CN105993913B - 一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，属于生物技术育种技术领域。该具体包括如下步骤：亲本材料的播种；花期杂交授粉；考种；组织培养获得杂种苗；无菌苗驯化；杂种形态学鉴定；杂种的细胞学鉴定方法。本发明根据芸薹属和萝卜远缘杂交，芸薹属的雌蕊允许萝卜花粉萌发和花粉管伸长，但是受精后障碍严重的特点，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定浓度赤霉素到母本柱头上的方法，最大程度改善属间杂交的亲和性，授粉后，采取的是自然结荚，借助组织培养技术，进行种粒无菌培养的方法，获得了杂种苗并对其进行了形态学和细胞学的鉴定，确定是真实的属间杂种。

Description

一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法

技术领域

本发明涉及一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，属于生物技术育种技术领域。

背景技术

萝卜是十字花科植物中芸薹属(Brassica)的近缘属，通过属间远缘杂交，已经获得萝卜和芸薹属间的双二倍体杂种，并被命名为新的物种。由于远缘杂交的生殖隔离、种间杂种的不亲和性、杂种败育以及杂种不育等共性问题，为了获得有性杂交的杂种，人们采用了多种技术和方法，包括嫁接、混合授粉、切柱头、化学药物处理等，但这些技术和方法对芸薹属与萝卜的远缘杂交，效果不大。房相佑在研究萝卜与芸薹野生种属间杂交时发现：芸薹种与萝卜杂交时受精前障碍较小，芸苔种的雌蕊允许萝卜花粉萌发和花粉管伸长，但是受精后障碍严重；胚培养技术保障了萝卜和芸薹属植物间远缘杂交的成功。

芜菁是十字花科芸薹属芸薹种芜菁亚种，同萝卜一样都是以其肥大肉质根供食用。进行萝卜和芜菁的远缘杂交，一方面可以创造新型遗传材料，如：人工合成新物种有助于探明物种间的种属进化关系；培育异附加系，在促进物种之间的基因渐渗和分子细胞遗传研究生有着重要的作用，同时在分子细胞遗传学中，可用来增加遗传图谱精确度，用于分子标签和克隆外源基因、染色体物理作图、建立特定染色，体文库、研究单条染色体区段的结构等方面。培育的种间杂种，作为桥梁物种，有助于增加萝卜属和芸薹属的杂交亲和性，同时有助于转移萝卜属中的优异性状到芸薹属作物中，丰富作物的育种基础。目前，鲜见有芜菁和萝卜的属间杂种成功的例子。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提出一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，具体包括如下步骤：

(1)亲本材料的播种：为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份播种芜菁材料；

(2)花期杂交授粉：次年3-4月份，以芜菁为母本，以萝卜为父本，采用人工去雄、蕾期采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交；

(3)考种：6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；

(4)组织培养获得杂种苗：9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生长；

(5)无菌苗驯化；待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑料大棚中，进行常规管理；

(6)杂种形态学鉴定：采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及游标卡尺，分别统计其株高、叶形、叶片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、雌蕊长，花粉情况，每次测量重复3次；

(7)杂种的细胞学鉴定方法：取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。

优选的，所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60×80cm；每穴播种2～3粒种子，出苗后，待植株长至5～10cm，进行间苗，每穴保留一株；常规田间管理。

优选的，所述步骤2中的花期杂交授粉具体为：

(1)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；

(2)使用质量浓度为60mg/L的GA3对授粉前母本柱头进行滴浸；

(3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、授粉时间。

优选的，所述步骤4中的组织培养获得杂种苗的具体步骤为：

(1)种子首先进行70％乙醇处理1min；

(2)6％次氯酸钠溶液处理15min；

(3)无菌水冲洗4～5次；

(4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；

(5)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10～15粒种子；

(6)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为：室温25℃，光照时间为16h/d，光照强度为2000lux条件下培养，获得无菌苗。

优选的，所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：

(1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇：氯仿：乙酸＝5:2:3进行固定，一天后更换新的固定液，于4℃冰箱保存备用；

(2)制片，从花序上挑取直径为0.5～1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70％乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；

(3)使用4％的纤维素酶RS和4％的果胶酶Y-23混合溶液，37℃酶解2h 10min；

(4)水洗、固定，制片、制片后加DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。

有益效果：

本发明根据芸薹种与萝卜杂交时受精前障碍较小，芸薹种的雌蕊允许萝卜花粉萌发和花粉管伸长，但是受精后障碍严重的特点，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定浓度赤霉素到母本柱头上的方法，最大程度的改善属间杂交的亲和性，而授粉后，采取的是自然结荚，借助组织培养技术，进行种粒无菌培养的方法，获得了杂种苗并对其进行了形态学和细胞学的鉴定，确定是真实的属间杂种。

本发明采用人工去雄的方式进行蕾期授粉杂交，人工授粉中采用赤霉素(GA360mg/L)溶液涂抹柱头的方法，促进了受精及子房和胚的发育。收获的种子采用组织培养的方式进行杂种胚的胚胎拯救。获得了芜菁(2n＝20)和萝卜(2n＝18)的属间杂种(染色体数2n＝19)，本发明一方面创造出了新型遗传材料，有助于探明物种间的种属进化关系；培育异附加系，在促进物种之间的基因渐渗和分子细胞遗传研究生有着重要的作用；另一方面，培育的种间杂种，作为桥梁物种，有助于增加萝卜属和芸薹属的杂交亲和性，同时有助于转移萝卜属中的优异性状到芸薹属作物中，丰富作物的育种基础。在特异新品种的培育方面，具有较高的实用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的作进一步说明。

图1是芜菁-萝卜亲本及杂种形态图(从左至右，次为：13W7、是芜菁-杂种、14R5)

图2是芜菁-萝卜亲本及杂种花形态图(从左至右，次为：13W7、是芜菁-杂种、14R5)

图3是芜菁-萝卜属间杂种的染色体图

具体实施方式

实施例1

一种创制芜菁和萝卜的属间杂种的方法，具体包括如下步骤：

1、亲本材料的播种：为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份播种芜菁材料；亲本材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60×80cm；每穴播种2～3粒种子，出苗后，待植株长至5～10cm，进行间苗，每穴保留一株；常规田间管理。

2、花期杂交授粉：次年3-4月份，以芜菁为母本，以萝卜为父本，采用人工去雄、蕾期采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交；具体为：

(1)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；

(2)使用质量浓度为60mg/L的GA3对授粉前母本柱头进行滴浸；

(3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、授粉时间。

3、考种：6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；

4、组织培养获得杂种苗：9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生长；组织培养获得杂种苗的具体步骤为：

(1)种子首先进行70％乙醇处理1min；

(2)6％次氯酸钠溶液处理15min；

(3)无菌水冲洗4～5次；

(4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；

(5)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10～15粒种子；

(6)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为：室温25℃，光照时间为16h/d，光照强度为2000lux条件下培养，获得无菌苗。

5、无菌苗驯化；待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑料大棚中，进行常规管理；

6、杂种形态学鉴定：采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及游标卡尺，分别统计其株高(cm)、叶形、叶片大小(长×宽，cm)、花色、花蕾大小(长×直径，mm)、花萼大小(长×宽，mm)、花瓣大小(mm)、雄蕊长(mm)、雌蕊长(mm)，花粉情况，每次测量重复3次；

7、杂种的细胞学鉴定方法：取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定，具体步骤为：

(1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇：氯仿：乙酸＝5:2:3进行固定，一天后更换新的固定液，于4℃冰箱保存备用；

(2)制片，从花序上挑取直径为0.5～1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70％乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；

(3)使用4％的纤维素酶RS和4％的果胶酶Y-23混合溶液，37℃酶解2h 10min；

(4)水洗、固定，制片、制片后加DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。

图1，母本芜菁，花色黄色，叶片抱茎，叶缘光滑；芜菁-萝卜属间杂种，花色白色，叶片基生，叶缘光滑；父本萝卜，花色白色，叶片着生在叶柄上，叶缘锯齿状；结合表2的表型数据，在叶形上、杂种处于偏亲表现；在叶片大小上，除杂种1偏向母本芜菁，杂种4偏向父本萝卜外，其他两株杂种，叶片大小介于双亲之间；所有杂种，花色均为白色，与父本萝卜相同；而在株高、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长等方面杂种表现介于双亲之间；雌蕊长，杂种1～3具有超亲优势，杂种4与雌蕊较长的母本芜菁相似；杂种无粉，是杂种不育的典型表现；

图2，母本芜菁13W7的花色为黄色，花型蝴蝶状，对称花夹角小；芜菁-萝卜杂种同父本萝卜花色相似为白色，花型与母本相似，为蝴蝶状，对称花夹角较小；父本萝卜14R5，花色为白色，花型为蜻蜓状，对称花夹角较大；

图3，染色体条数，共计为19条，证明我们获得了芜菁(n＝10)和萝卜(n＝9)的属间杂种(染色体数2n＝19)；

表1 芜菁-萝卜属间杂种的获得

表2 杂种的形态学鉴定

实施例2

实施例2的一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，具体步骤同实施例1的创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，不同之处在于：

所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，每穴播种2～3粒种子，出苗后，待植株长至一定大小，进行间苗，每穴保留一株；常规田间管理。

所述步骤2中的花期杂交授粉具体为：

(1)首先对母本花序进行整理，对合适大小的花蕾，进行剥蕾、去雄；

(2)使用一定质量浓度的GA3对授粉前母本柱头进行滴浸；

(3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、授粉时间。

所述步骤4中的组织培养获得杂种苗的具体步骤为：

(1)种子首先进行70％乙醇预处理；

(2)消毒处理；

(3)无菌水冲洗4～5次；

(4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；

(5)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10～15粒种子；

(6)放置在组织培养室内进行培养，获得无菌苗。

所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：

(1)取花序中间小花蕾，卡诺固定液进行固定，一天后更换新的固定液，于4℃冰箱保存备用；

(2)制片，从花序上挑取直径为0.5～1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70％乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；

(3)使用混合溶液进行酶解；

(4)水洗、固定，制片，显微镜下统计染色体数并拍照。

本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，具体包括如下步骤：

(1)亲本材料的播种：为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份播种芜菁材料；

(2)花期杂交授粉：次年3-4月份，以芜菁为母本，以萝卜为父本，采用人工去雄、蕾期采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交；具体如下：

(A)对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；

(B)使用质量浓度为60mg/L的GA3对授粉前母本柱头进行滴浸；

(C)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、授粉时间；

(3)考种：6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；

(4)组织培养获得杂种苗：9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生长；具体如下：

(A)种子首先进行70％乙醇处理1min；

(B)6％次氯酸钠溶液处理15min；

(C)无菌水冲洗4～5次；

(D)无菌滤纸吸干种子上残存水分；

(E)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10～15粒种子；

(F)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为：室温25℃，光照时间为16h/d，光照强度为2000lux条件下培养，获得无菌苗；

(5)无菌苗驯化；待无菌苗生长至根系健壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑料大棚中，进行常规管理；

(6)杂种形态学鉴定：采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及游标卡尺，分别统计其株高、叶形、叶片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、雌蕊长，花粉情况，每次测量重复3次；

(7)杂种的细胞学鉴定方法：取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。

2.根据权利要求1所述创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，其特征在于：所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60×80cm；每穴播种2～3粒种子，出苗后，待植株长至5～10cm，进行间苗，每穴保留一株；常规田间管理。

3.根据权利要求1所述创制芜菁和萝卜属间杂种的方法，其特征在于：所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：

(1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇：氯仿：乙酸＝5:2:3进行固定，一天后更换新的固定液，于4℃冰箱保存备用；

(2)制片，从花序上挑取直径为0.5～1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70％乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；

(3)使用4％的纤维素酶RS和4％的果胶酶Y-23混合溶液，37℃酶解2h 10min；

(4)水洗、固定，制片、制片后加DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。