CN105248279A - 微型马铃薯的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了微型马铃薯的组织培养方法，包括如下步骤：(1)马铃薯扩繁培养基的制备：马铃薯块，加蒸馏水，煮沸，过滤，向滤液中加入琼脂和蔗糖，加蒸馏水，灭菌；(2)诱导微型薯培养基的制备：马铃薯块，加蒸馏水，煮沸，过滤，向滤液中加入6-BA和NAA，调pH，加琼脂、蔗糖和蒸馏水，灭菌；(3)微型马铃薯的组培：①将无菌马铃薯幼苗茎段置于马铃薯扩繁培养基上培养；②切下带有3-4个茎芽的茎段置于诱导微型薯培养基上，培养。本发明以廉价的马铃薯滤液作为基本培养基，用作马铃薯扩繁、诱导微型薯培养，与普通的MS培养基相比，其制备简单且制备量大，用于大批量培养试管苗和微型薯，使块茎快速结薯且长势好，价廉。

Description

微型马铃薯的组织培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种微型马铃薯的组织培养方法。
背景技术
马铃薯(Solanumtuberosum,Potato)，茄科茄属，属于中国五大主食之一，其营养价值高、适应力强、产量大，是全球第三大重要的粮食作物，仅次于小麦和玉米。近年来，随着我国农业产业结构调整和种薯、商品薯、加工用薯比例大幅度增加，马铃薯栽培正在成为种植业结构调整和农民增收的一项战略选择，而马铃薯种植逐步走向规模化、标准化、区域化。现阶段马铃薯面临两大问题：第一，大面积种植马铃薯时采用无性块茎繁殖，而马铃薯连年的无性繁殖会引起块茎内病毒或者类病毒侵染和积累，造成马铃薯质量退化和产量下降，因而必须要栽培无病毒的马铃薯植株。第二，马铃薯作为主食之一，还缺少一些人体所必须的营养物质，现已有报道可以通过转基因提高这些营养，比如β-胡萝卜素是维生素A原的合成前体，可以通过提高类胡萝卜素代谢途径中的β-胡萝卜素的含量从而达到维生素A的含量增加。而这些研究的基础就是需要一种使马铃薯快速生长且价格合理的培养基进行培养。
我国学者多以MS培养基为基本培养基对马铃薯茎段进行扩繁，以及添加适当的生长激素，用马铃薯的茎段作为外植体进行离体培养，以得到愈伤组织和促进组织分化形成试管薯，茎段扩繁的重要性不言而喻，任何组织培养均需要进行扩繁，当然微型薯的形成也是相当重要。现阶段微型薯常用于实验室研究马铃薯的模型，在研究马铃薯退化和转基因马铃薯的问题上，微型薯具有种性高、繁殖快、占据空间小，便于贮藏和运输以及可以周年生产等优点。其与试管苗一样是马铃薯脱毒原种薯生产和转基因时农杆菌侵染的基础，但与试管苗相比，微型薯在脱毒和侵染时更容易成活，因此被广泛作为实验室比较理想的研究材料。但是一般的MS培养基不易使马铃薯块茎结薯，且生长周期长、培养基花费较大。如果要进行大批量快速培养高质量的微型薯，因此亟需一种培养基既可以培养高质量的微型薯，又可以节省成本的培养基的微型马铃薯的组织培养方法。
发明内容
本发明的目的克服现有技术的不足，提供一种既可以培养高质量的微型薯，又可以节省成本的培养基的微型马铃薯的组织培养方法。
本发明的技术方案概述如下：
微型马铃薯的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)马铃薯扩繁培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成块，按比例取180-220g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(2)诱导微型薯培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成块，按比例取180-220g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入6-BA使终浓度为1mg/L-2mg/L，加入NAA使终浓度0.1mg/L-0.2mg/L，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(3)微型马铃薯的组织培养：
①选取长势好的无菌马铃薯幼苗，取茎段2-3cm置于马铃薯扩繁培养基上；于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养；
②切下带有3-4个茎芽的茎段置于诱导微型薯培养基上，于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养至少6周。
步骤(3)马铃薯幼苗的品种优选为中农303、大西洋或早大白，还可以选择其它的营养含量与优选品种相类似的马铃薯品种。
本发明的优点：
本发明以廉价的马铃薯滤液作为基本培养基，用作马铃薯茎段扩繁培养，然后在此基础上添加不同比例的激素得到诱导微型薯的培养基。用于脱毒后的马铃薯的扩繁培养和微型薯的培养，与普通的MS培养基相比，其制备简单且制备量大，可用于大批量培养试管苗和微型薯，可以使马铃薯块茎快速结薯且长势良好，价格便宜。适合马铃薯的大规模培养。
附图说明
图1为马铃薯茎段扩繁图。
图2为中农303微型薯图。
图3为大西洋微型薯图。
图4为早大白微型薯图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
各实施例中步骤(1)和步骤(2)所选用的马铃薯均采用市售的马铃薯。
NAA：萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid)。
6-BA：6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)又称为细胞分裂素。
实施例1
微型马铃薯的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)马铃薯扩繁培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成4-9cm3块，按比例取200g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(2)诱导微型薯培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成4-9cm3块，按比例取200g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入6-BA使终浓度为1.5mg/L，加入NAA使终浓度0.15mg/L，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(3)微型马铃薯的组织培养(实验组)：
①选取长势好的中农303品种无菌马铃薯(商品化的)幼苗，取茎段2-3cm置于盛放有20ml马铃薯扩繁培养基的培养皿上，放8段；于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养，见图1；
②切下带有3-4个茎芽的茎段置于盛放有60ml诱导微型薯培养基的培养瓶中，于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养6周，见图2。每个实验组设立三组平行实验。
对照组采用对照组扩繁培养基和对照组诱导微型薯培养基替换步骤(3)中的马铃薯扩繁培养基和诱导微型薯培养基，其它同步骤(3)，每个对照组设立三组平行实验。
对照组扩繁培养基的制备：
取MS培养基(不含琼脂和蔗糖)4.74g加适量蒸馏水溶解，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌。
对照组诱导微型薯培养基的制备：
取MS培养基(不含琼脂和蔗糖)4.74g加适量蒸馏水溶解，加入6-BA使终浓度为1.5mg/L，加入NAA使终浓度0.15mg/L，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌。
培养6周时间观察马铃薯长势，见表1。
中农303品种实验组结果如表1-a；对照组结果如表1-b。
表1-a
实验组编号 1 2 3
微型薯个数 5 4 4
表1-b
对照组编号 1 2 3
微型薯个数 1 2 2
实施例2
微型马铃薯的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)马铃薯扩繁培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成4-9cm3块，按比例取180g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(2)诱导微型薯培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成4-9cm3块，按比例取180g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入6-BA使终浓度为1mg/L，加入NAA使终浓度0.1mg/L的，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(3)微型马铃薯的组织培养(实验组)：
①选取长势好的大西洋品种无菌马铃薯(商品化的)幼苗，取茎段2-3cm置于马铃薯扩繁培养基上；于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养；
②切下带有3-4个茎芽的茎段置于诱导微型薯培养基上，于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养6周，见图3。每个实验组设立三组平行实验。
对照组采用对照组扩繁培养基和对照组诱导微型薯培养基替换步骤(3)中的马铃薯扩繁培养基和诱导微型薯培养基，其它同步骤(3)，每个对照组设立三组平行实验。
对照组扩繁培养基的制备：同实施例1；
对照组诱导微型薯培养基的制备：
取MS培养基(不含琼脂和蔗糖)4.74g加适量蒸馏水溶解，加入6-BA使终浓度为1mg/L，加入NAA使终浓度0.1mg/L，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌。
培养6周时间观察马铃薯长势，见表2。
大西洋实验组结果如表2-a；对照组结果如表2-b。
表2-a
实验组编号 1 2 3
微型薯个数 5 4 6
表2-b
对照组编号 1 2 3
微型薯个数 1 2 2
实施例3
微型马铃薯的组织培养方法，包括如下步骤：
(1)马铃薯扩繁培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成4-9cm3块，按比例取220g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(2)诱导微型薯培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成4-9cm3块，按比例取220g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入6-BA使终浓度为2mg/L，加入NAA使终浓度0.2mg/L的，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(3)微型马铃薯的组织培养(实验组)：
①选取长势好的早大白品种无菌马铃薯(商品化的)幼苗，取茎段2-3cm置于马铃薯扩繁培养基上；于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养；
②切下带有3-4个茎芽的茎段置于诱导微型薯培养基上，于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养6周，见图4。每个实验组设立三组平行实验。
对照组采用对照组扩繁培养基和对照组诱导微型薯培养基替换步骤(3)中的马铃薯扩繁培养基和诱导微型薯培养基，其它同步骤(3)，每个对照组设立三组平行实验。
对照组扩繁培养基的制备：同实施例1；
对照组诱导微型薯培养基的制备：
取MS培养基(不含琼脂和蔗糖)4.74g加适量蒸馏水溶解，加入6-BA使终浓度为2mg/L，加入NAA使终浓度0.2mg/L，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌。
培养6周时间观察马铃薯长势，见表3。
早大白实验组结果如表3-a；对照组结果如表3-b。
表3-a
实验组编号 1 2 3
微型薯个数 5 7 6
表3-b
对照组编号 1 2 3
微型薯个数 1 2 2

Claims (2)

1.微型马铃薯的组织培养方法，其特征是包括如下步骤：
(1)马铃薯扩繁培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成块，按比例取180-220g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(2)诱导微型薯培养基的制备：
马铃薯洗净去皮切成块，按比例取180-220g，加蒸馏水至800ml，121℃煮沸30min后，用纱布过滤，向滤液中加入6-BA使终浓度为1mg/L-2mg/L，加入NAA使终浓度0.1mg/L-0.2mg/L，调节pH＝5.8，加入10g琼脂和20g蔗糖，加蒸馏水至1000ml，灭菌；
(3)微型马铃薯的组织培养：
①选取长势好的无菌马铃薯幼苗，取茎段2-3cm置于马铃薯扩繁培养基上；于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养；
②切下带有3-4个茎芽的茎段置于诱导微型薯培养基上，于26℃，16h/8h光周期，光强为300μmol/(m2.s)进行培养至少6周。
2.根据权利要求1所述的微型马铃薯的组织培养方法，其特征是所述步骤(3)所述马铃薯幼苗的品种为中农303、大西洋或早大白。
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