CN105993912B - 一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，属于生物技术育种技术领域。该具体包括如下步骤：亲本材料的播种；花期杂交授粉；考种；组织培养获得杂种苗；无菌苗驯化；杂种形态学鉴定；杂种的细胞学鉴定方法。本发明根据萝卜和芸薹属远缘杂交，受精前障碍较严重，而授粉后障碍较轻的特点，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定浓度甘氨酸到母本柱头上的方法，来改善属间杂交的亲和性，授粉后，采取的是自然结荚，借助组织培养技术，进行种粒无菌培养的方法，获得了杂种苗并对其进行了形态学和细胞学的鉴定，确定是真实的属间三倍体杂种。

Description

一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法

技术领域

本发明涉及一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，属于生物技术育种技术领域。

背景技术

萝卜是十字花科植物中芸薹属(Brassica)的近缘属，自上个世纪20年代以来，通过人工杂交、组织培养和体细胞融合等技术，成功合成了萝卜-甘蓝、萝卜-白菜两个双二倍体新物种并被命名为新的物种，以及一系列的附加系。由于远缘杂交的生殖隔离、种间杂种的不亲和性、杂种败育以及杂种不育等共性问题，为了获得有性杂交的杂种，人们采用了多种技术和方法，包括嫁接、混合授粉、切柱头、化学药物处理等，但这些技术和方法对芸薹属与萝卜的远缘杂交，效果不大。房相佑在研究萝卜与芸苔野生种属间杂交时发现：萝卜与芸苔种杂交时，芸苔种的花粉能较好地萌发，但是花粉管伸长受到很大妨碍，只有少数花粉管到达胚珠，受精后障碍相对较轻，母体内杂种胚很多能发育成熟。在授粉前，使用不同的浓度激素处理萝卜的柱头，增加芜菁花粉在萝卜柱头上的伸长，完成受精作用，对于其杂交成功的角果采用组织培养的技术手段，获得杂种后代。这些新型材料，一方面，可作为新型蔬菜和饲料作物，另一方面，萝卜中有利的性状导入到芸薹属植物中，创造出特异的遗传研究材料，用于细胞学和分子学研究。再一方面，作为桥梁，可以显著提高芸薹属和萝卜属的杂交亲和性。

梅时勇等公开的发明专利授权公告号为CN 102210259 B，发明名称为：一种萝卜与芜菁属间远缘杂交获得离体胚的方法，该方法采用了花期重复授粉以及对授粉后荚果内种胚进行离体胚培养的方法，获得了一定的成苗率，但未对杂种的真实性进行鉴定。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提出一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，具体包括如下步骤：

(1)亲本材料的播种：为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份播种芜菁材料；

(2)花期杂交授粉：次年3-4月份，以萝卜为母本，以芜菁为父本，采用人工去雄、蕾期采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交；

(3)考种：6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；

(4)组织培养获得杂种苗：9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生长；

(5)无菌苗驯化；待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑料大棚中，进行常规管理；

(6)杂种形态学鉴定：采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及游标卡尺，分别统计其株高、叶形、叶片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、雌蕊长，花粉情况，每次测量重复3次；

(7)杂种的细胞学鉴定方法：取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。

优选的，所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60×80cm；每穴播种2～3粒种子，出苗后，待植株长至5～10cm，进行间苗，每穴保留一株；常规田间管理。

优选的，所述步骤2中的花期杂交授粉具体为：

(1)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；

(2)使用质量浓度为100mg/L的Gly对授粉前母本柱头进行滴浸；

(3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、授粉时间。

优选的，所述步骤4中的组织培养获得杂种苗的具体步骤为：

(1)种子首先进行70％乙醇处理1min；

(2)6％次氯酸钠溶液处理15min；

(3)无菌水冲洗4～5次；

(4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；

(5)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10～15粒种子；

(6)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为：室温25℃，光照时间为16h/d，光照强度为2000lux条件下培养，获得无菌苗。

优选的，所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：

(1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇：氯仿：乙酸＝5:2:3进行固定，一天后更换新的固定液，于4℃冰箱保存备用；

(2)制片，从花序上挑取直径为0.5～1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70％乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；

(3)使用4％的纤维素酶RS和4％的果胶酶Y-23混合溶液，37℃酶解2h 10min；

(4)水洗、固定，制片、制片后加DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。

有益效果：

本发明根据芸薹属和萝卜远缘杂交，受精前障碍较严重，而授粉后障碍较轻的特点，采用蕾期授粉以及授粉前涂抹一定浓度甘氨酸到母本柱头上的方法，来改善属间杂交的亲和性，而授粉后，采取的是自然结荚，借助组织培养技术，进行种粒无菌培养的方法，获得了杂种苗并对其进行了形态学和细胞学的鉴定，确定是真实的属间三倍体杂种。

本发明采用人工去雄的方式进行蕾期杂交授粉，人工授粉中采用甘氨酸(Gly:100mg/L)溶液涂抹柱头的方法，促进了受精及子房和胚的发育，对改善属间杂交的亲和性，克服萝卜与芜菁杂交的授粉前障碍有较好效果。收获的种子采用组织培养的方式进行无菌培养。获得了萝卜(2n＝18)和芜菁(2n＝20)的异缘三倍体的属间杂种(染色体数2n＝28)，本发明一方面创造出了新型遗传材料，有助于探明物种间的种属进化关系；培育异附加系，在促进物种之间的基因渐渗和分子细胞遗传研究有着重要的作用；另一方面，培育的种间杂种，作为桥梁物种，有助于增加萝卜属和芸薹属的杂交亲和性，同时有助于转移萝卜属中的优异性状到芸薹属作物中，丰富作物的育种基础。在特异新品种的培育方面，具有较高的实用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的作进一步说明。

图1是萝卜-芜菁亲本及杂种形态图(从左至右，依次为：14R9、萝卜-芜菁杂种、13W9)

图2是萝卜-芜菁亲本及杂种花形态图(从左至右，依次为：14R9、萝卜-芜菁杂种、13W9)

图3是萝卜-芜菁属间杂种的染色体图

具体实施方式

实施例1

一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，具体包括如下步骤：

1、亲本材料的播种：为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份播种芜菁材料；播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60×80cm；每穴播种2～3粒种子，出苗后，待植株长至5～10cm，进行间苗，每穴保留一株；常规田间管理。

2、花期杂交授粉：次年3-4月份，以萝卜为母本，以芜菁为父本，采用人工去雄、蕾期采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交；具体为：

(1)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；

(2)使用质量浓度为100mg/L的Gly对授粉前母本柱头进行滴浸；

(3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、授粉时间。

3、考种：6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；

4、组织培养获得杂种苗：9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生长；具体步骤为：

(1)种子首先进行70％乙醇处理1min；

(2)6％次氯酸钠溶液处理15min；

(3)无菌水冲洗4～5次；

(4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；

(5)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10～15粒种子。

(6)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为：室温25℃，光照时间为16h/d，光照强度为2000lux条件下培养，获得无菌苗；

5、无菌苗驯化；待无菌苗生长至一定大小，根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑料大棚中，进行常规管理；

6、杂种形态学鉴定：采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及游标卡尺，分别统计其株高(cm)、叶形、叶片大小(长×宽，cm)、花色、花蕾大小(长×直径，mm)、花萼大小(长×宽，mm)、花瓣大小(mm)、雄蕊长(mm)、雌蕊长(mm)，花粉情况，每次测量重复3次；

7、杂种的细胞学鉴定方法：取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。具体步骤为：

(1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇：氯仿：乙酸＝5:2:3进行固定，一天后更换新的固定液，于4℃冰箱保存备用；

(2)制片，从花序上挑取直径为0.5～1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70％乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；

(3)使用4％的纤维素酶RS和4％的果胶酶Y-23混合溶液，37℃酶解2h 10min；

(4)水洗、固定，制片、制片后加DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。

图1，母本萝卜分枝性较弱，叶片宽大；杂种分枝性较母本弱，叶片较少且大；父本芜菁，分枝性强，叶片较小；结合表2的表型数据，叶形、叶片大小、花色，杂种处于偏亲表现；花蕾大小，杂种表现介于双亲之间；而株高、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、雌蕊长，杂种表现出超亲优势；杂种微粉，是杂种不育的典型表现；

图2，母本萝卜14R9的花色为白色，边缘浅粉，花型蜻蜓状，对称花夹角大；萝卜-芜菁杂种同母本萝卜花色相似为白色，花型与父本相似，为蝴蝶状，对称花夹角较小；父本芜菁13W9，花色为黄色，花型为蝴蝶状，对称花夹角较小；

图3，染色体条数，共计为28条，证明我们获得了萝卜(2n＝18)和芜菁(n＝10)的异缘三倍体的属间杂种(染色体数2n＝28)；

表1萝卜-芜菁属间杂种的获得

表2杂种的形态学鉴定

实施例2

实施例2的一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，具体步骤同实施例1的创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，不同之处在于：

所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，每穴播种2～3粒种子，出苗后，待植株长至一定大小，进行间苗，每穴保留一株；常规田间管理。

所述步骤2中的花期杂交授粉具体为：

(1)首先对母本花序进行整理，对合适大小的花蕾，进行剥蕾、去雄；

(2)使用一定质量浓度的Gly对授粉前母本柱头进行滴浸；

(3)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、授粉时间。

所述步骤4中的组织培养获得杂种苗的具体步骤为：

(1)种子首先进行70％乙醇预处理；

(2)消毒处理；

(3)无菌水冲洗4～5次；

(4)无菌滤纸吸干种子上残存水分；

(5)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10～15粒种子；

(6)放置在组织培养室内进行培养，获得无菌苗。

所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：

(1)取花序中间小花蕾，卡诺固定液进行固定，一天后更换新的固定液，于4℃冰箱保存备用；

(2)制片，从花序上挑取直径为0.5～1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70％乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；

(3)使用混合溶液进行酶解；

(4)水洗、固定，制片，显微镜下统计染色体数并拍照。

本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，具体包括如下步骤：

(1)亲本材料的播种：为使花期相遇，在塑料大棚中，于10月份播种萝卜材料，11月份播种芜菁材料；

(2)花期杂交授粉：次年3-4月份，以萝卜为母本，以芜菁为父本，采用人工去雄、蕾期采用化学药剂涂抹柱头的方式进行授粉杂交；

(A)首先对母本花序进行整理，去除已经开放的花以及花序中间特别小的花蕾，保留花序外围，未开放的大花蕾，进行剥蕾、去雄；

(B)使用质量浓度为100mg/L的Gly对授粉前母本柱头进行滴浸；

(C)取父本植株上，新开放的新鲜花粉，涂抹柱头，授粉后套袋，并挂牌标记杂交组合、授粉时间；

(3)考种：6月中旬，种荚成熟后，陆续采收、脱荚，统计收获种子数量和编号；

(4)组织培养获得杂种苗：9月中旬，利用组织培养技术对收获的种子，进行发芽、生长；

(A)种子首先进行70％乙醇处理1min；

(B)6％次氯酸钠溶液处理15min；

(C)无菌水冲洗4～5次；

(D)无菌滤纸吸干种子上残存水分；

(E)接种于1/2MS培养基上，每瓶接种10～15粒种子；

(F)放置在组织培养室内进行培养，培养条件为：室温25℃，光照时间为16h/d，光照强度为2000lux条件下培养，获得无菌苗；

(5)无菌苗驯化；待无菌苗生长至根系较壮后，于驯化前一天，揭开瓶盖进行练苗，移栽至盛装灭菌营养土的小钵中，遮阳网遮盖，进行幼苗生长，一周后，移栽入塑料大棚中，进行常规管理；

(6)杂种形态学鉴定：采用形态学的方法，对杂种苗进行鉴定，利用米尺、直尺以及游标卡尺，分别统计其株高、叶形、叶片大小、花色、花蕾大小、花萼大小、花瓣大小、雄蕊长、雌蕊长，花粉情况，每次测量重复3次；

(7)杂种的细胞学鉴定方法：取花蕾，利用细胞学方法，进行染色体鉴定。

2.根据权利要求1所述创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，其特征在于：所述步骤1中亲本材料的播种方式为穴播，株距为30cm，大小行距为60×80cm；每穴播种2～3粒种子，出苗后，待植株长至5～10cm，进行间苗，每穴保留一株；常规田间管理。

3.根据权利要求1所述创制萝卜和芜菁属间杂种的方法，其特征在于：所述步骤7中的杂种的细胞学鉴定方法的具体步骤为：

(1)取花序中间小花蕾，用改良卡诺固定液，乙醇：氯仿：乙酸＝5:2:3进行固定，一天后更换新的固定液，于4℃冰箱保存备用；

(2)制片，从花序上挑取直径为0.5～1mm的小花蕾，解剖镜下剥出花药，转移至70％乙醇中，后吸出花药，蒸馏水冲洗后，保留花药；

(3)使用4％的纤维素酶RS和4％的果胶酶Y-23混合溶液，37℃酶解2h 10min；

(4)水洗、固定，制片、制片后加DAPI后，在显微镜下观察，并记录染色体数。