CN103283597A - 一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法 - Google Patents

Abstract

一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法，涉及香蕉胚性悬浮细胞体系的建立方法。包括如下步骤：A、选用目前大面积推广的香蕉品种或者较难诱导出胚性愈伤的香蕉品种；B、选取开花后1到10周的香蕉花蕾，在正式培养未成熟雄花之前，这些花蕾可以保存24小时；C、胚性愈伤诱导；D、胚性悬浮细胞的获得；E、幼胚的发育；F、幼胚再生成幼苗。本发明通过在香蕉未成熟雄花胚性诱导和胚性悬浮细胞体系建立的不同关键阶段运用不同的培养基配方和培养工艺，达到提高香蕉未成熟雄花胚性诱导成功率和香蕉胚性悬浮细胞系建立的成功率，该发明的运用有效地建立了大面积推广的多个三倍体香蕉品种的胚性悬浮细胞系，利于香蕉不同品种转基因工作的开展。

Description

一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法

技术领域

本发明涉及香蕉体细胞再生方法，尤其指一种通过提高胚性愈伤诱导成功率，获得胚性悬浮细胞，由胚性悬浮细胞生成香蕉幼苗的方法。

背景技术

在我国香蕉种植过程中，经常会遇到枯萎病、冻害、台风、采后腐烂等问题。培育多抗高产的新品种是解决这些问题的根本途径。但是现在生产上推广的绝大多数栽培香蕉是三倍体。它们单性结实并且雌性高度不育。常规的杂交育种方法在香蕉上运用起来难度很大。非常规育种方法，例如转基因，是解决香蕉育种难题的一个途径。但是如果像其它植物转基因那样，直接把外植体或者愈伤组织作为转化对象，转化后常会因为嵌合体和胚性愈伤所占比例低而导致得到转基因植株的难度非常大。如果能够得到单个的胚性细胞，把单个的胚性细胞作为转化对象，则这些问题都可以得到解决。理论上来说，胚性悬浮细胞系里边的细胞是各自分离的。它们与农杆菌或银弹接触的概率很高。转基因成功的几率得到提高。每一个胚性细胞能够形成一个植株。将来长成的每一个植株也都来自于一个单独的胚性细胞。转基因后得到的植株将不存在嵌合体的问题。建立一个稳定均一的胚性悬浮细胞系是进行香蕉转基因工作的前提。诱导胚性愈伤是建立胚性悬浮细胞系的第一步。但是从已经发表的文章来看，由香蕉未成熟雄花诱导出愈伤的几率比较低，而且这些诱导出的愈伤中只有很小一部分是胚性愈伤，雄花和愈伤容易褐化坏死，香蕉胚性愈伤诱导成功的几率非常低，只有5％-8％。这意味着诱导香蕉胚性愈伤需要大量的时间和精力。在香蕉未成熟雄花中，位于第十六排到第八排的雄花最适宜于进行胚性愈伤诱导(最靠近尖端分生组织突起的雄花为第一排)。第一排到第八排的雄花在诱导培养基上进行培养的过程中，很容易褐化坏死。然而从理论上来说，未成熟雄花中的细胞是已经高度分化的细胞。得到胚性愈伤组织需要让它们回到早期的胚性状态。那些越接近尖端分生组织突起的雄花距离早期的胚性状态就越近，就越容易被诱导得到胚性愈伤组织。如果未成熟雄花褐化的问题能够被解决，将很有可能会大幅度提高获得胚性愈伤和胚性悬浮细胞系的概率，节约人力和物力。所以，提高获得香蕉胚性愈伤和胚性悬浮细胞系的概率有两条可能途径：一，降低愈伤和未成熟雄花在培养过程中的褐化问题；二，提高诱导出的愈伤向胚性愈伤转化的比例。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供一种大幅度提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导成功率的方法，其能够使花蕾中第一排到第八排的未成熟雄花在胚性愈伤诱导过程中褐化坏死的比例大幅度降低，并且能够使多数未成熟雄花成功诱导出胚性愈伤，进而大幅提高胚性悬浮细胞系成功建立的几率。

为此，本发明的技术方案包括如下步骤：

A、选用目前生产上大面积推广的、胚性悬浮细胞系较难建立的三倍体香蕉作为出发材料，包括：巴西蕉、威廉斯B6、海蕉一号、Anaikomban、Matti。

B、胚性愈伤的诱导

(1)选取开花后1到10周的雄花花蕾，在无菌条件下剥掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小为0.8cm×2cm，将花蕾放入内壁沾有水珠的塑料盒内，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾进行表面灭菌；

(2)将上述花蕾从塑料盒内取出，放入70％的酒精中浸泡1分钟，然后取出放于超净工作台上备用；

(3)在超净工作台中，将表面灭菌后的花蕾放于直径为120cm的无菌培养皿中，用镊子和手术刀片继续剥离花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花为止，然后将花蕾放于解剖镜下继续剥离花蕾外面的苞片，直到大约第20排的雄花出现为止；

(4)用手术刀片小心取下第8排到第1排的雄花(最接近分生组织突起的雄花为第1排)，转入装有胚性愈伤诱导培养基M1的培养瓶中，将创伤面紧贴培养基；每瓶5到8排雄花；胚性愈伤诱导培养基M1为：1/3MS+4mg/L2，4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L Biotin+30g/L Sucrose+7g/L Agar+0.1％ascorbic acid+10mg/L AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a-萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即琼脂粉；ascorbic acid即抗坏血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；

(5)培养条件：黑暗，温度28度，培养时间3到5个月；

C、胚性悬浮细胞系的诱导：

(1)选择包含有大量松脆易碎的胚性愈伤和处于发育早期的透明原胚的培养物，小心放于无菌的培养皿中，用手术刀片小心取下松脆易碎的胚性愈伤，放于盛放有6ml液体培养基M2中；液体培养基M2配方为：MS+1mg/L2，4-D+100mg/L glutamine+100mg/L maltose+10mg/L ascorbic acid+45g/L sucrose+10mg/LAG，pH＝5.3；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；glutamine即谷氨酰胺；maltose即麦芽糖；ascorbic acid即抗坏血酸；sucrose即蔗糖；AG即阿拉伯半乳聚糖；

(2)培养条件：黑暗，温度28度，转速90rpm，培养时间6到9个月；

(3)胚性悬浮细胞系诱发的第一个月，每7到10天更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；从第二个月开始，每两周更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；在更换培养液时，用移液器吸走并除去黄色的分生组织小球、处于子叶期的白色胚、褐化组织和高度液泡化的细胞。

(4)每个月转移一部分样品在细菌培养基上培养，以检测是否被细菌污染；每次更换培养液时，先静置1分钟，观察沉淀下来的细胞所占培养液的比例，如果沉淀细胞的体积所占整个培养液体积的比例超过3％，可以将细胞转移到一个更大的培养瓶中进行培养；在培养的过程中可以用FDA检测悬浮细胞的活性，先滴几滴FDA到蒸馏水中，直到呈现亮蓝色，加1到2滴这样的溶液到悬浮细胞样品中，在显微镜下观察，呈现亮绿色的细胞为具有活性的细胞；用孔径为250到500微米的筛网除去分生组织小球和原胚；如此反复，即可获得较理想的胚性悬浮细胞系；

D、植株再生

(1)转移一部分胚性悬浮细胞到一个带有刻度的试管内，静置1分钟后，观察细胞体积占培养液体积的比例，添加培养液M2使静置后细胞体积占培养液的体积为3％；

(2)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M3，M3培养基为：SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L biotin+680μmol/Lglutamine+2mmol/L proline+100mg/L maltose+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/Lzeatin+0.5μmol/L kinetin+0.7μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine+130mmol/Lsucrose+29mmol/L lactose+1g/L phytagel，pH5.8；所述SH即SH培养基；MS即MS培养基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麦芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激动素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝胶；在培养基的上面铺上一张定性分析滤纸，转移1ml上述培养物到滤纸上；

(3)黑暗，温度28度，培养时间为3到4个月

(4)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M4，M4培养基配方为：MS大量元素+MS微量元素+MS维生素+2mg/L IAA+0.5mg/L BAP+30g/L sucrose+3g/L phytagel，pH＝5，8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝胶；将成熟胚转移到培养基M4上，培养1到2个月获得发芽的胚；

(5)将发芽的胚转移到培养基M5上，M5培养基配方为：MS+1μmol/LIAA+1μmol/L BAP，pH＝5，8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；培养1到1.5个月，即可获得香蕉再生幼苗。

本发明的有益效果是：

在外植体材料选用上，本发明选用香蕉花蕾中第一排到第八排的未成熟雄花，这些未成熟雄花距离花蕾尖端的分生组织突起很近，雄花细胞在胚性愈伤诱导培养基上很容易回到原初的胚性状态，因此，能够大幅度提高胚性愈伤诱导成功的比例。在取下这些未成熟雄花时，应小心在解剖镜下进行操作，注意不要取到雄花外面的苞片，否则，由这些苞片在胚性愈伤诱导培养基上也能够诱导出愈伤组织，但是他们并不是胚性愈伤组织，混有外围苞片的未成熟雄花将会降低胚性愈伤诱导的成功率。在用手术刀取下未成熟雄花以后，创伤面将会有大量的酚类物质流出，这些酚类物质很容易被空气中的氧气所氧化，形成黑褐色物质，这些黑褐色物质会对外植体和愈伤组织造成危害，因此，在手术刀取下未成熟雄花以后，要快速将这些雄花转移到诱导培养基上，其中创伤面要紧贴着培养基，这样从创伤面流出的酚类物质被培养基所吸收，培养基中的抗坏血酸与这些酚类物质进行反应，消除掉这些酚类物质，从而将酚类物质对未成熟雄花和愈伤组织的危害降低甚至消除。

在胚性愈伤诱导培养基中，选用的大量元素仅为正常培养情况下的三分之一，即1/3MS。这样能够使未成熟雄花细胞在诱导的过程中处于饥饿状态。因为未成熟雄花的细胞是已经高度分化的细胞，要想得到胚性愈伤组织需要让它们回到原初的胚性状态，而细胞处于饥饿状态下能够促使染色体上的基因逆向调整编码程序，使已经分化的细胞回到胚性状态。

在诱导培养基中加入抗坏血酸，但是如果抗坏血酸浓度过高会导致过氧化反应。在胚性诱导培养基中加入抗坏血酸能够有效抑制未成熟雄花的褐化，但是如果浓度超过0.5％，则未成熟雄花在诱导培养基上出现玻璃化现象，大量的雄花细胞被杀死。作为抗氧化剂，抗坏血酸不仅有抗氧化作用，在一定条件下也有促氧化作用(即过氧化反应)。抗坏血酸的烯醇式羟基具有酸性，在过渡族离子(尤其是铁和铜)存在下，会产生OH^-，但抗坏血酸在清除OH^-的同时，又会产生半脱氢抗坏血酸负离子自由基(A^-)，当A^-不能及时清除时，会诱发一系列自由基连锁反应，损害生物膜及其功能，造成大面积细胞损伤。所以，诱导培养基中抗坏血酸的浓度以0.2％-0.4％为最佳浓度。

AGPs是一类异质性的糖蛋白，主要由蛋白质和碳水化合物组成，其蛋白质部分不超过10％。AG是AGPs中阿拉伯半乳糖的类似物。我们发现，在胚性愈伤诱导培养基中添加10mg/L AGPs能够显著提高未成熟雄花所诱导出的胚性愈伤在愈伤总数中所占的比例；在液体培养基中添加10mg/LAG能够提高胚性细胞在悬浮体系中所占的比例。

胚性愈伤转接到液体培养基以后，以每14天转接一次为宜，转接太频繁会增大被污染的几率，而且效果也不明显。转接时培养瓶内应保留10％-20％的原培养液不变。每次转接时，用移液器去除培养液内的黄色的分生组织小球、处于子叶期白色的胚、褐化坏死的组织和高度液泡化的细胞。

再生培养基应该用半固体培养基较好。此步骤改善以后，铺在培养基上面的滤纸能够更好地与培养基相接触，胚性悬浮细胞在滤纸上能够更容易地生长得到幼胚；而如果用全固体的培养基，则胚性悬浮细胞死亡率较高，生长出来的幼胚也呈现失水症状。

本发明通过在香蕉未成熟雄花胚性愈伤诱导、胚性悬浮细胞系转接和再生的不同关键阶段运用不同的培养基配方和工艺，达到大幅提高胚性愈伤诱导成功率和胚性悬浮细胞系建立成功率的目的，该发明的运用有效地建立了难以建立的香蕉胚性悬浮细胞系，利于香蕉不同品种悬浮细胞系的建立和转基因工作的开展。

具体实施方式

实施例一

A、选用目前生产上大面积推广的、胚性悬浮细胞系较难建立的三倍体香蕉作为出发材料，包括：巴西蕉(Musa acuminate AAA Cavendish cv.Brazil)、威廉斯B6、海蕉一号、Anaikomban、Matti等。

B、胚性愈伤的诱导

(1)选取开花后1到10周的雄花花蕾，在无菌条件下剥掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小为0.8cm×2cm，将花蕾放入内壁沾有水珠的塑料盒内，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾进行表面灭菌；

(2)将上述花蕾从塑料盒内取出，放入70％的酒精中浸泡1分钟，然后取出放于超净工作台上备用；

(3)在超净工作台中，将表面灭菌后的花蕾放于直径为120cm的无菌培养皿中，用镊子和手术刀片继续剥离花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花为止，然后将花蕾放于解剖镜下继续剥离花蕾外面的苞片，直到大约第20排的雄花出现为止；

(4)用手术刀片小心取下第8排到第1排的雄花(最接近分生组织突起的雄花为第1排)，转入装有胚性愈伤诱导培养基M1的培养瓶中，将创伤面紧贴培养基；每瓶5到8排雄花；胚性愈伤诱导培养基M1为：1/3MS+4mg/L2，4-D+1mg/L IAA+1mg/LNAA+1mg/L Biotin+30g/L Sucrose+7g/LAgar+0.1％ascorbic acid+10mg/L AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a-萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即琼脂粉；ascorbic acid即抗坏血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；

(5)培养条件：黑暗，温度28度，培养时间3到5个月；

C、胚性悬浮细胞系的诱导：

(1)选择包含有大量松脆易碎的胚性愈伤和处于发育早期的透明原胚的培养物，小心放于无菌的培养皿中，用手术刀片小心取下松脆易碎的胚性愈伤，放于盛放有6ml液体培养基M2中；液体培养基M2为：MS+1mg/L2，4-D+100mg/L glutamine+100mg/L maltose+10mg/L ascorbic acid+45g/L sucrose+10mg/L AG，pH＝5.3；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；glutamine即谷氨酰胺；maltose即麦芽糖；ascorbic acid即抗坏血酸；sucrose即蔗糖；AG即阿拉伯半乳聚糖；

(2)培养条件：黑暗，温度28度，转速90rpm，培养时间6到9个月；

(3)胚性悬浮细胞系诱发的第一个月，每7到10天更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；从第二个月开始，每两周更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；在更换培养液时，用移液器吸走并除去黄色的分生组织小球、处于子叶期的白色胚、褐化组织和高度液泡化的细胞。

(4)每个月转移一部分样品在细菌培养基上培养，以检测是否被细菌污染；每次更换培养液时，先静置1分钟，观察沉淀下来的细胞所占培养液的比例，如果沉淀细胞的体积所占整个培养液体积的比例超过3％，可以将细胞转移到一个更大的培养瓶中进行培养；在培养的过程中可以用FDA检测悬浮细胞的活性，先滴几滴FDA到蒸馏水中，直到呈现亮蓝色，加1到2滴这样的溶液到悬浮细胞样品中，在显微镜下观察，呈现亮绿色的细胞为具有活性的细胞；用孔径为250到500微米的筛网除去分生组织小球和原胚；如此反复，即可获得较理想的胚性悬浮细胞系；

D、植株再生

(1)转移一部分胚性悬浮细胞到一个带有刻度的试管内，静置1分钟后，观察细胞体积占培养液体积的比例，添加培养液M2使静置后细胞体积占培养液的体积为3％；

(2)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M3，M3培养基为：SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L biotin+680μmol/Lglutamine+2mmol/L proline+100mg/L maltose+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/Lzeatin+0.5μmol/L kinetin+0.7μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine+130mmol/Lsucrose+29mmol/L lactose+1g/L phytagel，pH5.8；所述SH即SH培养基；MS即MS培养基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麦芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激动素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝胶；在培养基的上面铺上一张定性分析滤纸，转移1ml上述培养物到滤纸上；

(3)黑暗，温度28度，培养时间为3到4个月

(4)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M4，M4培养基配方为：MS大量元素+MS微量元素+MS维生素+2mg/L IAA+0.5mg/L BAP+30g/L sucrose+3g/L phytagel，pH＝5，8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝胶；将成熟胚转移到培养基M4上，培养1到2个月获得发芽的胚；

(5)将发芽的胚转移到培养基M5上，M5培养基配方为MS+1μmol/LIAA+1μmol/L BAP，pH＝5，8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；培养1到1.5个月，即可获得香蕉再生幼苗。

实施例二

A、选用目前胚性悬浮细胞系较难建立的三倍体香蕉作为出发材料，包括：高种天宝蕉、高脚顿地雷、齐尾、河口高把香蕉、仙人蕉、矮脚顿地雷、广东香蕉2号等。

B、胚性愈伤的诱导

(1)选取开花后1到10周的雄花花蕾，在无菌条件下剥掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小为0.8cm×2cm，将花蕾放入内壁沾有水珠的塑料盒内，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾进行表面灭菌；

(2)将上述花蕾从塑料盒内取出，放入70％的酒精中浸泡1分钟，然后取出放于超净工作台上备用；

(3)在超净工作台中，将表面灭菌后的花蕾放于直径为120cm的无菌培养皿中，用镊子和手术刀片继续剥离花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花为止，然后将花蕾放于解剖镜下继续剥离花蕾外面的苞片，直到大约第20排的雄花出现为止；

(4)用手术刀片小心取下第8排到第1排的雄花(最接近分生组织突起的雄花为第1排)，转入装有胚性愈伤诱导培养基M1的培养瓶中，将创伤面紧贴培养基；每瓶5到8排雄花；胚性愈伤诱导培养基M1为：1/3MS+4mg/L2，4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L Biotin+30g/L Sucrose+7g/L Agar+0.1％ascorbic acid+10mg/L AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a-萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即琼脂粉；ascorbic acid即抗坏血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；

(5)培养条件：黑暗，温度28度，培养时间3到5个月；

C、胚性悬浮细胞系的诱导：

(1)选择包含有大量松脆易碎的胚性愈伤和处于发育早期的透明原胚的培养物，小心放于无菌的培养皿中，用手术刀片小心取下松脆易碎的胚性愈伤，放于盛放有6ml液体培养基M2中；液体培养基M2配方为：MS+1mg/L2，4-D+100mg/L glutamine+100mg/L maltose+10mg/L ascorbic acid+45g/L sucrose+10mg/L AG，pH＝5.3；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；glutamine即谷氨酰胺；maltose即麦芽糖；ascorbic acid即抗坏血酸；sucrose即蔗糖；AG即阿拉伯半乳聚糖；

(2)培养条件：黑暗，温度28度，转速90rpm，培养时间6到9个月；

(3)胚性悬浮细胞系诱发的第一个月，每7到10天更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；从第二个月开始，每两周更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；在更换培养液时，用移液器吸走并除去黄色的分生组织小球、处于子叶期的白色胚、褐化组织和高度液泡化的细胞。

(4)每个月转移一部分样品在细菌培养基上培养，以检测是否被细菌污染；每次更换培养液时，先静置1分钟，观察沉淀下来的细胞所占培养液的比例，如果沉淀细胞的体积所占整个培养液体积的比例超过3％，可以将细胞转移到一个更大的培养瓶中进行培养；在培养的过程中可以用FDA检测悬浮细胞的活性，先滴几滴FDA到蒸馏水中，直到呈现亮蓝色，加1到2滴这样的溶液到悬浮细胞样品中，在显微镜下观察，呈现亮绿色的细胞为具有活性的细胞；用孔径为250到500微米的筛网除去分生组织小球和原胚；如此反复，即可获得较理想的胚性悬浮细胞系；

D、植株再生

(1)转移一部分胚性悬浮细胞到一个带有刻度的试管内，静置1分钟后，观察细胞体积占培养液体积的比例，添加培养液M2使静置后细胞体积占培养液的体积为3％；

(2)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M3，M3培养基为：SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L biotin+680μmol/Lglutamine+2mmol/L proline+100mg/L maltose+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/Lzeatin+0.5μmol/L kinetin+0.7μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine+130mmol/Lsucrose+29mmol/L lactose+1g/L phytagel，pH＝5.8；所述SH即SH培养基；MS即MS培养基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麦芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激动素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝胶；在培养基的上面铺上一张定性分析滤纸，转移1ml上述培养物到滤纸上；

(3)黑暗，温度28度，培养时间为3到4个月

(4)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M4，M4培养基配方为：MS大量元素+MS微量元素+MS维生素+2mg/L IAA+0.5mg/L BAP+30g/L sucrose+3g/L phytagel，pH＝5，8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝胶；将成熟胚转移到培养基M4上，培养1到2个月获得发芽的胚；

(5)将发芽的胚转移到培养基M5上，M5培养基配方为：MS+1μmol/LIAA+1μmol/L BAP，pH＝5，8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；培养1到1.5个月，即可获得香蕉再生幼苗。

实施例三

A、选用目前胚性悬浮细胞系较难建立的三倍体香蕉作为出发材料，包括：广东香蕉1号、广东大种矮把、东莞中把、中山牙蕉、云南河口中把、广西龙舟中把、高州矮香蕉、广西那龙香蕉、云南红河矮蕉、西贡蕉等。

B、胚性愈伤的诱导

(1)选取开花后1到10周的雄花花蕾，在无菌条件下剥掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小为0.8cm×2cm，将花蕾放入内壁沾有水珠的塑料盒内，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾进行表面灭菌；

(2)将上述花蕾从塑料盒内取出，放入70％的酒精中浸泡1分钟，然后取出放于超净工作台上备用；

(3)在超净工作台中，将表面灭菌后的花蕾放于直径为120cm的无菌培养皿中，用镊子和手术刀片继续剥离花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花为止，然后将花蕾放于解剖镜下继续剥离花蕾外面的苞片，直到大约第20排的雄花出现为止；

(4)用手术刀片小心取下第8排到第1排的雄花(最接近分生组织突起的雄花为第1排)，转入装有胚性愈伤诱导培养基M1的培养瓶中，将创伤面紧贴培养基；每瓶5到8排雄花；胚性愈伤诱导培养基M1为：1/3MS+4mg/L2，4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L Biotin+30g/L Sucrose+7g/L Agar+0.1％ascorbic acid+10mg/L AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a-萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即琼脂粉；ascorbic acid即抗坏血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；

(5)培养条件：黑暗，温度28度，培养时间3到5个月；

C、胚性悬浮细胞系的诱导：

(1)选择包含有大量松脆易碎的胚性愈伤和处于发育早期的透明原胚的培养物，小心放于无菌的培养皿中，用手术刀片小心取下松脆易碎的胚性愈伤，放于盛放有6ml液体培养基M2中；液体培养基M2配方为：MS+1mg/L2，4-D+100mg/L glutamine+100mg/L maltose+10mg/L ascorbic acid+45g/L sucrose+10mg/L AG，pH＝5.3；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；glutamine即谷氨酰胺；maltose即麦芽糖；ascorbic acid即抗坏血酸；sucrose即蔗糖；AG即阿拉伯半乳聚糖；

(2)培养条件：黑暗，温度28度，转速90rpm，培养时间6到9个月；

(3)胚性悬浮细胞系诱发的第一个月，每7到10天更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；从第二个月开始，每两周更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；在更换培养液时，用移液器吸走并除去黄色的分生组织小球、处于子叶期的白色胚、褐化组织和高度液泡化的细胞。

(4)每个月转移一部分样品在细菌培养基上培养，以检测是否被细菌污染；每次更换培养液时，先静置1分钟，观察沉淀下来的细胞所占培养液的比例，如果沉淀细胞的体积所占整个培养液体积的比例超过3％，可以将细胞转移到一个更大的培养瓶中进行培养；在培养的过程中可以用FDA检测悬浮细胞的活性，先滴几滴FDA到蒸馏水中，直到呈现亮蓝色，加1到2滴这样的溶液到悬浮细胞样品中，在显微镜下观察，呈现亮绿色的细胞为具有活性的细胞；用孔径为250到500微米的筛网除去分生组织小球和原胚；如此反复，即可获得较理想的胚性悬浮细胞系；

D、植株再生

(1)转移一部分胚性悬浮细胞到一个带有刻度的试管内，静置1分钟后，观察细胞体积占培养液体积的比例，添加培养液M2使静置后细胞体积占培养液的体积为3％；

(2)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M3，M3培养基为：SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L biotin+680μmol/Lglutamine+2mmol/L proline+100mg/L maltose+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/Lzeatin+0.5μmol/L kinetin+0.7μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine+130mmol/Lsucrose+29mmol/L lactose+1g/L phytagel，pH＝5.8；所述SH即SH培养基；MS即MS培养基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麦芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激动素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝胶；在培养基的上面铺上一张定性分析滤纸，转移1ml上述培养物到滤纸上；

(3)黑暗，温度28度，培养时间为3到4个月

(4)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M4，M4培养基配方为：MS大量元素+MS微量元素+MS维生素+2mg/L IAA+0.5mg/L BAP+30g/L sucrose+3g/L phytagel，pH＝5，8，所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝胶；将成熟胚转移到培养基M4上，培养1到2个月获得发芽的胚；

(5)将发芽的胚转移到培养基M5上，M5培养基配方为：MS+1μmol/LIAA+1μmol/L BAP，pH＝5，8，所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；培养1到1.5个月，即可获得香蕉再生幼苗。

Claims (1)

1.一种提高香蕉未成熟雄花胚性愈伤获得成功率的方法，其特征在于包括如下步骤：

A.选用目前大面积推广的香蕉品种或者较难获得胚性悬浮细胞系的香蕉品种，包括：巴西蕉(Musa acuminate AAA Cavendish cv.Brazil)、威廉斯B6、海蕉一号、高种天宝蕉、高脚顿地雷、齐尾、河口高把香蕉、仙人蕉、矮脚顿地雷、广东香蕉2号；

B.胚性愈伤的诱导

1)选取开花后1到10周的香蕉花蕾，在无菌条件下剥掉花蕾外面的苞片，直到花蕾大小为0.8cm×2cm，将花蕾放入内壁沾有水珠的塑料盒内，塑料盒用封口膜密封，直到取出花蕾进行表面灭菌；

2)将上述花蕾从塑料盒内取出，放入70％的酒精中浸泡1分钟，然后取出放于超净工作台上备用；

3)在超净工作台中，将表面灭菌后的花蕾放于直径为120cm的无菌培养皿中，用镊子和手术刀片继续剥离花蕾外面的苞片，直到肉眼看不清雄花为止，然后将花蕾放于解剖镜下继续剥离花蕾外面的苞片，直到大约第20排的雄花出现为止；

4)用手术刀片小心取下第8排到第1排的雄花，最接近分生组织突起的雄花为第1排，转入装有胚性愈伤诱导培养基M1的培养瓶中，将创伤面紧贴培养基；每瓶5到8排雄花；胚性愈伤诱导培养基M1为：1/3MS+4mg/L2，4-D+1mg/L IAA+1mg/L NAA+1mg/L Biotin+30g/L Sucrose+7g/L Agar+0.1％ascorbic acid+10mg/L AGPs，pH5.8；所述1/3MS即NH₄NO₃、KNO₃、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄用量为MS培养基正常用量的1/3，其它元素用量不变；2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；IAA即吲哚乙酸；NAA即a-萘乙酸；Biotin即生物素；Sucrose即蔗糖；Agar即琼脂粉；ascorbic acid即抗坏血酸；AGPs即阿拉伯半乳糖蛋白；

5)培养条件：黑暗，温度28度，培养时间3到5个月；

C.胚性悬浮细胞系的诱导：

1)选择包含有大量松脆易碎的胚性愈伤和处于发育早期的透明原胚的培养物，小心放于无菌的培养皿中，用手术刀片小心取下松脆易碎的胚性愈伤，放于盛放有6ml液体培养基M2中；液体培养基M2为：MS+1mg/L2，4-D+100mg/Lglutamine+100mg/L maltose+10mg/L ascorbic acid+45g/L sucrose+10mg/LAG，pH＝5.3；所述2，4-D即2，4-二氯苯氧乙酸；glutamine即谷氨酰胺；maltose即麦芽糖；ascorbic acid即抗坏血酸；sucrose即蔗糖；AG即阿拉伯半乳聚糖；

2)培养条件：黑暗，温度28度，转速90rpm，培养时间6到9个月；

3)胚性悬浮细胞系诱发的第一个月，每7到10天更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；从第二个月开始，每两周更换一次培养液，每次更换时保留10％-20％的原有培养液；在更换培养液时，用移液器吸走并除去黄色的分生组织小球、处于子叶期的白色胚、褐化组织和高度液泡化的细胞；

4)每个月转移一部分样品在细菌培养基上培养，以检测是否被细菌污染；每次更换培养液时，先静置1分钟，观察沉淀下来的细胞所占培养液的比例，如果沉淀细胞的体积所占整个培养液体积的比例超过3％，可以将细胞转移到一个更大的培养瓶中进行培养；在培养的过程中可以用FDA检测悬浮细胞的活性，先滴几滴FDA到蒸馏水中，直到呈现亮蓝色，加1到2滴这样的溶液到悬浮细胞样品中，在显微镜下观察，呈现亮绿色的细胞为具有活性的细胞；用孔径为250到500微米的筛网除去分生组织小球和原胚；如此反复，即可获得较理想的胚性悬浮细胞系；

D.植株再生

1)转移一部分胚性悬浮细胞到一个带有刻度的试管内，静置1分钟后，观察细胞体积占培养液体积的比例，添加培养液M2使静置后细胞体积占培养液的体积为3％；

2)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M3，M3培养基为：SH大量元素+SH微量元素+MS维生素+4.1μmol/L biotin+680μmol/Lglutamine+2mmol/L proline+100mg/L maltose+1.1μmol/L NAA+0.2μmol/Lzeatin+0.5μmol/L kinetin+0.7μmol/L N6-(2-isopentenyl)adenine+130mmol/Lsucrose+29mmol/L lactose+1g/L phytagel，pH5.8；所述SH即SH培养基；MS即MS培养基；biotin即生物素；glutamine即谷氨酰胺；proline即脯氨酸；maltose即麦芽糖；NAA即萘乙酸；zeatin即玉米素；kinetin即激动素；adenine即腺嘌呤；sucrose即蔗糖；lactose即乳糖；phytagel即植物凝胶；在培养基的上面铺上一张定性分析滤纸，转移1ml上述培养物到滤纸上；

3)黑暗，温度28度，培养时间为3到4个月；

4)在直径为90mm的培养皿中盛放25ml再生培养基M4，M4培养基配方为：MS大量元素+MS微量元素+MS维生素+2mg/L IAA+0.5mg/L BAP+30g/L sucrose+3g/L phytagel，pH＝5，8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；sucrose即蔗糖；phytagel即植物凝胶；将成熟胚转移到培养基M4上，培养1到2个月获得发芽的胚；

5)将发芽的胚转移到培养基M5上，M5培养基配方为：MS+1μmol/L IAA+1μmol/L BAP，pH＝5，8；所述MS即MS培养基；IAA即吲哚乙酸；BAP即6-苄氨基嘌呤；培养1到1.5个月，即可获得香蕉再生幼苗。