３４項記載の方法。
49. ４９．前記発芽された胚が、根誘発培地への暴露、続く高湿度下での土壌への植 えつけにより段階（ｇ）で根づけられる請求の範囲第３４項記載の方法。
50. ５０．外来性ＤＮＡ配列を発現するバラカルス細胞。
51. ５１．外来性ＤＮＡ配列を発現する細胞を有するバラ植物。
52. ５２．外来性ＤＮＡ配列を発現するバラ体細胞歴。
53. ５３．請求の範囲第２６項記載の方法により生成されるバラカルス細胞。
54. ５４．請求の範囲第２９項記載の方法により生成されるバラ植物。
55. ５５．請求の範囲第３４項記載の方法により生成されるバラ体細胞胚。