CN101953297B - 一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法，该方法是在含有3mL NLN-13悬浮小孢子的培养皿中直接添加秋水仙素生物碱和噻二唑苯基脲(TDZ)细胞分裂素诱导胚状体发生。具体包括下列步骤：1)分别配制秋水仙素和TDZ母液的步骤；2)分别对秋水仙素母液和TDZ母液的灭菌步骤；3)花蕾选取与消毒步骤；4)小孢子游离与纯化步骤；5)诱导胚状体步骤。该方法对常规培养无反应的甘蓝材料，能促使其出胚，对出胚的甘蓝材料，能提高其胚状体产量。

Description

一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法

技术领域

本发明属于植物遗传育种技术领域，具体涉及一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法。

背景技术

植物界游离小孢子培养是直接从花蕾获取游离态的小孢子群体进行培养诱导其胚胎发生形成单倍体(Haploid)，进而加倍形成双单倍体(DoubleHaploid)植株的过程，这种双单倍体植株的自交后代则是DH系。自Lichter于1982年首次从油菜小孢子培养物中获得小孢子植株以来，许多重要作物如小麦、玉米、油菜、大白菜等利用小孢子培养都获得了小孢子植株或在实际工作中得到有效利用。甘蓝是结球甘蓝(Brasscia oleracea var.capitata)的简称，是十字花科芸薹属一种重要的蔬菜作物，异花授粉；在甘蓝作物上进行的小孢子培养研究已有报道，但是因其出胚较其它作物困难，即多数材料对常规培养无反应或出胚材料产胚量很低，成为目前这项技术有效利用的最大障碍。秋水仙素(C₂₂H₂₅NO₆)是一种水溶性生物碱，它除具有染色体加倍作用外，还能够促进游离小孢子胚状体的形成；人们已添加秋水仙素用于甘蓝型油菜、白菜型油菜、小麦等作物小孢子培养研究中，起到了诱发小孢子胚胎发生作用。但甘蓝是植物界很难诱导出小孢子胚状体的一种作物，在我们研究中添加了秋水仙素诱发小孢子胚胎发生，也起到了一定的作用，但其诱导出胚效果不理想。基于这种原因拟想探索出一种在添加秋水仙素的同时，再添加一种细胞分裂素(噻二唑苯基脲(TDZ)C₉H₈N₄OS)的方法来提高小孢子胚胎发生率，结果获得了显著的效果。这一种方法对常规培养无反应的甘蓝材料，能促使其出胚，对出胚的甘蓝材料，能提高其胚状体产量。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法。该方法对常规培养无反应的甘蓝材料，能促使其出胚；对出胚的甘蓝材料，能提高其胚状体产量。

实现上述发明目的的技术方案是：一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法，具体包括下列步骤：

1)分别配制秋水仙素和TDZ母液的步骤；

2)分别对秋水仙素母液和TDZ母液的灭菌步骤；

3)花蕾选取与消毒步骤；

4)小孢子游离与纯化步骤；

5)诱导胚状体步骤。

所述的秋水仙素和TDZ母液配制包括下列步骤：

1)秋水仙素母液配制

①称取秋水仙素3克；

②在秋水仙素中滴入少许酒精导溶后再加适量蒸馏水振摇使其全部溶解；

③在秋水仙素溶液中继续用蒸馏水定容至1000mL，即得浓度为3g/L的秋水仙素母液；

2)TDZ母液的配制

①称取TDZ0.3克；

②将称取的TDZ放进100mL的小烧杯中，滴入少许1mol/L的NaOH溶液导溶后加适量蒸馏水振摇使其全部溶解；

③将全部溶解后的TDZ定溶到1000mL定量瓶中，即配成0.3g/L的母液。

所述的秋水仙素母液的抽滤灭菌包括下列步骤：

1)用抽滤器将秋水仙素母液先用0.45μm滤膜预抽滤一遍；

2)将灭过菌的抽滤器主要部件安装和放置在超净工作台上，并用镊子将灭过菌的0.22μm滤膜放到滤头位置安装好；将预抽滤的秋水仙素母液在无菌超净工作台上抽滤一遍，装入贮藏瓶4℃冰箱中保存，待具体使用时再按所需要浓度进行稀释。

所述的TDZ母液的高压灭菌包括下列步骤：

1)将TDZ母液装入耐压瓶，封口放入高压灭菌锅；

2)在1.5压力下灭菌30分钟，随后冷却放在4℃冰箱中保存，待具体使用时再按所需要浓度进行稀释。

所述的花蕾选取与消毒包括下列步骤：

1)在盛花前期，采集长度3.5～5.5mm的花蕾在室内用倒置显微镜确定单核晚期至双核早期的花蕾长度，以此为标准选取一定数量的花蕾供试；

2)将供试花蕾用体积分数70％酒精浸泡30s，再用10g/L升汞浸泡10min，最后用无菌蒸馏水漂洗3次，每次1min。

所述的小孢子游离与纯化包括下列步骤：

1)将已消毒的花蕾放入无菌试管中，以含蔗糖130g/L的B5培养基为洗涤剂，用玻璃棒挤压花蕾使小孢子游离出来；

2)用孔径50μm无菌网过滤，收集滤液于离心管中，离心3次，沉在离心管底部的即为纯净小孢子。

所述的诱导胚状体包括下列步骤：

1)用微量移液器分别吸取一定量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13悬浮小孢子的培养皿中，使秋水仙素浓度在0.1～50mg/L之间，TDZ浓度在0.01～0.2mg/L之间，封口；

2)将培养皿静置在32℃下黑暗培养48h；

3)将培养皿内含小孢子的培养基装入离心管置于离心机中，在2000r/min的速度下离心三次，第一次离心10min，弃去上清液；第二次再向离心管内加入10ml NLN-13悬浮液培养基，继续离心10min，弃去上清液；第三次再向离心管内加入10ml NLN-13悬浮液培养基，继续离心5min，弃去上清液；然后将小孢子悬浮培养在不含有秋水仙素和TDZ的新鲜6mL NLN-13培养基中，培养于培养皿中，封口；

4)将悬浮小孢子的培养皿静置于25℃、黑暗条件下继续培养，直到肉眼可见小白点时，改换为振荡培养；

5)将肉眼可见小白点的培养皿转至60r/min振荡培养，同时保持适当的弱光条件，继续培养直至胚状体发育完全。

所述的盛花前期是指第一侧枝始花至第三侧枝始花期间。

所述的离心3次条件为以含蔗糖130g/L的B5培养基为洗涤剂，每次5min，2000r/min。

所述的NLN-13为含130g/L蔗糖的NLN培养基。

与现有技术相比，本发明的方法具有以下优点：

1、对常规培养无反应的甘蓝材料，能诱导其部分材料出胚，其出胚材料占供试材料52.6％，平均产胚量1.05胚/蕾～6.57胚/蕾，较单一添加10mg/L秋水仙素提高幅度0.85胚/蕾～6.60胚/蕾，较单一添加0.1mg/LTDZ提高幅度1.0胚/蕾～6.67胚/蕾。

2、对常规培养有反应出胚的甘蓝材料，均能够提高其胚状体产量，每蕾产胚量较未添加秋水仙素和TDZ提高幅度21.8％～550.0％；较单一添加秋水仙素提高幅度7.14％～376.0％；较单一添加TDZ提高幅度17.1％～360.2％。

3、在诱导出的胚状体中，均能够提高子叶型胚率，其比率较未添加秋水仙素和TDZ提高幅度6.8％～69.1％；较单一添加秋水仙素提高幅度3.8％～66.5％；较单一添加TDZ提高幅度0.8％～67.8％。

附图说明

图1是甘蓝小孢子培养花蕾适宜选取植株生长时期图；

图2是用倒置显微镜确定选取单核晚期至双核早期的花蕾不同长度图；

图3是本发明的方法对甘蓝小孢子常规培养无反应材料A632M-1s-5-6-3-8诱导产胚图；

图4是本发明的方法对甘蓝小孢子常规培养出胚材料633M×YP03诱导产胚图；

图5是子叶型胚状体图。

具体实施方式

实施例1

1、分别配制秋水仙素和TDZ母液的步骤；

1)秋水仙素母液配制

①称取秋水仙素3克；

②在秋水仙素中滴入少许酒精导溶后再加适量蒸馏水振摇使其全部溶解；

③在秋水仙素溶液中继续用蒸馏水定溶到1000mL，即得浓度为3g/L的秋水仙素母液；

2)TDZ母液的配制

①称取TDZ0.3克；

②将称取的TDZ放进100mL的小烧杯中，滴入少许1mol/L的NaOH溶液导溶后加适量蒸馏水振摇使其全部溶解；

③将全部溶解后的TDZ定溶到1000mL定量瓶中，即配成0.3g/L的母液。

2、秋水仙素母液的抽滤灭菌包括下列步骤：

1)用抽滤器将秋水仙素母液先用0.45μm滤膜预抽滤一遍；

2)将灭过菌的抽滤器主要部件安装和放置在超净工作台上，并用镊子将灭过菌的0.22μm滤膜放到滤头位置安装好；将预抽滤的秋水仙素母液在无菌超净工作台上抽滤一遍，装入贮藏瓶4℃冰箱中保存，待具体使用时再按所需要浓度进行稀释。

3、TDZ母液的高压灭菌包括下列步骤：

1)将TDZ母液装入耐压瓶，封口放入高压灭菌锅；

2)在1.5压力下灭菌30分钟，随后冷却放在4℃冰箱中保存，待具体使用时再按所需要浓度进行稀释。

4、所述的花蕾选取与消毒包括下列步骤：

1)在盛花前期，采集长度3.5～5.5mm的花蕾在室内用倒置显微镜确定单核晚期至双核早期的花蕾长度，以此为标准选取一定数量的花蕾供试；

2)将供试花蕾用体积分数70％酒精浸泡30s，再用10g/L升汞浸泡10min，最后用无菌蒸馏水漂洗3次，每次1min。

5、小孢子游离与纯化包括下列步骤：

1)将已消毒的花蕾放入无菌试管中，以含蔗糖130g/L的B5培养基为洗涤剂，用玻璃棒挤压花蕾使小孢子游离出来；

2)用孔径50μm无菌网过滤，收集滤液于离心管中，离心3次，沉在离心管底部的即为纯净小孢子。

6、诱导胚状体包括下列步骤：

1)用微量移液器分别吸取一定量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13悬浮小孢子的培养皿中，使秋水仙素浓度在0.1～50mg/L之间，TDZ浓度在0.01～0.2mg/L之间，封口；

2)将培养皿静置在32℃下黑暗培养48h；

3)将培养皿内含小孢子的培养基装入离心管置于离心机中，在2000r/min的速度下离心三次，第一次离心10min，弃去上清液；第二次再向离心管内加入10ml NLN-13悬浮液培养基，继续离心10min，弃去上清液；第三次再向离心管内加入10ml NLN-13悬浮液培养基，继续离心5min，弃去上清液；然后将小孢子悬浮培养在不含有秋水仙素和TDZ的新鲜6mL NLN-13培养基中，培养于培养皿中，封口；

4)将悬浮小孢子的培养皿静置于25℃、黑暗条件下继续培养，直到肉眼可见小白点时，改换为振荡培养；

5)将肉眼可见小白点的培养皿转至60r/min振荡培养，同时保持适当的弱光条件，继续培养直至胚状体发育完全。

所述的盛花前期是指第一侧枝始花至第三侧枝始花期间。

所述的离心3次条件为以含蔗糖130g/L的B5培养基为洗涤剂，每次5min，2000r/min。

所述的NLN-13为含130g/L蔗糖的NLN培养基。

下面通过发明人给出的试验例来进一步说明本发明的作用效果。需要说明的是。这些实施例是一些较佳的实施例。根据实验证明。本发明不限于这些实施例。

试验例1：采用本发明的方法对甘蓝小孢子常规培养无反应材料诱导产胚试验。

发明人研究选用的甘蓝一代杂种5份、高代自交系9份及低代自交系5份，共19份材料为例，对具体实施技术加以说明。

1、花蕾选取与消毒：

1)在田间纱网棚内于各试材盛花前期(图1)，即第一侧枝始花至第三侧枝始花期间，采集长度4.5mm的花蕾；带花蕾在室内用倒置显微镜确定单核晚期至双核早期的花蕾长度(图2)，以此为标准选取各材料40个花蕾。

2)在超净台上，将供试花蕾用体积分数70％酒精浸泡30s，再用10g/L升汞浸泡10min，最后用无菌蒸馏水漂洗3次，每次1min。

2、小孢子游离与纯化：

1)将已消毒的花蕾放入无菌试管中，以含蔗糖130g/L的B5培养基为洗涤剂，用玻璃棒挤压花蕾使小孢子游离出来。

2)用孔径50μm无菌尼龙网过滤，滤液收集于离心管中，离心3次，沉在离心管底部的即为纯净小孢子。每次离心5min(2000r/min)，以含蔗糖130g/L的B₅培养基为洗涤剂。

3、诱导胚状体：

第1步分皿。用NLN-13培养基(含130g/L蔗糖的NLN培养基)10mL悬浮小孢子，平均分到5个直径为60mm的玻璃培养皿中(2mL/皿)，每个培养皿预先加入NLN-13培养基1mL，即每皿3mL NLN-13培养基；第2步秋水仙素和TDZ诱导。用微量移液器分别吸取一定量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13悬浮小孢子的培养皿中，使秋水仙素浓度为10mg/L，TDZ浓度0.1mg/L，用Parafilm封口。第3步热激处理。将培养皿静置在32℃下黑暗培养48h。第4步更换新鲜培养基。将培养皿内含小孢子的培养基进行离心，离心后将原培养基弃去，再用NLN-13新鲜培养基3mL悬浮小孢子，培养于直径为90mm的玻璃培养皿中，每个培养皿预先加入NLN-13新鲜培养基3mL，即每皿6mL NLN-13新鲜培养基；用Parafilm封口；第5步静止培养。将悬浮小孢子的培养皿静置于25℃、黑暗条件下继续培养，直到肉眼可见小白点(胚状体)时，改换为振荡培养；第6步振荡培养。将肉眼可见小白点(胚状体)的培养皿由静止培养转至振荡培养(60r/min)，同时保持适当的弱光条件，继续培养直至胚状体发育完全。

由表1可知，研究结果得出甘蓝小孢子培养对培养基中未添加秋水仙素和TDZ(常规培养)无反应的19份甘蓝材料，在培养基中添加10mg/L秋水仙素浓度和0.1mg/LTDZ后有10份甘蓝材料产生胚状体，产胚材料占供试材料比例为52.6％，平均产胚量1.05胚/蕾～6.57胚/蕾(图3-5)；与对照比较产胚材料较单一添加10mg/L秋水仙素(CK₂)多3份，较单一添加0.1mg/LTDZ(CK₃)多5份；产胚量较单一添加10mg/L秋水仙素(CK₂)提高幅度0.85胚/蕾～6.60胚/蕾，较单一添加0.1mg/LTDZ(CK₃)提高幅度1.0胚/蕾～6.67胚/蕾。由此说明，本发明方法在甘蓝小孢子培养基中添加10mg/L秋水仙素和0.1mg/LTDZ，对常规培养无反应的一代杂种及不同自交代数的甘蓝材料，可显著的能促使其部分材料产胚，并同时添加秋水仙素和TDZ诱导胚状体发生的效果明显比单一添加秋水仙素或TDZ任一种效果都要好。

表1：采用本发明的方法对甘蓝小孢子常规培养无反应材料诱导产胚的结果

注：供试材料共19份均在常规培养时无反应，未诱导出胚状体；表中列出添加秋水仙素、TDZ后对有反应材料的诱导结果。

试验例2：采用本发明方法中不同浓度秋水仙素+TDZ对甘蓝小孢子常规培养出胚材料胚产量和子叶型胚率的试验。

本试验例以发明人研究选用的甘蓝8份常规培养出胚材料为例，对具体实施技术加以说明。

1、母液的配制、抽滤灭菌、花蕾选取与消毒、小孢子的游离与纯化同实施例1。

2、胚状体诱导具体包括下列步骤：

1)用NLN-13培养基(含130g/L蔗糖的NLN培养基)10mL悬浮小孢子，平均分到5个直径为60mm的玻璃培养皿中(2mL/皿)，每个培养皿预先加入NLN-13培养基1mL，即每皿3mL NLN-13培养基；重复四次，共计20皿。

2)用微量移液器分别吸取不同量的秋水仙素母液和一定量的TDZ直接添加于悬浮小孢子的培养皿中，使培养皿内培养基中秋水仙素浓度和TDZ浓度分设4个处理；处理1：不加秋水仙素和TDZ(常规培养ck)；处理2：10mg/L秋水仙素+0mg/LTDZ；处理3：0mg/L秋水仙素+0.1mg/LTDZ；处理4：1mg/L秋水仙素+0.1mg/LTDZ；处理5：10mg/L秋水仙素+0.1mg/LTDZ；处理6：50mg/L秋水仙素+0.1mg/LTDZ；用Parafilm封口。

3、热激处理、更换新鲜培养基、静止培养、振荡培养(同实施例1)。

由表2可知，研究结果得出选用培养基中未添加秋水仙素和TDZ(常规培养)有反应的8份甘蓝材料，通过在小孢子培养基中添加不同浓度秋水仙素和0.1mg/LTDZ后均能明显地提高甘蓝常规培养出胚材料的出胚率和子叶型胚率；其中较未添加秋水仙素和TDZ(CK₁)每蕾产胚数增加幅度最高提高550.0％，最低提高21.8％(图3)，子叶型胚(图5)的胚率增加幅度最高提高69.1％，最低提高6.8％(图4)；较单一添加10mg/L秋水仙素(CK₂)每蕾产胚数增加幅度最高提高376.0％，最低提高7.14％，子叶型胚率增加幅度最高提高66.5％，最低提高3.8％；较单一添加0.1mg/L TDZ(CK₃)每蕾产胚数增加幅度最高提高360.2％，最低提高17.1％，子叶型胚率增加幅度最高提高67.8％，最低提高0.8％；这些结果表明，添加两者的作用效果明显比单一添加秋水仙素或TDZ作用效果好。由此说明，本发明方法同时添加秋水仙素和TDZ有利于促进甘蓝游离小孢子胚胎发生，在甘蓝小孢子培养基中添加一定浓度的秋水仙素和TDZ，均能大幅度增加其胚状体产量和子叶型胚。

表2：不同浓度秋水仙素+TDZ对甘蓝小孢子常规培养出胚材料胚产量和子叶型胚率的影响

Claims (1)

1.一种促进甘蓝游离小孢子胚胎发生的方法，包括下列步骤：

(1)花蕾选取与消毒步骤；

(2)小孢子游离与纯化步骤；

其特征在于，还包括以下的诱导胚状体步骤：

1)用微量移液器分别吸取一定量的秋水仙素母液和TDZ母液直接添加于含有3mL NLN-13悬浮小孢子的培养皿中，使秋水仙素浓度在0.1～50mg/L之间，TDZ浓度在0.01～0.2mg/L之间，封口；

所述的NLN-13为含130g/L蔗糖的NLN培养基；

2)将培养皿静置在32℃下黑暗培养48h；

3)将培养皿内含小孢子的培养基装入离心管置于离心机中，在2000r/min的速度下离心三次，第一次离心10min，弃去上清液；第二次再向离心管内加入10ml NLN-13悬浮液培养基，继续离心10min，弃去上清液；第三次再向离心管内加入10ml NLN-13悬浮液培养基，继续离心5min，弃去上清液；然后将小孢子悬浮培养在不含有秋水仙素和TDZ的新鲜6mL NLN-13培养基中，培养于培养皿中，封口；

所述的TDZ是噻二唑苯基脲；

4)将悬浮小孢子的培养皿静置于25℃、黑暗条件下继续培养，直到肉眼可见小白点时，改换为振荡培养；

5)将肉眼可见小白点的培养皿转至60r/min振荡培养，同时保持适当的弱光条件，继续培养直至胚状体发育完全。

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