CN105638455B

CN105638455B - 一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基

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Publication number: CN105638455B
Application number: CN201410644602.0A
Authority: CN
Inventors: 朱华国; 赖黎丽; 孙杰
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2018-03-20
Anticipated expiration: 2034-11-14
Also published as: CN105638455A

Abstract

本发明公开了一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法，属于植物细胞工程技术领域。该培养方法包括如下步骤：（1）取花蕾，4℃预处理1~7天；（2）花蕾消毒；（3）剥取花药；（4）接种；（5）愈伤组织和胚状体诱导；（6）分化调控；（7）生根培养；（8）驯化与移栽；（9）加倍处理。本发明中基本培养基为改良的MSB培养基，由MS无机盐和B₅有机物构成，有利于胚状体和再生植株根的分化，本发明为辣椒花药培养获得单倍体提供了一种方便、快捷和有效的方法，具有较好的社会效益和经济效益。

Description

一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基。

背景技术

我国是辣椒种植大国，辣椒资源相当丰富，总产量已居世界之首，其中制干辣椒种植面积近600万亩，年产干辣椒60多万吨，产值近60亿元，已成为农民致富的重要经济作物之一。新疆具有独特的种植制干辣椒的气候条件，是世界适宜种植辣椒的少数地区之一，常年种植面积和产量均占全国的65%以上，加工辣椒产业已成为新疆“红色产业”的重要组成部分。但适合新疆种植的加工辣椒品种不多，迫切需要通过生物技术手段促进品种选育。

花药培养技术是迄今为止创造纯合基因型的最有效手段，在育种工作中，利用这项技术除了可以缩短材料的纯化时间，对杂交F1、F2的花药培养可选择出特异的性状外，还可以通过花药培养方法建立DH群体，直接获得纯化的品系，进而作为育种中间材料或亲本育成新品种。

生物技术和常规育种相结合，已成为当代作物育种的一大特点。应用单倍体培养所得的双单倍体植株，无论是在作物的育种，还是在遗传图谱构建、重要性状的QTL定位及基因的克隆筛选等分子生物学研究都有着重要的应用价值。目前辣椒花药培养或小孢子培养仍然存在着基因型限制、培养过程繁琐、成胚率低、畸形苗率高等需要克服的问题，限制了单倍体育种技术在育种实践中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基配方。

本发明的目的可以通过以下实施方案获得：首先供试辣椒于春季（4月）植于大田中，待现蕾后，选取无病虫害植株的花蕾。取材时间一般在晴天、无（少）露水时进行，在温度较低、日照较弱的8:00~10:00进行，选择花瓣与花萼近等长或根据花药颜色以1/3为紫色的花蕾，将取好的花蕾立即放于冰盒中，回实验室后放置4℃冰箱预处理1~7天。

预处理后的花蕾放在0.1% 升汞溶液中表面消毒10min，无菌水冲洗3-4 次，倒在无菌滤纸上，用两把尖头小镊子一把夹住花蕾底部一把镊子将花瓣部分拔出，然后将花瓣剥离开取出花药接种在已灭菌的诱导培养基上，每皿放30个左右的花药，然后用Parafilm膜封口。

诱导培养基以改良的MSB培养基为基本培养基，设置两种激素组合处理（0.1 mg/L2, 4-D+0.1 mg/L KT和0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT）。采用高压蒸汽灭菌，灭菌时间为15~20 min。

28 ℃恒温培养箱中，黑暗条件下诱导培养4周后继代于分化培养基上（生长素减半的诱导培养基），继续黑暗培养可见明显子叶的成熟胚状体和胚性愈伤组织（图1-3）。剥离成熟胚状体，28 ℃光照条件（2000lux）下进行生根培养（图4），长出发达根系后进行水培炼苗（图5），驯化后移栽至营养土和蛭石（3:1）混拌的土钵中（图6）；植株长势稳健后用脱脂棉蘸取0.25%秋水仙素进行加倍处理48小时（图7）。

本发明所提供的进行辣椒花药培养的基本培养基为改良的MSB培养基，由MS的无机盐成分和B₅培养基的有机成分组成，诱导培养基具体组成如下：硝酸钾1.9 g/L、硫酸铵1.65 g/L、磷酸二氢钾0.17 g/L、七水硫酸镁 0.37 g/L、二水氯化钙0.44 g/L、四水硫酸锰22.3 mg/L 、硼酸6.2 mg/L、七水硫酸锌8.6 mg/L、碘化钾0.83 mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025 mg/L、六水氯化钴0.025 mg/L、乙二胺四乙酸钠37.3 mg/L、七水硫酸亚铁27.8 mg/L、甘氨酸2mg/L、烟酸1 mg/L、盐酸硫胺素10 mg/L、盐酸吡哆醇1 mg/L、肌醇100 mg/L，蔗糖30 g/L、琼脂9 g/L，pH为5.8~6.0。

所述辣椒为杂交F1的二倍体辣椒，包括牛角椒、羊角椒、线椒等制干辣椒品种。

本发明具有以下有益效果：1、从一批来自全国适应新疆种植，生物学形状优秀的辣椒杂交F1代或杂交组合进行花药培养实验，建立起一套简便高效的再生体系，达到愈伤组织诱导率达20%以上，出胚率达到5%以上，正常苗率60%以上，10周内获得完整再生植株。2、本发明的培养方法简便，仅需要在固体培养基上继代培养一次后就可以获得再生植株。3、本发明的培养基是改良的MSB培养基，通过改善了有机物成分促进再生植株根的发育，有利于获得更多的正常再生植株。

附图说明

图1 继代一次后的胚状体发生

图2 单个花药分化的成簇胚状体

图3花药分化的胚性愈伤组织

图4 正常的再生植株

图5 水培炼苗

图6 再生苗的移栽

图7 染色体加倍

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

无机盐购自国药集团化学试剂有限公司和北京化学试剂公司；2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、激动素（KT）和维生素购自SIGMA公司；肌醇购自国药集团化学试剂有限公司；蔗糖购自北京北化精细化学品有限责任公司，琼脂粉购自北京振泰科技创新发展中心。

实验步骤如下：选择花瓣与花萼近等长或根据花药颜色以1/3为紫色的花蕾，放置4℃冰箱预处理1—7天不等。将处理好的材料在超净工作台无菌条件下，把花蕾放在0.1%升汞溶液中表面消毒10min，用无菌水冲洗3次。消毒后倒在无菌滤纸上，用两把尖头镊子，一把枪形镊子夹住花蕾底部一把眼科镊子将花瓣部分拔出，然后将花瓣剥离开取出花药接种，每皿放30个左右的花药， Parafilm 膜封口。

诱导培养基为改良的MSB培养基附加植物激素组成，MSB基本培养基组成为：硝酸钾1.9 g/L、硫酸铵1.65 g/L、磷酸二氢钾0.17 g/L、七水硫酸镁 0.37 g/L、二水氯化钙0.44 g/L、四水硫酸锰22.3 mg/L 、硼酸6.2 mg/L、七水硫酸锌8.6 mg/L、碘化钾0.83 mg/L、二水钼酸钠0.25 mg/L、五水硫酸铜0.025 mg/L、六水氯化钴0.025 mg/L、乙二胺四乙酸钠37.3 mg/L、七水硫酸亚铁27.8 mg/L、甘氨酸2 mg/L、烟酸1 mg/L、盐酸硫胺素10 mg/L、盐酸吡哆醇1 mg/L、肌醇100 mg/L。此外，附加两个植物激素组合分别为2，4-二氯苯氧乙酸0.1 mg/L和激动素0.1 mg/L，以及萘乙酸 0.5 mg/L和激动素0.1 mg/L。附加3% ( W/V)蔗糖，0.9%( W/V)琼脂。采用高压蒸汽灭菌、灭菌压力为1.2 kg/cm²，温度为121 ℃，灭菌时间为15~20 min。

将接种了花药的培养皿放入28 ℃的恒温培养箱中黑暗培养，4周后可见少量胚状体和愈伤组织；随后继代于分化培养基上，继续黑暗培养直至可见明显子叶的成熟胚状体。剥离成熟胚状体接种于生根培养基上进行生根培养；待幼苗长出发达根系后进行水培炼苗，随后移栽至土钵中；植株长势稳健后进行加倍处理，脱脂棉蘸取0.25%秋水仙素于生长点和腋芽处，处理48小时，期间添加秋水仙素保湿。可考虑加倍2-3次，以保证加倍效果。2011年，对6个新疆制干辣椒品种按照本方法进行了花药培养，6个品种均有愈伤组织出现，最高愈伤组织诱导率为42.83%；4个品种分化出了胚状体，最高出胚率为10.38%。诱导培养4周后统计愈伤组织诱导率，分化调控培养4周后统计出胚率，生根培养2周后统计正常苗率。

愈伤组织诱导率（％）＝形成愈伤组织的花药数/接种花药数×100％。

结果：6个品种在2, 4-D+KT和NAA+KT植物激素组合下的平均愈伤组织诱导率分别为10.53%和23.18%。

出胚率（％）＝分化胚状体数/接种花药数×100％。

结果：4个品种在2, 4-D+KT和NAA+KT植物激素组合下的平均出胚率分别为2.53%和5.39%。

正常苗率（%）=正常苗数/子叶胚数×100％。

结果：4个品种在2, 4-D+KT和NAA+KT植物激素组合下的平均正常苗率分别为52.18%和72.65%。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)取样，选择花瓣与花萼近等长或根据花药颜色以1/3为紫色的花蕾，4℃冰箱预处理1～7天；(2)消毒；(3)剥取花药；(4)接种，每皿放30个花药，Parafilm膜封口；(5)诱导培养，28℃的恒温培养箱中黑暗培养；(6)分化调控，诱导培养4周后继代于分化培养基上，继续黑暗培养直至获得可见明显子叶的成熟胚状体；(7)生根培养，剥离成熟胚状体接种于生根培养基上进行生根培养；(8)驯化移栽，待幼苗长出发达根系后进行驯化，随后移栽至土钵中；(9)加倍处理，植株长势稳健后进行加倍处理；

其中，接种中使用的诱导培养基为MSB培养基附加了0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT或0.5mg/L NAA+0.1mg/L KT；

分化调控过程中使用的分化培养基为MSB附加0.05mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT或0.3mg/LNAA+0.1mg/L KT；

生根培养过程中使用的生根培养基为无机物含量减半，有机物含量不变的1/2MSB培养基；

MSB培养基的成分为：硝酸钾1.9g/L、硫酸铵1.65g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、七水硫酸镁0.37g/L、二水氯化钙0.44g/L、四水硫酸锰22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸锌8.6mg/L、碘化钾0.83mg/L、二水钼酸钠0.25mg/L、五水硫酸铜0.025mg/L、六水氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸钠37.3mg/L、七水硫酸亚铁27.8mg/L、甘氨酸2mg/L、烟酸1mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、肌醇100mg/L、蔗糖30g/L、琼脂9g/L，pH为5.8～6.0。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于剥取花药过程为将消过毒的花蕾倒在无菌滤纸上，用两把尖头小镊子一把夹住花蕾底部，一把镊子将花药部分拔出，剥开花瓣取出花药。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于加倍处理过程为取脱脂棉蘸取0.25％秋水仙素于生长点和腋芽处，处理48小时，期间添加秋水仙素保湿，加倍2-3次，以保证加倍效果。