CN104686343A

CN104686343A - 一种菜薹小孢子离体培养方法

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Publication number: CN104686343A
Application number: CN201510085933.XA
Authority: CN
Inventors: 梁彩英
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-02-22
Filing date: 2015-02-22
Publication date: 2015-06-10

Abstract

本发明公开了一种菜薹小孢子离体培养方法，涉及菜薹（Brassica capestris ）花粉离体培养方法，即通过离体培养使花粉脱分化启动发育为单倍体植株的一种技术。本发明以红菜薹作为材料，经过花蕾采集及预处理、胚状体诱导、胚状体分化、生根培养、炼苗移栽等过程建立了菜薹小孢子离体培养技术体系，为培育大量花培植株构建DH群体，进行遗传性状筛选、分子标记、遗传图谱和基因定位研究奠定基础。

Description

一种菜薹小孢子离体培养方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术中单倍体育种方法，具体地说，涉及一种菜薹小孢子离体培养方法。

背景技术

菜薹（Brassica capestris ）为属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的变种，为一二年生草本植物，是原产我国的一种地方特色蔬菜，也是南方地区的主要蔬菜作物之一，其品质柔嫩、风味可口，为佐餐之佳品。近年来，南方各地大力推广水稻收割后冬季闲田种植外运型菜薹模式，因其投入少、成本低、风险小、效益好，使得菜薹种植面积急剧增加，已发展成为引导农业致富的大产业。

菜薹为异花授粉作物，多代自交衰退现象严重，自交不亲和系选育较困难，品种通过群体杂合方式保持稳定，选育杂种一代品种难度大，周期长。小孢子离体培养可达到人为改变其发育途径，使其从配子体发育转向孢子体发育途径，通过胚状体发育成完整的单倍体植株，为大量产生单倍体植株提供了有效手段。虽然菜薹的小孢子培养已经取得了较大的进展，但存在胚诱导率及植株成苗率低等问题，而本发明具有胚状体诱导率高、植株成活率高、简便、易操作等特点，适合用于培育大量花培植株以构建DH群体。

发明内容

本发明的目的在于提供出一种菜薹小孢子离体培养方法，本发明以红菜薹作为材料，经过花蕾采集及预处理、胚状体诱导、胚状体分化、生根培养、炼苗移栽等过程建立了菜薹小孢子离体培养技术体系，从而实现了本发明的目的。

本发明的一种菜薹小孢子离体培养方法，包括以下的步骤：

（1）花蕾采集及预处理：从菜薹现蕾开始，于上午8:00以前采摘符合要求的花蕾放入自封袋并装入冰袋带回室内后，摘去已经开放或花萼开裂的花蕾，其余装入玻璃瓶中置于2～4℃条件下进行低温预处理1～5天后。经低温处理后去除过大和过小的以及表面有损伤开裂的花蕾，只保留2.0～3.0mm左右的花蕾。

（2）胚状体诱导：将步骤（1）处理后的花蕾先70%～80%乙醇浸泡5～10s，0.1%升汞溶液消毒8～20min，再用无菌水清洗3～5次后置于无菌滤纸上用已消毒的镊子和解剖针剖开花蕾，切去花丝，将一定量的花药并接种于胚诱导培养基上进行胚状体诱导。接种后置于30～38℃恒温培养箱中热暗培养12～48小时后转至25～28℃的条件下继续暗培养直至形成胚状体。

（3）分化培养：当步骤（2）形成的胚状体生长至子叶期后置于光照强度为200～500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养1～5天，待胚状体转绿后转接于分化培养基中进行分化培养。接种置于每天光照10～12小时，光照强度为2000～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成较多丛生芽。

（4）生根培养：将步骤（3）所获得的高度约为1～2cm的丛生芽切割并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～7天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为2000～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根。

（5）炼苗移栽：待幼苗长至几条短的白根后置于自然光照下炼苗5～7天后，洗净根部培养基，移栽由营养土：沙土＝4:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田。

上述步骤（1）所述的符合要求的花蕾是指：长度2.0～3.0mm，花瓣为花药的1/2～4/5的花蕾，此时的小孢子经镜检绝大部分处于单核期或单核靠边期。

上述步骤（2）所述的胚诱导培养基为：MS+1～3mg/L 6-BA+0.3～1.5mg/L NAA+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。

上述步骤（2）所述的一定量花粉是指小孢子接种密度为2×10⁵个/ml。

上述步骤（3）所述的分化培养基为：MS+0.01～0.5mg/L NAA+0.1～1mg/L 6-BA+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。

上述步骤（4）所述的生根培养基为：MS+0.1～0.5mg/L NAA+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。

与现有技术相比本发明的优点是：本发明通过离体培养使花粉脱分化启动发育为单倍体植株的一种技术。以红菜薹作为材料，经过花蕾采集及预处理、胚状体诱导、胚状体分化、生根培养、炼苗移栽等过程建立了菜薹小孢子离体培养技术体系，为培育大量花培植株构建DH群体，进行遗传性状筛选、分子标记、遗传图谱和基因定位研究奠定基础。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

（1）花蕾采集及预处理：从菜薹现蕾开始，于上午8:00以前采摘长度2.0～3.0mm，花瓣为花药的1/2～4/5的花蕾放入自封袋并装入冰袋带回室内后，摘去已经开放或花萼开裂的花蕾，其余装入玻璃瓶中置于2℃条件下进行低温预处理1天后。经低温处理后去除过大和过小的以及表面有损伤开裂的花蕾，只保留2.0～3.0mm左右的花蕾。

（2）胚状体诱导：将步骤（1）处理后的花蕾先75%乙醇浸泡5s，0.1%升汞溶液消毒8min，再用无菌水清洗3次后置于无菌滤纸上用已消毒的镊子和解剖针剖开花蕾，切去花丝，将花药以2×10⁵个/ml密度接种于胚诱导培养基上进行胚状体诱导。接种后置于33℃恒温培养箱中热暗培养24小时后转至28℃的条件下继续暗培养28天即可形成胚状体，出胚率为83.4%。所述的胚诱导培养基为MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+2.0%蔗糖+0.35%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。

（3）分化培养：当步骤（2）形成的胚状体生长至子叶期后置于光照强度为200lx，培养温度为28℃的条件下培养2天，待胚状体转绿后转接于分化培养基中进行分化培养。接种置于每天光照10小时，光照强度为2000lx，培养温度为28℃的条件下培养10后即可形成较多丛生芽。所述的分化培养基为MS+0.05mg/L NAA+0.8mg/L 6-BA+3.5%蔗糖+0.5%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。

（4）生根培养：将步骤（3）所获得的高度约为1～2cm的丛生芽切割并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照10小时，光照强度为2000lx，培养温度为28℃的条件下培养7天即可生根，生根率可达95%以上。所述的生根培养基为MS+0.3mg/L NAA+2.0%蔗糖+0.5%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。

（5）炼苗移栽：待幼苗长至几条短的白根后置于自然光照下炼苗5～7天后，洗净根部培养基，移栽由营养土：沙土＝4:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养3天，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率可达98%。

实施例2：

（1）花蕾采集及预处理：从菜薹现蕾开始，于上午8:00以前采摘长度2.0～3.0mm，花瓣为花药的1/2～4/5的花蕾放入自封袋并装入冰袋带回室内后，摘去已经开放或花萼开裂的花蕾，其余装入玻璃瓶中置于4℃条件下进行低温预处理2天后。经低温处理后去除过大和过小的以及表面有损伤开裂的花蕾，只保留2.0～3.0mm左右的花蕾。

（2）胚状体诱导：将步骤（1）处理后的花蕾先78%乙醇浸泡7s，0.1%升汞溶液消毒10min，再用无菌水清洗5次后置于无菌滤纸上用已消毒的镊子和解剖针剖开花蕾，切去花丝，将花药以2×10⁵个/ml密度接种于胚诱导培养基上进行胚状体诱导。接种后置于36℃恒温培养箱中热暗培养30小时后转至28℃的条件下继续暗培养30天即可形成胚状体，出胚率为78.1%。所述的胚诱导培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+2.0%蔗糖+0.35%琼脂+0.06%活性炭，pH值为5.8。

（3）分化培养：当步骤（2）形成的胚状体生长至子叶期后置于光照强度为500lx，培养温度为28℃的条件下培养3天，待胚状体转绿后转接于分化培养基中进行分化培养。接种置于每天光照11小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养10后即可形成较多丛生芽。所述的分化培养基为MS+0.2mg/L NAA+1mg/L 6-BA+3.5%蔗糖+0.5%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。

（4）生根培养：将步骤（3）所获得的高度约为1～2cm的丛生芽切割并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养5天，然后置于每天光照11小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养6天即可生根，生根率可达90%以上。所述的生根培养基为MS+1mg/L NAA+2.0%蔗糖+0.5%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。

（5）炼苗移栽：待幼苗长至几条短的白根后置于自然光照下炼苗5～7天后，洗净根部培养基，移栽由营养土：沙土＝4:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养2天，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率可达92%。

Claims

1.一种菜薹小孢子离体培养方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）花蕾采集及预处理：从菜薹现蕾开始，于上午8:00以前采摘符合要求的花蕾放入自封袋并装入冰袋带回室内后，摘去已经开放或花萼开裂的花蕾，其余装入玻璃瓶中置于2～4℃条件下进行低温预处理1～5天后,经低温处理后去除过大和过小的以及表面有损伤开裂的花蕾，只保留2.0～3.0mm左右的花蕾；

（2）胚状体诱导：将步骤（1）处理后的花蕾先70%～80%乙醇浸泡5～10s，0.1%升汞溶液消毒8～20min，再用无菌水清洗3～5次后置于无菌滤纸上用已消毒的镊子和解剖针剖开花蕾，切去花丝，将一定量的花药并接种于胚诱导培养基上进行胚状体诱导,接种后置于30～38℃恒温培养箱中热暗培养12～48小时后转至25～28℃的条件下继续暗培养直至形成胚状体；

（3）分化培养：当步骤（2）形成的胚状体生长至子叶期后置于光照强度为200～500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养1～5天，待胚状体转绿后转接于分化培养基中进行分化培养,接种置于每天光照10～12小时，光照强度为2000～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成较多丛生芽；

（4）生根培养：将步骤（3）所获得的高度约为1～2cm的丛生芽切割并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～7天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为2000～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；

（5）炼苗移栽：待幼苗长至几条短的白根后置于自然光照下炼苗5～7天后，洗净根部培养基，移栽由营养土：沙土＝4:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度,待幼苗成活后再移栽大田。

2.根据权利要求1所述的一种菜薹小孢子离体培养方法，其特征在于步骤（1）所述的符合要求的花蕾是指：长度2.0～3.0mm，花瓣为花药的1/2～4/5的花蕾，此时的小孢子经镜检绝大部分处于单核期或单核靠边期。

3.根据权利要求1所述的一种菜薹小孢子离体培养方法，其特征在于步骤（2）所述的胚诱导培养基为：MS+1～3mg/L 6-BA+0.3～1.5mg/L NAA+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。

4.根据权利要求1所述的一种菜薹小孢子离体培养方法，其特征在于步骤（2）所述的一定量花粉是指小孢子接种密度为2×10⁵个/ml。

5.根据权利要求1所述的一种菜薹小孢子离体培养方法，其特征在于步骤（3）所述的分化培养基为：MS+0.01～0.5mg/L NAA+0.1～1mg/L 6-BA+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。

6.根据权利要求1所述的一种菜薹小孢子离体培养方法，其特征在于步骤（4）所述的生根培养基为：MS+0.1～0.5mg/L NAA+2.0%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。