DE19743256C2

DE19743256C2 - Verfahren zur Herstellung von polyploiden Pflanzen sowie polyploide Pflanzen

Info

Publication number: DE19743256C2
Application number: DE19743256A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Gaerditz
Original assignee: Individual
Current assignee: Gaerditz Christoph Dr 13599 Berlin De
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2017-10-01
Also published as: AU727616B2; DE19743256A1; WO1999016299A1; AU1141199A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von polyploiden Pflanzen gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie eine polyploide Pflanze gemäß Anspruch 13.

In der Regel liegen somatische Zellen von Tieren und vielen Pflanzen mit einem zweifachen Chromosomensatz vor. Man spricht hier von diploi den Organismen.

Zahlreiche Kulturpflanzen wie Hafer, Weizen oder Kartoffeln zeigen je doch eine Verdopplung oder Vervielfachung ihrer Chromosomensätze (Polyploidie). So können, wenn in der Meiose die Reduktionsteilung unter bleibt, diploide Keimzellen entstehen, aus deren Verschmelzung dann zum Beispiel tetraploide Zellen hervorgehen.

Polyploide Pflanzen findet man besonders auch bei Zierpflanzen häu fig! So ist z. B. von der Zierpflanze Primula malacoides, deren Wildform aus China stammt, bekannt, daß nach geglückter Ploidisierung und folgender züchterischer Bearbeitung mit konventionellen Methoden, die auftretenden Varietäten alle Erwartungen übertroffen haben.

Zur Herstellung polyploider Pflanzen wurde in der Vergangenheit der Mitoseablauf in der Anaphase dadurch beeinflußt, daß mit Mitosegiften die Funktionsfähigkeit der Spindelfasern gestört wurde. So ist beispielsweise vom Colchizin bekannt, daß es die Chromosomenwanderung zu den Zellpo len hemmt und hierdurch tetraploide Zellen entstehen können.

In der Pflanzenzüchtung ist ein derartiger Effekt häufig erwünscht, da sich aufgrund der polyploiden Kerne, welche größer sind als diploide, ent sprechend der Kern-Plasma-Relation größere Zellen, Gewebe und Organe der Pflanzen ergeben. Es hat sich nämlich herausgestellt, daß polyploide Pflanzen, insbesonders polyploide Kulturpflanzen, oft ertragreicher sind als die jeweiligen Wildtypen einer Pflanzenart.

In der Regel sind hierbei tetraploide Formen leistungsfähiger, jedoch können in bestimmten Fällen auch andere Ploidiegrade ertragreicher sein.

Dies ist bei manchen Kulturpflanzen der Fall; so zum Beispiel bei der hexaploiden Form des Weizens oder der triploiden Stufe mancher Zuc kerrüben und bei verschiedenen Apfelbäumen.

In der DE 34 23 207 C2 wird beispielsweise die Herstellung einer te traploiden Kamille der Kulturpflanzenart echte Kamille (Chamomilla recutita (L), Rauschert) beschrieben.

Ausgehend von einer diploiden Kamille wird im Stand der Technik der DE 34 23 207 C2 tetraploidisiert mittels Chemikalien bei Temperaturen zwischen 0° und 35°C, mittels γ-Strahlen, Röntgenstrahlen oder UV- Strahlen bei Temperaturen zwischen 0° und 35°C, mittels hoher Tempera turen von 33° bis 50°C, mittels niedriger Temperaturen von 0° bis 5°C, mittels der Dekapitierungs-Kallus-Methode oder durch Antherenkultur.

Bei der chemischen Polyploidisierung werden neben Colchizin eine Reihe von hochtoxischen Verbindungen wie beispielsweise Nikotin oder quecksilberorganische Verbindungen verwendet.

Der molekularbiologische Mechanismus ist im Detail noch weitgehend ungeklärt.

Ausgehend von dem oben beschriebenen Stand der Technik, ist es daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue verbesserte polyploide Pflanzen, insbesondere Lupinenpflanzen, zur Verfügung zu stellen.

Verfahrenstechnisch wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Bezüglich neuer polyploider Pflanzenarten, insbesondere Lupinenarten, wird die Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 13 sowie durch das Vermehrungsgut gemäß Anspruch 22 gelöst.

Die erfindungsgemäßen Pflanzen besitzen ein Genom,

- das keinerlei artfremde Gene enthält
- das aus Gründen der ökologischen Sicherheit mit keiner anderen Pflanze in Bezug auf die biologische Information interagieren kann
- das nur rezessive Kopplungsgruppen bezüglich der Bitterstoffe führt
- das wegen der mindestens vier physiologisch aktiven Allele in der Lage ist, im Rahmen der Gendosiswirkung nach entsprechender züchterischer Bearbeitung die wichtigen Leistungsfaktoren summieren zu können. (z. B.: Inhaltstoffe, Resistenzen, Streßstabilitäten) und
- das genügend genetische Plastizität hat, um durch Addition peripherer Genome weitere Nutzpflanzenarten entwickeln zu können.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Protoplasten aus Zellen diploider Pflanzen hergestellt. Die Herstellung derartiger Protoplasten erfolgt mit an sich bekannten Verfahren durch enzymatisches Entfernen der im wesentlichen Cellulose enthaltenden Zellwand der Ausgangspflanzenzel len. Nach Reinigung der Protoplasten werden diese fusioniert und man iso liert geradzahlige Mehrlingsprotoplasten, vorzugsweise Zwillingsprotopla sten, also solche Protoplasten, die aus einer Verschmelzung von zwei Pro toplasten entstehen.

Im Anschluß hieran werden konzeptionsfähige Fruchtknoten einer Empfängerpflanze geöffnet und die isolierten Mehrlingsprotoplasten werden in den Embryosack eingebracht.

Hierzu ist ein gewisses Geschick erforderlich, da die gewünschten Protoplasten beispielsweise mit einer Glaskapillare unter dem Binokular in den Embryosack der Empfängerpflanze transplantiert werden, wobei der Ei zellenkomplex mehr oder weniger gequetscht wird.

Nach der Übertragung der Protoplasten in den Embryosack der Emp fängerpflanze wird der Fruchtknoten wieder verschlossen.

Die Narbe des Empfängerfruchtknotens wird mit reifen Pollen (Mentorpollen) einer Fremdpflanze bestäubt, um den Stoffwechsel inner halb des Fruchknotens anzuregen.

Anschließend läßt man den polyploiden Pflanzenembryo zu einem keimfähigen Samen heranwachsen und - nach Samenreifung - läßt man den Samen auskeimen, so daß eine polyploide Pflanze erhalten wird.

Gemäß Anspruch 2 Zellen aus Lupinen, insbesondere Zellen aus Lu pinus albus L., vorzugsweise Linie C17/8 zu verwenden, hat den Vorteil, daß bei Ausgang von diesen Lupinenzellen eine neue bisher in der Natur nicht vorkommende Lupinen-Kulturpflanze zur Verfügung steht.

Das Verfahren gemäß Anspruch 3 hat den Vorteil, daß, wenn te traploide Lupinen hergestellt werden, diese sich bei richtiger Bearbeitung als genetisch stabilisierbar erweisen. Jedoch ist es mit dem vorliegenden Verfahren auch möglich höhere Ploidiegrade zu entwickeln (vgl. Fig. 5), welche unter Umständen einen größeren Ertrag und eine nicht abschätzbare Variabilität entwickeln könnten.

Die Verwendung von Apikalmeristemen gemäß Anspruch 4 hat den Vorteil, daß Apikalmeristeme für die Handhabung des erfindungsgemäßen Verfahrens leicht zugänglich sind und darüber hinaus aus genetisch omni potenten und z. B. virusfreien Zellen, Pflanzen zu regenerieren sind.

Die Maßnahmen des Anspruchs 5 haben den Vorteil, daß hiermit ein Routineverfahren zum Entfernen der Zellwände und zum Gewinnen der Protoplasten ohne große Modifikation eingesetzt werden kann.

Dichtegradienten aus Ficoll und/oder Rohrzucker zu verwenden, um die Protoplasten gemäß Anspruch 6 zu isolieren, hat den Vorteil, daß hiermit ein etabliertes Trenn- und Reinigungsverfahren zur Verfügung steht.

Eine Protoplastenfusion mit einem Polyethylenglykol gemäß Anspruch 7, insbesondere mit einem solchen, welches eine Molekularmasse von ca. 1550 Da aufweist durchzuführen, hat den Vorteil, daß hiermit eine sichere Methode zum Verschmelzen einzelner Protoplasten zur Verfügung steht und das Fusionsmittel billig ist und kommerziell erhalten werden kann.

Die Maßnahmen des Anspruchs 8, nämlich fusionierte Protoplasten durch Zentrifugation über einen Dichtegradienten, insbesondere einen Ficoll- und/oder Rohrzuckerdichtegradienten nach Zwillings- und Mehrlings protoplasten aufzutrennen beziehungsweise anzureichern, hat den Vorteil, daß hiermit ein gängiges Verfahren zum Isolieren der erwünschten Fusions produkte, beispielsweise der Zwillingsprotoplasten zur Verfügung steht.

Gemäß Anspruch 9 ist es bevorzugt, Zwillingsprotoplasten in den Em bryosack einzubringen, da hierdurch die in der Regel bevorzugten tetraploi den Pflanzen entstehen.

Gemäß Anspruch 10 wird der Schnitt an dem behandelten Fruchtkno ten mit Wollwachs geschlossen, wobei dem Wollwachs vorzugsweise ein Breitbandantibiotikum und/oder Antimykotium zugesetzt wird. Dies hat den Vorteil, daß hierdurch Infektionen der verletzten Pflanze weitgehend ver mieden werden, so daß die Erfolgsaussichten des pflanzenchirurgischen Eingriffs erhöht werden.

Dies gilt ebenso für die Maßnahmen des Anspruchs 11.

Gemäß Anspruch 12 werden nach ca. 24 bis 48 Stunden alle nicht transplantierten Fruchtknoten der Infloreszenz entfernt, was den Vorteil hat, daß nur die transplantierten Fruchtknoten optimal von der Pflanze ver sorgt werden, was ebenfalls die Erfolgschancen des erfindungsgemäßen Verfahrens verbessert.

Die Ansprüche 13 bis 18 betreffen die gemäß dem erfindungsgemä ßen Verfahren erhältlichen polyploiden Pflanzen, insbesondere Lupinen und die Ansprüche 19 bis 21 betreffen das Vermehrungsgut, insbesondere die Samenkörner sowie Meristemzellen, der erfindungsgemäßen polyploiden Pflanze, insbesondere der polyploiden Lupine.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeispielen sowie anhand der Zeichnung.

Es zeigt:

Fig. 1: Eine Fotographie des mittleren (= 3.) Fiederblattes des fünften Laubblattes am Hauptsproß folgender Lupinenarten (Reihenfolge von links nach rechts):
L. angustifolius: Schmalblättrige Lupine,
L. europaeus: erfindungsgemäße tetraploide Lupine,
L. albus: Weiße Lupine,
Größenvergleich: Streichholz;

Fig. 2: Eine Fotographie des letzten Laubblatts der vegetativen Phase von (Reihenfolge von oben links im Uhrzeigersinn):
L. angustifolius,
erfindungsgemäße tetraploide Lupine,
Lupinus albus,
Lupinus mutabilis,
Lupinus angustifolius,
Größenvergleich: Streichholz;

Fig. 3: Eine Fotographie der Blüten von (Reihenfolge von links nach rechts:
L. angustifolius,
erfindungsgemäße tetraploide Lupine,
L. albus,
Größenvergleich: Münze;

Fig. 4: Eine Fotographie des dritten Laubblattes der erfindungsgemäßen tetraploiden Lupine am Hauptsproß, Größenvergleich: Streichholz;

Fig. 5: Eine Fotographie eines Blattes einer erfindungsgemäßen oktoploiden Lupine mit besonderer Morphologie, Größenvergleich: Fliege (Sarcophaga carnaria)

Fig. 6: Ein Histogramm zur Erläuterung der Bestimmung des Ploidiegrades einer Probe anhand einer erfindungsgemäßen Lupine;

Fig. 7: Ein Histogramm zur Bestimmung des Ploidiegrades einer Probe einer erfindungsgemäßen Lupine;

Fig. 8: Ein Histogramm zur Bestimmung des Ploidiegrades einer weiteren Probe einer erfindungsgemäßen Lupine; und

Fig. 9: Ein Histogramm, welches vermutlich oktoploide Lupinen demonstriert.

Beispiel

Im vorliegenden Beispielsfalle wird beschrieben, wie eine tetraploide Lupine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird.

Man präpariert mehrere vollturgescente Apikalmeristeme von Pflanzen in der vegetativen Phase als Spender-Genome aus Lupinus albus L., Linie C17/8 (zum Beispiel beschrieben in Wolfgang D. Gärditz: "Die Bedeutung der heimischen Hummeln und Bienen (Apoideae) für die Ertragsstruktur der Weißen Lupine (Lupinus albus L.)", Dissertation am Lehrstuhl für Biogeo graphie, Abteilung Agrarökologie der Universität Bayreuth, 1989, frei, löst das Gewebe enzymatisch mit Pectinasen und/oder Cellulasen in Konzentra tionen von ca. 2% auf und entfernt die restlichen Zellwände mit einer Cellulase, deren Konzentration ca. 3% in Osmoticum 1 beträgt.

Zur Herstellung des Osmoticum 1 wird zunächst ein Pollenextrakt, im folgenden mit PE₂₀ abgekürzt, wie folgt hergestellt:

Man nimmt einer Erdhummel (Bombus terrestris), die einen blühenden Lupinenstand befliegt, das Höselgut, sterilisiert es, läßt die Pollen in einer Keimlösung (10% Rohrzucker, 100 ppm H₃BO₃, 300 ppm Ca(NO₃)₂ keimen, homogenisiert, füllt mit 4 Teilen Gamborg B5-Pflanzenmedium (Makro- und Mikrosalze) [nähere Angaben zur Keimlösung z. B. beschrieben in Simson, C. J. und Stanford, J. C.: "Induction of gametic selection in situ by stylar application of selective agents" in Biotechnology and Ecology of Pollen; Springer, New York, 1986, S. 107-112] auf und klärt das Homogenat in der Zentrifuge. Der Überstand wird unter Verwendung von Vorfiltern über einen Membranfilter steril filtriert.

Osmoticum 1 ist eine Lösung, welche 0,6 M Mannitol und 10% PE₂₀, pH 5,8 in Wasser enthält.

Die erhaltenen Lupinen-Protoplasten werden auf einem Ficoll-Dichte gradienten isoliert und mit Hilfe von Polyethylenglycol (PEG 1550) fusio niert.

Die Fusionsprodukte werden von der PEG-Lösung in Osmoticum 2 übertragen.

Osmoticum 2 enthält 0,5 M Mannitol, 0,3 ppm Gibberellin A₃ in PE₂₀, pH 6,2.

Die Protoplasten-Fusionsprodukte in Osmoticum 2 werden ebenfalls in einem Dichtegradienten, im Beispielsfalle aus Sucrose/Percoll, nach Zwil lings- und Mehrlingsprotoplasten getrennt und angereichert.

Die gewünschte Bande wird aus dem Zentrifugenröhrchen entnommen und sollte, um tetraploide Lupinen herzustellen, im wesentlichen Zwillings protoplasten enthalten. Zunächst wird die gewünschte Fraktion dann in ei nem Mikroreaktor, im Beispielsfalle einem Microslide oder einem "hängenden Tropfen" übertragen, aufgenommen und auf Vitalität geprüft (optisch). Die verwendete Nährlösung ist frisches Osmoticum 2.

Anschließend werden konzeptionsfähige Fruchtknoten der Empfän gerpflanze - im Beispielsfalle Lupinen der Linie Lupinus albus var. C17/8, welche in Gefäßkultur gehalten werden - aseptisch mittels eines Horizontal schnittes geöffnet, anfallende interstitielle Flüssigkeit wird mit einem Tup fer, der mit einem Antioxydans imprägniert ist, entfernt und die Wundflä che mit 50 mM MES-Puffer (Morpholinmethansulfonsäure) in PE₂₀ feucht gehalten.

Mit einer Glaskapillare werden dann lebensfähige Protoplasten direkt und möglichst genau unter dem Binokularmikroskop mittels einer Mikrome chanik in den Embryosack eines Empfängerfruchtknotens transplantiert. Dabei wird Osmoticum 2 mitübertragen und der Eizellenkomplex wird mehr oder weniger gequetscht.

Nach dem Schließen des Fruchtknotens wird die Schnittnaht mit Wollwachs, in das ein Breitbandantibiotikum, im Beispielsfalle Totocillin, eingearbeitet ist, geschützt.

Anschließend wird die Narbe des Empfängerfruchtknotens im Über schuß mit reifen Pollen (Mentorpollen) einer Fremdpflanze bestäubt. Diese Maßnahme dient zur Aktivierung des Stoffwechsels im Fruchtknoten durch die sich entwickelnden Pollenschläuche. In dieser Phase hat das Transplan tat jedoch einen räumlichen und zeitlichen Vorsprung gegenüber den Men torpollen, weil er sich bereits im Embryosack befindet und daher im Gegen satz zu den zeitlich und räumlich versetzten Pollen entwickeln kann.

Der behandelte Blütenstand wird zum Schutz vor Wasserverlust und Sekundärinfektionen mit luftdurchlässiger Folie umhüllt. Nach 24 bis 48 Stunden werden alle nichttransplantierten Fruchtknoten der Infloreszenz entfernt.

Sämtliche Arbeiten werden bei Reinraumbedingungen durchgeführt. Die Nährlösungen werden über Membranfilter steril filtriert. Pollen und App likalmeristeme werden mit Natriumhypochlorid sterilisiert.

Sämtliche verwendeten Reagenzien sind "analytical grade".

Die Ausgangsgenome stammen von Lupinus albus var. C17/8 wie bei spielsweise beschrieben in Wolfgang D. Gärditz: "Die Bedeutung der heimi schen Hummeln und Bienen (Apoideae) für die Ertragsstruktur der weißen Lupine (Lupinus albus L.)", Dissertation am Lehrstuhl für Biogeographie, Abteilung Agrarökologie der Universität Bayreuth, 1989.

Im Beispielsfalle ist das Symbiosebakterium ein von C17/8 isolierter, adaptierter Genotyp, wobei die Symbiosebakterien bekannterweise Rhizo bien sind.

Kulturtechnik für die Rhizobien erfolgte nach bekannten Verfahren. Neuerdings auch zusammenfassend beschrieben in Somasegaran, P. in "Handbook for Rhizobia" Springer, New York 1994

Die Reifung der Samen erfolgt bei erfolgreicher Transplantation inner halb von 140 bis 170 Tagen.

Die ausgereiften Samen der polyploiden Lupinen wurden unter den üblichen Bedingungen gekeimt.

Fig. 1 zeigt eine Fotographie des mittleren d. h. des dritten Fiederblattes des fünften Laubblattes am Hauptsproß der erfindungsgemäßen tetraploiden Lupine einerseits im Vergleich zu den Lupinenarten Lupinus angustifolius und Lubinus albus, andererseits im Größenvergleich zu einem Streichholz.

Das in Fig. 1 in der Mitte gezeigte Fiederblatt ist ca. viermal so groß wie das Blatt einer gleichaltrigen Vergleichspflanze der L. albus.

Fig. 2 zeigt eine Fotographie des letzten Laubblattes der vegetativen Phase der erfindungsgemäßen Lupine in tetraploider Ausführungsform im Vergleich zu den bekannten Arten L. angustifolius, L. albus, L. mutabilis im Größenvergleich zu einem Streichholz.

Selbst großblättrige Formen z. B. von Lupinus mutabilis, wie in Fig. 2 in der unteren rechten Bildhälfte zu sehen ist, sind bei unter gleichen Bedingungen aufgewachsenen Pflanzen um mindestens die Hälfte kleiner als die erfindungsgemäße tetraploide Lupine.

Auch die Blüten, der erfindungsgemäßen Lupine in tetraploider Ausführungsform sind deutlich größer als diejenigen der Vergleichsarten L. angustifolius und L. albus gemäß Fig. 3.

Fig. 4 zeigt eine Fotographie des dritten Laubblattes der erfindungsgemäßen tetraploiden Lupine am Hauptsproß im Größenvergleich zu einem Streichholz.

Fig. 5 zeigt eine Fotographie eines Blattes einer erfindungsgemäßen oktoploiden Lupine mit besonderer Morphologie, die sich dramatisch von der erfindungsgemäßen tetraploiden Lupine sowie gegenüber den Lupinen des Standes der Technik absetzt.

Um eine Größenvorstellung zu erhalten, wurde eine Fliege, hier Sarcophaga carnaria, mit fotographiert.

Die Fig. 1 bis 5 zeigen eindrucksvoll, daß die gesamte Pflanzenmasse der neuen Lupinenarten um ein Vielfaches höher ist als bei den Lupinenarten des Standes der Technik.

Keimwurzelgewebe und Blattspreitengewebe wurden einer Ploidie- Kontrolle mittels Durchflußcytometrie unterworfen. Die Ploidiegrade wurden von der Firma Partec GmbH in Münster bestimmt.

Die Messung des Ploidiegrades geschah gemäß A. M. M. de Laat, W. Göhde und M. J. D. C. Vogelsang: "Determination of Ploidy of Single Plants and Plant Populations by Flow Cytometry", Plant Breeding 99, 303- 307 (1987) und I. Ulrich und W. Ulrich: "High-resolution flow cytometry of nuclear DNA in higher plants", Protoplasma (1991) 165: 212-215. Als Fluoreszenzfarbstoff wurde DAPI (4'-,6-diamidino-2-phenylindol) eingesetzt.

Als Ergebnis der Messung des Ploidiegrades ergeben sich sogenannte Histogramme, bei welchen die Ordinate die Zahl der Kerne pro Kanal angibt, während die Abszisse die Fluoreszensintensitäten, welche proportional zum relativen DNA-Gehalt der gemessenen Kerne sind, ausgedrückt als Kanalnummer, angeben.

Fig. 6 zeigt ein derartiges Histogramm, bei welchem 4 Peaks erkennbar sind. Peak 1 entspricht haploiden G1-Kernen, Peak 2 entspricht haploiden G2- und diploiden G1-Kernen, Peak 3 entspricht diploiden G2- und tetraploiden G1-Kernen und Peak 4 entspricht tetraploiden G2- und oktoploiden G1-Kernen.

Ganz links in Fig. 6 zeigen die Histogramme Kernfragmente, die durch die Präparation entstehen. Die Häufigkeit, mit der die einzelnen Populationen vorkommen, entspricht den Flächen unter den einzelnen Peaks.

Die Fig. 7 und 8 zeigen jeweils ein solches Histogramm der Proben 3 und 5 der erfindungsgemäßen Lupinen.

Bei den sich ergebenden Histogrammen gemäß der Fig. 7 und 8 stellte sich heraus, daß tetraploide Lupinen erhalten wurden, was sich an dem Peak bei Kanal 200 ablesen läßt.

Darüberhinaus finden sich in diesen Histogrammen auch Hinweise dafür, daß höherploide Lupinen erhalten wurden, was man an den kleinen Peaks < Kanal 300 sowie an dem Blatt gemäß Fig. 5 erkennen kann.

Fig. 9 zeigt ein weiteres Histogramm einer Lupinenprobe, aus welchem sich ergibt, daß mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auch oktoploide Lupinen erhalten werden. Dies folgt daraus, daß neben dem Peak um Kanal 200, der tetraploiden G2- und oktoploiden G1-Kernen entspricht, noch ein deutlicher weiterer Peak jenseits von Kanal 300 zu erkennen ist.

Wie in Fig. 5 gezeigt, haben oktoploide Lupinen eine völlig andere Morphologie im Vergleich zu tetraploiden oder gar zu den Lupinenarten des Standes der Technik.

Die erfindungsgemäßen polyploiden Lupinen stellen neue Kulturpflan zenarten dar, welche als Süßlupinen eine für die menschliche und tierische Ernährung geeignete Pflanze ist, und die das genetische Potential haben, die Sojabohne in der Qualität zu erreichen und in der Flächenleistung klar zu übertreffen.

Die Süßlupinen des Standes der Technik enthalten in der Regel immer noch Bitterstoffe, also Alkaloide in der Größenordnung von 0,02 bis 3%, wobei ein Bitterstoffgehalt der Größenordnung über ca. 0,02% als Nah rung für Mensch oder Tier ungeeignet ist.

Die erfindungsgemäßen polyploiden, insbesondere tetraploiden, Lupinen, welche in einem abgeschlossenen, nicht der Öffentlichkeit zugänglichen Areal angebaut wurden, wurden seit über sieben Jahren regelmäßig auf ihren Alkaloidgehalt hin untersucht und es wurden nach dem Verfahren von Plarre, W. et al. (1975) "Verbesserte Methodik zur qualitativen bis halbquantitativen Alkaloidbestimmung bei Lupinen", Z. Pflanzenzüchtung 74, 89 bis 96, keine Alkaloide gefunden.

Auch die parallele sensorische Testung der erfindungsgemäßen Lupine ergab bezüglich der Bitterstoffe ein negatives Resultat.

Darüberhinaus hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße Lupine, nach bisherigen Beobachtungen, dem Pilz Colletotrichum spec. gegenüber, der vermutlich aus Chile, sekundär aber auch aus osteuropäischen Beständen eingetragen wurde und eine als Antracnose bekannte Lupinenerkrankung verursacht, wahrscheinlich resistent ist. Trotz experimentell vollzogener Kontakte trat keine Antracnose auf.

Die physiologische Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen poly ploiden Pflanzen, insbesondere Lupinen, bevorzugt der neuen tetraploiden Lupinenart, liegt in ihrer höheren Biomasse und im zu erwartenden höheren Öl- und Proteingehalt gegenüber bekannten Lupinenarten bei gleichzeitigem Freisein von Bitterstoffen.

Im kleinrahmigen Feldanbau der erfindungsgemäßen Lupinenart hat sich ebenfalls herausgestellt, daß Erdhummelvölker, besonders die Varietät Bombus magnus flavoscutellaris, welche in der Nähe der Lupinenfelder an gesiedelt werden, die neuen Lupinen bestäuben, und den Ertrag der erfin dungsgemäßen tetraploiden Lupine steigern können. Zu Details hierfür wird nochmals verwiesen auf Wolfgang D. Gärditz: "Die Bedeutung der heimi schen Hummeln und Bienen (Apoideae) für die Ertragsstruktur der Weißen Lupine (Lupinus albus L.), Dissertation am Lehrstuhl für Biogeographie, Abteilung Agrarökologie der Universität Bayreuth, 1989, auf welche hiermit diesbezüglich vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Tabelle 1 zeigt eine Aminosäureanalyse von Linien α, β, γ einer erfindungsgemäßen tetraploiden Lupine.

Tabelle 1

Aminosäureanalyse von 3 Linien einer erfindungsgemäßen tetraploiden Lupine

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer polyploiden Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß
man Protoplasten aus Zellen diploider Pflanzen herstellt, die Protoplasten fusioniert und Mehrlingsprotoplasten isoliert;
man konzeptionsfähige Fruchtknoten einer Empfängerpflanze öffnet,
man die isolierten Mehrlingsprotoplasten in den Embryosack einbringt;
man den Fruchtknoten wieder verschließt;
man die Narbe des Empfängerfruchtknotens mit reifem Pollen einer Fremdpflanze bestäubt;
man den polyploiden Pflanzenembryo zu einem keimfähigen Samen ausreifen läßt; und
den Samen zu einer polyploiden Pflanze auskeimen läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen aus Lupinen, insbesondere Zellen aus Lupinus albus L., vorzugsweise Linie C17/8, verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß tetraploide Lupinen hergestellt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Protoplasten Apikalmeristemgewebe verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Apikalmeristemgewebe enzymatisch aufgeschlossen wird und die Zellwände der Meristemzellen mit einer Cellulase entfernt werden, um Protoplasten zu erhalten.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Protoplasten durch Zentrifugation über einen Dichtegradienten, insbe sondere einen Ficoll- und/oder Rohrzuckerdichtegradienten, isoliert werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Protoplasten mit einem Polyethylenglykol, insbesondere mit einem solchen, welches eine Molekularmasse von ca. 1550 Da aufweist, fusioniert werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß fusionierte Protoplasten durch Zentrifugation über einen Dichtegradienten, insbesondere einen Ficoll- und/oder Rohrzucker dichtegradienten, nach Zwillings- und Mehrlings protoplasten getrennt und vorzugsweise angereichert werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß vorzugsweise Zwillings protoplasten in den Embryosack eingebracht werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Schnitt an dem behandelten Fruchtknoten mit Wollwachs geschlossen wird, wobei dem Wollwachs vorzugsweise ein Breitbandantibiotikum und/oder Antimykotikum zugesetzt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der behandelte Blütenstand zum Schutz vor Wasserverlust und Sekundärinfektionen mit luftdurchlässiger Folie umhüllt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß nach ca. 24 bis 48 h alle nicht transplantierten Fruchtknoten der Inflorescens entfernt werden.

13. Polyploide Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich ist nach einem Verfahren gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 12.

14. Polyploide Pflanze nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine tetraploide Lupine ist.

15. Polyploide Pflanze nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich ist aus Lupinus albus L., vorzugsweise Linie C17/8.

16. Polyploide Pflanze nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Vergleich zur Mutterpflanze wenigstens die doppelte Blattgröße erreicht.

17. Polyploide Pflanze nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Saatgut und/oder durch Zellkultur vermehrungsfähig ist.

18. Polyploide Pflanze nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen alkaloidfrei ist.

19. Polylploide Pflanze nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie als tetraploide Lupine ähnliche Aminosäuren- und Ölspektren wie die weiße Lupine aufweist.

20. Polylploide Pflanze nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie als tetraploide Lupine mit keiner anderen Pflanze fertil kreuzbar ist.

21. Polylploide Pflanze nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie als tetraploide Lupine einen im Vergleich zu diploiden Arten einen zweifach höheren DNA-Gehalt aufweist, wobei die DNA insbesondere in ca. 100 Chromosomen vorliegt.

22. Vermehrungsgut einer polyploiden Pflanze nach einem der Ansprüche 13 bis 21.

23. Vermehrungsgut nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es Vermehrungsgut, insbesondere Samenkörner, von polyploiden, insbesondere tetraploiden, Lupinen ist.

24. Vermehrungsgut nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Meristemzellen, insbesondere apikale Meristemzellen tetraploider Lupinen handelt.