CN113950978A - 一种提高萝卜种质创制效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高萝卜种质创制效率的方法，包括如下步骤：S1、砧木及接穗的准备：选易出胚的杂交品种做砧木材料，选取皮色肉色脆绿的杂交品种做接穗材料，将砧木和接穗种子进行播种并通过春化；S2、定植；S3、嫁接环境管理：控制环境温度使植株生长，用矮壮素稀释液进行灌根；S4、嫁接时间选择：在砧木的第二个及以后的一级分支处作嫁接部位；接穗的选择为长度为6‑10cm的一级分支；S5、嫁接：将接穗芽嫁接在砧木植株上；S6、嫁接后管理：嫁接完成后通过控制生长环境温度对嫁接植株进行管理；本发明可以有效的提升难出胚材料的游离小孢子出胚率，加快萝卜材料的纯化速度，提升种质创制效率。
Description
技术领域
本发明属于植物育种学技术领域，具体的说，涉及一种提高萝卜种质创制效率的方法。
背景技术
我国是萝卜(Raphanus sativus L.)的原产地之一，萝卜在中国有 2700 年以上的栽培历史，研究表明山东鲁中、鲁西山区及黄淮地区是我国萝卜的起源地；我国常年种植面积约1800万亩；我国的萝卜资源相对比较丰富，有 80 多个优质的水果萝卜地方品种资源，且分布较散，主要分布在山东、江苏、河北等地。；如山东‘潍县萝卜’、北京‘心里美萝卜’、天津‘卫青萝卜’等。
近年来，随着人们生活水平的提高以及国内外形势的发展，人们对萝卜的消费习惯也发生了变化，生食逐渐增多，且对萝卜品质提出了更高的要求。但由于育种观念的差异及技术水平的落后，水果萝卜种质资源利用程度不高，致使水果萝卜品种选育工作迟缓，日本和韩国的萝卜品种正陆续进入中国市场，并受到大面积的推广，且因口感好得到消费者的青睐。
中国水果萝卜符合市场需求的优良品种不多，在萝卜品质改良方面还有待发掘改良，以保证中国萝卜产业健康可持续发展；优良品种的选育需要优良的自交系材料；优良种质的创制多采用杂交后代分离、突变体诱导、游离小孢子培养、转基因等技术手段实现；其中游离小孢子培养是获取纯合自交系的高效途径。
萝卜是十字花科蔬菜作物中最不容易进行游离小孢子培养的物种之一，供体基因型的限制导致游离小孢子培养技术在很多萝卜材料上不能实现。
现有技术中，如专利申请号为CN200810123895.2，公开了一种快速获得萝卜单倍体的育种方法，该育种方法从热激、花粉发育时期、不同培养基及其添加物等方面对小孢子进行培养。
又如专利申请号为：CN201410371104.3，公分开了一种提高胭脂萝卜胚胎发生率的方法，该方法通过将萝卜小孢子与青花菜小孢子混合后培养获得萝卜再生植株。
又如专利申请号为：CN200310115112.3，公开了一种萝卜游离小孢子的培养方法，该方法通过采用低温预处理及震荡培养方式，提高萝卜小孢子培养的成胚率。
春白萝卜游离小孢子培养的研究（北方园艺，2013，（23））,研究了基因型对春白萝卜游离小孢子成胚率及4℃低温花蕾预处理+培养基中添加活性炭对游离小孢子胚状体发生的影响。
但是，有关通过萝卜抽薹枝条嫁接萝卜后进行小孢子培养提高出胚率的的例子，尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题是提供一种提高萝卜种质创制效率的方法，可以有效的提升难出胚材料的游离小孢子出胚率，加快萝卜材料的纯化速度，提升种质创制效率。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种提高萝卜种质创制效率的方法，包括如下步骤：
S1、砧木及接穗的准备：选取抗性强、易出胚的杂交品种做砧木材料，选取外形美观、品质优良、皮色肉色脆绿，辣味轻的杂交品种做接穗材料，将砧木和接穗种子进行播种并通过春化；
S2、定植：3月中上旬，将砧木和接穗种株刚要抽薹时定植于拱棚内；
S3、嫁接环境管理：控制环境温度使植株生长，用矮壮素稀释液进行灌根；
S4、嫁接时间选择：在砧木的第二个及以后的一级分支处作嫁接部位；接穗的选择为长度为6-10cm的一级分支；
S5、嫁接：将接穗芽嫁接在砧木植株上；
S6、嫁接后管理：嫁接完成后通过控制生长环境温度对嫁接植株进行管理。
以下是本发明对上述技术方案的进一步优化：
该创制方法还包括：S7、游离小孢子培养，游离小孢子培养按如下步骤进行：
（1）、控制嫁接植株的生长环境温度为15-20℃，去掉主薹，待一级侧枝5朵花时，选取处于单核靠边期或双核早期的2.5-4.5mm的花蕾连着花枝，将花蕾保湿并放置于4℃冰箱中，黑暗条件下冷处理24小时后灭菌；
（2）、向灭菌后的花蕾中加入B5-13培养基，使小孢子游离出来；
（3）、接种前，将花蕾浸泡在浓度为70％的酒精中，浸泡1min后倒掉酒精，再加入浓度为7％的次氯酸钠溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗；
（4）、将清洗完成后的花蕾在B5培养基中挤出小孢子；悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，将滤液进行离心处理，获得沉淀物；
（5）、在沉淀物中加10mL的B5培养基，摇匀，而后进行离心处理，所得沉淀物即为小孢子；
（6）、将游离小孢子转移入1/2NLN培养基中，调整浓度为1～2×105个/ml,每个处理10皿，而后转入培养箱进行33℃的热激处理48h，而后转入25℃暗环境下培养直至胚性愈伤组织形成。
进一步优化：步骤S1中，砧木的生长温度为0℃以上，10℃以下；使得砧木通过春化。
进一步优化：步骤S2中定植时，行距为1m，株距为1m，未长成的小萝卜完全埋入土中。
进一步优化：步骤S3中，生长环境温度为15-20℃；矮壮素稀释液的浓度为500毫克/升，矮壮素稀释液的灌根用量为：每株100-200毫升。
进一步优化：步骤S5中，嫁接工序按如下步骤进行：
1）、嫁接前对砧木和刀片分别进行消毒，留砧木顶芽和两个侧枝，多余侧枝从1cm处切断；
2）、选取砧木6-10cm的侧枝做嫁接切口，切除侧枝，不能切到中央髓腔部分；
3）、接穗切口与砧木切口相同；
4）、嫁接前确保砧木和接穗切口的湿润，有渗出液；将接穗切口与砧木切口对齐后立即用保鲜膜扎紧；
5）、捆扎好切口后，将接穗上的顶芽去掉，留1片叶，接穗的侧芽应摘心，留1片小叶。
进一步优化：步骤2）中，侧枝上下各产生1.5-2.5cm长的切口，切口最宽处约0.6-1cm，最厚处为0.2-0.4mm。
进一步优化：嫁接后管理按如下步骤进行：
a、嫁接完成后对嫁接植株及时浇水，用遮阳网进行遮阳，控制嫁接植株的生长环境温度在18-25℃，使得伤口愈合；
b、待伤口愈合，接穗回复长势后，摘除砧木的顶芽和多余侧枝，顶芽距离接穗留10-15cm的主枝；
c、嫁接25天左右，去除伤口处的保鲜膜，对接穗和砧木进行捆绑；
d、控制嫁接植株的生长环境温度在10-20℃，待接穗的主枝长出一级分支后，将一级侧枝固定于支架上，接穗主枝去顶，二级分支开花5-10朵时，收集2.5-4.5mm花蕾进行游离小孢子培养。
本发明以抗性强、易出胚的萝卜杂交种为砧木，以难出胚萝卜抽薹后的分支为接穗，控制环境温度在15-20℃，光照时间在14-15h，结合游离小孢子培养，提高了难出胚材料的出胚率。
本发明利用根部活力旺盛、抗性强、出胚率高的萝卜做砧木，供应上部材料，可有效提升上部材料的抗性信号传导和抗性水平，提升难出胚材料的出胚率，本发明为难出胚材料的种质创制效率提升开辟了新的有效途径。
本发明公开的提高萝卜种质创制效率的方法，嫁接成功率高(90％以上)，效果显著难（出胚率提升2倍以上），适用于萝卜种质材料的创制，有广泛的应用价值。
下面结合实施例对本发明进一步说明。
具体实施方式
实施例1：一种提高萝卜种质创制效率的方法，具体包括如下步骤：
S1、砧木及接穗的准备：选取抗性强、易出胚的杂交品种做砧木材料，选取外形美观、品质优良、皮色肉色脆绿，辣味轻的杂交品种做接穗材料，将砧木和接穗种子于12月中旬播种于50孔苗盘，放置于日光温室；在低温时通过温室内搭建小拱棚及覆盖二膜的方式，控制温室温度在0℃以上，10℃以下；使得砧木能顺利通过春化。
在本实施例中，所述砧木品种为“潍萝卜1号”由潍坊市农业科学院提供，“潍萝卜1号”品种为市面上正常销售的。
在本实施例中，所述接穗品种为潍县萝卜杂交种“潍卜16”由潍坊市农业科学院提供，“潍卜16”品种为市面上正常销售的。
S2、定植：3月中上旬，将砧木种株和接穗种株刚要抽薹时定植于拱棚，行距1m，株距1m。定植时，未长成的小萝卜完全埋入土中。
S3、嫁接环境管理：萝卜抽薹后侧枝及主薹的生长速度较快，内部组织比较疏松，通过控制生长环境温度在15℃，使植株生长速度变缓，组织比较致密，同时可用浓度为500毫克/升的矮壮素稀释液按每株100毫升的用量进行灌根，使得植株的节间变短，组织致密，提升嫁接的成活率。
步骤S3中通过控制萝卜植株的生长环境能够使植株生长速度变缓，进而使植株的组织比较致密，并且通过矮壮素稀释液进行灌根，能够使得植株的节间变短，组织致密，进而方便后期的嫁接和提升嫁接的成活率。
所述步骤S3中，矮壮素稀释液是由矮壮素加水进行稀释后制备而成的。
S4、嫁接时间选择：在砧木第二个及以后的一级分支在6cm时可以做嫁接部位，接穗的选择比较宽泛，以颜色嫩绿，生长健壮，长度为6cm的一级分支为佳。
S5、嫁接：将接穗芽嫁接在砧木植株上，嫁接工序按如下步骤进行：
1）、嫁接前喷洒百菌清等杀菌消毒药物对砧木进行消毒，并将刀片等器具进行消毒处理；留砧木顶芽和两个侧枝，多余侧枝从1cm处切断。
2）、选取砧木6cm的侧枝做嫁接切口，切除侧枝不能齐根切，要在侧枝上下各产生1cm长的切口，切口最宽处约0.6cm，最厚处约3mm，不能切到中央髓腔部分。
3）、接穗切口与砧木切口相同，侧枝上下各1cm,切口最宽处约0.6cm，最厚处约3mm，尽量减少上一级分支的木质部，切口要整齐，平滑。
这样设计，能够使接穗芽和砧木植株上产生较大的嫁接切口，通过该嫁接切口能够保证接穗与砧木形成层有更大的接触面积，容易成活，提高成活率。
4）、嫁接前确保砧木和接穗切口的湿润，有渗出液，而后将接穗切口与砧木切口对齐后立即用保鲜膜扎紧、扎严，防止水分从伤口处蒸发，影响伤口愈合。
5）、捆扎好切口后，将接穗上的顶芽去掉，留1片叶，若叶较大，减至1cm长，侧芽应摘心，留1片小叶。
S6、嫁接后管理：嫁接完成后通过控制生长环境温度对嫁接植株进行管理，嫁接后管理按如下步骤进行：
a、嫁接完成后对嫁接植株及时浇水，用遮阳网进行遮阳，控制嫁接植株的生长环境温度在18℃，使得伤口能够慢慢愈合。
b、待伤口愈合，接穗回复长势后，摘除砧木的顶芽和多余侧枝，顶芽距离接穗留10cm的主枝，避免主枝逐渐萎缩后影响接穗，同时保证接穗有充足的营养进行生长。
c、嫁接25天左右，去除伤口处的保鲜膜，对接穗和砧木进行上下各一道的捆绑，以免生长旺盛，发枝较多，将伤口撕裂，导致失败。
d、控制嫁接植株的生长环境温度在10℃，待接穗的主枝长出一级分支后，将一级侧枝固定于支架上，接穗主枝去顶，二级分支开花5朵时，收集2.5mm花蕾进行游离小孢子培养。
S7、游离小孢子培养按如下步骤进行：
（1）、控制嫁接植株的生长环境温度为15℃，促进小孢子发育的一致性，去掉主薹，待一级侧枝5朵花时，选取处于单核靠边期或双核早期的2.5mm的花蕾连着花枝，将花蕾保湿并放置于4℃冰箱中，黑暗条件下冷处理24小时后灭菌。
（2）、向灭菌后的花蕾中加入B5-13培养基，采用挤压法使小孢子游离出来。
所述B5-13培养基是由“北京汇德凯商贸有限公司”购买获得的，可由市面上直接购买获得。
（3）、接种前，将花蕾转移入超净工作台上的无菌烧杯中，而后倒入浓度为70％的酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入浓度为7％的次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次。
（4）、将清洗完成后的花蕾放入研钵种，在B5培养基中挤压花蕾，挤出花蕾中的小孢子；悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液，并将滤液装入15ml的离心管中，而后采用离心机对离心管中的滤液进行离心处理，离心速度为850rpm，离心时间为3min，离心处理完成后获得沉淀物。
（5）、在沉淀物中加10mL的B5培养基，摇匀，而后采用离心机对离心管中的滤液进行离心处理，离心速度为850rpm，离心时间为3min，重复两次，所得沉淀物即为小孢子；
所述步骤（4）和步骤（5）中的B5培养基是由“北京西美杰科技有限公司”生产的，可由市面上直接购买获得。
（6）、将游离小孢子转移入1/2NLN培养基中，调整浓度为1×105个/ml,每个处理10皿，而后转入培养箱进行33℃的热激处理，热激处理时间为48h，热激处理完成后转入25℃暗环境下培养直至胚性愈伤组织形成。
实施例2：
一种提高萝卜种质创制效率的方法，具体包括如下步骤：
S1、砧木及接穗的准备：选取抗性强、易出胚的“潍萝卜1号”（由潍坊市农业科学院提供）做砧木材料；选取外形美观、品质优良、皮色肉色脆绿，辣味轻的“潍卜16”（由潍坊市农业科学院提供）做接穗材料；将砧木和接穗种子于12月中旬播种于50孔苗盘，放置于日光温室；在低温时通过温室内搭建小拱棚及覆盖二膜的方式，控制温室温度在0℃以上，10℃以下；使得砧木能顺利通过春化。
S2、定植：3月中上旬，将砧木种株和接穗种株刚要抽薹时定植于拱棚，行距1m，株距1m。定植时，未长成的小萝卜完全埋入土中。
S3、嫁接环境管理：萝卜抽薹后侧枝及主薹的生长速度较快，内部组织比较疏松，通过控制环境温度在17℃，使植株生长速度变缓，组织比较致密，同时可用浓度为500毫克/升的矮壮素稀释液按每株150毫升的用量进行灌根，使得植株的节间变短，组织致密，提升嫁接的成活率。
S4、嫁接时间选择：在砧木第二个及以后的一级分支在8cm时可以做嫁接部位，接穗的选择比较宽泛，以颜色嫩绿，生长健壮，长度为8cm的一级分支为佳。
S5、嫁接：嫁接工序按如下步骤进行：
1）、嫁接前喷洒百菌清等杀菌消毒药物对砧木进行消毒，并将刀片等器具进行消毒处理；留砧木顶芽和两个侧枝，多余侧枝从1cm处切断。
2）、选取砧木8cm的侧枝做嫁接切口，切除侧枝不能齐根切，要在侧枝上下各产生1.3cm长的切口，切口最宽处约0.8cm，最厚处约4mm，不能切到中央髓腔部分。
3）、接穗切口与砧木切口相同，侧枝上下各1.3cm,切口最宽处约0.8cm，最厚处约4mm，尽量减少上一级分支的木质部，切口要整齐，平滑。
4）、嫁接前确保砧木和接穗切口的湿润，有渗出液，而后将接穗切口与砧木切口对齐后立即用保鲜膜扎紧、扎严，防止水分从伤口处蒸发，影响伤口愈合。
5）、捆扎好切口后，将接穗上的顶芽去掉，留1片叶，若叶较大，减至1cm长，侧芽应摘心，留1片小叶。
S6、嫁接后管理按如下步骤进行：
a、嫁接完成后对嫁接植株及时浇水，用遮阳网进行遮阳，控制嫁接植株的生长环境温度在20℃，使得伤口能够慢慢愈合。
b、待伤口愈合，接穗回复长势后，摘除砧木的顶芽和多余侧枝，顶芽距离接穗留13cm的主枝，避免主枝逐渐萎缩后影响接穗，同时保证接穗有充足的营养进行生长。
c、嫁接25天左右，去除伤口处的保鲜膜，对接穗和砧木进行上下各一道的捆绑，以免生长旺盛，发枝较多，将伤口撕裂，导致失败。
d、控制嫁接植株的生长环境温度在15℃，待接穗的主枝长出一级分支后，将一级侧枝固定于支架上，接穗主枝去顶，二级分支开花5-10朵时，收集3mm花蕾进行游离小孢子培养。
S7、游离小孢子培养按如下步骤进行：
（1）、控制嫁接植株的生长环境温度为17℃，促进小孢子发育的一致性，去掉主薹，待一级侧枝5朵花时，选取处于单核靠边期或双核早期的3mm的花蕾连着花枝，将花蕾保湿并放置于4℃冰箱中，黑暗条件下冷处理24小时后灭菌。
（2）、向灭菌后的花蕾中加入B5-13培养基，采用挤压法使小孢子游离出来。
（3）、接种前，将花蕾转移入超净工作台上的无菌烧杯中，而后倒入浓度为70％的酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入浓度为7％的次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次。
（4）、将清洗完成后的花蕾放入研钵种，在B5培养基中挤压花蕾，挤出花蕾中的小孢子；悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液，并将滤液装入15ml的离心管中，而后采用离心机对离心管中的滤液进行离心处理，离心速度为850rpm，离心时间为3min，离心处理完成后获得沉淀物。
（5）、在沉淀物中加10mL的B5培养基，摇匀，而后采用离心机对离心管中的滤液进行离心处理，离心速度为850rpm，离心时间为3min，重复两次，所得沉淀物即为小孢子；
（6）、将游离小孢子转移入1/2NLN培养基中，调整浓度为1.5×105个/ml,每个处理10皿，而后转入培养箱进行33℃的热激处理，热激处理时间为48h，热激处理完成后转入25℃暗环境下培养直至胚性愈伤组织形成。
实施例3：
一种提高萝卜种质创制效率的方法，具体包括如下步骤：
S1、砧木及接穗的准备：选取抗性强、易出胚的“潍萝卜1号”（由潍坊市农业科学院提供）做砧木材料；选取外形美观、品质优良、皮色肉色脆绿，辣味轻的“潍卜16”（由潍坊市农业科学院提供）做接穗材料；将砧木和接穗种子于12月中旬播种于50孔苗盘，放置于日光温室；在低温时通过温室内搭建小拱棚及覆盖二膜的方式，控制温室温度在0℃以上，10℃以下；使得砧木能顺利通过春化。
S2、定植：3月中上旬，将砧木种株和接穗种株刚要抽薹时定植于拱棚，行距1m，株距1m。定植时，未长成的小萝卜完全埋入土中。
S3、嫁接环境管理：萝卜抽薹后侧枝及主薹的生长速度较快，内部组织比较疏松，通过控制环境温度在20℃，使植株生长速度变缓，组织比较致密，同时可用浓度为500毫克/升的矮壮素稀释液按每株200毫升的用量进行灌根，使得植株的节间变短，组织致密，提升嫁接的成活率。
步骤S3中通过控制萝卜植株的生长环境能够使植株生长速度变缓，进而使植株的组织比较致密，并且通过矮壮素稀释液进行灌根，能够使得植株的节间变短，组织致密，进而方便后期的嫁接和提升嫁接的成活率。
S4、嫁接时间选择：在砧木第二个及以后的一级分支在10cm时可以做嫁接部位，接穗的选择比较宽泛，以颜色嫩绿，生长健壮，长度为10cm的一级分支为佳。
S5、嫁接：将接穗芽嫁接在砧木植株上，嫁接工序按如下步骤进行：
1）、嫁接前喷洒百菌清等杀菌消毒药物对砧木进行消毒，并将刀片等器具进行消毒处理；留砧木顶芽和两个侧枝，多余侧枝从1cm处切断。
2）、选取砧木10cm的侧枝做嫁接切口，切除侧枝不能齐根切，要在侧枝上下各产生1.5cm长的切口，切口最宽处约1cm，最厚处约5mm，不能切到中央髓腔部分。
3）、接穗切口与砧木切口相同，侧枝上下各1.5cm,切口最宽处约1cm，最厚处约5mm，尽量减少上一级分支的木质部，切口要整齐，平滑。
4）、嫁接前确保砧木和接穗切口的湿润，有渗出液，而后将接穗切口与砧木切口对齐后立即用保鲜膜扎紧、扎严，防止水分从伤口处蒸发，影响伤口愈合。
5）、捆扎好切口后，将接穗上的顶芽去掉，留1片叶，若叶较大，减至1cm长，侧芽应摘心，留1片小叶。
S6、嫁接后管理：嫁接完成后通过控制生长环境温度对嫁接植株进行管理，嫁接后管理按如下步骤进行：
a、嫁接完成后对嫁接植株及时浇水，用遮阳网进行遮阳，控制嫁接植株的生长环境温度在25℃，使得伤口能够慢慢愈合。
b、待伤口愈合，接穗回复长势后，摘除砧木的顶芽和多余侧枝，顶芽距离接穗留15cm的主枝，避免主枝逐渐萎缩后影响接穗，同时保证接穗有充足的营养进行生长。
c、嫁接25天左右，去除伤口处的保鲜膜，对接穗和砧木进行上下各一道的捆绑，以免生长旺盛，发枝较多，将伤口撕裂，导致失败。
d、控制嫁接植株的生长环境温度在20℃，待接穗的主枝长出一级分支后，将一级侧枝固定于支架上，接穗主枝去顶，二级分支开花5-10朵时，收集4.5mm花蕾进行游离小孢子培养。
S7、游离小孢子培养按如下步骤进行：
（1）、控制嫁接植株的生长环境温度为20℃，促进小孢子发育的一致性，去掉主薹，待一级侧枝5朵花时，选取处于单核靠边期或双核早期的4.5mm的花蕾连着花枝，将花蕾保湿并放置于4℃冰箱中，黑暗条件下冷处理24小时后灭菌。
（2）、向灭菌后的花蕾中加入B5-13培养基，采用挤压法使小孢子游离出来。
（3）、接种前，将花蕾转移入超净工作台上的无菌烧杯中，而后倒入浓度为70％的酒精进行表面消毒，浸泡1min后倒掉酒精，再加入浓度为7％的次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，然后用无菌水冲洗3次。
（4）、将清洗完成后的花蕾放入研钵种，在B5培养基中挤压花蕾，挤出花蕾中的小孢子；悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，收集滤液，并将滤液装入15ml的离心管中，而后采用离心机对离心管中的滤液进行离心处理，离心速度为850rpm，离心时间为3min，离心处理完成后获得沉淀物。
（5）、在沉淀物中加10mL的B5培养基，摇匀，而后采用离心机对离心管中的滤液进行离心处理，离心速度为850rpm，离心时间为3min，重复两次，所得沉淀物即为小孢子；
（6）、将游离小孢子转移入1/2NLN培养基中，调整浓度为2×105个/ml,每个处理10皿，而后转入培养箱进行33℃的热激处理，热激处理时间为48h，热激处理完成后转入25℃暗环境下培养直至胚性愈伤组织形成。
本发明利用根部活力旺盛、抗性强、出胚率高的萝卜做砧木，供应上部材料，可有效提升上部材料的抗性信号传导和抗性水平，提升难出胚材料的出胚率，本发明为难出胚材料的种质创制效率提升开辟了新的有效途径。
对本发明对下列萝卜单株进行播种检测各萝卜种质的成活率、花期、植株健壮程度和出胚率。
本发明公开的提高萝卜种质创制效率的方法，嫁接成功率在90％以上，花期略有延迟，植株健壮程度为：侧枝深绿节间短粗；出胚率为：15.9±2.6胚/皿，效果显著难（出胚率提升2倍以上），适用于萝卜种质材料的创制，有广泛的应用价值。
对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理与精神的情况下，对实施方式所进行的改变、修改、替换和变型仍落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种提高萝卜种质创制效率的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、砧木及接穗的准备：选取易出胚的杂交品种做砧木材料，选取皮色肉色脆绿的杂交品种做接穗材料，将砧木和接穗种子进行播种并通过春化；
S2、定植：3月中上旬，将砧木和接穗种株刚要抽薹时定植于拱棚内；
S3、嫁接环境管理：控制环境温度使植株生长，用矮壮素稀释液进行灌根；
S4、嫁接时间选择：在砧木的第二个及以后的一级分支处作嫁接部位；接穗的选择为长度为6-10cm的一级分支；
S5、嫁接：将接穗芽嫁接在砧木植株上；
S6、嫁接后管理：嫁接完成后通过控制生长环境温度对嫁接植株进行管理。
2.根据权利要求1所述的一种提高萝卜种质创制效率的方法，其特征在于：该创制方法还包括：S7、游离小孢子培养，游离小孢子培养按如下步骤进行：
（1）、控制嫁接植株的生长环境温度为15-20℃，去掉主薹，待一级侧枝5朵花时，选取处于单核靠边期或双核早期的2.5-4.5mm的花蕾连着花枝，将花蕾保湿并放置于4℃冰箱中，黑暗条件下冷处理24小时后灭菌；
（2）、向灭菌后的花蕾中加入B5-13培养基，使小孢子游离出来；
（3）、接种前，将花蕾浸泡在浓度为70%的酒精中，浸泡1min后倒掉酒精，再加入浓度为7%的次氯酸钠溶液浸泡10min，然后用无菌水冲洗；
（4）、将清洗完成后的花蕾在B5培养基中挤出小孢子；悬浮液经50μm无菌微孔纱布过滤，将滤液进行离心处理，获得沉淀物；
（5）、在沉淀物中加10mL的B5培养基，摇匀，而后进行离心处理，所得沉淀物即为小孢子；
（6）、将游离小孢子转移入1/2NLN培养基中，调整浓度为1～2×105个/ml,每个处理10皿，而后转入培养箱进行33℃的热激处理48h，而后转入25℃暗环境下培养直至胚性愈伤组织形成。
3.根据权利要求2所述的一种提高萝卜种质创制效率的方法，其特征在于：步骤S1中，砧木的生长温度为0℃以上，10℃以下；使得砧木通过春化。
4.根据权利要求3所述的一种提高萝卜种质创制效率的方法，其特征在于：步骤S2中定植时，行距为1m，株距为1m，未长成的小萝卜完全埋入土中。
5.根据权利要求4所述的一种提高萝卜种质创制效率的方法，其特征在于：步骤S3中，生长环境温度为15-20℃；矮壮素稀释液的浓度为500毫克/升，矮壮素稀释液的灌根用量为：每株100-200毫升。
6.根据权利要求5所述的一种提高萝卜种质创制效率的方法，其特征在于：步骤S5中，嫁接工序按如下步骤进行：
1）、嫁接前对砧木和刀片分别进行消毒，留砧木顶芽和两个侧枝，多余侧枝从1cm处切断；
2）、选取砧木6-10cm的侧枝做嫁接切口，切除侧枝，不能切到中央髓腔部分；
3）、接穗切口与砧木切口相同；
4）、嫁接前确保砧木和接穗切口的湿润，有渗出液；将接穗切口与砧木切口对齐后立即用保鲜膜扎紧；
5）、捆扎好切口后，将接穗上的顶芽去掉，留1片叶，接穗的侧芽应摘心，留1片小叶。
7.根据权利要求6所述的一种提高萝卜种质创制效率的方法，其特征在于：步骤2）中，侧枝上下各产生1.5-2.5cm长的切口，切口最宽处约0.6-1cm，最厚处为0.2-0.4mm。
8.根据权利要求7所述的一种提高萝卜种质创制效率的方法，其特征在于：嫁接后管理按如下步骤进行：
a、嫁接完成后对嫁接植株及时浇水，用遮阳网进行遮阳，控制嫁接植株的生长环境温度在18-25℃，使得伤口愈合；
b、待伤口愈合，接穗回复长势后，摘除砧木的顶芽和多余侧枝，顶芽距离接穗留10-15cm的主枝；
c、嫁接25天左右，去除伤口处的保鲜膜，对接穗和砧木进行捆绑；
d、控制嫁接植株的生长环境温度在10-20℃，待接穗的主枝长出一级分支后，将一级侧枝固定于支架上，接穗主枝去顶，二级分支开花5-10朵时，收集2.5-4.5mm花蕾进行游离小孢子培养。
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