CN115777528B

CN115777528B - 一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养方法

Info

Publication number: CN115777528B
Application number: CN202310085469.9A
Authority: CN
Inventors: 任海龙; 肖婉钰; 周贤玉; 孙艺嘉; 张晶; 郑岩松; 许东林; 张华�; 戴修纯
Original assignee: GUANGZHOU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: GUANGZHOU ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2023-02-09
Filing date: 2023-02-09
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2043-02-09
Also published as: CN115777528A

Abstract

本发明公开了一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养方法。其包括以下步骤：（1）于变温条件下对紫菜薹进行光暗交替培养，于恒温条件下对菜心进行光暗交替培养，杂交获得F1代杂交种子；（2）按照紫菜薹的培育方式将杂交种子培育至抽薹开花；（3）挑选步骤（2）所产生的花蕾，并进行消毒，然后离心获得小孢子；（4）将小孢子置于NLN培养基中；（5）于暗室中对步骤（4）中的小孢子进行热激处理，然后再转入暗室中震荡培养即可。本发明可将紫菜薹的优良性状转育到菜心中的周期从3‑4年，缩短到1年以内，并且获得基因型完全纯合的材料。

Description

一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养方法

技术领域

本发明属于小孢子培育技术领域，一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养方法。

背景技术

菜心（ Brassica campestrisL.ssp. Chinensis var.utilis Tsen et Lee）又名菜薹，是岭南地区栽培规模最大的特产蔬菜之一，在我国蔬菜生产中的地位越来越重要，其中油绿702是广东省的主导菜心品种，具有优质、高产、适应性广的特点。紫菜薹（ Brassica campestrisvar. purpurariaL.H. Bariley）起源自长江中游流域，是白菜亚种经过长期栽培驯化而形成的一个变种，因其紫色的花薹富含丰富的营养物质，尤其是具有保健功能的花青素，已经作为优质高档的蔬菜在全国范围内引种栽培，其中洪山菜薹是紫菜薹中的精品。通过常规杂交选育的方法，将紫菜薹的优良性状转育到菜心中，过程一般需6~8代才能稳定遗传，相当费工费时，且长期自交会出现衰退现象。

应用游离小孢子培养技术获得单倍体进而加倍成后代完全纯合的双单倍体植株，可在1年内获得纯合、稳定的育种材料，从而大幅度缩短育种年限，在提高育种效率方面具有明显优势。然而菜心和紫菜薹尚未形成统一的小孢子培养体系，所报道的菜心和紫菜薹的小孢子培养方法仅能针对特定的基因型（或品种），现有的菜心和紫菜薹的小孢子培养方法均不能诱导出菜心（油绿702）×紫菜薹（优选洪山）杂交种的胚状体。如新近发表的文章中，赵艳艳等认为，130 g/L蔗糖浓度NLN（NLN-13）小孢子胚诱导率最高，在培养基中添加0.05 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA 可以显著提高菜心胚状体诱导率；而杨易等则认为，100g/L 蔗糖浓度NLN（NLN-10）小孢子胚诱导率最高，130 g/L 蔗糖浓度NLN（NLN-13）会明显降低菜心的出胚率，分别添加0.1 mg/L 6-BA 和NAA 的出胚效果最佳，所报道的菜心小孢子培养体系大相径庭。目前尚未见到其他菜心和紫菜薹杂交种的小孢子培养方法。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养方法，本发明可将紫菜薹的优良性状转育到菜心中的周期从3-4年，缩短到1年以内，并且获得基因型完全纯合的材料。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养方法，包括以下步骤：

（1）于变温条件下对紫菜薹进行光暗交替培养，于恒温条件下对菜心进行光暗交替培养，并使两者同期抽薹开花，然后以紫菜薹为母本，菜心为父本杂交获得F1代杂交种子；

（2）按照紫菜薹的培育方式将杂交种子培育至抽薹开花，然后取其无损花序，于4~8℃诱导12~24h后保存；

（3）挑选步骤（2）所产生的花蕾，并进行消毒，然后离心获得小孢子；

（4）将小孢子置于NLN培养基中培育；NLN培养基包括终浓度为1000~1700mg/LNLN、0.1~0.5mg/L NAA、0.05~0.2mg/L 6-BA、100000~140000mg/L蔗糖、10000~20000mg/L聚乙二醇以及400~600mg/L活性炭；

（5）于暗室中对步骤（4）培育后的小孢子进行热激处理，然后再转入暗室中震荡培养即可。

通过光温调控可实现菜心与紫菜薹花期相遇，自然条件下紫菜薹在华南地区种植会大幅延迟抽薹开花时间，同时，以紫菜薹为母本，可最大程度保留紫菜薹的优良性状，如花青素含量。

而高温热激则可以影响小孢子中微管的分布，促使小孢子对称均等分裂，从而由配子体发育途径转向孢子体发育途径。但热激时间过长或过短，温度过高或过低都会影响小孢子胚的发育。

进一步地，紫菜薹的培养过程为：于25℃/10℃变温条件下进行16h/8h光暗交替培养。

进一步地，菜心于25℃环境下进行14h/10h光暗交替培养。

进一步地，步骤（2）中诱导温度为4℃，诱导时间为12h；保存温度为8℃，保存时间为12h。

在4℃低温处理12小时能提高小孢子胚胎的产量，时间过长则会导致胚胎产量下降。

进一步地，步骤（3）中选择处于单核靠边期的花蕾，然后将花蕾用75%乙醇表面消毒25s，再用0.1%升汞表面消毒花蕾5分钟，最后无菌水清洗。

进一步地，NLN培养基pH值为5.8，其含有以下终浓度的组分：

1.7g/L NLN、0.2mg/L NAA、0.05mg/L 6-BA、120g/L蔗糖、20g/L聚乙二醇以及0.6g/L活性炭。

在培养基中，蔗糖和聚乙二醇用于提供碳源、调节渗透压，适当的渗透压可以使花粉小孢子冲破花粉外壳，并启动胚胎发育。NAA抑制小孢子胚状体发生，但能促进其发育，提高正常胚比例。6-BA对诱导小孢子胚有促进作用。合理的NAA和6-BA比例，可以显著提高胚状体诱导率。

进一步地，热激温度为32.5℃，热激时间为36h。

进一步地，紫菜薹品种为洪山，菜心品种为油绿702。

一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养基，该培养基为NLN培养基，其包括以下终浓度的各组分：

1000~1700mg/LNLN、0.1~0.5mg/L NAA、0.05~0.2mg/L 6-BA、100000~140000mg/L蔗糖、10000~20000mg/L聚乙二醇以及400~600mg/L活性炭。

上述培养基在提升小孢子出胚率中的用途。

本发明的有益效果：

1、本发明可以将紫菜薹的优良性状转育到菜心中的周期从3-4年，缩短到1年以内，并且获得基因型完全纯合的材料，极大缩短了选育时间，大幅提高了选育效率。

2、现有的菜心和紫菜薹的小孢子培养方法均不能诱导出菜心（油绿702）×紫菜薹（优选洪山）杂交种的胚状体，而通过本发明则实现了菜心和紫菜薹杂交种的游离小孢子成胚。

3、本发明在培育过程中提出了渐进式低温诱导的技术，并通过120g/L 蔗糖和20g/L 聚乙二醇协同调节渗透压，大幅提高出胚率，最后获取了更为合理的热激温度和时间，以确保在整个方案的培育下具有优异的出胚率。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1 处理条件筛选

1、低温保存对比试验，见表1。

表1 低温保存对比试验

序号	温度1	温度2	处理时间	胚/蕾
					处理1	4℃	4℃	24h	1.24
处理2	4℃	8℃	12h+12h	3.28
					处理3	8℃	8℃	24h	0.86

可以看到，处理2效果最佳。

2、不同培养基对比试验，见表2。

表2 不同培养基对比试验

可以看出，处理4效果最佳。

3、渗透压调节对比试验，见表3。

表3 渗透压调节对比试验

序号	蔗糖（g/L）	聚乙二醇（g/L）	胚/蕾
				处理1	120	0	1.24
处理2	120	10	2.06
				处理3	120	20	5.58
处理4	120	30	0.84
				处理5	120	40	0.08
处理6	120	50	0

可以看出，处理3效果最佳。

4、热激处理对比试验，见表4。

表4 热激处理对比试验

序号	热激温度	热激时间	胚/蕾
				处理1	32	24	0
处理2	32	36	0.29
				处理3	32	48	0
处理4	32.5	24	0.41
				处理5	32.5	36	6.70
处理6	32.5	48	0.30
				处理7	33	24	0
处理8	33	36	0.85
				处理9	33	48	0.04

可以看出，处理5效果最佳。

基于上述对比筛选获得的最佳试验过程，构建了本方案以下培养过程。

实施例2

一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养方法，具体过程如下：

（1）将紫菜薹（优选洪山）于25℃/10℃变温条件下进行16h/8h光暗交替培养，将菜心（油绿702）于25℃恒温条件下进行14h/10h光暗交替培养，诱导两种作物同期抽薹开花。以紫菜薹为母本，菜心为父本进行杂交，获得F1杂交种子；

（2）按照紫菜薹的培育方式将杂交种子培育至抽薹开花，取无损花序，放置于自封袋中，并加入少量无菌水以保持环境湿润，然后将材料放到4℃冰箱里，低温诱导12h，之后转到8℃冰箱里，放置12h；

（3）通过镜检，选择处于单核靠边期的花蕾，将花蕾依次用75%乙醇表面消毒25s，0.1%升汞表面消毒花蕾5分钟，再用无菌水清洗3次（每次3分钟）；

（4）将消过毒的花蕾夹入离心管中，再在离心管中加入少量冲洗液（N6），并用玻璃棒研磨花蕾，挤出小孢子，再用40μm的细胞筛将小孢子悬浮液过滤至15mL的离心管中；将冲洗液倒至8mL，800r离心5分钟，重复三次，均倒掉上清液；

（5）再加入无菌的NLN培养液至10mL，然后倒入9cm培养皿中，培养皿中分别加入0.6g/L 活性炭1滴（溶于无菌水），0.01g聚乙二醇（PEG-4000）（可溶态），0.002 mg NAA（可溶态），0.0005mg 6-BA（可溶态），1.2g 蔗糖。

（6）于32.5℃暗室中对步骤（4）培育后的小孢子进行热激处理36个小时，然后再转入25℃暗室中40r震荡培养20天。

实施例3

（5）再加入无菌的NLN培养液至10mL，然后倒入9cm培养皿中，培养皿中分别加入0.6g/L 活性炭1滴（溶于无菌水），0.02g聚乙二醇（PEG-4000）（可溶态），0.003 mg NAA（可溶态），0.0002g 6-BA（可溶态），1.2g 蔗糖。

实施例4

（5）再加入无菌的NLN培养液至10mL，然后倒入9cm培养皿中，培养皿中分别加入0.6g/L 活性炭1滴（溶于无菌水），0.03g聚乙二醇（PEG-4000）（可溶态），0.0025 mg NAA（可溶态），0.0004mg 6-BA（可溶态），1.2g蔗糖。

实验例1

一种诱导菜心小孢子出胚的培养方法，具体过程如下：

（1）将菜心（油绿702）于25℃恒温条件下进行14h/10h光暗交替培养，诱导其抽薹开花；

（2）然后取无损花序，放置于自封袋中，并加入少量无菌水以保持环境湿润，然后将材料放到4℃冰箱里，低温诱导12h，之后转到8℃冰箱里，放置12h；

实验例2

一种诱导紫菜薹小孢子出胚的培养方法，具体过程如下：

（1）将紫菜薹（优选洪山）于25℃/10℃变温条件下进行16h/8h光暗交替培养，其抽薹开花；

实验例3

1、根据上述记载的技术方案可知，本申请是以实施例1中表1的处理2、表2的处理4、表3的处理3和表4的处理5结合形成的技术方案。同时，在上述技术方案结合以后，最终得到的出胚率可达6.70/蕾，出胚率远远高于表4中其余处理所形成的技术方案。

2、实验例1和实验例2分别以菜心和紫菜薹作为培养对象，采用本申请实施例1所记载的方案进行诱导培育，但基于相同的培育方法，在更换了培育对象后，发现最终并不能成功诱导出胚，可见，本申请技术方案只能针对特异的杂交种才能发挥功效。

最后应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种提升菜心和紫菜薹杂交种小孢子出胚率的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）于变温条件下对紫菜薹进行光暗交替培养，即25℃培养16h后，10℃培养8h；然后于25℃恒温条件下对菜心进行14h/10h光暗交替培养，并使两者同期抽薹开花，然后杂交获得F1代杂交种子；

（2）按照紫菜薹的培育方式将杂交种子培育至抽薹开花，然后取其无损花序，于4℃诱导12h后，8℃保存12h；

（3）挑选步骤（2）中处于单核靠边期的花蕾，然后将花蕾用75%乙醇表面消毒25s，再用0.1%升汞表面消毒花蕾5分钟，最后无菌水清洗，离心获得小孢子悬浮液；

（4）将小孢子置于NLN培养基中；所述NLN培养基pH值为5.8，包括终浓度为1.7g/L NLN、0.2mg/L NAA、0.05mg/L 6-BA、120g/L蔗糖、20g/L聚乙二醇以及0.6g/L活性炭；

（5）于暗室中对步骤（4）中的小孢子进行热激处理，然后再转入暗室中震荡培养，其中，热激温度为32.5℃，热激时间为36h。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，紫菜薹品种为洪山，菜心品种为油绿702。