CN105660407B - 一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法 - Google Patents

一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法 Download PDF

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Abstract

一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，涉及羽扇豆“画廊”种苗快繁和优良遗传性状保存技术，尤其是一种结合愈伤组织诱导和瓶外生根培养产生再生植株的方法，包括叶片处理、愈伤组织诱导、分化培养、增殖培养与再分化、瓶外生根培养及移栽定植。本发明采用离体叶片诱导愈伤组织，再通过愈伤组织分化产生不定芽，继而结合瓶外生根培养获得再生植株的方法。采用本发明方法，叶片污染率小于5%，愈伤组织诱导率72.8%，芽分化率79.5%，增殖与再分化率83.6%，瓶外生根成活率85.3%，移栽成活率92.5%。有效解决羽扇豆“画廊”种苗生产需求和优良单株无性繁殖问题，可用于规模化生产及优良遗传性状高效保存。

Description

一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法
技术领域
本发明涉及一种羽扇豆“画廊”叶片快速诱导再生植株的方法，属花卉组织培养技术领域。
背景技术
羽扇豆(Lupins polyphyllus Lindl)属豆科蝶形花亚科羽扇豆属一年至多年生草本植物，俗称鲁冰花，因其赋予特殊的寓意—中国的母亲花，而得到人们的加倍钟爱。“画廊”是市场上培育的早花羽扇豆品种，有粉红色、红色、白色、黄色、蓝色及混色等花色系列，株形紧凑、叶片茂盛，株高40～50cm，也是非常优秀的矮生盆栽品种，它的出现使羽扇豆有机会从园林应用中走进普通家庭。
羽扇豆“画廊”以种子繁殖为主，但因羽扇豆为自花授粉植物，种子繁殖系数低，种子以进口为主，相应成本占生产成本的30％，且时间和数量上很难保证，优质种苗生产成为制约羽扇豆“画廊”在我国推广的瓶颈。目前，以进口种子为外植体进行羽扇豆“画廊”组织培养快繁的技术仍不够成熟，种苗难以供应；另外，在栽培生产过程中通过自然筛选或育种选育的优良羽扇豆“画廊”单株，因其结实率非常低，其优良性状很难遗传给后代，良种推广严重受阻。因此，结合瓶外生根技术进行羽扇豆“画廊”叶片离体快繁，不仅可以解决种苗供需矛盾，降低生产成本，也可以对筛选的优良单株进行无性繁殖，保存其优良性状，对羽扇豆良种选育和培育工作具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的问题是羽扇豆“画廊”种苗供需矛盾和优良单株无性繁殖问题，为生产提供一种可周年生产的低成本羽扇豆“画廊”优质种苗快速繁殖及优良单株遗传性状高效保存的方法。
本发明的技术方案是，一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，包括叶片处理、愈伤组织诱导、分化培养、增殖培养与再分化、瓶外生根培养及移栽定植步骤，其特征在于，所述方法步骤为：
(1)剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30min，通过主脉横切成1cm宽的片状；在超净工作台上，先用75％酒精消毒10s，无菌水漂洗2次；再用10％的NaOCl磁力搅拌5min，无菌水漂洗5次；然后用0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次；最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分；切断叶缘，以横切主脉的形式切成3mm×3mm块状，并在主脉上横切2～3个切口；
(2)将处理好的叶片背面朝下接种到愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上；接种后先在22℃的恒温恒湿培养箱中进行暗培养15d；再进行光照培养，15～20d产生黄绿色疏松透明的愈伤组织；
其中，MS是培养基(Murashige&Skoog Medium)，6-BA是6-苄氨基嘌呤，ZT是玉米素，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，VC是抗坏血酸；
(3)当愈伤组织长到1mm或稍大些时，及时转移到分化培养基MS+6-BA 0.8mg/L+ZT0.6mg/L+IAA0.2mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上；继续光照培养，20～25d形成浅绿色质地致密的愈伤组织，并在愈伤组织上分化出绿色芽点；
其中，MS是培养基(Murashige&Skoog Medium)，6-BA是6-苄氨基嘌呤，ZT是玉米素，IAA是3-吲哚乙酸，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，VC是抗坏血酸；
(4)切下愈伤组织上生长的绿色芽点，接种到增殖与再分化诱导培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA 0.25mg/L+AC 2.0g/L+GA3 1.0mg/L上；继续光照培养，25～30d可分化出健康丛生芽；
其中，MS是培养基(Murashige&Skoog Medium)，6-BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是α-萘乙酸，AC是活性炭，GA3是赤霉素；
(5)将产生的2～3cm健康单个芽切下，先在生根液中浸泡3min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚；扦插后的15d内大棚相对空气湿度保持在85％以上，温度控制在15℃～25℃；扦插20d后，每10d用1/2MS大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒3次；育苗袋为无底蜂窝育苗袋，规格是8cm×13cm×350孔；营养基质的体积比是腐叶土:红壤土:骨粉＝6:2:2；营养基质事先充分暴晒后，用1000倍甲基托布津消毒，薄膜覆盖，7d后扦插；20d可见明显生根，30～35d可见新芽生出，50d后即可移栽定植；
(6)将步骤(5)生长良好的幼苗进行定植，营养钵规格为25cm×20cm，营养土按体积比为表层田土:泥炭土＝5:2比例混合均匀；栽种选择下午进行，及时浇灌封口水，连续3天注意保持土壤湿润。
所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)的培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。
所述步骤(2)和步骤(3)，光照培养的光照强度2000～2500Lux，每天光照12h，培养温度为(22±2)℃。
所述步骤(4)，光照培养的光照强度3000～3500Lux，每天光照14h，培养温度为(22±2)℃。
所述生根液为NAA 300mg/L+VB1 0.15g/L，其中，NAA是α-萘乙酸，VB1是维生素B1。
本发明的有益效果是，本发明采用羽扇豆“画廊”叶片获得愈伤组织，再通过增殖培养与再分化获得丛生芽，进而结合瓶外生根技术获得完整植株的方法。叶片污染率小于5％，愈伤组织诱导率为72.8％，愈伤组织呈黄绿色疏松透明状；芽分化率为79.5％，分化时间短；分化健康丛生芽数量多，增殖与再分化率为83.6％；瓶外生根成活率为85.3％，根系短而粗壮，移栽成活率为92.5％。本发明可快速进行羽扇豆“画廊”种苗规模化生产，及优良单株遗传性状高效保存，有利于羽扇豆“画廊”的推广种植。
本发明适用于羽扇豆“画廊”工厂化种苗培育及优良单株遗传性状保存。
附图说明
图1为一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法流程图。
具体实施方式
实施例1
本实例以愈伤组织诱导与分化培养基中不添加细胞分裂素ZT，以及愈伤组织诱导培养不经过暗培养为对照，包括以下步骤：
1、叶片处理：剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30min，通过主脉横切成1cm宽的片状。在超净工作台上，先用75％酒精消毒10s，无菌水漂洗2次；再用10％的NaOCl磁力搅拌5min，无菌水漂洗5次；然后用0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次；最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分。切断叶缘，以横切主脉的形式切成3mm×3mm块状，并在主脉上横切2～3个切口。
2、愈伤组织诱导：将处理好的叶片背面朝下接种到培养基MS+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上，培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。接种后先在22℃的恒温恒湿培养箱中进行暗培养15d；再进行光照培养15～20d，光照强度2000～2500Lux，每天光照12h，培养温度(22±2)℃。
对照叶片接种到培养基MS+6-BA 0.5mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上培养30～35d。培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内，培养温度(22±2)℃，光照强度2000～2500Lux，每天光照12h。
3、分化培养：当愈伤组织长到1mm或稍大些时，及时转移到分化培养基MS+6-BA0.8mg/L+ZT 0.6mg/L+IAA 0.2mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上培养20～25d。培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内，培养温度(22±2)℃，光照强度2000～2500Lux，每天光照12h。
对照愈伤组织及时转移到分化培养基MS+6-BA0.8mg/L+IAA0.2mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上。
4、增殖培养与再分化：切下愈伤组织上生长的绿色芽点，接种到增殖与再分化诱导培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.25mg/L+AC 2.0g/L+GA31.0mg/L上培养25～30d。培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内，培养温度(22±2)℃，光照强度3000～3500Lux，每天光照14h。
5、瓶外生根培养：将2～3cm的健康单个芽切下，先在生根液(NAA 300mg/L+VB10.15g/L)中浸泡3min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚。扦插后的15d内大棚相对空气湿度保持在85％以上，温度控制在15℃～25℃。扦插20d后，每10天用1/2MS大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒3次。育苗袋为无底蜂窝育苗袋，规格是8cm×13cm×350孔。营养基质的体积比是腐叶土:红壤土:骨粉＝6:2:2，营养基质事先充分暴晒后，用1000倍甲基托布津消毒，薄膜覆盖，7d后扦插。
6、移栽定植：将生长良好的幼苗进行定植，营养钵规格为25cm×20cm，营养土按体积比为表层田土:泥炭土＝5:2比例混合均匀。栽种选择下午进行，及时浇灌封口水，连续3天注意保持土壤湿润。
7、试验处理愈伤组织诱导率72.8％，芽分化率79.5％，增殖与再分化率83.6％。对照愈伤组织诱导率45.6％，芽分化率64.5％，增殖与再分化率77.2％。
实施例2
本实例以增殖与再分化培养基中添加不同浓度的6-BA和NAA为对照，包括以下步骤：
1、叶片处理：剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30min，通过主脉横切成1cm宽的片状。在超净工作台上，先用75％酒精消毒10s，无菌水漂洗2次；再用10％的NaOCl磁力搅拌5min，无菌水漂洗5次；然后用0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次；最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分。切断叶缘，以横切主脉的形式切成3mm×3mm块状，并在主脉上横切2～3个切口。
2、愈伤组织诱导：将处理好的叶片背面朝下接种到培养基MS+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上，培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。接种后先在22℃的恒温恒湿培养箱中进行暗培养15d；再进行光照培养15～20d，光照强度2000～2500Lux，每天光照12h，培养温度(22±2)℃。
3、分化培养：当愈伤组织长到1mm或稍大些时，及时转移到分化培养基MS+6-BA0.8mg/L+ZT 0.6mg/L+IAA 0.2mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上培养20～25d。培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内，培养温度(22±2)℃，光照强度2000～2500Lux，每天光照12h。
4、增殖培养与再分化：切下愈伤组织上生长的绿色芽点，接种到增殖与再分化诱导培养基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.25mg/L+AC 2.0g/L+GA3 1.0mg/L上培养25～30d。培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内，培养温度(22±2)℃，光照强度3000～3500Lux，每天光照14h。
对照叶片接种到培养基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+AC 2.0g/L+GA3 1.0mg/L上培养25～30d。培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内，培养温度(22±2)℃，光照强度3000～3500Lux，每天光照14h。
5、瓶外生根培养：将2～3cm的健康单个芽切下，先在生根液(NAA 300mg/L+VB10.15g/L)中浸泡3min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚。扦插后的15d内大棚相对空气湿度保持在85％以上，温度控制在15℃～25℃。扦插20d后，每10天用1/2MS大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒3次。育苗袋为无底蜂窝育苗袋，规格是8cm×13cm×350孔。营养基质的体积比是腐叶土:红壤土:骨粉＝6:2:2，营养基质事先充分暴晒后，用1000倍甲基托布津消毒，薄膜覆盖，7d后扦插。
6、移栽定植：将生长良好的幼苗进行定植，营养钵规格为25cm×20cm，营养土按体积比为表层田土:泥炭土＝5:2比例混合均匀。栽种选择下午进行，及时浇灌封口水，连续3天注意保持土壤湿润。
7、试验处理愈伤组织再分化率83.6％，瓶外生根成活率85.3％；对照愈伤组织再分化率57.4％，瓶外生根成活率71.5％。
实施例3
本实例以瓶外生根培养时生根液浓度和浸泡时间不同，以及移栽定植时的营养土配比不同为对照，包括以下步骤：
1、叶片处理：剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30min，通过主脉横切成1cm宽的片状。在超净工作台上，先用75％酒精消毒10s，无菌水漂洗2次；再用10％的NaOCl磁力搅拌5min，无菌水漂洗5次；然后用0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次；最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分。切断叶缘，以横切主脉的形式切成3mm×3mm块状，并在主脉上横切2～3个切口。
2、愈伤组织诱导：将处理好的叶片背面朝下接种到培养基MS+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上，培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。接种后先在22℃的恒温恒湿培养箱中进行暗培养15d；再进行光照培养15～20d，光照强度2000～2500Lux，每天光照12h，培养温度(22±2)℃。
3、分化培养：当愈伤组织长到1mm或稍大些时，及时转移到分化培养基MS+6-BA0.8mg/L+ZT 0.6mg/L+IAA 0.2mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上培养20～25d。培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内，培养温度(22±2)℃，光照强度2000～2500Lux，每天光照12h。
4、增殖培养与再分化：切下愈伤组织上生长的绿色芽点，接种到增殖与再分化诱导培养基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.25mg/L+AC 2.0g/L+GA3 1.0mg/L上培养25～30d。培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。此期间内，培养温度(22±2)℃，光照强度3000～3500Lux，每天光照14h。
5、瓶外生根培养：将2～3cm的健康单个芽切下，先在生根液(NAA 300mg/L+VB10.15g/L)中浸泡3min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚。扦插后的15d内大棚相对空气湿度保持在85％以上，温度控制在15℃～25℃。扦插20d后，每10天用1/2MS大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒3次。育苗袋为无底蜂窝育苗袋，规格是8cm×13cm×350孔。营养基质的体积比是腐叶土:红壤土:骨粉＝6:2:2，营养基质事先充分暴晒后，用1000倍甲基托布津消毒，薄膜覆盖，7d后扦插。
对照培养将2～3cm的健康单个芽切下，先在生根液(NAA 100mg/L+VB1 0.15g/L)中浸泡5min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚。
6、移栽定植：将生长良好的幼苗进行定植，营养钵规格为25cm×20cm，营养土按体积比为表层田土:泥炭土＝5:2比例混合均匀。栽种选择下午进行，及时浇灌封口水，连续3天注意保持土壤湿润。
对照将生长良好的幼苗定植在装有表层田土的营养钵中，营养钵规格为25cm×20cm。
7、试验处理瓶外生根成活率85.3％，移栽成活率92.5％；对照瓶外生根成活率72.6％，移栽成活率84.1％。

Claims (4)

1.一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，包括叶片处理、愈伤组织诱导、分化培养、增殖培养与再分化、瓶外生根培养及移栽定植步骤，其特征在于，所述方法步骤为：
(1)剪下离叶尖2/3的幼嫩叶片，用流水冲洗30min，通过主脉横切成1cm宽的片状；在超净工作台上，先用75％酒精消毒10s，无菌水漂洗2次；再用10％的NaOCl磁力搅拌5min，无菌水漂洗5次；然后用0.1％的升汞溶液消毒3min，无菌水漂洗5次；最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分；切断叶缘，以横切主脉的形式切成3mm×3mm块状，并在主脉上横切2～3个切口；
(2)将处理好的叶片背面朝下接种到愈伤组织诱导培养基MS+6-BA 0.5mg/L+ZT1.0mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上；接种后先在22℃的恒温恒湿培养箱中进行暗培养15d；再进行光照培养，15～20d产生黄绿色疏松透明的愈伤组织；
其中，MS是培养基，6-BA是6-苄氨基嘌呤，ZT是玉米素，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，VC是抗坏血酸；
(3)当愈伤组织长到1mm或稍大些时，及时转移到分化培养基MS+6-BA 0.8mg/L+ZT0.6mg/L+IAA 0.2mg/L+水解酪蛋白(CH)300mg/L+PVP 5.0mg/L+VC 1.0mg/L上；继续光照培养，20～25d形成浅绿色质地致密的愈伤组织，并在愈伤组织上分化出绿色芽点；
其中，MS是培养基，6-BA是6-苄氨基嘌呤，ZT是玉米素，IAA是3-吲哚乙酸，PVP是聚乙烯吡咯烷酮，VC是抗坏血酸；
(4)切下愈伤组织上生长的绿色芽点，接种到增殖与再分化诱导培养基MS+6-BA1.5mg/L+NAA 0.25mg/L+AC 2.0g/L+GA3 1.0mg/L上；继续光照培养，25～30d可分化出健康丛生芽；
其中，MS是培养基，6-BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是α-萘乙酸，AC是活性炭，GA3是赤霉素；
(5)将产生的2～3cm健康单个芽切下，先在生根液中浸泡3min，再扦插至装有营养基质的育苗袋后置于温室大棚；扦插后的15d内大棚相对空气湿度保持在85％以上，温度控制在15℃～25℃；扦插20d后，每10d用1/2MS大量元素母液作为肥料进行喷洒一次，连续喷洒3次；育苗袋为无底蜂窝育苗袋，规格是8cm×13cm×350孔；营养基质的体积比是腐叶土:红壤土:骨粉＝6:2:2；营养基质事先充分暴晒后，用1000倍甲基托布津消毒，薄膜覆盖，7d后扦插；20d可见明显生根，30～35d可见新芽生出，50d后即可移栽定植；所述生根液为NAA300mg/L+VB1 0.15g/L，其中，NAA为α-萘乙酸，VB1是维生素B1；
(6)将步骤(5)生长良好的幼苗进行定植，营养钵规格为25cm×20cm，营养土按体积比为表层田土:泥炭土＝5:2比例混合均匀；栽种选择下午进行，及时浇灌封口水，连续3天注意保持土壤湿润。
2.根据权利要求1所述一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)的培养基中白砂糖45g/L，琼脂6g/L，pH值为5.8～5.9。
3.根据权利要求1所述一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，所述步骤(2)和步骤(3)，光照培养的光照强度2000～2500Lux，每天光照12h，培养温度为(22±2)℃。
4.根据权利要求1所述一种结合瓶外生根技术的羽扇豆“画廊”叶片快繁方法，所述步骤(4)，光照培养的光照强度3000～3500Lux，每天光照14h，培养温度为(22±2)℃。
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