CN102210259A - 一种萝卜与芜菁属间远缘杂交获得离体胚的方法 - Google Patents

Abstract

一种萝卜与芜菁间远缘杂交获得离体胚的方法，其特征在于按以下步骤依次组成：(1)材料准备、(2)播种、(3)套袋、挂牌、(4)授粉、(5)胚胎抢救，采用本发明的方法成功获得萝卜与芜菁间远缘杂交离体胚，并培养出杂种胚幼苗，以利于得到育种新资源。

Description

一种萝卜与芜菁属间远缘杂交获得离体胚的方法

技术领域

本发明为植物组织培养快速繁殖领域，具体涉及一种萝卜与芜菁属间远缘杂交获得离体胚的方法。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)是我国栽培的主要蔬菜作物之一，十字花科、萝卜属，一、二年生草本植物。原产我国，各地均有栽培，品种极多，常见有白皮萝卜、红皮萝卜、青皮萝卜等。根供食用，鲜食生食均可，种子含油42％，可用于制肥皂或作润滑油。种子、鲜根、叶均可入药，功能下气消积，生萝卜含淀粉酶，能助消化。大头菜(Brassica juncea Coss.var.napiformmis Palet.Bols)是芥菜的一个变种，为根用芥菜，是十字花科、芸薹属的二年生草本植物。其产品器官为肉质根，质地紧密，水份少，纤维多，形状为锥型，肉白色，肉质坚实，有强烈的芥辣味，具有宜肺豁痰、开胃理气的作用。芥菜含有丰富的维生素和大量的微量元素、糖类、蛋白质等，供食部分为肥大的肉质根。萝卜和大头菜均为根用蔬菜，但两者的风味不同。

芜菁是十字花科芸薹属的二年生草本植物，别名蔓菁等。其为直根系，下胚轴与主根上部膨大形成肉质根。芜菁喜冷凉气候，种子在2-3度时即可发芽，幼苗可耐2-3度的低温，成长的植株可耐轻霜，肉质根生长适温15-18℃，要求一定的昼夜温差。第一年主要为营养生长，形成产品器官。低温春化后，长日照和较高温度时抽薹时开花。对光照要求比较严格，光补偿点为4000勒克斯，光饱和点为2万勒克斯左右，肉质根生长期的光合强度为11.8mg二氧化碳·分。芜菁喜湿润的砂质壤土或壤土，在肉质根膨大盛期需适时灌水。有适应酸性土壤的能力。土壤pH值5.5时仍生长良好。芜菁需要较多的磷、钾肥，对增施有机肥有良好的反应。另外芜菁需要较多的磷、钾肥，对增施有机肥有良好的反应。另外芜青较耐土壤贫瘠，但肥料充足，比例适当，才能获得较高产量。

对于萝卜与芜菁的远缘杂交，特别在在杂种胚胎发育阶段出现胚胎败育时，实施胚胎抢救的最佳时期、最佳部位，培养条件等对胚胎抢救的影响国内外都没有系统研究。

发明内容

本发明提供一种萝卜与芜菁间远缘杂交获得离体胚的方法，明确了施胚胎抢救的最佳时期、最佳部位，培养条件等对胚胎抢救的影响，获得萝卜与芜菁间远缘杂交离体胚，获得杂种胚幼苗，以利于得到育种新资源。

本发明采用的技术方案是：

一种萝卜与芜菁间远缘杂交获得离体胚的方法，其特征在于按以下步骤依次组成：

(1)材料准备：以萝卜雄性不育为母本，以芜菁作为父本；

(2)播种：芜菁和萝卜种子播种在试验大棚里，对其进行常规田间管理；

(3)套袋、挂牌：萝卜和芜菁抽薹后套袋，萝卜雄性不育系每个单株单独套袋，挂牌编号标记，共10个单株，所有的数据取10个单株的平均值，大头菜不分单株，混合给萝卜授粉；

(4)授粉：套袋以后，萝卜与芜菁开花时，进行人工授粉；授粉一般在早上9点和下午3点进行，效果最佳；授粉的方法：1)在授粉之前首先用水将手洗干净，然后再用酒精消毒；2)打开纱网袋，摘下已经盛开的芜菁的花朵，摘完以后立即将纱袋封好；3)再打开萝卜植株的纱网袋，将芜菁的花粉授到萝卜的柱头上；

(5)胚胎抢救：

1)在试验田取授粉以后的荚果，取授粉后第4-10天的荚果，用小刀把果柄去掉；

2)用70％的乙醇消毒0.5min，然后用0.1％HgCl浸泡8～10min，无菌水冲洗3次，每次用无菌水浸泡3min；接种前，用无菌滤纸吸干荚表面无菌水，将其小心剥开获得杂种胚，在超净工作台上将杂种胚珠置入分化培养基；

3)当培养到长出真叶后将幼苗移至生根培养基上进行生根培养，培养室温度控制在25℃，光照16h.d^-1，光照强度2000lx，待季节恰当时将生根的幼苗移栽至营养钵中；

4)胚胎抢救期间，观察统计如下数据：测量荚长、荚的横径、统计结荚率和观察并统计杂种胚珠培养的出苗率，通过胚珠培养的结果确定萝卜与大头菜远缘杂交胚抢救的最佳时期。

在步骤(4)中为了增加花粉与柱头的亲和性，采用的是重复授粉法：连续授粉5天，并注意观察花粉与柱头的亲和性。

步骤(5)在杂种胚发育后5-7天期间进行胚抢救为最佳时期。

步骤(5)中培养基的配方为：分化培养基1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+500mg/L水解酪蛋白+0.5％活性炭和生根培养基1/2MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。

本发明取得了以下有益效果：

(1)采用的是重复授粉法提高了花粉与柱头的亲和性；

(2)确定萝卜与芜菁远缘杂交胚抢救的最佳时期：在杂交荚发育到5至7天；

(3)采用本试验所提到的生芽和生根培养基能培育出成功的试管苗有利于种资资源的创新。

具体实施方式

下面对本发明作一详细说明：

1、材料和方法

1.1供试材料

以萝卜雄性不育系DH303A为母本，以芜菁作为父本，父母本均由湖北省农科院蔬菜科技中心提供。

1.2试验方法

本试验在湖北省农科院经济作物研究所蔬菜科技中心进行。

1.2.1结荚后的胚抢救

授粉后第5、6、7天后摘荚，用7O％的乙醇消毒0.5min，然后用0.1％HgCl浸泡8～10min，无菌水冲洗3次，每次用无菌水浸泡3min。接种前，用无菌滤纸吸干荚表面无菌水，将其小心剥开获得杂种胚，在超净工作台上将杂种胚珠置入分化培养基。

当培养到长出真叶后将幼苗移至生根培养基上进行生根培养。培养室温度控制在250C，光照16h.d-1，光照强度2000lx。待季节恰当时将生根的幼苗移栽至营养钵中。

1.2.2培养基配方

分化培养基，生根培养基配方见表1。

表1  杂种胚珠培养的培养基配方[5]

2.结果与分析

2.1萝卜与芜菁属间杂交的结荚率

将芜菁的花粉分别授予5个雄性不育株萝卜单株上，统计其结荚率，其结果列于表2。

表2  萝卜与芜菁杂交的结荚率*

*结荚率(％)＝结荚数/授粉花数×100％

从表2中可以看出萝卜与芜菁杂交的结荚率为88.2％-90.0％，平均初期结荚率为88.6％，说明萝卜与芜菁杂交的初期结荚率高，杂交非常容易成功。

2.2萝卜与芜菁杂交胚败育时间

萝卜与芜菁的杂交胚珠发育到一定时间出现败育现象。败育的胚珠在外观上表现为萎蔫，发黄。荚停止生长、黄化。通过随机选取同一天授粉花20朵，最终结荚18个，对每朵花进行跟踪观察记录，统计败育时间和败育率，结果列于表3。

从表3可知，萝卜与芜菁杂交后第6天开始出现胚珠败育现象，其败育率为20.0％，但到第7天有一半的荚出现败育，有活力的胚珠最长的持续时间为10天。

表3  萝卜与芜菁杂交的天数与胚败育率之间的关系

2.3萝卜与芜菁杂种胚抢救的成苗率

在授粉后5-7天，分10个批次取杂交荚130个中的274个胚珠进行胚抢救，经过分化培养和生根培养共获得幼苗9株(表4)。这说明胚珠的败育是由于胚乳的败育所引起的。

表4  结荚后胚抢救的成苗数及成苗率

Claims (4)

1.一种萝卜与芜菁属间远缘杂交获得离体胚的方法，其特征在于按以下步骤依次组成：

(1)材料准备：以萝卜雄性不育为母本，以芜菁作为父本；

(2)播种：芜菁和萝卜种子播种在试验大棚里，对其进行常规田间管理；

(3)套袋、挂牌：萝卜和芜菁抽薹后套袋，萝卜雄性不育系每个单株单独套袋，挂牌编号标记，共10个单株，所有的数据取10个单株的平均值，大头菜不分单株，混合给萝卜授粉；

(4)授粉：套袋以后，萝卜与芜菁开花时，进行人工授粉；授粉一般在早上9点和下午3点进行，效果最佳；授粉的方法：1)在授粉之前首先用水将手洗干净，然后再用酒精消毒；2)打开纱网袋，摘下已经盛开的芜菁的花朵，摘完以后立即将纱袋封好；3)再打开萝卜植株的纱网袋，将芜菁的花粉授到萝卜的柱头上；

(5)胚胎抢救：

1)在试验田取授粉以后的荚果，取授粉后第4-10天的荚果，用小刀把果柄去掉；

2)用70％的乙醇消毒0.5min，然后用0.1％HgCl浸泡8～10min，无菌水冲洗3次，每次用无菌水浸泡3min；接种前，用无菌滤纸吸干荚表面无菌水，将其小心剥开获得杂种胚，在超净工作台上将杂种胚珠置入分化培养基；

3)当培养到长出真叶后将幼苗移至生根培养基上进行生根培养，培养室温度控制在25℃，光照16h.d^-1，光照强度2000lx，待季节恰当时将生根的幼苗移栽至营养钵中；

4)胚胎抢救期间，观察统计如下数据：测量荚长、荚的横径、统计结荚率和观察并统计杂种胚珠培养的出苗率，通过胚珠培养的结果确定萝卜与大头菜远缘杂交胚抢救的最佳时期。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(4)中为了增加花粉与柱头的亲和性，采用的是重复授粉法：连续授粉5天，并注意观察花粉与柱头的亲和性。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(5)在杂种胚发育后5-7天期间进行胚抢救为最佳时期。

4.如权利要求1或2之一所述的方法，其特征在于：培养基的配方为：分化培养基1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+500mg/L水解酪蛋白+0.5％活性炭和生根培养基1/2MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。