CN108371101A - 一种马铃薯仔薯的诱导繁殖培养基及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种马铃薯仔薯的诱导繁殖培养基及应用方法。本发明提供的马铃薯仔薯的诱导繁殖培养基由MS、6‐苄氨基嘌呤、植物凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖组成，该培养基成分简单，易于配制，培养基的均一化程度高，适用于产业化操作。通过MS、6‐苄氨基嘌呤(6‐BA)、G3251、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、蔗糖的合适配比，获得了良好的马铃薯仔薯诱导效果，为后续的繁殖培养提供了优良的基础。同时，本发明也提供了该马铃薯仔薯的诱导繁殖培养基的配制方法和具体的应用方法。

Description

一种马铃薯仔薯的诱导繁殖培养基及应用方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种马铃薯仔薯的诱导繁殖培养基和组织培养方法。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum L.)属于茄目Solanales；茄科Solanaceae；茄属Solanum。马铃薯(S.tuberosum)又称土豆、山药蛋、洋芋等，块茎可以食用，是世界上非常重要的一种宜粮、宜菜、宜饲、宜工业原料等多用途的经济作物，同时是世界上仅次于小麦、水稻、玉米，产量居列第四位的作物。中国马铃薯种植面积占全球种植面积的22％以上，占亚洲种植面积的58％左右，居世界首位；总产量占世界总产量的18％，居世界第一因此成为世界马铃薯生产第一大国。马铃薯是重要的粮菜兼用作物和工业原料，在我国粮食生产和农村经济发展中具有举足轻重的地位，马铃薯产业的发展对解决“三农”问题、缓解大部分耕地处于自然条件胁迫状态下的我国粮食安全、参与国际农产品和加工产品的市场竞争等都具有重要的现实意义和战略意义。由于马铃薯耐旱、耐瘠薄、高产稳产、适应性广、营养成分全和产业链长而受到全世界的高度重视。

病毒病一直阻碍着马铃薯生产的发展,不仅导致马铃薯品种退化、产量下降，而且严重影响了马铃薯的品质。传统的育种方式已很难满足马铃薯生产的需要，而利用生物工程结合传统育种技术培育马铃薯新品种已成为解决当前马铃薯生产和推广问题的重要手段。组织培养仔薯(microtuber)诱导是继脱毒试管苗之后发展起来的一种生产无毒薯的新方法。马铃薯仔薯不但具有试管苗的一切优点,而且个体小,质量轻,与大田常规薯相比,更便于保存、运输和推广。此外,马铃薯仔薯还可作为基因转移的受体材料,与其他基因工程研究中的外植体如叶片、茎段相比,具有更高的再生频率。

目前仔薯的诱导培养主要采用3种培养方式,即采用3种培养基(固体培养基、液体培养基、固液培养基)进行培养。3种培养基各有其优缺点：固体培养基操作方便,易于配制,且不易受到污染,缺点是营养不均；液体培养基营养分布均一,但易污染,且需要摇床等设备,要求较高；固液培养基介于两者之间。对于马铃薯仔薯的诱导培养方式，现有技术通常采用两种不同的方法，一种是分步诱导培养，另一种是则是直接诱导培养。分步诱导培养通常是将切取的马铃薯茎段先在壮苗培养基上进行壮苗培养1个月左右，待切取的马铃薯茎段生长成熟后，再将其移栽到马铃薯的仔薯诱导培养基中进行培养，这种诱导方式虽然能够有较高的仔薯诱导率，但是，其在易于感染病毒、细菌，且其操作周期较长，对于操作的无菌条件和无菌设备的要求较高，不适合大规模工业化的仔薯诱导生产。

直接诱导培养则是将切取的马铃薯茎段直接栽入仔薯诱导培养基中进行诱导培养。该方法具有诱导周期短，繁殖系数，不易受到细菌和病毒的污染、易操作等优点，但是，该方法的仔薯诱导率较低，而且其对诱导培养基要求也很高。目前，现有技术中的采用直接诱导法进行仔薯诱导的培养基，通常需要加入较多的生长激素类物质，例如，细胞分裂素、细胞周期蛋白，6-BA、NAA、ALA(丙氨酸)、多效唑、香豆素等，其培养基的成分较为复杂，配制过程繁琐，培养基的成本也较高。

因此，获得一种培养基成分简单，配制容易、适用于马铃薯仔薯直接诱导培养，且能在较短的时间内，获得高仔薯诱导率的诱导繁殖培养基，并以此培养基为基础开发出再生率高，操作简便，繁殖速度快的马铃薯组织培养技术，是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明目的之一是提供一种马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，其适用于马铃薯仔薯直接诱导培养，且能在较短的时间内，获得高仔薯诱导率，从而提高马铃薯繁殖的速度和再生率。

为实现上述目的，本发明的所采用的马铃薯仔薯诱导繁殖培养基成分为：MS、6‐苄氨基嘌呤(6‐BA)、植物凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖；优选的，马铃薯仔薯诱导繁殖培养基成分为：MS、0.5‐3mg/L 6‐苄氨基嘌呤(6‐BA)、2‐3g/L植物凝胶、2‐3g/L PVP、5％‐8％蔗糖；更加优选的，马铃薯仔薯诱导繁殖培养基成分为：MS、2mg/L 6‐苄氨基嘌呤(6‐BA)、3g/L植物凝胶、3g/L PVP、8％蔗糖。其中，植物凝胶，优选为Gelzan胶，更加优选为PhytotechlabGelzan G3251。

在上述培养基中，MS为本领域常用的植物组织培养培养基，其成分具体为：大量元素：NH4NO3，1650mg/L、KNO3，1900mg/L、CaCl2·2H2O，440mg/L，MgSO4·7H2O，370mg/L、KH2PO4 170mg/L；微量元素：KI，0.83mg/L、H3BO3，6.2mg/L、MnSO4·4H2O，22.3mg/L、ZnSO4·7H2O，8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O，0.25mg/L、CuSO4·5H2O，0.025mg/L、CoCl2·6H2O，0.025mg/L；铁盐：FeSO4·7H2O(27.8mg/L)、Na2‐EDTA·2H2O(37.3mg/L)；有机物质：肌醇，100mg/L、烟酸，0.5mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)，0.5mg/L、盐酸硫胺素(维生素B1)，0.1mg/L、甘氨酸，2.0mg/L。本发明中所使用的MS为商业制造的MS培养基粉末，使用时直接称量溶解即可。本发明的MS培养基中不含有植物激素类物质和糖类物质。

6‐苄氨基嘌呤(6‐BA)为人工合成细胞分裂素。具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质分解,保绿防老；氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能,广泛用农业、树和园艺作物从发芽收获各阶段。

聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，是N‐乙烯基酰胺类聚合物中的一种，PVP作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性质，胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用，其广泛的应用于医药卫生、食品加工领域。

在本发明的培养基中，所述的植物凝胶是Gelzan胶，具体的为G3251(Phytotechlab公司生产的一种植物凝胶，CAS:71010‐52‐1)。G3251是众多Gelzan胶中的一种，其是由微生物发酵而来，G3251与同类的Gelzan胶产品相比具有用量少(0.25％的使用量就可以达到琼脂1.5％使用量的凝胶强度)，凝固点、熔点和弹性、硬度都可以调节，产品差异小，与营养附加物的良好兼容、热稳定性好且耐酸等优良的特性。

本发明另外一个目的是提供一种马铃薯仔薯诱导繁殖培养基的制备方法，具体步骤如下：以配置1L的目标培养基为例，称取MS 4.43g/L(不同品牌MS使用量参照说明书)，3g/L PVP，80g/L蔗糖，加适量蒸馏水溶解，加入2ml浓度为1mg/ml的6‐BA，然后加入蒸馏水定容到1L，用1mg/ml氢氧化钠(NaOH)调节PH至5.8，称取3g/L G3251，微波炉加热至G3251充分溶解(一般1L需加热7‐8分钟)。

本发明的第三个目的是提供一种基于马铃薯仔薯的组织培养方法，其采用本发明所述的马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，实现了只用一种培养基，完成仔薯诱导和马铃薯组织再生的效果，且能够获得良好再生率。所述基于马铃薯仔薯的组织培养方法具体为：

(1).诱导仔薯：取马铃薯无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2‐5cm，至少1个节点，放置于灭菌后的仔薯诱导培养基中。培养条件：温度24‐26℃，光照强度：100‐300lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养3‐5周。

(2).切取仔薯：3‐5周后，培养瓶中出现黄豆大小的仔薯，用灭菌镊子在超净工作台中将仔薯切取出备用，将原无菌苗放回光照培养室继续培养。取一空盘，先铺一层吸水纸，覆盖2层纱布，将仔薯置于纱布上，再覆盖2层纱布，加入适量的自来水，浸泡仔薯同时不产生积水，每天更换新鲜的水。培养条件：温度24‐26℃，黑暗培养，保持水分，培养2‐3周，仔薯诱导出小苗。

(3).移栽：将诱导出小苗的仔薯移栽到用多菌灵灭菌过的土壤+蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中，浇足水，光照强度：5000‐10000lx，光照时间16h/d，2周后室外培养，保证水分即可。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明的培养基在MS培养基的基础上，仅加入了6‐苄氨基嘌呤(6‐BA)作为生长激素类物质，并加入G3251、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、蔗糖，培养基成分简单，易于配制，培养基的均一化程度高，易于产业化操作。通过MS、6‐苄氨基嘌呤(6‐BA)、G3251、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、蔗糖的合适配比，仅用3周时间即可获得较高的马铃薯仔薯诱导率，适用后期基于仔薯的马铃薯组织培养。

2、本发明所采用的基于仔薯的马铃薯组织培养方法仅采用了一种培养基，即可获得较高的出芽率和移栽成活率，操作简单，培养效率高。

3、采用结冷胶G3251(Gelzan胶)代替传统琼脂。G3251结冷胶具有较传统琼脂更高的透明度，本实验中便于观察茎段的生根情况；其能够更好的兼容各种营养物质，凝胶的弹性更好，有更好的仔薯诱导效果。

附图说明

图1是仔薯诱导培养3周后，切取的仔薯；

图2是仔薯诱导苗移栽室内2周后的生长情况。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。

实施例1马铃薯仔薯诱导繁殖培养基的配制和不同成分培养基仔薯诱导效果比较

马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，培养基配方为：MS、2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、3g/L G3251、3g/L聚乙烯吡咯烷酮、8％蔗糖。

培养基的配置方法为：以配置1L的目标培养基为例，称取MS 4.43g/L(不同品牌MS使用量参照说明书)，3g/L PVP，80g/L蔗糖，加适量蒸馏水溶解，加入2ml浓度为1mg/ml的6-BA，然后加入蒸馏水定容到1L，用1mg/ml氢氧化钠(NaOH)调节PH至5.8，称取3g/L G3251，微波炉加热至G3251充分溶解(一般1L需加热7-8分钟)。将配制好的培养进行分装，备用。

为了比较不同培养基成分对马铃薯仔薯诱导繁殖过程中，仔薯诱导效果的影响，根据上述培养基配制的方法，结合本领域常规的配制技术，对培养基成分进行调整，获得以下不同成分组成的培养基：

培养基1：MS、1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、8g/L琼脂糖、8％蔗糖；

培养基2：MS、2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、8g/L琼脂糖、8％蔗糖；

培养基3：MS、2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、3g/L G3251、3g/L聚乙烯吡咯烷酮、5％蔗糖；

培养基4：MS、1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、3g/L G3251、3g/L聚乙烯吡咯烷酮、8％蔗糖；

培养基5：MS、2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、3g/L G3251、3g/L聚乙烯吡咯烷酮、8％蔗糖；

培养基6：MS、1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、3g/L G3251、、5％蔗糖；

培养基7：MS、2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、3g/L G3251、8％蔗糖。

取马铃薯无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少1个节点，放置于灭菌后的上述仔薯诱导培养基1-7中。培养条件：温度24-26℃，光照强度：100-300lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养3周。培养结果如表1所示。

表1不同的培养基成分对马铃薯仔薯诱导效果的影响

从表1的结果中可以看出，采用MS、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、G3251、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖的培养基有较好的仔薯诱导效果，特别是培养基5：MS、2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、3g/L G3251、3g/L聚乙烯吡咯烷酮、8％蔗糖，在诱导培养第3周后，能够获得结薯率为168％优异效果，这对于后续的获得良好的组培苗繁殖效果，打下了优良的基础。另外，通过比较G3251和琼脂糖的仔薯效果效果可以看出，采用G3251的培养基有更好效果，这说明G3251有着更好的营养物质兼容性、凝胶的弹性更好，更加易于仔薯的诱导。

实施例2：基于马铃薯仔薯的组织培养方法

(1).诱导仔薯：取马铃薯无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少1个节点，放置于灭菌后的仔薯诱导培养基中。培养条件：温度24-26℃，光照强度：100-300lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养3周。

(2).切取仔薯：3周后，培养瓶中出现黄豆大小的仔薯，用灭菌镊子在超净工作台中将仔薯切取出备用，将原无菌苗放回光照培养室继续培养。取一空盘，先铺一层吸水纸，覆盖2层纱布，将仔薯置于纱布上，再覆盖2层纱布，加入适量的自来水，浸泡仔薯同时不产生积水，每天更换新鲜的水。培养条件：温度24-26℃，黑暗培养，保持水分，培养2周，仔薯诱导出小苗。

(3).移栽：将诱导出小苗的仔薯移栽到用多菌灵灭菌过的土壤+蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中，浇足水，光照强度：5000-10000lx，光照时间16h/d，2周后室外培养，保证水分即可。

实施例3：基于马铃薯仔薯的组织培养方法

(1).诱导仔薯：取马铃薯无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少1个节点，放置于灭菌后的仔薯诱导培养基中。培养条件：温度24-26℃，光照强度：100-300lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养4周。

(2).切取仔薯：4周后，培养瓶中出现黄豆大小的仔薯，用灭菌镊子在超净工作台中将仔薯切取出备用，将原无菌苗放回光照培养室继续培养。取一空盘，先铺一层吸水纸，覆盖2层纱布，将仔薯置于纱布上，再覆盖2层纱布，加入适量的自来水，浸泡仔薯同时不产生积水，每天更换新鲜的水。培养条件：温度24-26℃，黑暗培养，保持水分，培养2周，仔薯诱导出小苗。

实施例4：基于马铃薯仔薯的组织培养方法

(1).诱导仔薯：取马铃薯无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少1个节点，放置于灭菌后的仔薯诱导培养基中。培养条件：温度24-26℃，光照强度：100-300lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养5周。

(2).切取仔薯：5周后，培养瓶中出现黄豆大小的仔薯，用灭菌镊子在超净工作台中将仔薯切取出备用，将原无菌苗放回光照培养室继续培养。取一空盘，先铺一层吸水纸，覆盖2层纱布，将仔薯置于纱布上，再覆盖2层纱布，加入适量的自来水，浸泡仔薯同时不产生积水，每天更换新鲜的水。培养条件：温度24-26℃，黑暗培养，保持水分，培养3周，仔薯诱导出小苗。

实施例2-4中所有马铃薯试管苗室外移栽地点均为湖北省武汉市洪山区，移栽在时间为9-12月。实施例2-4中基于马铃薯仔薯的组织培养方法的具体实验结果如表2所示。

表2基于马铃薯仔薯的组织培养方法的具体实验结果

	茎段数量(个)	出芽率	移栽成活率
				实例2	20	86.45％	90.22％
实例3	26	88.27％	95.74％
				实例4	29	90.01％	97.84％

由上表可以看出，仅采用本发明的马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，而不采用任何其他类型培养基的情况下，可以达到出芽率率90.01％、移栽成活率(再生率)高达97.84％的优异效果。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，其特征在于，所述仔薯诱导繁殖培养基含有MS培养基、6-苄氨基嘌呤、植物凝胶、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖。

2.权利要求1所述的马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，其特征在于，所述仔薯诱导繁殖培养基的成分由以下物质组成：MS培养基、6-苄氨基嘌呤、植物凝胶、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖。

3.权利要求1-2任意一项所述的马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，其特征在于，所述仔薯诱导繁殖培养基的成分由以下物质组成：MS培养基、0.5-3mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2-3g/L植物凝胶、2-3g/L聚乙烯吡咯烷酮、5％-8％蔗糖。

4.权利要求1-2任意一项所述的马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，其特征在于，所述仔薯诱导繁殖培养基的成分由以下物质组成：MS培养基、2mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、3g/L植物凝胶、3g/L聚乙烯吡咯烷酮、8％蔗糖。

5.权利要求4所述的马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，其特征在于，所述植物凝胶为Gelzan胶。

6.权利要求1-2或5任意一项所述的马铃薯仔薯诱导繁殖培养基，其特征在于，所述植物凝胶为Phytotechlab Gelzan G3251。

7.权利要求1-6任意一项所述马铃薯仔薯诱导繁殖培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤为：称取MS 4.43g/L，3g/L PVP，80g/L蔗糖，加适量蒸馏水溶解，加入2ml浓度为1mg/ml的6-BA，然后加入蒸馏水定容到1L，用1mg/ml氢氧化钠调节PH至5.8，称取3g/L G3251，微波炉加热至G3251充分溶解。

8.权利要求1-6任意一项所述马铃薯仔薯诱导繁殖培养基在马铃薯组织培养中的用途。

9.权利要求8所述的用途，其特征在于，马铃薯组织培养具体为马铃薯仔薯诱导培养。

10.一种基于马铃薯仔薯的组织培养方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

(1).诱导仔薯：取马铃薯无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少1个节点，放置于灭菌后的仔薯诱导培养基中。培养条件：温度24-26℃，光照强度：100-300lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养3-5周。

(2).切取仔薯：3-5周后，培养瓶中出现黄豆大小的仔薯，用灭菌镊子在超净工作台中将仔薯切取出备用，将原无菌苗放回光照培养室继续培养。取一空盘，先铺一层吸水纸，覆盖2层纱布，将仔薯置于纱布上，再覆盖2层纱布，加入适量的自来水，浸泡仔薯同时不产生积水，每天更换新鲜的水。培养条件：温度24-26℃，黑暗培养，保持水分，培养2-3周，仔薯诱导出小苗。

(3).移栽：将诱导出小苗的仔薯移栽到用多菌灵灭菌过的土壤+蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中，浇足水，光照强度：5000-10000lx，光照时间16h/d，2周后室外培养，保证水分即可。