DE69507146T3

DE69507146T3 - Zytoplasmische männliche-sterile Pflanzenzelle der Compositae Familie und Verfahren zur Herstellung der Pflanze

Info

Publication number: DE69507146T3
Application number: DE69507146T
Authority: DE
Inventors: Nanne M. Faber; Joep J.M. Lambalk; Margret G. Nootebos; Monique A.C.M. Zaal
Original assignee: Enza Zaden Beheer BV
Current assignee: Enza Zaden Beheer BV
Priority date: 1995-11-02
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2015-11-03
Also published as: DE69507146T2; EP0771523A1; EP0771523B2; EP0771523B1; ES2131760T3; DE69507146D1; ES2131760T5

Description

Die Erfindung betrifft eine Gemüsepflanze mit cytoplasmatischer Pollensterilität der Familie Compositae gemäß dem Hauptanspruch, d.h. die Entwicklung neuer Elternlinien einer solchen Pflanze in der Familie. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Gewinnen der vorstehend genannten Pflanze mit cytoplasmatischer Pollensterilität.
In der Pflanzenzüchterwelt ist es üblich, Erbeigenschaften zweier Elternlinien in der Hybride durch Kreuzen zu kombinieren. Wenn die zwei Elternlinien selbstbestäubend sind, wird Selbstbestäubung verhindert, z. B. durch Entfernen der Antheren (sogenanntes Emaskulieren), um zu gewährleisten, daß die erwünschten Erbeigenschaften beider Eltern in der Hybride vorhanden sind. Eine solche Hybride wird auch als F1-Hybride bezeichnet und ist von großer Bedeutung in der Welt der Pflanzenzüchter. F1-Hybride sind allgemein gekennzeichnet durch ein hohes Maß an Uniformität (Farbe, Geschmack, Größe und dergleichen), eine hohe Vitalität und eine hohe Ausbeute an Pflanzenteilen, wie Früchten und dergleichen, die verwertet werden können. Ein zusätzlicher Vorteil einer F1-Hybride, insbesondere für Pflanzenzuchtbetriebe, ist darüber hinaus die Tatsache, daß es nicht möglich ist, Produkte der gleichen Qualität durch Nachkommen von der davon erhaltenen Saat aufzuziehen (größere Heterogenität und geringere Ausbeute), so daß sich der Betrieb eines inhärenten Schutzes seiner F1-Hybride sicher ist, wie sie war. Mit Gemüsepflanzen der Familie Compositae ist die Entwicklung von Elternlinien und die kommerzielle Produktion reiner F1-Hybridsamen sehr problematisch, da diese Gemüsepflanzen im allgemeinen selbstbestäubend sind und die gegen Selbstbestäubung gerichteten Maßnahmen, die bisher verwendet worden sind, nicht nur zeitintensiv und arbeitsintensiv sind, sondern darüber hinaus auch nicht in ausreichender Weise genau zu sein scheinen. Entsprechend führt diese letztere Tatsache zu Samenchargen von fehlender einheitlicher Qualität.
Zum Beispiel ist es nun mit Kohlpflanzen (Brassica oleracea) unter Verwendung moderner Techniken möglich, 100% reine F1-Hybride zu produzieren. Tatsache ist, daß man bei Rettich (Raphanus sativus), der wie Kohl zur Familie der Cruciferae gehört, ein Cytoplasma gefunden hat, das Pollensterilität verursacht und das auch bekannt ist als Ogura-CMS-Cytoplasma. Mitochondrien des Ogura-CMS-Cytoplasmas werden in Brassica oleracea-Pflanzen durch Protoplastenfusion eingeführt, wodurch sowohl der Nukleus als auch die Chloroplasten (Chlo rophyllgranula) von normal fertilen Brassica oleracea-Pflanzen stammen. Somit werden CMS-Brassica oleracea-Pflanzen erhalten. Derzeit sind noch keine F1-Hybride von wichtigen Gemüsepflanzen der Familie der Compositae erhältlich, trotz des großen Bedürfnisses des Marktes. Das vorerwähnte Ogura-CMS-Cytoplasma kann nicht mit Gemüsepflanzen der Familie der Compositae verwendet werden infolge der genetischen Inkompatibilität zwischen Arten der Familien.
Das Ziel der Erfindung ist es, cytoplasmatische Pollensterilität in eine Gemüsepflanze der Familie der Compositae einzuführen und zu diesem Zweck wird das Cytoplasma einer solchen Gemüsepflanze mit Mitochondrien versehen, die DNA umfassen, die wenigstens teilweise von einer anderen Art der Familie der Compositae stammt und die der Träger stabil exprimierter cytoplasmatischer Pollensterilität (CMS) ist, wobei deren Zellen speziesspezifisches Chloroplasten- und Kerngenom umfassen, die für die Gemüsepflanze normal sind. Uberraschenderweise hat die Forschung gezeigt, daß trotz der starken genetischen Inkompatibilität von Pflanzenarten innerhalb der Familie der Compositae die Einführung von CMS in eine Gemüsepflanze der Familie der Compositae von einer Pflanze einer anderen Spezies derselben Familie, durch Protoplastenfusion, sehr wohl möglich ist. Bevorzugterweise ist die Gemüsepflanze phänotypisch cytoplasmatisch pollensteril, d.h. die Pollensterilität (im allgemeinen definiert als die Unfähigkeit einer Pflanze, fertile Pollenkörner zu bilden) hat sich in der Pflanze manifestiert. Infolge der cytoplasmatischen Erblichkeit von CMS weisen alle Nachkommen dieser pollensterilen Pflanze diese unveränderte Eigenschaft auf. Es wird offensichtlich sein, daß die obige Form der erblichen Ubertragung genotypischer CMS von großer Bedeutung für die effiziente Entwicklung von Elternlinien der Gemüsearten und für die nachfolgende Produktion von F1-Hybriden ist. Man nimmt Kenntnis davon, daß die Pflanze nicht notwendigerweise phänotypisch cytoplasmatisch pollensteril sein muß, sondern daß es auch möglich ist, daß der Nukleus sogenannte "Reparaturgene" besitzt, die die Pollensterilität phänotypisch umkehren, d.h. sie daran hindern, sich in der Pflanze trotz der Anwesenheit von DNA im Cytoplasma, die ein Träger von CMS ist, zu manifestieren. In diesem Falle wird es notwendig sein, das Kreuzen fortzusetzen, bis eine Pflanze erhalten wird, die phänotypische CMS besitzt. Da ein Nukleus und Chloroplasten der normalen, fertilen Gemüsepflanze im unveränderten Zustand vorhanden sind (im Falle des Nukleus ist dies gewöhnlicherweise eine diploide Situation), ist das Produkt ein 100% reines Produkt.
Die Publikation in Theor. Appl. Genet. (Band 87, Seiten 347–352 (1993)) mit dem Titel "Male-sterile chicory cybrids obtained by intergeneric protoplast fusion" beschreibt eine landwirtschaftliche Pflanze vom Typ "Cichorium intybus cv Magdebourg", deren Cytoplasma mit Mitochondrien versehen ist, die DNA aufweisen, die von Helianthus annuus (CMS-Typ Petiolaris) stammen. Es wurde jedoch weder eine stabil exprimierbare CMS erhalten noch 100% reine Pflanzen, was das Chloroplasten- und Kerngenom betrifft. Zwei weitere Publikationen von Ramboud et al. (C.R. Acad. Agric. Fr., Band 80(7): 63–67 (1994)) und „Quel avenir pour l'améloriation des plantes?", Ed. Audelf-Uref, John Libeey Eurotext, Paris, Seiten 483–489 (1994) beziehen sich auf denselben fehlgeschlagenen Versuch, Pflanzen mit stabiler Pollensterilität der Familie der Compositae zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die anderen Arten der Familie der Compositae ausgewählt worden aus der Gruppe, die Helianthus spp. und Circium spp. umfaßt. Man hat gefunden, daß diese Pflanzen CMS enthalten. Insbesondere ist Helianthus annuus (L.) (Sonnenblume) mit CMS vom Petiolaris-Typ ausgewählt worden. Uberraschenderweise kann die Einführung von CMS von diesen genotypisch cytoplasmatisch pollensterilen Pflanzen in effizienter Weise mittels Protoplastenfusion erfolgen trotz der genetischen Inkompatibilität. In diesem Zusammenhang ist beachtlich, daß die Übertragung von CMS von den vorerwähnten Pflanzen auf die Gemüsepflanzen, die zur selben Familie gehören, nicht vorgenommen werden kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren infolge Kreuzungsbarrieren.
Entsprechend der Erfindung kann die andere CMS-einführende Art (der "Donor"), der zur Familie der Compositae gehört, auch eine Spezies sein, die nicht CMS enthält, die aber eine sogenannte "alloplasmatische" Form von CMS in der Gemüsepflanze durch Protoplastenfusion induziert. Entsprechend der Erfindung wird eine Spezies dieses Typs bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe, die Chrysanthenum, Senecio, Centaurea, Sonchus, Hieracium, Tagetes Dahlia und Aster umfaßt. Gute Ergebnisse sind entsprechend der Erfindung besonders mit Chrysantenum erhalten worden, insbesondere mit Sonchus.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Gemüsepflanze ausgewählt worden aus der Gruppe, die Cichorium intybus (L.) var. foliosum (Hegi) (Salatzichorie), Cichorium endivie (L.) (Endivie), Lactuca sativa (L.) (Kopfsalat), Scorzonera hispanica (L.) (schwarze Haferwurz), Cynara scolymus (L.) (Artischocke) und Taraxacum officinale (L.) (Löwenzahnsalat) umfaßt. Extensive Experimente haben gezeigt, daß insbesondere Lactuca saliva, aber ganz besonders Cichorium intybus L.) var. foliosum und Cichorium endivia den wesentlichen Vorteil besitzen, daß als ein Ergebnis der Einführung von CMS keine anderen Eigenschaften, die für die Gemüsepflanze charakteristisch sind, verloren gehen.
Allgemeine Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Gewinnen von CMS-Pflanzen, -samen oder Teilen von Gemüsepflanzen, die zur Familie der Compositae gehören, umfassen:

– Isolieren von Protoplasten (Pflanzenzellen, von denen die Zellwand entfernt worden ist) von Geweben verschiedener Gemüsepflanzen, die zur Familie der Compositae gehören, hierin im folgenden als "Akzeptor" bezeichnet, und von Geweben einer anderen Art der Familie der Compositae, z.B. Helianthus species, hierin im folgenden als "Donor" bezeichnet (siehe Beispiel 1);
– Optionale Behandlung der Protoplasten, z. B. mittels Bestrahlung, Cytoplastieren oder spezifischer Chemikalien, was weiter im Verfahren zu einer Erhöhung der Effizienz führt (siehe Beispiel 2);
– Fusionieren von Protoplasten (in vitro Fusion von Zellen), z. B. unter dem Einfluß chemischer Substanzen oder durch Verwenden von Elektrizität (siehe Beispiel 3);
– Optional gefolgt vom Durchführen von (einem) Verfahren, das/die zu einer Form von Selektion von Hybridzellen führt/führen; Zellen, die aus Fusion von (einem) Akzeptor-Protoplasten mit (einem) Donorprotoplast(en) resultieren (siehe Beispiel 4);
– Gefolgt von der Kultivierung von Zellen und ihre Regeneration zu ganzen Pflanzen (siehe Beispiel 5);
– Selektion von Individuen aus der Gruppe der Regeneranten, die solchermaßen erhalten werden, durch Analyse von mitochondrialer, Chloroplasten- und genomischer DNA, gefolgt von phänotypischer Bewertung von Pflanzeneigenschaften (siehe Beispiel 6);
– Spezifisches Kreuzen der obigen Individuen, oder deren Nachkommen, mit anderen Genotypen der gleichen Spezies und anderer Spezies (siehe Beispiel 7);
– Samenproduktion im großen Maßstab.

Die Erfindung wird detaillierter im folgenden unter Bezugnahme auf die Beispiele erklärt werden (auf die bereits oben kurz Bezug genommen wurde), die unten diskutiert werden und die alle bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung darstellen. Um diese Beispiele nicht unnötig zu komplizieren, basieren die Beispiele auf Helianthus annuus (L.), der der Donor ist. Wie bereits vorhin erklärt, betrifft die Erfindung allgemein einen Donor der Familie der Compositae einer Art, die verschieden ist von der Gemüsepflanze, und ist konsequenterweise nicht beschränkt auf den angeführten Donor, auf den in den Beispielen Bezug genommen wird.
In allen folgenden Beispielen müssen die Maßnahmen aseptisch ausgeführt werden und alle Lösungen, Medien (deren Zusammensetzungen später beschrieben werden) und Instrumente, die verwendet werden sollen, müssen steril sein. Petrischalen sind weiterhin mit einer Filmschicht, wie Fuji, Nesco oder Parafilm, versiegelt.
Beispiel 1
Kultivieren von Akzeptormaterial; in vitro-Blatt von Salatzichorie, Endivie und/oder Kopfsalat
Wasche Samen mit 70% Ethanol für 10 Sekunden, sterilisiere dann für 10 Minuten in 1 % Na-Hypochlorit, wasche dann gründlich mit sterilem Wasser. Säe aseptisch in einem Einweg-Gewebekulturgefäß mit etwa 75 ml MS-Medium aus (etwa 8 Samen/Schale). Kultiviere bei 25°C im Licht (16 Stunden Licht; etwa 2000 Lux/8 Stunden Dunkelheit). Nach etwa 2 Wochen werden die jungen Sämlinge in eine Schale mit frischem MS-Medium (ein Sämling/Schale) gegeben. Einen Monat nach Aussäen können die Pflanzen als Ausgangsmaterial verwendet werden.
Protoplastenisolierung von Blättern von Akzeptormaterial; Salatzichorie, Endivie und Kopfsalat
Schneide in vitro-Blattmaterial (± 25 cm²) mit einem Skalpell in einer Petri-Schale (TC, Durchmesser 9 cm) mit etwa 10 ml PPO. Ersetze die Lösung nach Schneiden durch etwa 10 ml Macerationslösung. Inkubation: stationär, dunkel, 25°C, etwa 16 Stunden. Filtration durch 45 μm Nylonnetz, letztes Waschen und Verdünnen der Suspension mit etwa 3 Volumina Waschlösung. Zentrifugiere die Protoplasten-Suspension in 15 ml Zentrifugenröhrchen für 5 Minuten bei 600 Upm (= 63 × g). Wasche das Pellet zweimal mit 15 ml Waschlösung, zentrifugiere dann für 5 Minuten bei 600 Upm. Die Protoplasten (pps) sind nun bereit zur Fusion oder zum Kultivieren, nun kann ein Inaktivierungsschritt, bevorzugterweise eine Jodacetatbehandlung, durchgeführt werden, sofern erwünscht.
Kultivierung von Donormaterial; Sonnenblumenhypokotylen
Etiolierte Hypokotylen werden ausgewählt als das Ausgangsmaterial des Donors, von dem die Protoplasten isoliert werden. Im Vergleich zum Blatt, das ausgewählt ist als "Akzeptor"-Gewebe, enthält diese Pflanzenmaterial eine bei weitem größere Menge an Mitochondrien. Darüber hinaus enthalten Hypokotylen keine Chloroplasten (sie enthalten einige Proplastiden), wohingegen Blattzellen diese enthalten. Diese Gewebeselektion führt zu einer größeren Wahrscheinlichkeit, die richtige Organellenzusammensetzung eines Fusionsproduktes zu erhalten. Zusätzlich erlaubt diese Gewebeselektion optische Selektion nach Fusion; Fusionsprodukte von Akzeptor- und Donorprotoplasten sind erkennbar.
Sterilisiere Sonnenblumensamen in 1 % Na-Hypochlorit für 10 Minuten, wasche dann gründlich mit sterilem Wasser. Säe aus in Replika-Schalen mit MS-Medium. Dunkel, 25°C.
Protoplastenisolierung von Donormaterial; Sonnenblume
Schneide die obere Hälfte der Hypokotylen in PPO. Schneide die Hypokotylenteile sehr fein in einer 9 cm TC-Schale mit 10 ml PPO, 15 nach 5 Tagen, erneuere die PPO-Lösung nach dem Schneiden und erlaube, für eine Stunde zu stehen, dunkel (Raumtemperatur).
Ersetze die PPO-Lösung durch eine Macerierungslösung. Inkubation: stationär, dunkel, 25°C, 16 bis 18 Stunden (mögliche FITC/FDA-Colorierung; 2 Tropfen der gesättigten Stammlösung, in Aceton, in 10 ml Macerierungslösung).
Filtration durch 45 μl Nylonfilter, letztes Waschen mit Waschlösung. Zentrifugiere für 8 Minuten bei 600 Upm. Wasche das Pellet erneut mit Waschlösung; Zentrifugiere für 8 Minuten bei 600 Upm. Die Protoplasten (pps) sind nun bereit zur Fusion. Nun kann ein Nukleusinaktivierungs-/Eliminierungsschritt, z.B. Bestrahlung oder Cytoplastieren, durchgeführt werden, sofern erwünscht.
Die Kulturbedingungen für Salatzichorie/Endivie oder Kopfsalat sind jedoch so, daß die Sonnenblumen-Protoplasten in der Tat Teile und Calli ausbilden, aber es gibt keine Sproßregeneration.
Beispiel 2
Akzeptor-Cytoplasmainaktivierung; Jodacetamid-Behandlung
Ähnlich wie Jodacetat ist Jodacetamid ein Cytoplasma-orientierter biochemischer Inhibitor. Es wird hier verwendet, um die Mitochondrien der Akzeptor-Protoplasten zu inaktivieren, wobei als eine Folge davon diese Zellen, wenn überhaupt, kaum in der Lage sind zu überleben. Das gibt den Mitochondrien des Donors in einem Fusionsprodukt einen Selektionsvorteil gegenüber jenen des Akzeptors, während zusätzlich das fortgesetzte Wachstum von Fusionsprodukten bevorzugt gegenüber demjenigen der Akzeptorprotoplasten bei Verwendung dieser chemischen Substanzen unterstützt wird. Die Behandlung von Protoplasten mit Jodacetamid wird z. B. in der folgenden Art und Weise erfolgen:
Stammlösung 60 mM, verwende 1–5 mM (bevorzugterweise 2,5 mM) in Waschlösung mit einer Zelldichte von 10⁴ bis 10⁶ (bevorzugterweise 10⁵), inkubiere für 5–30 Minuten (bevorzugterweise 15 Minuten bei einer Temperatur von 2–22°C, bevorzugtererweise bei 4°C. Wasche dann die behandelten Protoplasten sehr gründlich mit Waschlösung. Führe danach die Protoplasten in die Fusionslösung ein.
Donor-Nukleusinaktivierung; Bestrahlung
Röntgenstrahl-, Gamma- oder Ultraviolettbestrahlung dient dem Ziel, chromosomale DNA der Donorprotoplasten zu fragmentieren, wobei als ein Ergebnis diese Zellen nicht länger in der Lage sind, sich zu teilen. Darüber hinaus wird als ein Ergebnis davon der Nukleus des Donors in einem Fusionsprodukt verglichen mit dem Akzeptor einen Selektionsnachteil aufweisen. Der Vorteil der Bestrahlung besteht darin, daß die Protoplastenmembranen nicht zu sehr beschädigt werden, was wichtig ist, da die Fusion eine desaströse Wirkung darauf haben kann. Der Nachteil besteht jedoch darin, daß der Nukleus vorhanden bleiben wird, und sei es in fragmentiertem Zustand, mit dem damit einhergehenden Risiko einer wenigstens teilweisen Ubertragung chromosomaler DNA vom Donor zum Akzeptor.
Röntgenbestrahlung wird zum Beispiel wie folgt vorgenommen werden:
Plaziere pps in suspendiertem Zustand in pps-Kulturmedium mit einer Dichte von etwa 2,5 × 10⁶ pps/ml in einer 6 cm TC-Petri-Schale (2 ml) unter eine Röntgenstrahlenquelle (z. B. Baltobloc CE 100) in einer geeigneten Entfernung, so daß die Dosis 10 KRad pro Minute sein wird, für 3 bis 20 Minuten (bevorzugterweise 5 Minuten). Wasche dann die Zellen zweifach mit Waschlösung.
Gamma-Bestrahlung erfolgt gewöhnlicherweise mittels einer Cobalt 60-Quelle. Auch hier werden die Protoplasten in pps-Kulturmedium eingeführt. Eine geeignete Dosis beträgt 2–30 KRad. Gefolgt von zweifachem Waschen der Zellen mit Waschlösung.
Donor-Nukleuseliminierung; Cytoplastieren
Wenn Cytoplastieren erfolgt, wird der Nukleus aus dem Protoplasten entfernt, so daß das einzige, was bleibt, ein Cytoplast ist, der Mitochondrien und Proplastiden enthält. Es gibt mehrere Möglichkeiten, dies zu bewerkstelligen. Zum Beispiel kann der Unterschied der spezifischen Masse zwischen dem Nukleus und dem Cytoplasma verwendet werden. Der Nukleus wird wörtlich aus der Zelle mittels Hochgeschwindigkeitszentrifugation und einem diskontinuierlichen (Percoll/Saccharose)-Gradienten, möglicherweise in Gegenwart von Cytochalacin-B, herausgeschleudert. Eine anderes, schonenderes Verfahren besteht darin, eine starke Plasmolyse während der Enzyminkubation zu bewirken, indem eine Macerierungslösung mit einer vergleichsweise hohen Osmolarität (z. B. 0,7 M Mannitol) verwendet wird, wobei in dieser Situation Cytoplasten spontan gebildet werden, von bis zu soviel wie 40% der Zellen. Diese Cytoplasten können dann von den Protoplasten getrennt werden unter Verwendung des Unterschiedes der spezifischen Masse zwischen Protoplasten und Cytoplasten. Die pps/cps-Mischung wird auf einen Percoll/Mannitol-Gradienten geladen und durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation (160 × g; 10 Minuten) erneut fraktioniert. Der Erfolg dieser Maßnahmen hängt in einem großen Umfang von der Auswahl des Ausgangsmaterials ab. Eine Kombination der oben beschriebenen Verfahren ist möglich, sofern erforderlich. Natürlich werden die Cytoplasmen nach der Reinigung gewaschen (Waschlösung) und in die Fusionslösung eingeführt. Ein Hauptvorteil von Cytoplasmen besteht darin, daß der Nukleus eliminiert wird, was die Möglichkeit der Übertragung chromosomaler DNA vom Donor zum Akzeptor ausschließt. Ein Nachteil der PEG-Fusion besteht darin, daß Cytoplasten eine geringe spezifische Masse aufweisen, weshalb sie auf der Oberfläche schwimmen bleiben.
Beispiel 3
PEG-Fusion von Mesophylprotoplasten von Salatzichorie/Endivie/Kopfsalat mit Hypotokylprotoplasten von Sonnenblumen
Erlaube Tropfen von 100μl (1–2 für Salatzichorie, 4–8 für Endivie und Kopfsalat) einer pps-Suspension mit einer Dichte von 10⁶, wobei die Fusionspartner 1:1 gemischt sind, sich ungestört in einer Fusionslösung in unbeschichteten Petrischalen (Durchmesser 9 cm für Salatzichorie, 6 cm für Endivie und Kopfsalat) für 15 Minuten abzusetzen. Für jeden Tropfen pps-Lösung werden zwei Tropfen (etwa 20 μl) PEG1 zugegeben; nach 2 bis 10 Minuten, abhängig davon, wie zerbrechlich die pps sind (meistens 4 Minuten), wird die Schale in einer Schrägposition gehalten und die Flüssigkeit kann an der Kante mittels einer Pasteur-Pipette abgesaugt werden, wohingegen die Protoplasten am Boden kleben bleiben, auf dem sie sich abgesetzt haben. Einige wenige Tropfen PEG2 werden vorsichtig zugegeben und mach 3 bis 15 Minuten (meistens 7 Minuten) werden sie in derselben Art und Weise entfernt, wie die PEG1-Lösung. Mache das gleiche für PEG3, gebe hinzu und entferne nach 5 bis 30 Minuten (meistens 10 Minuten). Ergänze wieder mit Protoplastenkulturmedium (10 ml WA-Medium für Salatzichorie, 2 ml AA-Medium für Endivie oder 2 ml SA-Medium für Kopfsalat) und kultiviere, wie vorstehend beschrieben. PEG-Fusion ist ein sehr geeignetes Verfahren zum Fusionieren großer Mengen von Protoplasten mit einem Ansatz.
Elektrofusion von Mesophylprotoplasten von Salatzichorie/Endivie/Kopfsalat mit Hypotokylprotoplasten von Sonnenblumen
Elektrofusion soll gegenüber PEG bevorzugt sein, wenn die Protoplasten beider Fusionseltern bspw. ziemlich unterschiedliche spezifische Massen aufweisen. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn Cytoplasten (siehe das obige Beispiel 2) verwendet werden als das Donor-Material; als ein Ergebnis der Abwesenheit eines Nukleus sind die Zellen vergleichsweise leicht, was dazu führt, daß sie aufschwimmen, was PEG-Fusion unmöglich macht. Ein Vorteil besteht darin, daß das Elektrofusionsverfahren es möglich macht, mit großer Genauigkeit und in einer sehr kontrollierten Art und Weise zu arbeiten; selbst die Fusion von nur 2 Protoplasten ist möglich. Dafür ist ein Elektrofusionsapparat und eine Fusionskammer erforderlich. Die Verfahrensweise kann wie folgt sein:
Die Mischung aus Donor- und Akzeptorprotoplasten wird in einer isotonischen Lösung (0,5 M Mannitol + 0,2 mM CaCl₂) suspendiert und in die Fusionskammer gegeben.
Dann wird ein elektrisches Feld eines hochfrequenten Wechselstroms (Oszillation 0,3 bis 1,5 Mhz) angelegt, was dazu führt, daß sich die Protoplasten selbst in Ketten anordnen; Dauer (10 Sekunden bis 10 Minuten). Die pps-Dichte (10⁴–2 × 10⁶) und die Feldstärke (1 bis 150 V RMS/cm) bestimmen die Länge der Ketten und müssen ständig optimiert werden. Dann werden die Protoplasten (einem) kurzen, starken Stromstoß/Stromstößen ausgesetzt, der/die die Membranen, die in Kontakt miteinander sind, dazu veranlassen kann/können, zu fusionieren. Die Amplitude des/der Pulse) [40–3000 V/cm) ebenso wie die Dauer [10 Mikrosekunden – 1 Millisekunde], die Form [Block], die Anzahl [1–10] und das Intervall des/der Pulse) haben einen Einfluß auf die Fusionshäufigkeit und das Überleben der Zellen. Das AC-Feld wird für einige Zeit aufrecht erhalten werden, woraufhin die Zellen in pps-Kulturmedium eingeführt werden können.
Beispiel 4
Sortieren von Zellen
Es ist möglich, die erwünschten Fusionsprodukte, bevorzugterweise 5 bis 10% der Gesamtanzahl der Protoplasten, von der Fusionsmischung durch Reinigung direkt nach der Fusion zu trennen. Es ist unzweifelhaft, daß dies für die Effizienz des Gesamtverfahrens von Vorteil sein wird. Zu diesem Zweck werden Techniken, die per se bekannt sind, verwendet werden, wie Mikromanipulation, Durchflußsortierung oder andere Techniken. Es ist jedoch nicht erforderlich, Zellsortierung zu verwenden, insbesondere nicht, wenn Inaktivierung [zum Beispiel Jodacetamid, Bestrahlung und/oder Cytoplasten] verwendet wird. Darüber hinaus wird sich die Sonnenblume unter den für Salatzichorie, Endivie oder Kopfsalat beschriebenen Bedingungen nicht regenerieren.
Beispiel 5
Kultivieren von Salatzichorie-Protoplasten

Plattiere in WA-Medium aus, wobei die Dichte 5 × 10³ pps/ml beträgt, 10 ml in einer 9 cm TC-Petrischale.
Kultiviere bei 25°C im Dunkeln.

Verdünnen mit WB-Medium muß innerhalb von 10 Tagen nach Isolierung erfolgen, um ein braun werden und Absterben der Zellen zu verhindern. Verdünne 1:10 in 9 cm TC-Petrischalen (10 ml pro Schale). Halte die Schalen wieder bei 25°C, aber nun bei gedämpftem Licht (16 Stunden im Licht; etwa 500 Lux/8 Stunden im Dunkeln).
Wenn die Calli einen vernünftigen Durchmesser aufweisen (von 2 mm), etwa 1–2 Monate nach Protoplastenisolierung, müssen sie in Sproßregenerationsmedium überführt werden; WC-Medium, etwa 50 Calli pro Petrischale (Durchmesser 9 cm) mit etwa 20 ml Medium. 25°C, im Licht (16 Stunden im Licht; etwa 1000 Lux/8 Stunden im Dunkeln).
Nach etwa einem Monat können Sprossen von den Calli abgeschnitten werden und in Einweggewebekulturbehältnisse (6 bis 8 pro Schale) mit etwa 75 ml D-Medium für Wurzelentwicklung überführt werden, in Licht (16 Stunden im Licht; etwa 1000 Lux/8 Stunden im Dunkeln) bei 25°C.
Kultivieren von Endivien-Protoplasten

Plattiere in AA-Medium aus, Dichte 10⁴–10⁵ pps/ml, 2 ml in einer 6 cm TC-Petrischale.
Kultiviere bei 25°C im Dunkeln.

Wenn eine Teilung erfolgt und wenigstens ein Teil der Protoplasten ein 4-Zell-Stadium erreicht hat, muß Verdünnen mit WB-Medium, z. B. 1:2, erfolgen. Halte die Schalen wieder bei 25°C, nun aber bei gedämpften Licht (16 Stunden im Licht; etwa 500 Lux/8 Stunden im Dunkeln).
Wenn die Calli einen vernünftigen Durchmesser erreicht haben (von 2 mm), etwa 2–4 Monate nach Protoplastenisolierung, müssen sie überführt werden in Sproßregenerationsmedium; AC, etwa 50 Calli pro Petrischale (Durchmesser 9 cm) mit etwa 20 ml Medium. 25°C, im Licht (16 Stunden im Licht; etwa 1000 Lux/8 Stunden im Dunkeln).
Nach etwa zwei bis vier Monaten können Sprossen von den Calli abgeschnitten und in Einweggewebekulturgefäße (6 bis 8 pro Schale) mit etwa 75 ml D-Medium für Wurzelentwicklung im Licht (16 Stunden im Licht; etwa 1000 Lux/8 Stunden im Dunkeln) bei 25°C überführt werden.
Kultivieren von Kopfsalat-Protoplasten

Plattiere in SA-Medium aus, Dichte 1,5 × 10⁴ pps/ml, 2 ml in einer 6 cm TC-Petrischale.
Kultiviere bei 25°C im Dunkeln.

Eine Woche nach pps-Isolierung wird die erste Verdünnung mit SB-Medium erfolgen, z. B. 1:1, und nachfolgend alle 5 Tage, um ein braun werden und Absterben der Zellen zu verhindern.
Wenn die Calli einen vernünftigen Durchmesser erreicht haben (von 2 mm), etwa 1 Monat nach Protoplastenisolierung, müssen sie in Sproßregenerationsmedium überführt werden; SC-Medium, etwa 50 Calli pro Petrischale (Durchmesser 9 cm) mit etwa 20 ml Medium. 25°C im Licht (16 Stunden im Licht; etwa 1000 Lux/8 Stunden im Dunkeln).
Nach etwa 2 Monaten können Sprossen von den Calli abgeschnitten werden und in Einweggewebekulturgefäße (6–8 pro Schale) mit etwa 75 ml D-Medium für Wurzelentwicklung überführt werden, im Licht (16 Stunden im Licht; etwa 1000 Lux/8 Stunden im Dunkeln) bei 25°C).
Beispiel 6
DNA-Analyse von Mitochondrien und Chloroplasten
Gesamt-DNA wird aus Blattmaterial des Donors, Akzeptors, Fusionsprodukts und der Nachkommen isoliert mittels eines Dellaporte-Verfahrens (Plant Molecular Biology reporter, Band 1, Nummer 4 (1983)). Gesamt-DNA umfaßt genomische, mitochondriale und Chloroplasten-DNA. Gesamt-DNA wird in kleinere Fragmente mittels Restriktionsenzymen verdaut. Die verdaute DNA wird nachfolgend entsprechend der Fragmentgöße mittels Elektrophorese in einem Agarose-Gel getrennt. Nach der Trennung werden Einzelstrang-DNA-Fragmente auf eine positiv geladene Membran mittels Vakuum-Blotten überführt, dem sogenannten "Prinzip des Southern Blottens" (Journal Mol. Biol. 98, 503–517 (1975)). Die verschiedenen, Einzelstrang-DNA-Produkte umfassenden Membranen werden hybridisiert mit:

– mitochondrialen DNA-Sequenzen, Codes: pEZMT22 und pEZMTA2;
– Chloroplasten-DNA-Sequenz, Code: pEZCP64.

Zum Markieren, Hybridisieren und Nachweisen wird das "ECL direct nucleic acid labelling and detection system #RPN3001" (Amersham) verwendet.
Irgendwelche Änderung in der mitochondrialen DNA von Regeneranten, die nachgewiesen werden, können einerseits dem Auftreten spezifischer Umlagerungen während der durchgeführten Fusion- und Regenerationsprozeduren zugeschrieben werden. Fusionsprodukt und Nachkommen können in gleicher Weise, wenigstens teilweise, die mitochondriale Donor-DNA enthalten. 1 zeigt ein spezifisches Fusionsprodukt und Nachkommen davon, die mitochondriale DNA enthalten, was das Ergebnis spezifischer Rekombinationsereignisse zwischen der mitochondrialen DNA des Donors (Helianthus) und des Akzeptors (Cichorium) ist.
Figur 1
1: Hybridisierung mit pEZMTA2, Restriktionsenzym BgIII. Die Figur zeigt Helianthus (den Donor), Cichorium (den Akzeptor) und verschiedene Fusionsprodukte (A–J). Die Figur zeigt deutlich, daß spezifische Helianthus-Banden in einer Anzahl der Fusionsprodukte (Cichorium-Phänotyp) vorhanden sind. Infolge der angewandten Verfahrensweisen sind die mitochondrialen Genome des Donors und des Akzeptors fusioniert.
Figur 2
2: Hybridisierung mit pEZMT22, Restriktionsenzym EcoRI. Die Figur zeigt Helianthus (den Donor), Cichorium (den Akzeptor) und ein CMS-Fusionsprodukt. Die Figur zeigt auch 5 Pflanzen, die Rückkreuzungen der Fusionsprodukte (der Mutter) und des Akzeptors/Cichorium (des Bestäubers) sind. Vom mitochondrialen DNA-Profil des Fusionsprodukts und den Nachkommen (Rückkreuzungen) erscheint es so, daß die mitochondriale DNA sich geändert hat. Die solchermaßen geänderte mitochondriale DNA wird stabil auf die Nachkommen übertragen.
Figur 3
3: Hybridisierung mit pEZCP64, Restriktionsenzym DraI. Die Figur zeigt, daß das CMS-Fusionsprodukt und seine Nachkommen den Chloroplastentyp des Akzeptors (Cichorium) enthalten.
Figur 4
4: Ploidie-Bestimmung von (CMS)-Sonnenblumen-Salatzichorie-Fusionsprodukten. Dies erfolgt mittels Relativmessungen der Menge Kern-DNA mittels Flußcytometrie (Ulrich & Ulrich, Protoplasma, 1991, 165: 212–215). Die Messungen von Salatzichorie und Sonnenblume werden verglichen mit den Messungen einer Mischung aus Salatzichorie, Sonnenblume und einem CMS-Salatzichorie-Fusionsprodukt. Dieser Vergleich zeigt deutlich, daß das Fusionsprodukt nicht verschieden ist von Salatzichorie, was das Maß an Ploidie betrifft.
Figur 5
5: Eine normale fertile Salatzichorie-Blüte, wobei die Antheren und gebildeten Pollen klar erkennbar sind
Figur 6
6: Eine cytoplasmatische pollensterile Salatzichorie-Biüte, die deutlich zeigt, daß die Antheren nicht entwickelt sind und daß keine Pollen gebildet worden sind, während der Rest der Pflanze normal ist.
Figur 7
7: Ein Detail zweier Strahlenblüten von Salatzichorie (auf der linken Seite zeigend eine normale fertile Blüte und auf der rechten Seite eine cytoplasmatisch pollensterile Blüte), wobei die Antheren und Pollen in der fertilen Blüte vorhanden sind und in der sterilen Blüte fehlen.
Beispiel 7
Kreuzungen

Natürlich ist es erforderlich, Fusionsprodukte zu vermehren und den Genotyp an die neuesten Erfordernisse wieder mittels herkömmlicher Pflanzenzüchtungsmethoden zu adaptieren. Der Samen muß zu diesem Zweck produziert werden. Dies kann in einem großen Maßstab in Käfigen unter Verwendung von Bienen oder Fliegen oder ganz spezifisch durch manuelles Kreuzen erfolgen. In diesem Falle werden Pollen eines geeigneten Bestäubers auf die Pistille der Fusionsprodukte (oder deren Nachkommen) gegeben, woraufhin Samen gebildet werden. Als ein Ergebnis mütterlicher Vererbung werden alle cytoplasmatisch codierten Eigenschaften, wie CMS, in allen Nachkommen vorhanden sein. Auf diese Weise ist es möglich, sowohl inter-spezifische als auch intra-spezifische Kombinationen herzustellen. Ein gutes Beispiel für einfaches intra-spezifisches Kreuzen ist die Kombination von Salatzichorie und Endivie; keine speziellen Techniken, wie Embryonen-Rettung, sind erforderlich, um dieses Kreuzen auszuführen. Medien und Lösungen PPO (Präplasmolyse-Lösung)

54,64 g/l	Sorbitol
7,35 g/l	CaCl₂·2H₂O
0,59 g/l	MES
pH 5,8,autoklaviere	(20 Minuten, 115°C)

Macerationslösung: Löse Enzyme in WA-Medium

Cellulase R-10	0,0667%
Driselase	0,033%
Macerozyme R-10	0,013%
Cellulysine	0,2%
Macerase	0,03%
MES	0,2 g/l
2,4D	0,33 mg/l
BAP	0,16 mg/l
pH 5,6	filtriere steril (0,22 μM)

Waschlösung:

CaCl₂·2H₂O	0,2%
KCl	2,5%
MES	0,06%
pH	5,8, autoklaviere

Fusionslösung:

Sorbitol	0,15M
CaCl₂·2H₂O	0,03M
KCl	0,075M
Tris-HCl	0,05M
pH	7,2, autoklaviere

PEG1:

PEG 1500	40%
Glucose	0,3M
CaCl₂·2H₂O	50mM
Filtersterilisation	(0,22μM)

PEG2:

PEG 1500	13,3%
Glucose	0,1 M
CaCl₂·2H₂O	0,067M
Sorbitol	0,067M
Filtersterilisation	(0,22μM)

PEG3:

PEG 1500	6,7%
Glucose	0,05M
CaCl₂·2H₂O	0,083M
Sorbitol	0,083M
Filtersterilisation	(0,22μM)

Verwendete Abkürzungen:

PEG	Polyethylenglycol
NAA	α-Naphtalenessigsäure
2,4D	2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
BAP	6-Benzylaminopurin
IAA	Indol-3-essigsäure
IBA	Indol-3-buttersäure
MES	(2(N-Morpholino)ethansulfonsäure
FITC	Fluoreszeinisothiocyanat
FDA	Fluoreszeindiacetat
TC	Gewebekultur

Zusammensetzung der Medien (mg/l)

Claims

Pflanze, die zur Familie der Compositae gehört, deren Zytoplasma mit Mitochondrien versehen ist, welche DNA umfassen, die wenigstens teilweise von einer unterschiedlichen Spezies der Familie der Compositae stammt und die der Träger von stabil exprimierbarer zytoplasmatischer Pollensterilität (CNS) ist, wobei deren Zellen Spezies-spezifisches Chloroplasten- und Kerngenom umfassen, die für die Pflanze normal sind.
Pflanze gemäß Anspruch 1, wobei der Phänotyp besagter Pflanze zytoplasmatische Pollensterilität ist.
Pflanze gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die andere Spezies der Familie der Compositae ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Helianthus spp. und Cirsium spp.
Plante gemäß Anspruch 3, wobei die andere Spezies der Familie der Compositae Helianthus annuus (L.) mit CMS vom Petiolaris-Typ ist.
Pflanze gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die andere Spezies der Familie der Compositae ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Chrysanthemum, Senecio, Centaurea, Sonchus, Hieracium, Tagetes Dahlia und Aster.
Pflanze gemäß einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 5, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cichorium intybus (L.), var. foliosum (Hegi) Cichorium endivia (L.), Lactuca sativa (L.), Scorzonera hispanica (L.), Cynara scolymus L.) und Taraxacum officinale (L.).
Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die zur Familie der Compositae gehört, umfassend den Schritt des Bereitstellens des Zytoplasmas davon mit Mitochondrien, welche DNA umfassen, die wenigstens teilweise von einer unterschiedlichen Spezies der Familie der Compositae stammt und die der Träger von stabil exprimierbarer zytoplasmatischer Pollensterilität (CMS) ist, sowie das Bereitstellen des Zytoplasmas davon mit Speziesspezifischem Chloroplasten- und Kerngenom, wobei – die Pflanze ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Cichorium intybus (L.), var. foliosum (Hegi), Cichorium endivia (L.), Lactuca sativa (L.), Scorzonera hispanica (L.), Cynara scolymus (L.) und Taraxacum officinale (L.); und – die andere Spezies der Familie der Compositae ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Helianthus spp., Cirsium spp., Chrysanthemum, Senecio, Centaurea, Sonchus, Hieracium, Tagetes, Dahlia und Aster; und – von Bestrahlung zur Inaktivierung des Donor-Nukleus Gebrauch gemacht wird.