KR20080063418A

KR20080063418A - 세포질 잡종（ｃｙｂｒｉｄ） 왕고들빼기속 식물 및 그생산 방법

Info

Publication number: KR20080063418A
Application number: KR1020087012442A
Authority: KR
Inventors: 신고 호리우찌
Original assignee: 가부시키가이샤 사카타노타네
Priority date: 2005-10-26
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2008-07-03
Also published as: KR101106932B1; CN101522896A; JPWO2007049730A1; EP1950290A4; US20100077499A1; ES2547068T3; US8058505B2; JP4139429B2; AU2006307069A1; BRPI0618023A2; EP2944692A1; EP1950290B1; WO2007049730A1; EP1950290A1; AU2006307069C1; EG26029A; CN101522896B; AU2006307069B2

Abstract

본 발명은 상추의 F1 품종 생산에 유용한 세포질 웅성 불임 상추 및 그 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 식물의 세포질에서 유래된 유전자를 세포질 내에 갖는, 바람직하게는 세포질 웅성 불임성인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물의 생산 방법에 관한 것이다.

상추, 세포질 잡종 식물, 세포질 웅성 불임, 왕고들빼기속,

Description

세포질 잡종（ＣＹＢＲＩＤ） 왕고들빼기속 식물 및 그 생산 방법{CYTOPLASMIC HYBRID PLANT BELONGING TO THE GENUS LACTUCA AND METHOD FOR RPODUCTION THEREOF}

세포질 잡종(Cybrid) 왕고들빼기(Lactuca)속 식물 및 그 생산 방법에 관한 것이다.

종래부터 식물 품종에는 고정 품종과 잡종 제1대(이하, F1이라고 함) 품종이 있는데, 주요 작물에서는 F1 품종이 보급되어 있다. F1 품종은 잡종강세(헤테로시스)에 의해 생육이 왕성해짐으로써, 생육 속도가 빠르고 수량성이 높아지는 등 큰 이점이 있다. 추가로, 병해충에 대한 내성이나, 내한·내서성 등의 환경 적응성의 향상도 기대할 수 있다. 또한 F1 품종은 이형접합체(헤테로)이지만 동일한 유전자형을 가지며, 표현형이 매우 높은 균일성을 나타냄으로써 생산물의 시장성이 높아진다. 또한 F1품종은 육종을 신속하게 하는 우성의 유용한 형질을 집적하기 쉽다. 또한, F1품종의 후대에서는 형질들이 분리되어 자손들의 품질의 균일성이 없기 때문에 매년 F1 종자를 생산해야만 한다. 그러므로 품종 육성자의 권리를 보호하는 큰 이점을 제공하기도 한다.

이상과 같은 이유로부터, F1 품종은 주요 작물에서 재배 품종의 주류를 차지 하게 되었다. 그러나, F1 종자를 상업적으로 대량 생산하기 위해서는 저렴하고 용이한 제웅방법이 필요하다. 과채류의 토마토, 멜론, 오이, 호박, 화훼류의 피튜니아, 터키 도라지 등과 같이 1회의 교배에 의해 많은 종자가 얻어지는 경우에는, 사람 손에 의해 제웅, 교배를 행함으로써 경제적인 F1 종자의 생산이 가능하다. 그러나, 꽃의 구조상 효과적인 제웅이 어려운 작물도 매우 많고, 1회의 교배에 의해 얻어지는 종자가 적은 작물의 경우에는 사람 손에 의한 교배로는 충분한 종자를 얻기가 어려워 F1 종자의 생산이 비경제적인 경우도 있다. 웅성 불임성을 가진 식물을 종자친으로 하여 채종(seed production)하면, 이와 같은 작물들에서도 많은 노력과 고비용이 소요되는 제웅작업을 생략할 수 있으므로 채종에서 웅성 불임성을 이용하는 방법의 개발은 매우 중요하다.

상추는 세계 각국에서 생산되어 시장 규모가 매우 큰 야채이고, F1 품종화가 강하게 요망되고 있다. 비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2에는, 상추에서의 잡종 강세의 발현에 대하여 기재되어 있다. 유전자적 웅성 불임성을 이용하여 생산된 F1 식물을 종래의 고정종과 비교한 결과, F1 식물이 현저한 잡종 강세를 나타내는 것이 보고되어 있다. 그래서, 상추의 웅성 불임성을 이용한 F1 종자의 효율적인 채종 기술의 확립이 강하게 요망되어 왔으나, 현재까지는 확립되어 있지 않다. 예를 들면, 비특허 문헌 3은 상추의 유전자적 웅성 불임성의 유전 양식을 밝힌 것인데, 웅성 불임성이 불안정하고 자성 가임성(female fertility)도 장해가 나타나는 등(비특허 문헌 7), 실용적인 이용은 과제로 남아 있었다. 비특허 문헌 3에서도 비특허 문헌 4와 비특허 문헌 5와 동일한 결과를 보고하고 있다. 실제로, 유전자적 웅성 불임성을 이용한 F1 품종이 상품화되기도 하였다. 하지만, 웅성 불임성이 불안정하고, 종래의 고정종을 대신하기까지는 이르지 못했다(비특허 문헌 6).

최근에 상추에서 새로운 타입의 유전자적 웅성 불임 계통이 발견되었다. 예를 들면, 특허 문헌 1, 비특허 문헌 1에 기재되어 있는 계통 "MS1024"는, 병해 저항성에 대해 선발된 식물의 후대 중에서 발견된 것인데, 웅성불임개체들이 화분을 전혀 생산하지 않는 점이나 채종량이 높다는 점에서 비특허 문헌 3 등에 기재된 유전자적 웅성 불임 식물보다 우수하다.

그러나, 유전자적 웅성 불임 식물을 상업적인 F1 종자의 생산에 이용하는 데는 생산비용의 측면에서 여전히 문제점을 안고 있다. 지금까지 발견된 상추의 유전자적 웅성 불임성은 열성 유전자의 동형접합(homozygosis)에 의해 기인된 웅성 불임성이다(비특허 문헌 7). 열성 유전자가 동형접합한 웅성 불임 식물은 자가수분할 수 없기 때문에, 웅성 불임 계통을 유지·증식하기 위해서는, 웅성 불임 유전자를 이형접합(heterozygosis)으로 가지는 개체를 교배하고, 후대로부터 웅성 불임 유전자를 동형접합으로 가지는 개체를 선택해야만 한다. 교잡 후대에서는 가임 식물 개체와 불임 식물 개체가 1:1로 분리된다. 즉, 그 교잡 후대의 약 50%가 웅성 불임 개체가 된다. 그러므로, 상업적인 F1 종자의 생산을 위해서는 채종포에서 어떻게든 가임 식물 개체를 선발, 제거해야만 한다. 상추의 경우에는 이러한 제거 과정이 특히 어렵다. 왜냐하면 상추의 화기(flower organ)는 작아 불임 식물 개체와 가임 식물 개체의 판별이 용이하지 않고, 가는 화경에 다수의 꽃이 달려 있기 때문이다.

또한, 개화 시기가 개체마다 다르기 때문에, 꽃의 외관을 보고 가임 개체를 완전히 제거하는 것은 대단히 힘들고, 또한 제거과정에서 실수들이 생산종자의 품질과 직결된 F1 종자의 순도 저하로 이어질 수 있다.

또한 육종면에서도, 개화기 이외에는 웅성 불임 유전자를 가지는 개체를 시각적으로 구별할 수 없기 때문에, 육종 효율이 나쁘고 긴 육종 연한을 필요로 한다. 가임성 식물과 불임성 식물의 판별을 용이하게 하기 위해서는, 종자 또는 생육 초기에 형태와 연관된 유전자를 발견하여 이용하거나, 웅성 불임 유전자에 연관된 DNA 마커를 개발하여 웅성 불임 식물만을 선발하는 방법의 개발이 필수적이다. 현재 상추에서 그러한 연구가 진행되고 있지만, 그 기술은 아직 확립되어 있지 않다.

상추의 유전자적 웅성 불임성의 유전 양식이 밝혀지고 나서 긴 세월이 경과하고 있음에도 불구하고, 유전자적 웅성 불임을 이용한 F1 품종의 개발은 전술한 바와 같이 많은 과제가 남아 있으며, 시장성이 높은 F1 품종의 개발은 아직 어렵다.

반면에, 세포질 웅성 불임성을 이용한 F1 종자의 생산은, 해바라기, 사탕무, 감자, 벼, 밀, 당근, 양파, 파 등에서는 이전부터 실용화되어 있고, 상업적인 종자생산 시스템도 확립되어 있다. 또한, 십자화과 식물인 양배추, 브로콜리, 무, 배추 등에서는 자가불화합성을 이용한 F1 품종의 채종이 널리 이용되어 왔는데, 최근에는 고품질의 종자가 요구되게 됨으로 인해, 세포질 웅성 불임성을 이용한 F1 종자의 생산이 확대되고 있다.

일반적으로, 안정적인 웅성 불임성을 가지는 세포질 웅성 불임 개체가 만들 어지면, 연속적인 역교잡을 통해 그 세포질 웅성 불임성을 많은 우량 계통에 도입할 수 있고, F1 품종에 사용되는 종자친의 육성이 가능해진다. 세포질 웅성 불임성은 세포질을 통해 유전하기 때문에, 후대 식물은 모두 웅성 불임성을 나타낸다. 세포질 웅성 불임 계통은 동일한 게놈과 정상적인 세포질을 가진 유지 친과의 교배에 의해 용이하게 유지·증식될 수 있다. 세포질 웅성불임을 이용한 채종은 유전자적 웅성 불임성을 이용하는 경우와 같이 채종포에서 종자친내의 가임 개체를 제거하는 작업이 필요 없기 때문에 효율적이고, 추출 실수에 의한 F1 종자의 순도의 저하의 문제도 없어진다.

이상과 같은 배경으로부터, 세포질 웅성 불임 식물을 이용한 F1 종자의 채종 방법은 유전자적 웅성 불임성을 이용한 경우와 비교하여 경제적·상업적 실용성이 매우 높다고 말할 수 있다.

상기한 바와 같이 높은 유용성이 기대됨에도 불구하고, 상추에서는 세포질 웅성 불임 개체를 이용한 F1 종자의 채종법이 아직 개발되어 있지 않다. 이는, 상추의 경우에는, 상추의 세포질에 도입되었을 때 세포질 웅성 불임성을 유발할 수 있는 세포질을 갖는 교잡 가능한 동종 또는 동속의 식물이 존재하지 않기 때문이다.

한편, 국화과 해바라기속의 해바라기 재배종(헬리안투스 안누스 엘.(Helianthus annuus L.))에서는, 종간 교잡에 의해 수많은 세포질 웅성 불임 식물이 발견되었고, F1 품종도 실용화되어 있다. 이들에 대해서는 비특허 문헌 9∼13 등에 보고되어 있다. 국화과에서 세포질 웅성 불임 채소를 유발한 한 예로는, 해바 라기와 치커리의 세포 융합에 의해 세포질 웅성 불임 치커리를 생산한 것을 들 수 있다. 이와 같은 기술은 특허 문헌 2, 특허 문헌 3, 비특허 문헌 14 내지 비특허 문헌 17에서 열람할 수 있다.

비특허 문헌 14는, 세포질 웅성 불임 치커리 생산의 최초의 보고이고, 해바라기의 세포질을 세포 융합 기술에 의해 치커리에 도입함으로써 세포질 웅성 불임 치커리를 생산할 수 있음을 밝혔다. 비특허 문헌 14는 또한, 생산된 세포질 웅성 불임 치커리에서의 미토콘드리아 게놈이, 치커리의 미토콘드리아 게놈과 해바라기의 미토콘드리아 게놈이 재조합된 것임을 보고하고 있다. 또한 비특허 문헌 16, 비특허 문헌 17에서는, 상기 세포질 웅성 불임 치커리의 후대에서의 세포질 웅성 불임성의 발현과 미토콘드리아 DNA 구조의 분석 결과를 보고하고 있다.

특허 문헌 2에는 국화과 식물의 세포질 웅성 불임 식물체 및 그 생산 방법이 기재되어 있다. 특허 문헌 2에서 실제로 생산된 것으로 알려진 세포질 웅성 불임 식물체만이 비특허 문헌 14와 같이 세포질 웅성 불임 치커리이다. 특허 문헌 2에는 세포질 웅성 불임 상추에 대한 언급은 있지만, 원형질체의 배양 방법과 융합 방법이 현재형의 문장으로 언급되어 있을 뿐이고, 실제로 세포질 잡종 상추 또는 세포질 웅성 불임 상추를 생산하는 방법 및 실험 결과는 기재되어 있지 않다. 세포 융합 기술에서는 원형질체의 단리·융합의 공정까지는 비교적 용이하게 행할 수 있다. 예를 들면, 동물 세포와 식물 세포의 원형질체를 각각 단리하고 융합시키는 것까지도 가능하다. 그러나, 계통학적으로 유연관계가 먼 세포들 간의 융합 세포를 배양하여 분열시키고, 또한 식물체로 재분화시키는 공정은 기술적으로 매우 어렵 다. 이러한 기술적인 어려움은 융합세포의 분열을 저해할 수 있는 융합 과정 동안의 스트레스, 혹은 이종의 핵과 세포질 사이에서의 유전적 불친화성 등에 의해 유발된다. 이 어려움을 극복하여 식물체를 재생하기 위해서는, 융합 세포의 세포막을 상하지 않도록 하는 융합 방법의 개발, 새로운 게놈의 조합을 가지는 융합 세포에서도 분열이나 식물체의 재분화이 가능하도록 되는 배양 방법의 개발이 필요하다. 그러므로, 융합 세포의 배양 기술과 그에 이어지는 융합 세포로부터의 식물체의 재분화 기술은 세포 융합 기술의 핵심이 되는 기술이다. 또한, 웅성 불임성을 발현시키기 위해서는 계통학적으로 적당히 먼 유연관계에 있는 이종 간의 미토콘드리아 게놈의 재조합이나 재배열이 필요하다. 그래서, 유연관계가 먼 이종 간의 세포질 잡종 식물이 생산가능하여도, 웅성 불임성을 발현하는 식물을 생산할 수 있을 지의 여부는 예측할 수 없다. 그러므로, 실제로 세포질 잡종 식물을 생산하고 웅성 불임성을 가지는 개체를 선별하는 공정이 불가결하다. 또, 특허 문헌 2에는, 상추의 세포질 웅성 불임 식물 생산을 위해 결정적인 기술은 기재되어 있지 않다. 이런 이유들로 인해, 세포질 웅성 불임 상추의 생산 방법의 개발은 종래부터 강하게 시도되었지만, 특허 문헌 2의 발표 이 후에도 상추의 세포질 웅성 불임 식물이 성공적으로 생산되었다는 보고는 존재하지 않는다.

특허 문헌 3에서는 해바라기의 세포질 웅성 불임성의 원인 유전자로 추정되는 orf522를 비대칭 세포 융합에 의해 치커리속 식물에 도입하여 세포질 웅성 불임 치커리를 생산하는 방법에 대하여 기재되어 있다.

비특허 문헌 15는 새로운 연구 그룹에 의한 세포질 웅성 불임 치커리의 생산 예인데, 그들은 최근까지 실용적인 세포질 웅성 불임 치커리의 생산을 목적으로 연구를 진행해 오고 있다.

이상과 같이, 해바라기의 미토콘드리아 DNA의 일부를 세포 융합에 의해 도입한 세포질 웅성 불임 치커리의 생산에 대해서는 많이 보고되어 있다. 그러나, 상추가 치커리와 동일한 국화과에 속함에도 불구하고, 세포질 웅성 불임 상추의 생산 예는 보고되어 있지 않다. 세포질 웅성 불임 해바라기를 이용해 세포질 웅성 불임 상추의 생산이 어려운 이유는 상추의 핵 게놈이 치커리의 핵 게놈에 비해 해바라기의 미토콘드리아 게놈과의 유전적 친화성이 낮은 것이 원인이라고 생각된다.

또한, 해바라기의 세포질 웅성 불임 유전자를 치커리에 도입하여 세포질 웅성 불임 치커리를 얻은 후, 그 치커리와 상추를 교잡하여 세포질 웅성 불임성을 상추에 도입하는 방법도 생각되는데, 상추와 치커리는 속이 상이하고 유연관계가 멀기 때문에 교잡이 어려워, 이와 같은 방법에 의해 세포질 웅성 불임 상추를 성공적으로 만들었다는 보고는 알려져 있지 않다.

이상과 같이, 세포질 웅성 불임 상추의 생산은 기술적으로 상당히 어렵고, 아직까지 성공한 예도 없다. 그러나, 세포질 웅성 불임 상추를 이용하여 상추의 F1 품종화를 실현한다면 매우 유용할 것이다. 그러므로, 세포질 웅성 불임 상추의 생산이 강하게 요망되고 있었다.

특허 문헌 1:일본 특개 2005-110623호 공보

특허 문헌 2:유럽 특허 제0771523호 명세서

특허 문헌 3:국제 공개 WO97/45548호 팸플릿

특허 문헌 4:일본 특개 소62-232324호 공보

특허 문헌 5:일본 특개 소63-79548호 공보

특허 문헌 6:일본 특개 평2-303426호 공보

특허 문헌 7:일본 특개 소63-36776호 공보

특허 문헌 8:일본 특개 소64-20041호 공보

특허 문헌 9:일본 특개 평1-218530호 공보

특허 문헌 10:일본 특개 평10-052185호 공보

특허 문헌 11:미국 특허 제5254802호 명세서

특허 문헌 12:일본 특개 평10-108676호 공보

특허 문헌 13:일본 특개 평10-108677호 공보

특허 문헌 14:일본 특개 2001-145497호 공보

특허 문헌 15:일본 특개 평02-138927호 공보

특허 문헌 16:일본 특개 평01-206931호 공보

특허 문헌 17:국제 공개 WO99/55143호 팸플릿

특허 문헌 18:국제 공개 WO95/09910호 팸플릿

특허 문헌 19:국제 공개 WO97/09873호 팸플릿

특허 문헌 20:일본 특허 제3635036호 공보

비특허 문헌 1:다카타 카츠야, 후지노 마사다케(1987) 상추의 F1 종자의 채종에 관한 연구(제1보) 웅성 불임계를 종자친으로 한 F1의 잡종 강세에 대하여, 원학 학회 1987년도 춘계 대회 연구 발표 요지 208-209

비특허 문헌 2:다카타 카츠야, 후지노 마사다케(1986) 상추의 웅성 불임성 이용 기술의 개발 (1) F1 조합에서의 잡종 강세 발현에 대하여, 야채·다업 시험장 모리오카 지장 연구연보 No.1, 87-93.

비특허 문헌 3:Edwrd J. Ryder(1967) A recessive male sterility gene in Lettuce(Lactica sativa L.) Pro. Am. Soc. Hortic. Sci. 91, 366-368

비특허 문헌 4:Ryder, E, J Proceeding of the American society for horticultural Science 1963 Vol.83 585-589 An epistatically controlled pollen sterile in Lettuce(Lactica sativa L)

비특허 문헌 5:Ryder, E, J Science 1989 vol.114(1) 129-133 Studies of three new genes, linkage, and epistasis in Lettuce

비특허 문헌 6:품종 등록 출원 서류 「Fine」 카네코 종묘 제1745호

비특허 문헌 7:세리자와 히로아키 원예학회잡지 제73권 별책 2 p566 상추의 열성 웅성 불임 유전자

비특허 문헌 8:Matsumoto, E., Plant cell reports 1991. vol.9(10) Interspecific somatic hybridization between lettuce(Lactica sativa) and wild species L. virosa

비특허 문헌 9:L. H. Rieseberg, C. Van Fossen, D. Arias, and R. L. Carter, The journal of heredity 1994:85(3) 233-238 Cytoplasmic male sterility in Sunflower:origin, Inheritance, and Frequency in Natural Populations

비특허 문헌 10:R. Horn Theor Appl Genet(2002) 104:562-570 Molecular diversity of male sterility inducing and male-fertile cytoplasms in the genus Helianthus

비특허 문헌 11:S. Sukno, J. Ruso, Euphytica(1999) 106:69-78 Interspecific hybridization between sunflower and wild perennial Herianthus species via embryo rescue

비특허 문헌 12:R. Horn, W. Friedt, Plant Breeding 116(1997) 317-322 Fertility restoration of new CMS sources in sunflower(Helianthus annuus L.)

비특허 문헌 13:Horn, R., Plant molecular biology;an international journal on fundamental research and genetic engineering July 1991 v17(1), 29-36 A mitochondrial 16kDa protein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower.

비특허 문헌 14:C. Rambaud, J. Dubois, J. Vasseur(1993) Male-sterile chicory cybrids obtained by intergeneric protoplast fusion, Theor Appl Genet 87:347-352

비특허 문헌 15:S. Varotto, E. Nenz, M. Lucchin, P. Parrini(2001) Production of asymmetric somatic hybrid plants betwwen Cichorium intybus L. and Helianthus annuus L., Theor Appl Genet 102:950-956

비특허 문헌 16:C. Rambaud, A. Bellamy, A. Dubreucq, J. -C. Bourquin and J. Vasseur(1997) Molecular analysis of the fourth progeny of plants derived form a cytoplasmic male sterile chicory cybrid, Plant Breeding 116:481-486

비특허 문헌 17:A. Dubreucq, Theor Appl Genet(1999):1094-1105 Analyses of mitochondrial DNA structure and expression in three cytoplasmic male-sterile chicories originating from somatic hyvridisation between fertile chicoly and CMS sunflower protoplasts

비특허 문헌 18:미즈타니 다카유키 Bull. Fac. Agr., Saga Univ 67:109-118(1989) 상추 및 일본산 근연 야생종의 원형질체로부터의 식물체 재분화 및 세포 융합

<발명의 개시>

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 감안하여, 상추의 F1 종자 생산에 유용한 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 상추 및 그 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는, 상기한 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 행한 결과, 해바라기와 상추의 융합 잡종 세포의 배양 및 세포질 잡종 식물의 재분화 방법에 의해 안정된 세포질 웅성 불임 상추를 생산하고, 이것을 이용하여 상추의 F1 종자가 효율적으로 얻어지는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 발명들을 포함한다.

(1) 해바라기속 식물 유래의 원형질체와 왕고들빼기속 식물 유래의 원형질체를 세포 융합하고, 이어서 융합 세포를 배양하고, 배양된 융합 세포로부터 식물체를 재생하는 것을 특징으로 하는 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물의 생산 방법.

(2) 해바라기속 식물 유래의 원형질체가 에이치. 안누스 엘.(해바라기;H. annuus L.)에서 유래된 원형질체이거나, 또는 에이치. 페티올라리스(H. petiolaris), 에이치. 아르고필루스(H. argophyllus), 에이치. 데빌리스(H. debilis), 에이치. 데카페탈루스(H. decapetalus), 에이치. 기간테우스(H. giganteus), 에이치. 리지두스(H. rigidus), 에이치. 살리시폴리우스(H. salicifolius), 에이치. 아노말루스(H. anomalus), 에이치. 볼란데리(H. bolanderi), 에이치. 엑실리스(H. exilis), 에이치. 막시밀리아니(H. maximiliani), 에이치. 네글렉투스(H. neglectus), 에이치. 프래콕스(H. praecox) 또는 에이치. 투베로수스(H. tuberosus)의 세포질을 갖는 해바라기(에이치. 안누스 엘.)의 세포질 치환 계통에서 유래된 원형질체인 (1)에 기재된 방법.

(3) 왕고들빼기속 유래의 원형질체가 락투카 사티바 엘.(상추;Lactuca sativa L.), 엘. 세리올라(L. serriola), 엘. 아큘레아테(L. aculeate), 엘. 스카리올로이데스(L. scarioloides), 엘. 아제르바이자니카(L. azerbaijanica), 엘. 게오르기카(L. georgica), 엘. 드레게아나(L. dregeana), 엘. 알타이카(L. altaica), 엘. 살리그나(L. saligna), 엘. 비로사(L. virosa), 엘. 타타리카(L. tatarica), 엘. 인디카(L. indica), 혹은 엘. 데빌리스(L. debilis), 또는 그들의 종간 교잡 식물에서 유래된 원형질체인 (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4) 해바리기속 식물이 세포질 웅성 불임성을 가지는 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(5) 해바라기속 식물이 미토콘드리아에 웅성 불임 유전자를 가지는 (4)에 기재의 방법.

(6) 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물이 세포질 웅성 불임성을 가지는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 생산된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

(8) 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부가, 그 식물체의 세포 또는 세포질을 포함하는 것인 (7)에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부.

(9) 해바라기속 식물의 미토콘드리아에서 유래된 유전자를 세포질 내에 가지는 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

(10) 해바라기속 식물이 에이치. 안누스 엘.이거나, 또는 에이치. 페티올라리스, 에이치. 아르고필루스, 에이치. 데빌리스, 에이치. 데카페탈루스, 에이치. 기간테우스, 에이치. 리지두스, 에이치. 살리시폴리우스, 에이치. 아노말루스, 에이치. 볼란데리, 에이치. 엑실리스, 에이치. 막시밀리아니, 에이치. 네글렉투스, 에이치. 프래콕스 또는 에이치. 투베로수스의 세포질을 갖는 에이치. 안누스 엘.의 세포질 치환 계통인 (9)에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

(11) 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물이 락투카 사티바 엘., 엘. 세리올라, 엘. 아큘레아테, 엘. 스카리올로이데스, 엘. 아제르바이자니카, 엘. 게오르기카, 엘. 드레게아나, 엘. 알타이카, 엘. 살리그나, 엘. 비로사, 엘. 타타리카, 엘. 인디카 혹는 엘. 데빌리스, 또는 이들의 종간 교잡 식물에서 유래된 것인 (9) 또는 (10)에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

(12) 해바라기속 식물의 미토콘드리아에서 유래된 유전자가 웅성 불임 유전자인 (9) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

(13) 세포질 웅성 불임성을 가지는 (9) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

(14) 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부가, 그 식물체의 세포 또는 세포질을 포함하는 것인 (9)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부.

(15) 수탁 번호 FERM BP-10421인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물의 종자, 그 종자로부터 생육시킨 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

(16) 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부가, 그 식물체의 세포 또는 세포질을 포함하는 것인 (15)에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부.

(17) 수탁 번호 FERM BP-10647인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물의 종자, 그 종자로부터 생육시킨 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.

(18) 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부가, 그 식물체의 세포 또는 세포질을 포함하는 것인 (17)에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부.

(19) (6)에 기재된 방법에 의해 생산된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 생산 방법.

(20) (13)에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 생산 방법.

(21) (15)에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 생산 방법.

(22) (17)에 기재된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 생산 방법.

(23) (19) 내지 (22) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 생산된 잡종 제1대 종자 또는 그 종자로부터 생육시킨 잡종 제1대 식물.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 2005-311598호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은 시험 재료에 이용한 세포질 웅성 불임 해바라기 두 계통과 웅성 가임 해바라기 한 계통, 상추의 재배 품종 13 품종으로부터 DNA를 추출하고, 해바라기 미토콘드리아 유전자 orf522에 특이적인 프라이머(윗 그림) 및 orf873에 특이적인 프라이머(아래 그림)를 이용하여 PCR을 행한 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.

도 2는 해바라기 미토콘드리아 유전자 orf522 및 orf873에 특이적인 프라이머를 이용하여, 세포질 잡종 식물의 검정을 행한 결과의 일례를 나타내는 전기 영동 사진이다.

도 3은 시험 재료에 이용한 세포질 웅성 불임 해바라기 두 계통과 웅성 가임 해바라기 한 계통, 상추의 재배 품종 13 품종으로부터 DNA를 추출하고, 엽록체 유전자 rbcL에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 그 증폭 산물을 TaqI로 절단하였을 때의 PCR-RFLP 패턴을 나타내는 전기 영동 사진이다.

도 4는 상추 재배 품종 ‘텔 미(Tell me)’의 꽃의 형태를 나타낸 도면이다(A:화서, B:두화, C:두화의 중심부(배율×20), D:암술과 꽃밥통(배율×64)).

도 5는 세포질 웅성 불임 상추의 꽃의 형태를 나타낸 도면이다(A:화서, B:두화, C:두화의 중심부(배율×20), D:화분이 부착된 암술과 꽃밥통(배율×64)).

도 6은 세포질 웅성 불임 상추의 염색체의 관찰 결과를 나타내는 도면이다.

도 7은 세포질 웅성 불임 상추에 웅성 가임 상추의 화분을 교배함으로써 후대 종자가 얻어지는 것을 나타낸 도면이다.

도 8은 세포질 웅성 불임 상추의 BC3 세대 14 개체의 잎으로부터 DNA를 추출하고, 해바라기 미토콘드리아 유전자 orf873에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.

도 9A는 세포질 웅성 불임 상추의 BC3 세대 14 개체의 잎으로부터 DNA를 추출하고, 미토콘드리아 유전자 atp6, coxII, cob에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다. 미토콘드리아 유전자 atp6, coxII, cob의 경우에는, PCR 증폭 산물을 더 제한 효소로 절단한 PCR-RFLP의 결과이다.

도 9B는 세포질 웅성 불임 상추의 BC3 세대 14 개체의 잎으로부터 DNA를 추출하고, 미토콘드리아 유전자 rps3, trnN과 trnY, trnS와 trnP에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다.

도 10은 세포질 웅성 불임 상추의 BC3 세대 14 개체의 잎으로부터 DNA를 추출하고, 엽록체 유전자 rbcL에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 그 증폭 산물을 TaqI로 절단하였을 때의 PCR-RFLP 패턴을 나타내는 전기 영동 사진이다.

도 11은 세포질 웅성 불임 상추 ‘1216-2-T1’×‘텔 미’의 F1 식물의 화기와 암술의 형태를 나타낸 도면이다.

도 12는 세포질 웅성 불임 상추 ‘1216-2-T1’×‘스테디(Steady)’의 F1 식물의 화기와 암술의 형태를 나타낸 도면이다.

도 13은 세포질 웅성 불임 상추 ‘1216-2-T1’×‘로직(Logic)’의 F1 식물의 화기와 암술의 형태를 나타낸 도면이다..

도 14는 세포질 웅성 불임 상추 ‘1216-2-T1’×‘미야(Miya)’의 F1 식물의 화기와 암술의 형태를 나타낸 도면이다.

도 15는 세포질 웅성 불임 상추 ‘1216-2-T1’과 상추 야생종 엘. 세리올라의 교잡종의 식물체, 화기, 암술의 형태를 나타낸 도면이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

본 발명에 의한 융합 잡종 세포 및 세포질 잡종 식물은, 하기의 수단으로 이루어지는 방법에 의해 작성할 수 있다.

(1) 원형질체의 제조

(2) 원형질체의 융합 처리

(3) 융합 잡종 세포의 배양

(4) 마이크로 캘러스로부터의 식물체의 재생

(5) 세포질 잡종 식물의 선별

(6) 우량 계통의 선발

(7) 세포질 웅성 불임 식물의 이용과 F1 종자의 생산

각 공정의 상세는 하기과 같다.

(1) 원형질체의 제조

(ⅰ) 왕고들빼기속 식물 유래의 원형질체의 단리

원형질체의 제조에 이용하는 왕고들빼기속 식물은, 락투카 사티바 엘., 엘. 세리올라, 엘. 아큘레아테, 엘. 스카리올로이데스, 엘. 아제르바이자니카, 엘. 게오르기카, 엘. 드레게아나, 엘. 알타이카, 엘. 살리그나, 엘. 비로사, 엘. 타타리카, 엘. 인디카 또는 엘. 데빌리스, 또는 이들의 종간 교잡 식물인 것이 바람직하고, 그 중에서도, 상추의 재배종인 L. sativa L.이 바람직하다. L. sativa L.은, var. angustana(아스파라 상추, 줄기 상추 등을 포함함), var. longifolia(코스, 로메인 상추, 잎 상추 등을 포함함), var. crispa(잎 상추(리프 상추, 루스리프 상추) 등을 포함함), var. capitata(헤드 상추, 옥 상추, 버터 헤드, 양상추, 크리스프 헤드, 양배추 타입 상추 등을 포함함) 등으로 구분되어 있고, 이들은 모두 생태적으로 분화한 동일종 내에서의 변종이다. 본 발명에는 L. sative L.에 속하는 모든 변종을 바람직하게 이용할 수 있다. 또한, 엔다이브나 치커리 등은 상추와 유사한 특성을 가지지만, 왕고들빼기속에는 속하지 않기 때문에, 상추에는 포함되어 있지 않다 (야채원예대백과 7 상추·셀러리 1989년 4월 30일 제1쇄 발행 발행처 사단법인 농산어촌문화협회 P87).

원형질체를 얻기 위해서 사용하는 세포 조직으로서는, 수량성이 높고, 분열 활성이 높은 엽내 조직을 사용하는 것이 바람직한데, 배축이나 줄기, 캘러스 등의 다른 조직도 재료로서 이용하여도 된다.

원형질체를 단리하는 방법은 통상 이용되는 방법(비특허 문헌 8, 18) 이며, 특별히 한정되지 않는다. 우선, 상추의 세포 조직을 잘게 썰고, 효소 처리함으로써 원형질체를 단리한다. 여기서는, 원형질체 단리용 효소 용액을 사용한다. 이 용액 은 주로 세포벽 분해 효소, 삼투압조정제를 포함하는 무기염 완충액이다. 세포벽 분해 효소로서는, 식물의 세포벽의 분해에 사용할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않지만, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제 등을 들 수 있다. 본 발명에서는, 메이셀라제와 마세로자임 R-10의 조합이 바람직하다. 삼투압조정제로서는, 일반적인 당 알코올류, 예를 들면 만니톨, 솔비톨, 글루코오스 등을 이용할 수 있는데, 만니톨이 바람직하고, 0.3M∼0.7M의 농도의 만니톨이 특히 바람직하다. 또한, 효소 용액에는 원형질체의 막의 안정화를 위해서 무기염을 첨가하는 것이 바람직한데, 예를 들면 표 1에 기재된 조성의 CPW염(코킹 앤드 페버디(Cocking and Peberdy), 1974)을 첨가하면 바람직하다. 효소 처리는 25∼30℃에서 8∼20시간 정치 처리하면 바람직하다.

CPW염 용액의 조성

KH₂PO₄	27.2㎎/l
KNO₃	101.0㎎/l
CaCl₂·2H₂O	1,480.0㎎/l
MgSO₄	246.0㎎/l
KI	0.16㎎/l
CuSO₄·5H₂O	0.025㎎/l
만니톨	0.6M
pH	5.8

효소 처리에 의해 단리한 원형질체는 30∼100㎛의 구멍 직경의 나일론 메쉬로 여과하고, 원심 분리하여 효소액을 제거한 다음 모은다. 모아진 원형질체는 세정액에 현탁하여 세정한다. 세정액으로서는, 일반적으로 이용되는 CPW염 용액에 삼투압조정제로서 당 알코올류를 첨가한 것을 이용할 수도 있는데, 나중에 단리하는 해바라기속 식물 유래 원형질체와의 융합시에 하기 조성의 S액(문헌:Lenee P, Chupeau Y, Plant Sci. 43:69-75(1986) 참조)을 이용하는 것이 바람직하기 때문에, 여기서는 세정액으로서 표 2에 기재된 조성을 가지는 S액을 이용하는 것이 바람직하다.

S액의 조성

CaCl₂·2H₂O	2,000㎎/l
KCl	250,000㎎/l
MES	700㎎/l
pH	5.6

다음에, 왕고들빼기속 식물 원형질체의 단독 분열을 방지하기 위해서 불활성화 처리를 행하는 것이 바람직하다. 불활성화 처리는 요오드아세트산, 요오드아세트아미드 등의 요오드 화합물을 용해한 CPW염 용액 등에 원형질체를 현탁시킴으로써 행할 수 있다. 본 발명에서는 주로 요오드아세트아미드를 5mM∼30mM의 농도로 조정한 CPW 용액에 원형질체를 현탁하여 5∼20분간 배양하였다.

다음으로는 원심 분리를 이용하여 S액으로 1∼3회 반복하여 세척하는 것이 바람직하다. 원형질체의 현탁액에는 도관이나 세포의 단편도 혼입하기 때문에, 또한 밀도 구배 원심 분리법 등에 의해 원형질체를 좀 더 정제한다. 이 정제과정에 이용되는 시약으로는 당류, 합성 콜로이드 등을 들 수 있는데, 본 발명에서는 자당액의 이용이 바람직하고, 15%∼20%의 자당액의 이용이 특히 바람직하다. 원형질체의 정제한 후에는 혈구 계산판을 이용하여 세포 밀도를 계측하고, 세포 융합에 적합한 세포 밀도로 되도록 첨가하는 S액의 양을 조정한다. 원형질체의 세포 밀도는, 1×10⁵∼1×10⁷세포/ml가 바람직하고, 액량의 조정에는 S액을 이용하는 것이 바람직하다.

(ⅱ) 해바라기속 식물 유래의 원형질체의 단리

본 발명에서 세포질 공여 재료로서 해바라기속 식물이 이용되어진다. 해바라기속 식물 중에서도 해바라기의 재배 품종인 헬리안투스 안누스 엘. 혹은, 에이치. 페티올라리스, 에이치. 아르고필루스, 에이치. 데빌리스, 에이치. 데카페탈루스, 에이치. 기간테우스, 에이치. 리지두스, 에이치. 살리시폴리우스, 에이치. 아노말루스, 에이치. 볼란데리, 에이치. 엑실리스, 에이치. 막시밀리아니, 에이치. 네글렉투스, 에이치. 프래콕스 또는 에이치. 투베로수스의 세포질을 갖는 에이치. 안누스 엘.의 세포질 치환 계통이 바람직하다.

본 발명에 이용되는 해바라기속 식물은 세포질 웅성 불임 계통인 것이 바람직하다. 원래 에이치. 안누스 엘.에서는, 다수의 세포질 웅성 불임 계통이 있는데, 그들은 재배종의 자연 돌연 변이나 여러 종간 교잡 후대로부터 얻어지는 것이 알려져 있다. 구체적으로는, 에이치. 안누스 엘.의 자연 돌연 변이체 혹은 전술한 에이치. 안누스 엘.의 각종 세포질 치환 계통으로부터 육성된 세포질 웅성 불임 계통이 알려져 있고, 분자 생물학적 방법에 의해 그 다양성도 보고되어 있다(비특허 문헌 10). 즉 에이치. 안누스 엘.에서는, 이미 많은 세포질 웅성 불임성을 가지는 세포질 치환 계통이 육성되어 있다. 본 발명에서는 해바라기속 식물의 여러 세포질 치환 계통을 세포질 공여 재료로서 사용할 수 있다.

본 발명에서 세포질 웅성 불임성의 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물을 얻기 위해서는, 세포질 공여 재료로서 세포질 웅성 불임 유전자를 가지는 해바라기속 식물을 이용하는 것이 바람직한데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 해바라기속 식물 유래의 원형질체와 왕고들빼기속 식물 유래의 원형질체를 세포 융합할 때에 양 식물 중의 미토콘드리아 게놈 간에서 게놈의 재조합이나 재배열이 일어난 결과, 세포질 웅성 불임성을 발현하는 계통이 얻어지는 경우도 있는데, 이렇게 해서 얻어지는 세포질 웅성 불임성의 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물도 또한 본 발명에 포함된다.

또한 세포 융합에 이용되는 해바라기속 식물 세포는 방사선 처리에 의해 핵 게놈을 불활성화한 것을 이용할 수 있다. 해바라기속 식물의 세포의 핵 게놈을 불활성화 한 후, 해바라기속 식물 세포와 왕고들빼기속 식물 세포를 융합 하면, 융합세포는 해바라기속 식물의 핵 게놈에 영향을 받지 않고, 왕고들빼기속 식물의 핵 게놈이 가지는 재분화 능력을 갖게 된다. 그 결과 해바라기속 식물의 세포질을 가진 왕고들빼기속 식물 개체의 재분화가 가능하다.

이상과 같이 본 발명에서는, 해바라기속 식물의 여러 소재를 세포질 공여 세포로서 사용하여, 다양한 유전적 배경을 가진 왕고들빼기속의 세포질 잡종(Cybrid)체의 생산이 가능하다.

해바라기속 식물 유래의 원형질체를 제조하기 위해서는, 우선 해바라기속 식물의 세포 조직을 잘게 썰고, 원형질체 단리용 효소 용액에 침지함으로써 원형질체를 단리한다. 사용하는 세포 조직으로서는, 수량성이 높고 세포막이 단단하기 때문에 하배축을 사용하는 것이 바람직한데, 잎이나 줄기 등의 다른 조직을 재료로 하여도 된다. 세포벽 분해 효소는, 왕고들빼기속 식물의 경우와 마찬가지로, 식물의 세포벽의 분해에 사용할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 본 발명에서는 드리세라제와 마세로자임 R-10의 조합으로 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 해바라기속 식물의 배축으로부터 분리한 원형질체는 비중이 낮기 때문에, 세포벽 분해 효소는 KCl이나 NaCl 등으로 하여 삼투압을 조정한 용액, 예를 들면 본 발명에서는 S액에 넣어 사용하는 것이 바람직하다. 효소 처리는, 25∼30℃에서 8∼20시간 정치 처리하면 바람직하다. 효소 처리에 의해 단리한 원형질체를, 30∼100㎛의 구멍 직경의 나일론 메쉬로 여과한다. 해바라기속 식물 유래의 원형질체의 핵 유전자는 불필요하기 때문에, 단리한 원형질체는 방사선의 조사에 의해 핵 유전자를 불활성화시키는 것이 바람직하다. 조사하는 방사선으로서는 X선, γ선, 자외선 등을 들 수 있는데, 핵 유전자를 불활성화할 수 있으면, 특별히 한정되는 것은 아니다. 조사선량은 핵을 불활성화할 수 있는 범위에서, 가능한 한 저 조사량으로 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명에서의 연질 X선의 조사의 경우 0.1Gy∼0.6Gy의 조사량이 바람직하다.

(2) 원형질체의 융합 처리

그 다음에는 이상과 같은 불활성화 처리로 얻어진 양종의 원형질체는 세포 융합을 행한다. 융합 방법으로서는 특별히 한정되지 않지만, 공지의 전기 융합법(Planta, 151, 26-32, 1981), PEG법(Planta, 120, 215-227, 1974), 덱스트란법(Jap. J. Genet., 50, 235, 1975) 등이 있는데, 본 발명에서는 PEG법을 개량한 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

(3) 융합 잡종 세포( Fused hybrid cell )의 배양

융합 처리한 세포는, 왕고들빼기속 식물 유래의 원형질체의 배양에 적합한 배지로 배양하는 것이 바람직하다. 왕고들빼기속 식물 유래의 원형질체의 배양 방법으로서는 여러 방법이 알려져 있고, 본 발명에는 모든 방법을 바람직하게 이용할 수 있는데, 본 발명에 이용하기 위해서는, 공지의 방법(니시오, T., et al., Japanese journal of breeding, 38, 165-171)을 개량한 방법이 바람직하다. 이 니시오(니시오) 등의 방법은 왕고들빼기속 식물 원형질체를 배양 방법으로서 우수하다. 그러나 니시오 등의 방법은 본 발명에 직접 적용할 수는 없다. 왜냐하면, 니시오 등의 보고에서는 왕고들빼기속 식물만의 원형질체를 배양하였는데, 이 때 융합 처리를 거치지 않는 원형질체들은 세포막의 손상이 적어, 배양 초기부터 젤란검을 포함하는 고체 배지에서의 배양이 가능하였다. 본 발명에서 배양하는 융합 처리 후의 세포는 처리과정 동안의 스트레스에 의해 세포막이 파괴되기 쉬운 상태가 된다. 따라서 니시오 등을 방법을 이용하면 융합 세포를 젤란검과 혼합할 때 세포가 파괴되어 효율적인 배양을 행하는 것이 어렵게 된다. 그 때문에 본 발명에서는, 융합 처리 후의 세포를 젤란검을 포함하지 않는 액체 배지로 3-7일간 초기 배양하고, 세포막의 재생시킨 후 젤란검을 첨가하면 바람직하다. 니시오 등의 방법에 이와 같은 개량을 가함으로써, 융합 세포를 효율적으로 배양하는 것이 가능해진다. 융합 세포는 분열을 반복하고, 마이크로 캘러스를 형성하기 때문에 삼투압을 감소시킨 새로운 배지에 계대하면 바람직하다.

(4) 마이크로 캘러스로부터의 식물체의 재생

마이크로 캘러스가 수 ㎜까지 생장한 단계에서, 재분화 배지에 이식하여 재분화시킨다. 재분화 배지에 대한 반응은 재료로 하는 왕고들빼기속 식물의 종류나 마이크로 캘러스의 상태에 따라 차이가 있지만, 예를 들면 0.3∼1.0㎎/l의 BA를 포함하는 MS 배지(Murasige, T. & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497(1962)) 등을 이용하면 바람직하다. 재분화한 슈트는 발근용 배지, 예를 들면, 1/2 농도의 MS 배지 등에 이식하여 발근시키고, 식물체로 재생시킨다. 재생한 식물체는 순화하여 온실 내에 옮겨 심는다.

(5) 세포질 잡종 식물의 선별

상기한 수순으로 재생한 식물체 및 재료에 사용한 해바라기속 식물 및 왕고들빼기속 식물의 잎으로부터 DNA를 추출한다. 예를 들면 에이치. 안누스 엘.의 미토콘드리아에 특이적인 유전자로는 orf522, orf708, orf873 등을 들 수 있는데, 이들 유전자를 마커로 하여 PCR법에 의해 검출함으로써, 에이치. 안누스 엘.의 미토콘드리아 유전자가 도입된 세포질 잡종 식물을 판별할 수 있다. 우선 표적으로 하는 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 설계하여 PCR을 행한 다음, 전기 영동을 행하여 예상되는 크기의 밴드를 확인한다. 이와 같이 하여, 왕고들빼기속 식물의 식물체에 해바라기속 식물의 미토콘드리아 DNA가 도입되어 있는 개체를 선발할 수 있다. 더 나아가 PCR-RFLP법(Tsumura, Y., Yoshimura, K. Tomaru, N. et al., Theor. Appl. Genet. 91, 1222-1236, 1995)을 이용하면, 해바라기속 식물 유래의 미토콘드리아 DNA와 왕고들빼기속 식물 유래의 미토콘드리아 DNA를 구별할 수 있다.

또한, PCR-RFLP 방법은 PCR 분석에 의해 선별한 세포질 잡종 식물의 엽록체가 왕고들빼기속 식물로부터 유래하였는지를 확인하는 데도 사용된다. PCR-RFLP법에 이용되는 엽록체 유전자로는 특별한 제한이 없지만, rbcL, matK 등과 같이 해바라기속 식물과 왕고들빼기속 식물의 사이에서 다형성을 확인할 수 있는 것이면 된다. 표적으로 하는 엽록체 유전자 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머들은 PCR을 수행할 수 있도록 고안되어져 있다. 이러한 PCR의 증폭 산물을 제한 효소 처리하고, 제한 효소 절단 부위의 차이에 의한 RFLP에 의해 엽록체의 기원을 확인한다. 왕고들빼기속 식물 유래의 엽록체를 가지는 개체들은 핵 유전자와의 친화성으로 인해 구분된다.

이상의 DNA를 이용한 확인은 순화한 식물체나 캘러스의 단계에서 수행하여도 된다. 또한 세포 유동 계측법이나 염색체의 관찰 등에 의해 배수성의 검정도 행해 두는 것이 바람직하다.

(6) 우량 계통의 선발

얻어진 세포질 잡종 식물체들 중에서, 웅성 불임 형질을 가지고, 그 외의 기관이 형태적인 이상을 수반하지 않는 계통을 선발한다. 웅성 불임성과 같이 생식기관에 장애가 있으면, 자성 가임성 즉 종자의 결실성도 저하하는 경우가 많은 경향에 있기 때문에 자성 가임성이 높은 계통을 선발하는 것은 특히 중요하다. 세포질 잡종 식물의 미토콘드리아 게놈을 PCR-RFLP로 분석하고, 그 데이터를 선발의 판단 재료로 하면 더 효율적인 선발이 가능하다. 예를 들면, 해바라기속 식물의 미토콘드리아 유전자의 일부가 도입되어 웅성 불임 형질이 발현되고 있는 왕고들빼기속 식물체는 미토콘드리아 유전자의 대부분이 왕고들빼기속 식물과 동일하여 왕고들빼기속 식물의 핵과의 친화성이 높으므로 웅성 불임성 이외의 형질들은 정상일 가능성이 높다.

또한, 선발한 웅성 불임 개체에 정상 세포질의 상추의 화분을 교배하고, 교잡 후대에서 웅성 불임성이 세포질 유전하고 있는 것을 확인한다. 또한, 다수의 교잡 후대를 여러 환경 하에서 재배하고, 웅성 불임성이 안정한지 확인한다.

우량 계통을 선발할 수 있는 가능성을 높이기 위해서는, 선발의 후보가 되는 왕고들빼기속 식물의 세포질 잡종 수를 많게 하는 방법이 유효하다. 또한, 비교적 소수의 후보로 되는 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 중에서 세포질 웅성 불임성을 가지는 우량 계통 식물을 일차 선발한 후, 우량 계통 식물의 세포질을 더 개량하여 더 바람직한 우량 계통을 얻는 방법도 유효하다. 어느 방법을 채택하여도 우량 계통을 선발할 수 있고, 2개의 방법을 조합하여 적용하여도 된다. 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속 세포질 잡종 식물의 세포질을 더욱 개량하기 위한 바람직한 방법으로는 세포질 공여 재료로 왕고들빼기속의 세포질 웅성 불임성 세포질 잡종 식물을 이용하고, 이것을 임의의 상추와의 비대칭 세포 융합을 행하는 것 등을 들 수 있다. 이와 같은 비대칭 세포 융합을 행함으로써, 예를 들면 미토콘드리아 게놈에 재조합이나 재배열이 일어나서, 세포질 웅성 불임성은 유지하면서 상추의 핵 유전자와의 친화성은 더 높은 세포질을 가지는 계통을 선발할 수 있는 가능성이 높아진다.

상기 수순에 의해 생산되어 선발된 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물은 해바라기속 식물의 세포질, 바람직하게는 미토콘드리아에서 유래된 유전자를 세포질 내에 가진다. 이 왕고들빼기속 세포질 잡종 식물은 왕고들빼기속 식물의 핵 게놈을 가지며, 바람직하게는 왕고들빼기속 식물의 엽록체 게놈도 더 가진다. 본 발명은 또한 이 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부에 관한 것이다. 본 발명에서 「왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물의 후대」란, 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물에 왕고들빼기속 식물의 화분을 교배하여 얻어지는 차세대 및 차세대 이후의 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물로, 이들은 세포질 유전에 의해 해당 세포질을 계승한 것을 의미한다. 본 발명에서 「왕고들빼기속 세포질 잡종 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부」란, 해당 식물체의 1개 이상의 세포 또는 1개 이상의 세포들의 세포질을 포함하는 것으로, 구체적으로는 꽃, 잎, 줄기, 뿌리 등의 기관 또는 조직, 혹은, 이들의 기관 또는 조직으로부터 만들어진 세포(세포로부터 제조된 원형질체를 포함함) 혹은 세포질, 혹은 상기 세포 혹은 세포질의 집합체를 의미한다.

(7) 세포질 웅성 불임 식물의 이용과 F1 종자의 생산

세포질 웅성 불임성을 가지는 우량 계통은 본 발명의 방법으로 생산한 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물에 우수한 왕고들빼기속 식물의 계통을 연속 역교잡하여 얻을 수 있다. 이렇게 해서 얻어진 세포질 웅성 불임성을 가지는 우량 계통은 F1 종자를 얻기 위한 종자친으로서 이용할 수 있다.

또한, 더 바람직하게는, 본 발명에 의해 생산한 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물을 세포질 공여 소재로서 이용하여, 임의의 상추와의 비대칭 세포 융합을 행함으로써, 단기간 내에 세포질 웅성 불임성을 가지는 종자친을 육성할 수 있다. 이와 같은 비대칭 세포 융합을 행함으로써, 예를 들면 미토콘드리아 게놈에 재조합이나 게놈의 재배열이 일어나고, 세포질 웅성 불임성을 유지하고, 상추의 핵 유전자와의 친화성이 더 높은 세포질을 가지는 계통을 선발할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 생산한 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물의 세포질은, 왕고들빼기속의 다른 종에 도입하는 것도 가능하다. 왕고들빼기속 식물에는 약 100종의 야생종이 알려져 있고, 상추 재배 품종 엘. 사티바는 9개 야생종인 엘. 세리올라, 엘. 아큘레아테, 엘. 스카리올로이데스, 엘. 아제르바이자니카, 엘. 게오르기카, 엘. 드레게아나, 엘. 알타이카, 엘. 살리그나, 엘. 비로사와 교잡 가능하다(특허 문헌 17).

교잡이 가능하면, 종래 육종 기술의 연속 역교잡법에 의해, 세포질과 핵을 치환시켜 새로운 세포질과 핵의 조합을 만들어내는 것(핵 치환)을 용이하게 행할 수 있다. 그리하여, 이들 야생종 또는 이들의 종간 잡종에도, 본 발명에 의해 생산한 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물과의 교잡에 통해 세포질 웅성 불임성을 발현하는 세포질을 용이하게 도입할 수 있다. 또한, 배·배주 배양에 의해서도 적용 범위가 확대될 수 있다.왕고들빼기속에는 엘. 타타리카, 엘. 비로사, 엘. 인디카, 데빌리스 등과 같은 야생종들의 유용 형질을 도입하기 위해, 야생종간의 원형질 융합으로 만들어진 체세포 잡종이 다수 육성되어 있다(예를 들면, 특허 문헌 17, Plant cell reports 9:531-534(1991), 비특허 문헌 18). 그리고 이 같은 야생종과 본 발병에 의해 만들어진 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속의 세포질 잡종 식물의 세포 융합 기술을 이용하면, 본 발명에 의해 생산한 왕고들빼기속의 세포질 잡종의 세포질 웅성 불임성 세포질을 야생종이나 그들의 종간 잡종에 도입하는 것이 가능하다. 본 발명에 의해 생산한 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속 세포질 잡종 식물에 방사선 등을 조사하여 핵을 불활성화시키거나, 비대칭 세포융합을 하기 위해 그것들을 세포질 공여 세포로 사용하면, 세포질의 도입은 좀 더 효율적으로 수행할 수 있다. 따라서, 연속 역교잡법이나 세포 융합 등의 종래 기술을 이용하면, 본 발명에 의해 생산한 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속 세포질 잡종 식물의 세포질을 많은 왕고들빼기속 식물에 도입하는 것이 가능하다. 야생종의 유용 유전자를 도입되어져 있는 왕고들빼기속의 종간 잡종 식물 등에도 세포질 웅성 불임성을 도입하는 것도 보다 용이해진다.

이상의 점으로부터, 본 발명에 의해 생산한 세포질 웅성 불임성의 왕고들빼기속 세포질 잡종 식물 또는 그 식물로부터 상기한 수순으로 육성 또는 생산된 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하여 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하면, 왕고들빼기속 식물의 효율적인 F1 종자의 생산이 가능해진다. 교배 방법은 특별하지 않고, 화분친 계통의 화분이 종자친의 암술에 수분되면 충분하데, 예를 들면 풍매, 충매(예를 들면 특허 문헌 20)에 의한 수분이나, 사람 손에 의해 화분친 계통의 화분을 종자친의 암술에 부착시키는 인공 교배 등의 통상의 방법을 적용할 수 있다. 채종방법은 채종하는 지역, 시설에 적합한 경제적인 것을 선택하는 것이 바람직하다.

상기한 과정으로 상추 F1 품종을 생산하면, 우량 형질을 가진 상추 품종의 신속한 육종이 가능해지고, 생산물의 균일성이나 환경 적응성 등이 우수한 시장성이 높은 상추 품종의 생산이 가능해진다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(1) 원형질체의 제조

(ⅰ) 상추 원형질체의 단리

본 실시예에서는, 상추 품종 ‘텔 미’(사카타노타네)를 사용한 예를 나타냈다. 멸균한 종자를 자당 10g/l, 한천 8g/l를 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 20℃, 16시간 조명 하에서 1개월간 배양하였다. 전개한 본잎을 약 1g 채취하고, 약 2㎜의 크기로 잘게 썬 후에, 0.4% 메이셀라제, 0.08% 마세로자임 R-10, 만니톨을 포함하는 CPW염 용액 10ml에 침지하고, 25℃, 16시간 정치하였다.

원형질체의 현탁액을 92㎛의 나일론 메쉬로 여과하였다. 원형질체 현탁액을 500rpm으로 3분간 원심 분리한 후, 상징액을 제거하여 15mM의 요오드아세트아미드를 포함하는 S액 2ml를 첨가하여 현탁하고, 25℃에서 5분간 정치하였다. 요오드아세트아미드 처리한 원형질체를 300rpm으로 3분간 원심 분리한 후, 상징액을 제거하여 S액 10ml에 현탁하여 세정하였다. S액에 의한 세정은 3회 반복하였다. 300rpm으로 3분간 원심 분리하여 상징액을 제거하고, 20%의 자당을 포함한 CPW염 용액을 첨가하여 현탁하고 최종 9.5ml로 맞춘 다음, 그 위에 S액 0.5ml를 얹어 1000rpm, 5분간 원심 분리하였다.

정제된 원형질체는 상층의 S액층 중에 부상하기 때문에 파스퇴르 피펫으로 빨아들여 원심분리용 튜브에 넣고, 2ml의 S액을 첨가하여 현탁하였다. 현탁액을 소량 취하여 혈구 계산판을 이용하여 원형질체의 밀도를 구한 다음, S액을 첨가하여 현탁액내의 원형질체를 1×10⁶개/ml로 제조하였다.

(ⅱ) 해바라기의 원형질체의 단리

본 실시예에서는, 절화 해바라기의 재배 품종 ‘노조미(Nozomi)'(사카타노타네)(해바라기 특이적인 orf522, orf873 유전자를 가짐)와 절화 해바라기 육종 계통 ‘IB5’(해바라기 특이적인 orf873 유전자를 가지지만 orf522는 갖지 않음)를 사용한 예를 나타냈다. 멸균한 종자를 자당 10g/l, 한천 8g/l를 첨가한 MS 배지에 플레이팅하고, 25℃ 암소에서 7일간 배양하였다. 50㎜ 전후로 신장한 하배축을 길이 1㎝로 절단하고, 다시 종(배축의 신장 방향)으로 2등분하였다. 10개의 하배축으로부터 만들어진 절단물은 0.5% 셀룰라아제 오노즈카 R-10, 0.1% 마세로자임 R-10을 포함하는 S액 10ml에 침지하고, 16시간 정치하였다.

원형질체의 현탁액을 92㎛의 나일론 메쉬로 여과하였다. 원심분리용 튜브에 17%의 자당을 포함한 CPW염 용액을 2ml를 넣고, 그 위에 여과한 원형질체 현탁액을 얹어 1200rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 원심분리를 하면 원형질체들이 하나의 밴드속에 모이게 되는데, 원형질체를 빨아들이지 않도록 이 밴드의 상층의 액을 조심스럽게 제거한다. 원형질체들은 17%의 자당을 포함한 CPW염 용액을 첨가하여 현탁한 다음, 최종 9.5ml로 부피를 맞추었다. 그 위에 S액 0.5ml를 얹고, 1200rpm으로 5분간 원심 분리하였다.

상층의 S액층으로 이동한 원형질체들은 파스퇴르 피펫으로 빨아들이고, 플라스틱 샬레에 옮겨 연질 X선을 0.5Gy 조사하였다. 연질 X선을 조사한 원형질체 현탁액은 원심분리용 튜브에 옮긴 다음, 17%의 자당을 포함한 CPW염 용액을 첨가하여 최종 9.5ml 부피로 맞추었다. 그 위에 S액 0.5ml를 얹어 1200rpm으로 5분간 원심 분리하였다. S액층으로 이동한 원형질체들을 원심분리용 튜브에 옮기고, S액을 첨가하여 10ml로 하여 현탁하였다. 이 현탁액을 소량 취하여 혈구 계산판으로 원형질체의 밀도를 구하고, S액을 첨가하여 원형질체의 밀도가 3×10⁶개/ml가 되도록 제조하였다.

(2) 원형질체의 융합 처리

요오드아세트아미드 처리한 상추 원형질체 현탁액과 연질 X선 조사한 해바라기 원형질체 현탁액을 등량 혼합하고, 9㎝ 샬레의 저면 중앙에 혼합액을 2ml 적하하였다. 30분간 정치 후, PEG 용액(PEG3350 300g/l, CaCl₂·2H₂O 1,500㎎/l, KH₂PO₄ 100㎎/l, pH 5.5) 3ml를 원형질체 혼합액의 주변에 적하하였다.

1분 후에 CPW염 용액 3.5ml를 원형질체 혼합액의 주변에 적하하였다. 2분 후에 다시 CPW염 용액 3.5ml를 원형질체 혼합액의 주변에 적하하였다. 5분 후 샬레의 가장자리로부터 적하한 액을 가만히 빨아올려 제거하고, CPW염 용액 20ml를 샬레의 가장자리로부터 첨가하였다. CPW염 용액으로의 이러한 세정은 5분 간격으로 3회 반복하였다.

(3) 융합 잡종 세포의 배양

세정액을 제거 후, 숙신산이나트륨육수화물(NaOOCH₂CH₂COONa.6H₂O) 2.7g/l, 카자미노산 1.0g/l, NAA 1.0㎎/l, BA 0.3㎎/l, 0.3M 자당을 포함하고, 질산암모늄(NH₄NO₃₎를 200㎎/l를 첨가한 1/2 농도의 MS 배지(이하, 상추 원형질체 배양용 배지라고 함) 10ml(pH 5.8)를 첨가하고, 25℃ 암소에서 배양하였다.

배양 개시로부터 3일 후, 4배 농도의 상추 원형질체 배양용 배지(0.3M 자당 농도) 5ml와 0.3M 자당 용액(0.6% 젤란검 포함, pH5.8) 5ml를 혼합한 반고체 겔 상태의 배지에서 배양을 계속하였다.

배양 개시 10일 후에, 융합 잡종 세포가 포함된 배지 10ml를 겔은 자당 농도가 0.15M으로 맞추어진 10ml의 상추 원형질체 배양용 배지로 옮겼다. 마이크로 캘러스를 육안으로 확인할 수 있는 배양 개시 20일 후에는, 캘러스들을 1.0% 자당, 0.3% 젤란검을 포함한 상추 원형질체 배양용 배지(고체 배지, pH 5.8)에 이식하였다.

(4) 마이크로 캘러스로부터의 식물체의 재생

배양 개시 30일 후, 마이크로 캘러스가 2㎜ 정도의 크기로 되었을 때에, NAA 0.1㎎/l, BA 0.3㎎/l, 1.0% 자당, 0.8% 한천을 포함하는 MS 배지(pH 5.8)에 이식하였다.

배양 개시 40∼60일 후, 캘러스로부터 재분화한 슈트를 1.0% 자당, 0.8% 한천이 포함된 1/2 MS 배지(pH 5.8)로 이식하고 발근시켜 세포질 잡종 식물로 재분화시켰다.

세포질 잡종 식물은 질석에 이식하여 온실 내에서 순화, 재배하였다.

(5) 해바라기에 특이적인 미토콘드리아 유전자를 가지는 세포질 잡종 식물의 선별

세포질 잡종 식물의 잎으로부터 공지의 방법(Jhingan, A. K. (1992), Methods in molecular and cellularbiology 3:15-22)으로 전체 DNA를 추출하였다.

PCR으로 해바라기 특이적인 DNA를 검출하기 위해서 공지의 염기 서열 정보(Gene Bank 등록 번호 Z23237, X62592)로부터 orf522, orf873 유전자에 특이적인 프라이머를 설계하였다(표 3). 추출한 전체 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 orf522-F와 orf522-R, 프라이머 orf873-F와 orf873-R의 조합을 이용하여 PCR을 행하였다. PCR은 열 변성 94℃ 1분, 프라이머 부착(어닐링) 60℃ 2분, 신장 반응 72℃ 2분을 35사이클 반복하였다. PCR 산물은 1.8% 아가로오스 겔에서 전기 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액에 침지 후, UV 조사 하에서 사진 촬영을 행하여 예상되는 크기(209bp, 798bp)의 밴드의 유무를 확인하였다.

목적 DNA 단편의 특이적인 증폭을 확인하기 위해서 세포질 웅성 불임 해바라기 2계통과 웅성 가임 해바라기 1계통(육종 계통 ‘OS06’), 표 4에 나타낸 상추의 재배 품종 13품종으로부터 DNA를 추출한 다음, 해바라기 미토콘드리아 유전자 orf522 및 orf873에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 하고, 그 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1은, 시험 재료에 이용한 세포질 웅성 불임 해바라기 2계통(레인 1, 2)과 웅성 가임 해바라기 1계통(레인 3), 상추의 재배 품종 13품종(레인 4∼16)으로부터 DNA를 추출하고, 해바라기 미토콘드리아 유전자 orf522에 특이적인 프라이머(상단그림) 및 orf873에 특이적인 프라이머(하단그림)를 이용하여 PCR을 행한 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다(도 1중의 부호 설명:M:분자량 마커, 1:노조미, 2:IB5, 3:OS06, 4:텔 미, 5:스테디, 6:로직, 7:미야, 8:V 레터스(V lettuce), 9:산타나스(Santanasu), 10:시리우스(Sirius), 11:아스레(Asure), 12:브루투스(Brutus) 7호, 13:스파크(Spark), 14:산토스(Santos) 2호, 15:데제로(Dejero), 16:서더(Souther)). 도 1로부터 분명한 바와 같이 해바라기 재배 품종 ‘노조미’의 경우에는 orf522(209bp)와 orf873(798bp)의 밴드가 검출되었고, 해바라기 육종 계통‘IB5’에서는 orf873(798bp)의 밴드가 검출되었다. 한편, 시험한 상추 13품종 모두에서는 어느 밴드도 검출되지 않았으므로, 상추의 DNA에서는 orf522에 특이적인 프라이머와 orf873에 특이적인 프라이머로 PCR을 행한 경우 특이적인 DNA가 증폭되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 근거로 하면, 비대칭 원형질체 융합에 의해 얻어진 식물체로부터 DNA를 추출하여 PCR을 행할 경우, 해바라기에 특이적인 미토콘드리아 유전자를 가진 세포질 잡종 식물을 선별하는 것이 가능해졌다.

도 2에는, 본 실시예에서 얻어진 세포질 잡종 식물을 검정한 결과의 일례를 나타냈다. 도 2는 해바라기 미토콘드리아 유전자 orf522 및 orf873에 특이적인 프라이머를 이용하여 세포질 잡종 식물의 검정을 행한 결과의 일례를 나타내는 전기 영동 사진이다(도 2 중의 부호 설명:M:분자량 마커, 1:노조미, 2∼7:세포질 공여 재료로서 ‘노조미’를 사용하여 생산한 세포질 잡종 식물, 8:IB5, 9∼14:세포질 공여 재료로서‘IB5’를 사용하여 생산한 세포질 잡종 식물). 세포질 공여 재료로 2종류의 해바라기 품종(노조미’와 ‘IB5')을 사용하였을 경우, 2개의 해바라기 품종 모두에서 세포질 잡종 식물을 생산이 가능했다.

도 2의 레인 3, 5에서와 같이, orf522가 도입되어 있음에도 불구하고 orf873의 밴드가 없는 개체가 확인되었는데, 이들은 미토콘드리아에서 재조합이 발생한 결과라고 생각된다.

프라이머의 특이성 검정에 사용한 가임 상추 품종

No.	품종명	웅성 가임성	판매원
1	텔 미	가임	가부시키가이샤 사카타노타네
2	스테디	가임	츠루타종묘(주)
3	로직	가임	요코하마식목(주)
4	미야	가임	스미카농업자재(주)
5	V 레터스	가임	카네코종묘(주)
6	산타나스	가임	가부시키가이샤 사카타노타네
7	시리우스	가임	가부시키가이샤 사카타노타네
8	아스레	가임	스미카농업자재(주)
9	브루투스 7호	가임	요코하마식목(주)
10	스파크	가임	와타나베농사(주)
11	산토스 2호	가임	(주)후지이씨드
12	데제로	가임	스미카농업자재(주)
13	서더	가임	타키이종묘(주)

PCR-RFLP법에 의해 엽록체의 유래를 추정하기 위해서 공지의 염기 서열 정보(Gene Bank 등록 번호 L13929)로부터 해바라기 엽록체의 rbcL 유전자에 특이적인 프라이머를 설계하였다(표 3). PCR 은 추출한 전체 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 rbcL-F, 프라이머 rbcL-R의 조합을 이용하여 수행하였다. PCR은, 열 변성 94℃ 1분, 프라이머 부착(어닐링) 60℃ 2분, 신장 반응 72℃ 2분을 35사이클 반복하였다. PCR 산물은 제한 효소 TaqI로 절단하고, 1.8% 아가로오스 겔로 전기 영동 후, 에티듐 브로마이드 용액에 침지하고, UV 조사 하에서 사진 촬영을 행하여 밴드의 절단 양상을 확인하였다. rbcL 유전자는 해바라기와 상추에서 상동성이 높고, 동일한 사이즈의 밴드가 증폭되기 때문에 PCR 산물을 제한 효소 TaqI로 절단하여야 한다. 엽록체의 기원의 추정은 제한 효소의 인식부위의 차이를 구분하는 RFLP를 통해 가능해졌다. 도 3은 시험 재료에 이용한 세포질 웅성 불임 해바라기 2계통(레인 1, 2)과 웅성 가임 해바라기 1계통(레인 3), 상추의 재배 품종 13품종(레인 4∼16)으로부터 DNA를 추출하고, 엽록체 유전자 rbcL에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 후, 그 증폭 산물을 TaqI로 절단하였을 때의 PCR-RFLP 패턴을 나타내는 전기 영동 사진이다(도 3 중의 부호의 설명:M:분자량 마커, 1:노조미, 2:IB5, 3:OS06, 4:텔 미, 5:스테디, 6:로직, 7:미야, 8:V 레터스, 9:산타나스, 10:시리우스, 11:아스레, 12:브루투스 7호, 13:스파크, 14:산토스 2호, 15:데제로, 16:서더). 도 3에 나타낸 바와 같이, 상추에서는 TaqI의 제한 효소 부위가 존재하지 않기 때문에 1096bp의 사이즈의 밴드가 1개 검출되는 것에 비해, 해바라기에서는 taqI의 제한 효소 부위가 존재하기 때문에 311bp와 785bp의 2개의 밴드가 검출된다. 따라서 용이하게 엽록체의 유래를 식별하는 것이 가능하였다. 이 결과를 보면, 비대칭 세포 융합에 의해 얻어진 식물체의 DNA를 추출한 후, PCR-RFLP를 행함으로써 상추 엽록체를 가지는 세포질 잡종 식물을 선별하는 것이 가능함을 알 수 있다.

(6) 세포질 웅성 불임 식물의 선별

상추 유래의 핵 유전자와 도입된 해바라기 유래의 미토콘드리아 유전자의 불화합성으로 인하여, 다수의 세포질 잡종 식물은 형태적인 기형을 나타내는 개체가 많이 나타나는데, 그와 같은 형태적 기형 개체들은 제거하였다. 미토콘드리아는 세포 융합에 의해 고빈도로 재조합이나 게놈의 재배열이 일어나기 때문에 재분화된 각 개체마다 형태적인 차이가 관찰되었다. 특히 화기는 불화합성에 의해 형태적인 이상을 일으키기 쉽기 때문에, 다수의 세포질 잡종 식물이 웅성 불임 형질을 갖고 그 외의 형태가 정상인 우량 계통으로 생산, 선발되었다. 일반적으로 상추는 수술선숙이므로, 암술이 꽃밥통 중을 신장하는 과정에서 수분하기 때문에 개화시에 도 4에 나타내는 바와 같이 암술에 화분이 다량으로 부착된다. 이 때문에 상추에서는 자가수분 비율이 매우 높다. 본 발명에서 선발한 가장 유망하다고 생각되는 세포질 웅성 불임 계통(이하 ‘1216-2’라고 기술함(해바라기‘IB5’유래))은, 도 5에 나타내는 바와 같이 암술에 화분의 부착이 전혀 보이지 않고, 꽃밥통 중에도 화분의 흔적이 보이지 않았다. 또한, 화기나 그 외 기관의 형태에 있어서 명확한 차이는 발견되지 않았으며, 염색체 수는 2n=18으로 통상의 상추와 동일한 것으로 확인되었다(도 6).

선발한 세포질 웅성 불임 계통 ‘1216-2’에 정상 세포질을 가진 상추의 화분을 교배하면 도 7에 나타내는 바와 같이 정상적으로 결실하고 종자가 얻어진다. 이것으로 이 계통내에 자성 가임성이 유지되는 것을 확인하였다.

또한, ‘1216-2’에 웅성 가임성의 상추의 화분을 교배하여 얻은 후대의 식물들은 모두 웅성 불임성을 나타낸다. 이것으로 웅성 불임성이 세포질에 기인하고, 세포질 유전하고 있는 것을 확인하였다.

도 8은‘1216-2’를 ‘텔 미’에 2회 역교잡한 BC3 세대(1216-2-T1-1∼14) 14개체를 사용하여, 해바라기 미토콘드리아 유전자 orf873을 특이적으로 증폭하는 프라이머로 PCR한 결과를 보여준다(도 8 중의 부호의 설명:M:분자량 마커, S:IB5, L:텔 미, 1∼14:세포질 웅성 불임 상추 BC3 14개체(1216-2-T1-1∼14)). 모든 개체가 orf873을 가지고 있는데, 이 결과는 상추에서 해바라기의 미토콘드리아 유전자가 안정적으로 유전하는 것을 의미한다.

또한, 공지의 해바라기, 상추의 미토콘드리아 유전자의 염기 서열 정보(Gene Bank 등록 번호 X82387, X62341, X98362, AF319170, X73425, X87209)에 기초하여 표 3에 나타내는 프라이머를 설계하고, 그 외의 미토콘드리아 유전자에 대해서도 PCR 및 PCR-RFLP법을 이용하여 분석하였다. rps3는 trnN과 trnY의 유전자 사이의 영역(이하, trnN-trnY라고 기술함)와 trnS와 trnP의 유전자 사이의 영역(이하, trnS-trnP라고 기술함)에 존재하는 미토콘드리아 유전자인데, 이것을 증폭한 PCR산물의 차이로 유전자형을 구분하였다. 또, 미토콘드리아 유전자 atp6, coxII, cob는 PCR-RFLP법, 즉 PCR 증폭 산물을 제한 효소로 절단하고, 절단 패턴의 차이로 유전자형을 식별하는 방법으로 분석하였다. 또한 엽록체 유전자 rbcL도 PCR-RFLP법으로 분석하였다. 도 9는 PCR 및 PCR-RFLP의 결과를 보여주는 전기 영동 사진이다(도 9 중의 부호의 설명:M:분자량 마커, S:IB5, L:텔 미, 1∼14:세포질 웅성 불임 상추 BC3 14개체(1216-2-T1-1∼14)). 그 결과는 표 5에 요약되어 있다.

이 결과는 미토콘드리아 유전자 atp6는 해바라기형이었으나, 분석한 그 외의 미토콘드리아 유전자들은 모두 상추형임을 의미한다. 도 10은 세포질 웅성 불임 상추의 BC3 세대 14개체의 잎으로부터 DNA를 추출한 다음, 엽록체 유전자 rbcL에 특이적인 프라이머로 PCR을 행하고, 그 PCR 증폭 산물을 제한 효소로 절단한 PCR-RFLP의 결과를 나타내는 전기 영동 사진이다(도 10 중의 부호의 설명:M:분자량 마커, S:IB5, L:텔 미, 1∼14:세포질 웅성 불임 상추 BC3 14개체(1216-2-T1-1∼14)). 도 10에 나타낸 PCR-RFLP의 결과를 보면 엽록체 유전자 rbcL도 모두 상추형임을 알 수 있다. 즉, 본 발명에서 생산한 세포질 웅성 불임 상추에는 해바라기의 미토콘드리아 유전자의 일부만이 유입되었고, 엽록체는 상추에서 유래된 것을 알 수 있다. 또한, 시험에 사용한 후대 14개체에서 모두 동일한 밴드 패턴을 나타낸 점을 볼 때, 미토콘드리아 게놈이 후대에서 안정되어 있다고 생각되었다. 단, 도 9, 도 10 및 표 5의 결과는 세포질 웅성 불임성을 발현하는 개체의 분석 결과를 일례로 나타낸 것으로, 세포질 웅성 불임 상추가 반드시 동일한 밴드 패턴을 나타낸다고는 할 수 없다.

이상의 결과를 보면, 비대칭 세포 융합에 의해 해바라기의 일부 미토콘드리아 DNA를 도입하여 세포질 웅성 불임 상추를 생산할 수 있는 것이 분명해졌다.

지금까지의 세포질의 분석의 결과를 보면, 웅성 불임성은 웅성 불임성을 유발하는 미토콘드리아 유전자의 재조합, 미토콘드리아 게놈의 재배열 등에 의해 유발된 것으로 생각되었다.

즉, 본 발명에 의해 개발된 세포질 잡종 상추는 미토콘드리아 게놈이 고도로 재조합된 세포질 웅성 불임 상추인데, 이것은 미토콘드리아 게놈의 변이로 의해 세포질 웅성 불임 형질을 가지며, 동시에 상추의 핵 게놈과 친화성이 높은 미토콘드리아 게놈을 갖는 것을 알 수 있다.

(7) 세포질 웅성 불임 식물의 이용과 F1 종자의 생산

‘1216-2’에 ‘텔 미’를 교배하여 얻은 후대의 ‘1216-2-T1’과 같은 세포질 웅성 불임 상추는 시판중인 상추 고정종 5품종‘텔 미’(사카타노타네), ‘스테디’(츠루타종묘(주)),‘로직’(요코하마식목(주)),‘미야’(스미카농업자재(주)),‘V 레터스’(카네코종묘(주))을 화분친으로 사용하여 교배한 후 F1 종자를 채종하였다.

F1 종자를 플러그 트레이에 파종하여 육묘한 후, 10호 화분에 정식하고, 온실 내에서 통상의 재배를 행하여 특성을 조사하였다. 1계통·품종당 3그루를 사용하였는데, 모든 계통·품종이 정상적으로 생육하였다. 각 계통·품종의 웅성 불임성의 조사에는 1그루당 10꽃을 사용하였고, 실체 현미경을 이용하여 상세한 관찰을 행하였다. 꽃잎의 색, 화기의 형태는 개화 중에 순차적으로 관찰하고, 개화 후에는 자식 종자의 유무도 조사하였다. 그 조사 결과를 표 6에 나타냈다. ‘1216-2-T1’과 상기 고정종 5품종 사이에서 만들어진 F1 품종들은 모든 개체에서 100%의 웅성 불임성을 나타냈다. 또한, 도 11∼14에 나타낸 바와 같이, ‘텔 미’ 이외의 상추 재배 품종을 교배한 경우에도 자가수분에 의해 암술에 부착된 화분은 전혀 관찰되지 않았고, 꽃밥(수술)에서도 화분이 관찰되지 않았다. 또한, 도 15에 나타낸 바와 같이 상추 야생종 엘. 세리올라의 화분을 교배한 교잡 후대를 자가수분한 경우에도 꽃밥에 부착된 화분은 관찰할 수 없었다.

이 결과는 이 웅성불임성이 핵 유전자가 ‘텔 미’ 이외의 유전자형으로 변화하여도 화분이 생성하지 않은 상태로 유지되며, 세포질로부터 기인하는 것을 뒷받침한다. 따라서 본 발명에 의해 생산한 세포질 잡종 식물은 안정적인 세포질 웅성 불임성을 나타내는 것이 증명되었다.

또한, 화분을 생성하지 않는 세포질 웅성 불임 계통의 자성 가임성을 조사하기 위해서 F1 채종하였을 때와 동일한 품종의 화분을 교배하여 조사하였다. 계통당 10꽃을 조사하고, 꽃당 10개 이상의 종자를 형성하는 능력을 가지는 계통·품종을 자성 가임성 ‘유’로 하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이 세포질 웅성 불임 계통 모두는 유전자형의 차이에 관계없이 모두 자성 가임성을 가지고 있었는데, 본 발명에 의해 생산된 본 세포질 웅성 불임 상추는 효율적인 F1 종자의 생산에 이용될 수 있다는 것을 확인하였다.

상추 시험 품종과 세포질 웅성 불임 상추 BC3 ‘1216-2-T1’사이의 F1 식물체들의 화기의 특성 조사

계통·품종명	화분 생성률(%)	꽃잎 색	화기 이상	자식 종자	자성 가임성
텔 미	100	황	무	유	유
스테디	100	황	무	유	유
로직	100	황	무	유	유
미야	100	황	무	유	유
V 레터스	100	황	무	유	유
1216-2-T1×텔 미	0	황	무	무	유
1216-2-T1×스테디	0	황	무	무	유
1216-2-T1×로직	0	황	무	무	유
1216-2-T1×미야	0	황	무	무	유
1216-2-T1×V 레터스	0	황	무	무	유
화분 생성률:화분 생성 꽃 수/조사 꽃 수

‘1216-2’에 ‘텔 미’를 교배하여 얻은 후대의 ‘1216-2-T1’의 종자는 2005년 9월 29일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1츄오 다이6)에 국제 기탁되어 있다(기탁자가 붙인 식별을 위한 표시 SSC-LET-05-001, 수탁 번호 FERM BP-10421).

실시예 2

세포질 웅성 불임성의 세포질 잡종‘50125-3’는 ‘1216-2-T1’을 세포질 공여 소재로서 사용하고,‘V 레터스’(카네코종묘(주))와의 비대칭 세포 융합을 하여 생산되었다.‘50125-3’의 꽃에서는 암술에 부착된 화분이 전혀 보이지 않고, 꽃밥에서도 화분이 관찰되지 않았다. 또한,‘V 레터스’와 비교할 때, 화기 등의 형태에서 명확한 차이는 발견되지 않았다. 선발한 세포질 웅성 불임 계통 ‘50125-3’에 정상 세포질을 가진 상추의 화분을 교배하면, 정상적으로 결실하고, 종자가 얻어진 점으로부터 계통에 자성 가임성이 유지되는 것을 확인하였다. 또한, ‘50125-3’에 웅성 가임 상추의 화분을 교배하여 얻은 후대의 식물이 모두 웅성 불임성을 가졌다. 이러한 결과로부터 이 웅성 불임성이 세포질에 기인하고, 세포질 유전을 한다는 것을 확인하였다.

표 7은‘50125-3’에 ‘V 레터스’를 교배하여 얻은 10개의 후대개체(50125-3-V1-1∼10)의 PCR 및 PCR-RFLP법에 의한 미토콘드리아 유전자의 분석 결과를 보여주고 있다. 세포질 공여 소재로서 이용된 ‘1216-2-T1’에 비하여, 예를 들면, ‘50125-3-V1-1∼10’개체들이 해바라기형과 상추형의 양쪽의 atp6 유전자를 유지하고 있는 것도 관찰할 수 있었다.

단, 표 7의 결과는 세포질 웅성 불임성을 발현하는 개체의 분석 결과의 일례를 나타낸 것으로, 세포질 웅성 불임 상추가 반드시 이와 같은 밴드 패턴만을 나타낸다고는 할 수 없다.

‘50125-3’에 ‘V 레터스’를 교배하여 얻은 후대의 ‘50125-3-V1’의 종자는 2006년 7월 31일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1츄오 다이6)에 국제 기탁되어 있다(기탁자가 붙인 식별을 위한 표시 SSC-LET-06-001, 수탁 번호 FERM BP-10647).

본 발명에 의해 해바라기로부터 유래한 세포질을 가지는 세포질 잡종 상추가 제공된다.

본 발명에 의한 세포질 잡종 상추가 세포질 웅성 불임인 경우에는 본 상추를 종자친으로서 이용하면, 유전자 웅성 불임 식물을 상업적인 F1 종자의 생산에 이용하는 경우와는 달리, 효율적이고 순도가 높은 F1 종자의 채종이 가능해진다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Cytoplasmic hybrid plant belonging to genus Lactuca and method for producing the same <120> Sakata seed corporation <130> PH-2882-PCT <150> JP 2005-311598 <151> 2005-10-26 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 cgtccttgcg tgagggtttg 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 2 tgagtaccgt tctctcacga gttg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 gctactcgga cgaaaactag gaac 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 cccaacttca cgcggaacag 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 5 tcaacctgga gttccgcctg aag 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 gtgccctaaa gttcctccac cgaa 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 gctaactctc agtttggtcc tac 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 8 ccagaccggt taatgcaaga 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 9 ctggcttacc ggtaatctcc aa 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 10 cttgcaagtt tccccgcaaa 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 11 tcttctccac actgaatcag ca 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 12 agaatgggcg ttatggcaaa g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 13 ggaaatccga tttcggtaag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 14 agggtccttt taagtggatg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 15 gagcggtcgg ctgttaactg 20 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 16 cagatttaca gtctgtcgct tttaacc 27 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 17 ggcattggtt tgctaaatcg acatac 26 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 18 acctatggcc ctctgtaccc 20

Claims

해바라기(Helianthus)속 식물 유래의 원형질체와 락투카(Lactuca)속 식물 유래의 원형질체를 세포 융합하고, 이어서 융합 세포를 배양하고, 배양된 융합 세포로부터 식물체를 재생하는 것을 특징으로 하는 세포질 잡종(Cybrid) 왕고들빼기속 식물의 생산 방법.
제1항에 있어서, 해바라기속 식물 유래의 원형질체가 에이치. 안누스 엘.(해바라기;H. annuus L.)에서 유래된 원형질체이거나, 또는 에이치. 페티올라리스(H. petiolaris), 에이치. 아르고필루스(H. argophyllus), 에이치. 데빌리스(H. debilis), 에이치. 데카페탈루스(H. decapetalus), 에이치. 기간테우스(H. giganteus), 에이치. 리지두스(H. rigidus), 에이치. 살리시폴리우스(H. salicifolius), 에이치. 아노말루스(H. anomalus), 에이치. 볼란데리(H. bolanderi), 에이치. 엑실리스(H. exilis), 에이치. 막시밀리아니(H. maximiliani), 에이치. 네글렉투스(H. neglectus), 에이치. 프래콕스(H. praecox) 또는 에이치. 투베로수스(H. tuberosus)의 세포질을 갖는 해바라기(에이치. 안누스 엘.)의 세포질 치환 계통에서 유래된 원형질체인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 왕고들빼기속 유래의 원형질체가 락투카 사티바 엘.(상추;Lactuca sativa L.), 엘. 세리올라(L. serriola), 엘. 아큘레아테(L. aculeate), 엘. 스카리올로이데스(L. scarioloides), 엘. 아제르바이자니카(L. azerbaijanica), 엘. 게오르기카(L. georgica), 엘. 드레게아나(L. dregeana), 엘. 알타이카(L. altaica), 엘. 살리그나(L. saligna), 엘. 비로사(L. virosa), 엘. 타타리카(L. tatarica), 엘. 인디카(L. indica), 혹은 엘. 데빌리스(L. debilis), 또는 그들의 종간 교잡 식물에서 유래된 원형질체인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 해바라기속 식물이 세포질 웅성 불임성을 갖는 것인 방법.
제4항에 있어서, 해바라기속 식물이 미토콘드리아에 웅성 불임 유전자를 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물이 세포질 웅성 불임성을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 생산된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제7항에 있어서, 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부가, 그 식물체의 세포 또는 세포질을 포함하는 것인, 세포질 잡종 왕고들빼기 속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부.
해바라기속 식물의 미토콘드리아에서 유래된 유전자를 세포질 내에 가지는 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제9항에 있어서, 해바라기속 식물이 에이치. 안누스 엘.이거나, 또는 에이치. 페티올라리스, 에이치. 아르고필루스, 에이치. 데빌리스, 에이치. 데카페탈루스, 에이치. 기간테우스, 에이치. 리지두스, 에이치. 살리시폴리우스, 에이치. 아노말루스, 에이치. 볼란데리, 에이치. 엑실리스, 에이치. 막시밀리아니, 에이치. 네글렉투스, 에이치. 프래콕스 또는 에이치. 투베로수스의 세포질을 갖는 에이치. 안누스 엘.의 세포질 치환 계통인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제9항 또는 제10항에 있어서, 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물이 락투카 사티바 엘., 엘. 세리올라, 엘. 아큘레아테, 엘. 스카리올로이데스, 엘. 아제르바이자니카, 엘. 게오르기카, 엘. 드레게아나, 엘. 알타이카, 엘. 살리그나, 엘. 비로사, 엘. 타타리카, 엘. 인디카 혹는 엘. 데빌리스, 또는 이들의 종간 교잡 식물에서 유래된 것인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 해바라기속 식물의 미토콘드리 아에서 유래된 유전자가 웅성 불임 유전자인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 웅성 불임성을 가지는 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부가, 그 식물체의 세포 또는 세포질을 포함하는 것인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부.
수탁 번호 FERM BP-10421인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물의 종자, 그 종자로부터 생육시킨 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제15항에 있어서, 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부가, 그 식물체의 세포 또는 세포질을 포함하는 것인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부.
수탁 번호 FERM BP-10647인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물의 종자, 그 종자로부터 생육시킨 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물, 그 후대, 또는 그들의 식물체의 일부.
제17항에 있어서, 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부가, 그 식물체의 세포 또는 세포질을 포함하는 것인 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대의 식물체의 일부.
제6항의 방법에 의해 생산된 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 생산 방법.
제13항의 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 생산 방법.
제15항의 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 생산 방법.
제17항의 세포질 잡종 왕고들빼기속 식물 또는 그 후대를 종자친으로 하고, 그 식물과 교배 가능한 왕고들빼기속 식물을 화분친으로 하여 교배하고, 교배 후의 종자친으로부터 잡종 제1대 종자를 채종하는 것을 포함하는, 잡종 제1대 종자의 생산 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 잡종 제1대 종자 또는 그 종자로부터 생육시킨 잡종 제1대 식물.